CN103006359A - 仿生三维立体组织工程支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
仿生三维立体组织工程支架，由高分子纤维膜负载活性生长因子构成，或由高分子纤维膜与大孔海绵层组成的复合支架上负载活性生长因子构成。本发明克服了乳液电纺纤维膜负载活性分子浓度低的问题，将乳液电纺纤维膜与大孔海绵或混合电纺工艺相结合，极大地提高了活性因子的负载率；部分因子通过乳液电纺的核壳结构，保留在纤维内部，实现了对释放时间的有效控制，及修复过程进行的长期调控。活性分子在支架中的引入，为新生细胞增殖、定向分化、细胞迁移粘附、捕获干细胞从而诱导新生组织的再生功能起到了引导、促进作用，为再生医学产业的发展提供了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料，特别涉及对组织具有长期诱导再生作用的仿生三维立体组织工程支架及其制备方法。
背景技术
对于复杂、大面积创伤的修复不仅仅需要依靠支架材料，同时也需要生长因子对细胞分化、组织发育过程中特殊结构的形成进行调节。由于蛋白和基因的不稳定性，传统蛋白质或基因药物剂型，例如针剂，并不利于长时间内保持蛋白质与基因的结构以及活性。同时，生长因子在有水及酶环境下很容易失去生物学活性。所以直接使用生长因子时常会面临生物学活性保持时间短的困境，达不到所期望的生物学效率。因此，一个成功的组织工程支架需要在为细胞生长提供空间的同时，与控制释放系统相结合，以组织工程支架作为生长因子的载体，在组织再生的过程中对生长因子的局部释放及释放时间进行控制，达到促进细胞增殖、组织修复的目的。
药物控释型组织工程支架的制备方法主要分为吸附方式和包裹方式。以吸附方式将药物携载于组织工程支架的方法，是将蛋白类或基因类药物通过化学接枝法或电相互作用的方法固定于已制备好的支架上。这种支架携载药物面临的问题是，在组织修复过程时生物活性大分子直接与组织液相接触，药物的扩散速度过快，以及易于被酶类物质降解，不利于对修复过程进行长期调控。以包裹方式制备载药组织工程支架的方法是指，将药物直接与构成支架的聚合物混合，再进行支架制备。以包裹方式载药支架主要包括水凝胶支架、多孔支架、微球支架以及静电纺纤维支架。这种携载方式主要面临的难题是制备过程对蛋白及基因的结构完整性和生物学活性的保持。
静电纺丝技术是目前唯一能够直接、连续制备纳米或微米级聚合物纤维的技术。近年来，这项技术被越来越多的应用于药物传递系统以及组织工程支架的制备，与其它的载药剂型与组织工程支架制备技术相比，静电纺纤维主要有以下几个特点：(1)超细纤维具有小尺寸、大比表面积的特点，为细胞生长提供更多的表面，也可以提高药物的携载效率；(2)可以将药物以共混、包裹或吸附的方式携载于超细纤维上，不同的携载和释放机制可以满足不同药物和疾病治疗的要求；(3)超细纤维较好的模拟了ECM的结构，杂乱排列和定向排列的纤维可以满足不同结构组织的要求；(4)纤维膜高孔隙率，利于营养物质和代谢产物的输送，纤维间较弱的作用力，利于细胞在整个支架中的迁移；(5)通过调节聚合物材料以及电纺参数，易于满足纤维对基质材料、应用形状的要求；(6)将生物活性分子控释纤维应用于组织工程支架中，可以在组织修复中释放生物学信号，调控组织再生的过程。相比于混纺工艺，同轴电纺及乳液电纺等技术因将药物包裹在纤维内部，充分保持了药物活性且避免了药物突释的问题。以同轴共纺法制备包裹蛋白质或基因的芯壳纤维时，由于蛋白或基因的水溶液与聚合物溶液分装在两个容器中同时纺丝，减少了与有机溶剂的接触，因此有利于提高稳定性。但是由于蛋白质和基因溶液本身的粘度过低，不具备可纺性，因此通过同轴共纺技术获得具有完整芯壳结构的载蛋白或基因的芯壳纤维就具有更为苛刻的实验参数。另外，同轴共轭电纺毕竟是一个动态的过程，受许多因素的影响，例如核壳部位两种溶液的流速、界面张力、两种聚合物溶液的粘度等，从而使其无法制备出理想的核壳结构。除此之外，复杂的仪器要求和苛刻的控制参数的选择同样使其应用受到限制。而在乳液电纺过程中，蛋白或基因溶液仅需要与纤维载体材料简单乳化，即可以普通电纺装置纺制成芯壳结构纤维。细胞色素酶C和NGF等都被使用乳液电纺的方法包裹于聚合物芯壳纤维中，并不会对蛋白质的结构和功能造成明显的影响。因此，乳液电纺制备药物负载的核壳结构纳米纤维得到尤为广泛的关注。
