CN113318270B - 生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，包括以下步骤：将聚酯材料通过纺粘、加固为网状片层；对网状片层进行清洗和干燥；利用强碱性溶液对清洗干燥完毕的网状片层进行羧基化处理；对网状片层进行活化和交联；对网状片层进行多次偶联以在网状片层上形成生物活性物质覆层；对覆层后的网状片层进行封闭，得到生物活性物质覆层聚酯网状片层支架。通过对聚酯材料进行纺粘、加工制作成网状片层，并对所述网状片层进行羧基化、活化交联、偶联和封闭四个步骤来实现覆层，通过调整参数来实现仿生细胞外基质与合成高分子聚酯材料的共价连接，无需等离子表面处理机等特殊设备，也不引入有毒化学物质，保证生物制品生产的安全质量。

Description

生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法
技术领域
本申请涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法。
背景技术
细胞增殖、分化和代谢等生理活动都严重受到微环境的调控影响，生物反应器是以规模化生产细胞或以规模化生产细胞或以收获细胞培养产物为目的的一种生物反应装置。其中，贴壁依赖性细胞主要在反应器中加入支架材料以提供细胞生长表面，通过材料的高比表面积，实现细胞的高密度培养。
目前，常用的生物反应器内支架材料主要包括Cytodex微载体、Cytopore微载体、纤维状支架等。作为细胞表面贴附基质的Cytodex微载体是一种球形的细胞二维培养材料，细胞受到重力的作用而自然沉降在微载体表面,形态由球状变为扁平状。这种培养模式下细胞会发生去分化现象，使培养的细胞逐渐失去其来源组织的许多生理特征。虽然可以实现细胞的规模化生产，但是细胞的活性和功能难以有效维持。同时这种细胞外包材料的模式，反应器的液态剪切力会对细胞的活率及功能有所损害。Cytopore微载体是一种多孔式微载体，细胞生长于材料的多孔内，可以实现三维培养并降低剪切力对细胞的损伤。基于Cytopore微载体的反应器培养模式为搅拌式，虽然这种多孔结构可以在一定程度上降低剪切力对细胞的损伤，但是并不能从根本上消除剪切力对细胞的影响。纤维状支架如FibraDisk载体具备一定的机械强度，有良好的力学性能，可以实现细胞的体外三维培养结构，但是，单纯高分子材料，其生物相容性与天然细胞外基质成分比较仍有一定的缺陷。
发明内容
本申请的目的旨在提供一种将合成聚酯高分子材料具备一定的机械性能、可塑性的优势与天然高分子材料良好的生物相容性相结合的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，
为了实现上述目的，本申请提供以下技术方案：
一种生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，包括以下步骤：
将聚酯材料通过纺粘、加固为网状片层；
对所述网状片层进行清洗和干燥；
利用强碱性溶液对清洗干燥完毕的网状片层进行羧基化处理；
对所述网状片层进行活化和交联；
对所述网状片层进行多次偶联以在网状片层上形成生物活性物质覆层；
对覆层后的网状片层进行封闭，得到所述生物活性物质覆层聚酯网状片层支架。
进一步设置：所述聚酯材料包括聚己内酯、碳酸聚酯、对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二酯、局对苯二甲酸丙二酯、聚对苯二甲酸-1,4-环己二甲酯纤维及聚-2,6-萘二酸乙二酯中的一种或多种组合物，且所形成的网状片层的单根网状纤维直径为25～35μm。
进一步设置：对所述网状片层进行清洗和干燥包括以下步骤：分别用乙醇、丙酮和超纯水对所述网状片层进行超声波清洗，清洗时间各8～15min，再在40℃～80℃下干燥过夜。
进一步设置：利用强碱性溶液对清洗干燥完毕的所述网状片层进行羧基化处理包括以下步骤：将清洗干燥后的所述网状片层浸泡在强碱性溶液中20～50min，以断裂所述网状片层的酯基暴露羧基，所述强碱性溶液的溶质为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的至少一种，且所述强碱性溶液中含有以质量体积百分比计的溶质5％～20％。
进一步设置：对所述网状片层进行活化和交联包括以下步骤：
将羧基化处理后的网状片层浸入2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液中进行一次活化，反应时间为30min～4h；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按比例加入到2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液中进行二次活化和交联，反应时间为15min～3h；
最后加入2-巯基乙醇来终止上述活化和交联反应。
进一步设置：所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2～5mmol/ml，且所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比例范围为1:2～1:9。
进一步设置：对所述网状片层进行偶联以在网状片层上形成生物活性物质覆层，包括以下步骤：
配置胶原蛋白溶液，将所述网状片层投入所述胶原蛋白溶液中进行一次偶联，反应时间为30min～4h；
配置包含有胶原蛋白和糖胺聚糖的混合溶液，将上述一次偶联后的网状片层投入到所述混合溶液中进行二次偶联，反应时间为30min～4h；
配置脱细胞基质溶液，将上述二次偶联后的网状片层投入到所述脱细胞基质溶液中进行三次偶联，反应时间为30min～4h。
进一步设置：所述胶原蛋白溶液的pH值为7.2～7.5，其含有浓度3～12mg/ml的胶原蛋白，所述胶原蛋白为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白中的一种或一种以上的混合物。
进一步设置：所述混合溶液的pH值为7.2～7.5，其含有浓度为3～12mg/ml的胶原蛋白和10mg/ml～80mg/ml的透明质酸，所述胶原蛋白为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白中的一种或一种以上的混合物。
进一步设置：所述脱细胞基质溶液采用动物来源的器官组织来制备，先将动物来源的器官组织剪成小块，用含有0.01％～0.04％胰酶和0.03％～0.07％乙二胺四乙酸溶液搅拌1～4h，再用2％～5％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液浸泡搅拌1～4h，接着再浸泡于3％～6％的脱氧胆酸钠溶液中1～4h，将浸泡结束后的脱细胞的小块支架冷冻干燥并研磨成粉末，再用盐酸胃蛋白酶消化48h～96h后，即可配置成3～12mg/ml的脱细胞基质溶液。
进一步设置：对覆层后的网状片层通过加入20～50mmol/ml赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中至少一种进行封闭。
进一步设置：获得所述生物活性物质覆层聚酯网状片层支架后，进行辐照灭菌处理后于4℃下保存。
相比现有技术，本申请的方案具有以下优点：
在本申请的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法中，通过对聚酯材料进行纺粘、加工制作成网状片层，并对所述网状片层进行羧基化、活化交联、偶联和封闭四个步骤来实现覆层，通过调整参数来实现仿生细胞外基质与合成高分子聚酯材料的共价连接，无需等离子表面处理机等特殊设备，同时也不引入有毒化学物质，保证生物制品生产的安全质量。并且制成的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架将合成聚酯高分子材料具备一定的机械性能、可塑性的优势与天然高分子材料良好的生物相容性相结合，为细胞培养提供仿生的培养环境，促进反应器内细胞的黏附、生长增殖和功能活性维持，同时覆层后聚酯片层支架具有更高的孔隙率和比表面积，利于传质能满足生产时对细胞高质量、高密度、长时间功能维持的要求，能够成为灌注(填充)床/支架反应器细胞理想的装载材料。
本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
本申请上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1本申请的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法的工艺流程图；
图2为未经生物活性物质覆层的对苯二甲酸乙二醇酯网状片层支架材料的XPS分析结果；
图3为经胶原蛋白覆层后的对苯二甲酸乙二醇酯网状片层支架材料的XPS分析结果；
图4为生物活性物质覆层前后网状片层支架材料的FTIR谱图；