乳液电纺法是将水溶性的药物溶液分散于聚合物有机溶液中，制备稳定的油包水微乳液，再使用普通的静电纺丝设备获得芯壳纤维的技术。对油包水乳液进行电纺的过程中，油包水液滴在电场作用下拉伸成丝，内外层溶剂的挥发使得液滴从表面向芯层垂直方向浓缩，由于有机溶剂的挥发速度快于内层水相的挥发速度，纤维外层的粘度增加大大快于内层，这种粘度的区别使得纤维具有芯壳的结构，并且被包裹的药物主要存在于纤维内部而不是表面。纤维的芯壳结构可在整个释放持续时间内保护药物的结构和生物活性。Xu等最早使用乳液静电纺丝的方法将聚氧化乙烯(PEO)与盐酸阿霉素(Dox)共混包裹于聚乳酸一聚乙二醇共聚物(PELA)纤维内部，制备了芯壳结构的PEO-Dox/PELA纤维，并研究了Dox在芯壳纤维中的释放行为以及对肿瘤细胞的毒性作用，研究结果表明芯壳结构纤维在释放过程中保护了Dox的生物学活性，对神经胶质瘤细胞具有明显的杀伤作用。清华大学的齐宏旭等人用此法从水/油和油/水乳液中制得了具有“水珠挂线”结构的复合材料纤维，他们用钙藻酸盐微球作为亲水性药物载体，对牛血清白蛋白(BSA)进行载药。纤维的主体由生物降解性的聚(L-乳酸)(PLLA)构成，亲水性蛋白质则进入水珠挂线结构的水珠部分。体外释放实验表明，经过这样处理的纤维，释药时问增加，突释速率也低于裸露的钙藻酸盐微球。然而对于乳液电纺来说，为确保电纺乳液的稳定性，药物负载率往往偏低。
发明内容
本发明的目的之一是提供具有高效负载活性生长因子、良好生物相容性、足够的力学强度、可生物降解、生长因子可控释放，具有促进新生组织再生功能的仿生三维立体组织工程支架。
本发明的目的之二是提供上述仿生三维立体组织工程支架的制备方法。
本发明的目的之三是提供活性生长因子在支架中的高效负载方法，即支架对活性生长因子的吸附与包裹相结合的负载方法。
本发明的目的之四是活性生长因子包裹负载方式中涉及的乳液电纺及吸附负载方式中混合电纺技术或大孔海绵的制备技术。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种仿生三维立体组织工程支架，包括由生物高分子物质通过静电纺丝形成的高分子纤维膜，高分子纤维膜上负载有活性生长因子，以生物高分子物质为100重量份计，活性生长因子为0-0.1重量份但不为零；所述高分子纤维膜是由生物高分子物质通过静电纺丝形成的纳米纤维膜，或由生物高分子物质与亲水性生物高分子物质通过静电纺丝形成的复合纳米纤维膜，活性生长因子均匀分布在纳米纤维膜内部。
一种仿生三维立体组织工程支架，包括由生物高分子物质通过静电纺丝形成的高分子纤维膜，在高分子纤维膜上覆盖有一层大孔海绵层，在高分子纤维膜和大孔海绵层上负载有活性生长因子；所述高分子纤维膜是由生物高分子物质通过静电纺丝形成的纳米纤维膜，或由生物高分子物质与亲水性生物高分子物质通过静电纺丝形成的复合纳米纤维膜；以生物高分子物质为100重量份计，活性生长因子为0-0.1重量份但不为零；所述100重量份生物高分子物质中，用于形成高分子纤维膜的生物高分子物质为50-100重量份但不为100，用于形成大孔海绵层的生物高分子物质为0-50重量份但不为零。
上述仿生三维立体组织工程支架，其中，用于形成高分子纤维膜的生物高分子物质的分子量为5～20万，选自乳酸-羟基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己内酯或聚乙交酯中的一种或几种的混合物；
用于形成高分子纤维膜的亲水性生物高分子物质和用于形成大孔海绵层的生物高分子物质的分子量为5～100万，选自透明质酸、丝蛋白、硫酸软骨素、肝素、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、核酸、血清纤维结合蛋白或多肽中的一种或几种的混合物；
活性生长因子选自表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子bFGF、内皮细胞生长因子VEGF、转化生长因子TGF-β、胰岛素样生长因子IGF、CD31抗体、CD24抗体、层粘连蛋白、趋化因子SDF-1、神经细胞生长因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生长肽OPG、血小板衍生生长因子PDGF、富血小板血浆(PRP)、含多种生长因子的富血小板血浆中的一种或几种的混合物。
一种仿生三维立体组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
a、将生物高分子物质溶解在第一溶剂中，然后加入表面活性剂和活性生长因子，得到高分子纺丝液；或将生物高分子物质和亲水性生物高分子物质的混合物溶解在第二溶剂中，然后加入活性生长因子，得到高分子纺丝液；
b、选用多喷头或单喷头纺丝装置，将步骤a所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝，得到可作为仿生三维立体组织工程支架的负载有活性生长因子的高分子纤维膜，纤维直径为50nm～5000nm。
一种仿生三维立体组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
a、将生物高分子物质溶解在第一溶剂中，然后加入表面活性剂和活性生长因子，得到高分子纺丝液；或将生物高分子物质和亲水性生物高分子物质的混合物溶解在第二溶剂中，然后加入活性生长因子，得到高分子纺丝液；
b、选用多喷头或单喷头纺丝装置，将步骤a所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝，得到高分子纤维膜，纤维直径为50nm～5000nm；