图5为生物活性物质覆层前后网状片层支架材料的比表面积的测定结构；
图6为生物活性物质覆层前后网状片层支架材料的孔隙率测定结果；
图7为覆层后的网状片层支架材料培养的C3A肝细胞在第7天时扫描电镜下观察到的图像；
图8为覆层后的网状片层支架材料培养的间充质干细胞在第7天时扫描电镜下观察到的图像；
图9为C3A肝细胞经覆层前后网状片层支架材料培养后功能活性表达的差异的ELISA检测图像。
具体实施方式
下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能解释为对本申请的限制。
本申请涉及一种仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架，其通过仿生细胞外基质成分来构建模拟细胞体内生长微环境，具有良好的结构稳定性和机械性能，适于贴壁细胞体外的大规模三维培养，能够实现细胞规模化培养并促进细胞生物活性和功能维持。
所述仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架(以下简称“覆层聚酯网状片层支架”)包括网状片层及覆盖在所述网状片层表面的生物活性物质覆层，所述网状片层采用聚酯材料制成，且所述网状片层的表面经羧基化后可经过多次偶联以形成生物活性物质覆层，同时在所述生物活性物质覆层外还设有封闭层。
具体地，形成网状片层的聚酯材料包括聚己内酯、碳酸聚酯、对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二酯、局对苯二甲酸丙二酯、聚对苯二甲酸-1,4-环己二甲酯纤维及聚-2,6-萘二酸乙二酯中的一种或多种的组合物，并通过纺粘、加固等手段将上述聚酯材料制成网状片层，该网状片层的厚度为100～500μm，且该网状片层的单根网状纤维的直径为25～35μm，孔隙率在45％～85％之间，使得本申请的网状片层具有良好的柔性和可塑性，方便拿取、塑形，从而可将所述网状片层设计成任意大小的形状，并可通过折叠成一定角度来增大材料在反应器内的堆叠面积，以便于后续的覆层处理，可在有限的空间内增大细胞的生长面积，实现细胞的高密度培养。
所述网状片层在进行覆层前需经过羧基化处理和活化交联处理，具体可将清洗好的网状片层浸泡在强碱性溶液中，使得聚酯材料的酯基断裂以暴露羧基，然后再将羧基化后的网状片层浸泡入MES溶液(0.1molMES+0.5mol氯化钠，pH为4.7～6.0)中进行活化，然后在将EDC和NHS按比例加入到所述MES溶液中以进一步活化和交联，且所述EDC的最终浓度为2～5mmol/ml，EDC和NHS的比例可为1:2～1:9，通过上述活化和交联的步骤，可调节所述网状片层的羧基至活泼状态，同时增强羧基后续联结的强度，以通过对所述网状片层进行活化和交联来实现仿生细胞外基质生物活性物质与聚酯合成高分子材料的共价连接，继而在所述网状片层上形成生物活性物质覆层。
所述生物活性物质覆层为依次经过胶原蛋白溶液、含有胶原蛋白与透明质酸的混合溶液及脱细胞基质溶液偶联而成，其中，所述胶原蛋白溶液的pH为7.2～7.5，浓度为3～12mg/ml，且所述胶原蛋白溶液中的胶原蛋白为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白中的一种或一种以上的混合物，例如，Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白混合且两者的比例为3:1～1:3；所述混合溶液含有浓度为3～12mg/ml的上述胶原蛋白和10mg/ml的透明质酸，且该混合溶液pH亦为7.2～7.5；所述脱细胞基质溶液采用动物来源的肝脏、肾脏、心脏或脐带等制成，具体通过将动物器官组织修剪成小块，用含有0.01％～0.04％胰酶和0.03％～0.07％EDTA溶液搅拌1～4h，然后用2％～5％Triton X-100浸泡搅拌1～4h，接着再浸泡于3％～6％的脱氧胆酸钠溶液中1～4h，从而可得到脱细胞基质支架，再对该脱细胞基质支架进行冷冻干燥并研磨成粉末状，用盐酸胃蛋白酶消化48～96h后，随后可配置成3～12mg/ml的脱细胞基质溶液。所述网状片层经三次偶联覆层，所述胶原蛋白溶液、混合溶液及脱细胞基质溶液中的胶原蛋白与所述网状片层表面羧基联结可在所述网状片层表面形成包含有三种不同活性物质的网架结构，使得本申请的聚酯网状片层能够获得更高的孔隙率和比表面积，还能够满足细胞在生产时的高质量、高密度以及长时间功能维持的要求，使得本申请的覆层聚酯网状片层支架具有良好的生物相容性，有利于细胞黏附、促进细胞分化增值及维持细胞功能。
此外，所述网状片层在进行覆层前需经过羧基化处理，具体可将经过清洗后的网状片层浸泡入MES溶液(0.1molMES+0.5mol氯化钠，pH为4.7～6.0)中进行活化，然后在将EDC和NHS按比例加入到所述MES溶液中以进一步活化和交联，且所述EDC的最终浓度为2～5mmol/ml，EDC和NHS的比例可为1:2～1:9。
所述网状片层在覆层后可通过加入20mmol/ml赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中至少一种以在其表面形成封闭层，所述封闭层利用赖氨酸、精氨酸及甘氨酸等氨基酸分子抢占覆层可以发生化学反应的基团位置，从而钝化所述覆层的活性，避免所述覆层的消耗，延长所述覆层的寿命。
本申请的仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架通过在网状片层上进行仿生细胞外基质覆层来模拟细胞机体体内的生理环境构建三维培养体系，使得所构建的生理环境接近于细胞机体实际的生理环境，所述网状片层经过三次偶联，即在所述网状片层通过羧基共价连接三种不同的活性物质，具体包括由Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原、纤维联结蛋白等蛋白以及透明质酸和硫酸乙酰肝素等糖胺聚糖以及多种细胞生长因子，以在所述网状片层外构成仿生细胞外基质生物活性物质的覆层，能够支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动，可以影响细胞的形态、增殖、功能、存活、分化、迁移等一切生命现象。通过将细胞培植在本申请构建的仿生细胞外基质生物活性物质的网架结构中，利用该覆层充当细胞的生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维特异性结构，最大程度地模拟体内状态。同时，所述网状片层可为其外部构建的仿生细胞外基质生物活性物质的覆层提供支撑，使得本申请的仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架具有良好的结构稳定性和机械性能，具有良好的力学性能，可以实现细胞的体外三维培养。
综上，本申请的仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架将合成聚酯高分子材料具备一定的机械性能、可塑性的优势与天然高分子材料良好的生物相容性相结合，使得本申请的支架不仅具有一定的机械强度和良好的生物相容性，为细胞培养提供仿生的培养环境，促进反应器内细胞的黏附、生长增殖和功能活性维持，同时覆层后聚酯片层支架具有更高的孔隙率和比表面积，利于传质能满足生产时对细胞高质量、高密度、长时间功能维持的要求，能够成为灌注(填充)床/支架反应器细胞理想的装载材料。
本申请还涉及一种生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，具体为上述仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，请结合图1，具体包括以下步骤：
(1)将聚酯材料通过纺粘、加固为网状片层。
优选地，本实施例中的聚酯材料包括包括聚己内酯、碳酸聚酯、对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二酯、局对苯二甲酸丙二酯、聚对苯二甲酸-1,4-环己二甲酯纤维及聚-2,6-萘二酸乙二酯中的一种或多种组合物，将上述聚酯材料通过纺粘、加固的加工手段制成网状片层。本实施例所制成的网状片层的厚度为100～500μm，孔隙率在45％～85％之间，单根网状纤维的直径为25～35μm，本实施例的网状片层具备一定的柔和型和可塑性，便于在后续加工中方便拿取、塑形和在反应器内堆叠。本申请可将成型的网状片层设计成任意大小的形状，还可折叠成一定角度来增大网状片层在反应器内的堆叠面积。
(2)对所述网状片层进行清洗和干燥。
将上述网状片层分别用乙醇、丙酮和超纯水各清洗8～15min，以除去所述网状片层表面的有机杂质和水溶性杂质，再在40℃～80℃下干燥过夜。
(3)利用强碱性溶液对清洗干燥完毕的网状片层进行羧基化处理。
将上述清洗、干燥后的网状片层浸泡在强碱性溶液中20～50min，以断裂聚酯网状片层的酯基而暴露羧基。
优选地，本实施例中的强碱性溶液溶质为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的至少一种，且该强碱性溶液包含有以质量体积百分比计的溶质％～20％。
(4)对所述网状片层进行活化和交联。
首先，将上述羧基化处理后的网状片层浸泡在2-(N-吗啉代)乙磺酸(简称“MES”)溶液中进行一次活化，活化时间为30min～4h。优选地，本实施例的MES溶液中包括0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸和0.5mol/L的氯化钠，并将所述MES的pH调至4.6～6.0。
随后，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC，为可溶于水的碳二亚胺)和N-羟基琥珀酰亚胺(简称“NHS”)按比例加入到上述MES溶液中，其中，EDC常用作羧基的活化试剂以及活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联，NHS常用于生物偶联和交联，通过联用EDC和NHS可有效地促进偶联效率。优选地，EDC在所述MES中的最终浓度为2～5mmol//ml，且EDC和NHS的比例范围在1:2～1:9之间，从而对所述网状片层进行二次活化和交联，反应时间为15min～3h，以将所述网状片层的羧基活化至最佳状态，便于与仿生细胞外基质进行偶联。
此外，上述的二次活化及交联的过程中，通过在所述MES溶液中加入2-巯基乙醇即可终止活化及交联反应，以进行下一个步骤。
(5)对所述网状片层进行多次偶联以在网状片层上形成生物活性物质覆层。
在本实施例中，通过对所述网状片层进行三次偶联在所述网状片层上形成生物活性物质覆层，具体分为三个阶段：
首先，配置胶原蛋白溶液，该胶原蛋白溶液含有浓度为3～12mg/ml的胶原蛋白，且所述胶原蛋白为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白中的一种或一种以上的混合物，例如Ⅰ型胶原蛋白:Ⅲ型胶原蛋白的比例为3:1～1:1，同时将所述胶原蛋白溶液的pH值调节至7.2～7.5。将活化后的网状片层投入到所述胶原蛋白溶液中与所述胶原蛋白进行一次偶联，偶联时间为30min～4h，即可将所述胶原蛋白通过其氨基与羧基共价连接以偶联到所述网状片层上。
随后，对所述网状片层进行二次偶联处理。具体地，配置含有浓度为3～12mg/ml的胶原蛋白和10～80mg/ml糖胺聚糖的混合溶液，本实施例中的糖胺聚糖优选采用透明质酸，所述胶原蛋白与上述一次偶联阶段中的胶原蛋白相同，并将所述混合溶液的pH值调节至7.2～7.5。将上述一次偶联后的网状片层投入到所述混合溶液中以与所述胶原蛋白和所述糖胺聚糖进行二次偶联，偶联时间为30min～4h，即可将所述胶原蛋白和糖胺聚糖偶联到所述网状片层上。
最后，对所述网状片层进行三次偶联处理。具体地，配置三次偶联所需的脱细胞基质溶液，所述脱细胞组织溶液是采用物理、化学、酶解等方法对组织或器官去除细胞成分，保留细胞外基质的结构和成分的溶液，细胞外基质是组织和器官的细胞分泌到胞外的复合物，其是结构蛋白和功能蛋白的复合体，包含有Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤维联结蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖和多种细胞生长因子等，则通过脱细胞组织溶液的三次偶联可在所述网状片层上形成脱细胞基质凝胶覆层。
优选地，本申请的脱细胞组织溶液采用动物来源的器官组织作为组织材料来制备，例如肝脏、肾脏、心脏或脐带等，先将动物来源的器官组织剪成小块，用含有0.01％～0.04％胰酶和0.03％～0.07％乙二胺四乙酸溶液(EDTA)搅拌1～4h，再用2％～5％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液(TritonX-100)浸泡搅拌1～4h，接着再浸泡于3％～6％的脱氧胆酸钠溶液中1～4h，将浸泡结束后的脱细胞的小块支架冷冻干燥并研磨成粉末，再用盐酸胃蛋白酶消化48h～96h后，即可配置成3～12mg/ml的脱细胞基质溶液。将上述二次偶联后的网状片层放入到所述脱细胞基质溶液中以与其胶原蛋白进行偶联，偶联时间为30min～4h。
经过上述三个阶段的不同溶液的偶联，可在所述网状片层上形成三种不同材料的覆层，每种覆层的活性物质不同，并具有不同的功能。
(6)对覆层后的网状片层进行封闭，得到所述生物活性物质覆层聚酯网状片层支架。
对覆层后的网状片层通过加入20～50mmol/ml的赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中至少一种进行封闭，以对所述网状片层的覆层起到保护的作用，封闭完成后即可获得本申请的仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架。
最后，可将获得的仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架进行10～20kGy电子束辐射灭菌处理后，于4℃下进行保存。
本申请的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法通过对聚酯材料进行纺粘、加工制作成网状片层，并对所述网状片层进行羧基化、活化交联、偶联和封闭四个步骤来实现覆层，通过调整参数来实现仿生细胞外基质与合成高分子聚酯材料的共价连接，无需等离子表面处理机等特殊设备，同时也不引入有毒化学物质，保证了生物制品生产的安全质量。
此外，将本申请细胞培养用仿生细胞外基质生物活性物质覆层聚酯网状片层支架进行相关测试，并将其用于动物细胞培养试验，本申请的聚酯网状片层以对苯二甲酸乙二醇酯网状片层为示例，结果显示：
将仿生细胞外基质生物活性物质覆层的对苯二甲酸乙二醇酯网状片层支架材料进行X射线光电子能谱(XPS)分析和傅里叶红外(FTIR)分析，分别得到如图1～图5结果。其中，图2为未经生物活性物质覆层的对苯二甲酸乙二醇酯网状片层支架材料的XPS分析结果，材料主要由C元素和O元素组成。图3为经Ⅰ型胶原蛋白:Ⅲ型胶原蛋白为3:1的胶原蛋白覆层后的对苯二甲酸乙二醇酯网状片层支架材料的XPS分析结果，N元素出现在材料的主要成分中，提示生物活性物质与材料已实现共价连接。图4为生物活性物质覆层前后网状片层支架材料的FTIR谱图，A曲线代表未覆层，B曲线代表覆层后，两者有明显的差异，B曲线在1550cm-1、1665cm-1和3330cm-1附近均出现胶原蛋白的特征吸收峰(AmidⅡ、AmidⅠ和AmidA)，进一步提示生物活性物质与材料已实现共价连接。图5和图6分别为生物活性物质覆层前后网状片层支架材料的比表面积和孔隙率测定结果，其中A为未覆层，B代表覆层后，可见覆层后网状片层支架材料的比表面积和孔隙率显著提高。
再将生物活性物质覆层前后的材料填充入在先构建的循环灌注式细胞培养系统及其生物反应器(ZL201510738480.6)进行肝细胞和间充质干细胞规模化培养，图7和图8分别显示覆层后的网状片层支架材料培养C3A肝细胞和间充质干细胞第7天时在扫描电镜下观察到的图像，可见大量细胞生长并紧密贴附在材料上，细胞与细胞之间连接紧密，部分细胞呈现出类组织聚团生长的征象。进一步评价C3A肝细胞经胶原蛋白覆层前后网状片层支架材料培养后功能活性表达的差异，于第1、3和5天分别收集培养基上清，进行ELISA检测，结果如图9所示，其中A为未覆层，B代表覆层后，结果显示细胞在覆层后的网状片层支架材料白蛋白分泌量显著高于未覆层的网状片层支架材料，覆层后的网状片层支架材料利于促进细胞分化和功能表达。
以上所述仅是本申请的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (11)

1.一种生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将聚酯材料通过纺粘、加固为网状片层，所述网状片层的厚度为100～500μm，且该网状片层的单根网状纤维的直径为25～35μm，孔隙率在45％～85％之间；
对所述网状片层进行清洗和干燥；
利用强碱性溶液对清洗干燥完毕的网状片层进行羧基化处理；
对所述网状片层进行活化和交联；
配置胶原蛋白溶液，将所述网状片层投入所述胶原蛋白溶液中进行一次偶联，反应时间为30min～4h，配置包含有胶原蛋白和糖胺聚糖的混合溶液，将上述一次偶联后的网状片层投入到所述混合溶液中进行二次偶联，反应时间为30min～4h，配置脱细胞基质溶液，将上述二次偶联后的网状片层投入到所述脱细胞基质溶液中进行三次偶联，反应时间为30min～4h，以在所述网状片层进行多次偶联以在网状片层上形成生物活性物质覆层；
对覆层后的网状片层进行封闭，得到所述生物活性物质覆层聚酯网状片层支架。
2.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，所述聚酯材料包括聚己内酯、碳酸聚酯、对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二酯、局对苯二甲酸丙二酯、聚对苯二甲酸-1,4-环己二甲酯纤维及聚-2,6-萘二酸乙二酯中的一种或多种组合物。
3.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，对所述网状片层进行清洗和干燥包括以下步骤：分别用乙醇、丙酮和超纯水对所述网状片层进行超声波清洗，清洗时间各8～15min，再在40℃～80℃下干燥过夜。
4.根据权利要求3所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，利用强碱性溶液对清洗干燥完毕的所述网状片层进行羧基化处理包括以下步骤：将清洗干燥后的所述网状片层浸泡在强碱性溶液中20～50min，以断裂所述网状片层的酯基暴露羧基，所述强碱性溶液的溶质为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的至少一种，且所述强碱性溶液中含有以质量体积百分比计的溶质5％～20％。
5.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，对所述网状片层进行活化和交联包括以下步骤：
将羧基化处理后的网状片层浸入2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液中进行一次活化，反应时间为30min～4h；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按比例加入到2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液中进行二次活化和交联，反应时间为15min～3h；
最后加入2-巯基乙醇来终止上述活化和交联反应。
6.根据权利要求5所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2～5mmol/ml，且所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比例范围为1:2～1:9。
7.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白溶液的pH值为7.2～7.5，其含有浓度3～12mg/ml的胶原蛋白，所述胶原蛋白为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白中的一种或一种以上的混合物。
8.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，所述混合溶液的pH值为7.2～7.5，其含有浓度为3～12mg/ml的胶原蛋白和10mg/ml～80mg/ml的透明质酸，所述胶原蛋白为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白中的一种或一种以上的混合物。
9.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质溶液采用动物来源的器官组织来制备，先将动物来源的器官组织剪成小块，用含有0.01％～0.04％胰酶和0.03％～0.07％乙二胺四乙酸溶液搅拌1～4h，再用2％～5％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液浸泡搅拌1～4h，接着再浸泡于3％～6％的脱氧胆酸钠溶液中1～4h，将浸泡结束后的脱细胞的小块支架冷冻干燥并研磨成粉末，再用盐酸胃蛋白酶消化48h～96h后，即可配置成3～12mg/ml的脱细胞基质溶液。
10.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，对覆层后的网状片层通过加入20～50mmol/ml赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中至少一种进行封闭。
11.根据权利要求1所述的生物活性物质覆层聚酯网状片层支架的制备方法，其特征在于，获得所述生物活性物质覆层聚酯网状片层支架后，进行辐照灭菌处理后于4℃下保存。
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