c、在步骤b所获得的高分子纤维膜上涂覆一层2％的明胶粘稠水溶液，然后将纤维膜冷冻干燥，然后置于第一交联剂溶液中进行交联反应过夜，用大量的去离子水浸泡冲洗，得到高分子纤维膜上覆盖大孔海绵层的复合支架；
或者将步骤b所获得的高分子纤维膜浸泡到第一交联剂溶液中，于室温反应6～12小时后，再在纤维膜表面上涂覆一层2％的明胶粘稠水溶液，然后将纤维膜冷冻干燥，然后置于第一交联剂溶液中进行交联反应过夜，用大量的去离子水浸泡冲洗，得到高分子纤维膜上覆盖大孔海绵层的复合支架；
d、将步骤c所获得的复合支架浸泡于含有活性生长因子的溶液中，然后取出置于真空干燥机中抽干水分，即得到负载有高浓度活性生长因子的仿生三维立体组织工程支架。
一种仿生三维立体组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
a、将生物高分子物质溶解在第一溶剂中，然后加入表面活性剂和活性生长因子，得到高分子纺丝液；或将生物高分子物质和亲水性生物高分子物质的混合物溶解在第二溶剂中，然后加入第二交联剂溶液，得到高分子纺丝液；
b、选用多喷头或单喷头纺丝装置，将步骤a所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝，得到高分子纤维膜，纤维直径为50nm～5000nm；
c、在步骤b所获得的高分子纤维膜上涂覆一层2％的明胶粘稠水溶液，然后将纤维膜冷冻干燥，然后置于第一交联剂溶液中进行交联反应过夜，用大量的去离子水浸泡冲洗，得到高分子纤维膜上覆盖大孔海绵层的复合支架；
d、将步骤c所获得的复合支架浸泡于含有活性生长因子的溶液中，然后取出置于真空干燥机中抽干水分，即得到负载有高浓度活性生长因子的仿生三维立体组织工程支架。
上述仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其中，用于形成高分子纤维膜的生物高分子物质的分子量为5～20万，选自乳酸-羟基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己内酯或聚乙交酯中的一种或几种的混合物；
用于形成高分子纤维膜的亲水性生物高分子物质和用于形成大孔海绵层的生物高分子物质的分子量为5～100万，选自透明质酸、丝蛋白、硫酸软骨素、肝素、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、核酸、血清纤维结合蛋白或多肽中的一种或几种的混合物；
活性生长因子选自表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子bFGF、内皮细胞生长因子VEGF、转化生长因子TGF-β、胰岛素样生长因子IGF、CD31抗体、CD24抗体、层粘连蛋白、趋化因子SDF-1、神经细胞生长因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生长肽OPG、血小板衍生生长因子PDGF、富血小板血浆、含多种生长因子的富血小板血浆中的一种或几种的混合物。
上述仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其中，所述第一溶剂选自1，2-二氯甲烷、二甲苯、氟代试剂、氯仿、DMF、THF中的一种或几种；所述第二溶剂选自水、氟代试剂或水与乙酸、乙醇、DMF、甘油的混合溶剂；所述表面活性剂选自司盘或吐温。
上述仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其中，所述第一交联剂溶液是由碳二亚胺与丙酮和水的混合溶剂新配制的溶液，温度为4℃，其中碳二亚胺的浓度为50mM～200mM，丙酮和水的混合溶剂中，丙酮与水的重量比为80∶20；所述第二交联剂溶液为新配制的碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，其中碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔质量比为1∶3。
上述仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其中，所述的静电纺丝的工艺条件为：溶液的供料速率为5～50ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为8～20cm；环境温度为20～50℃；静电压为10～30kV。
本发明基于生长因子对细胞分化、组织发育过程中特殊结构形成的促进作用，将生长因子负载于可降解生物聚合物组织工程支架中，设计构建了具有良好生物相容性、足够的力学强度、可生物降解、生长因子可控释放，具有促进新生组织再生功能的仿生三维立体组织工程支架。其中，为克服乳液电纺膜负载因子浓度低的问题，本发明将药物包裹与吸附两种负载方式相结合，即在乳液电纺纤维膜的基础上引入了负载高浓度生长因子的冷冻海绵层或可高浓度负载因子的混合电纺工艺。这种携载方式不仅为细胞生长提供了适宜生长的空间，而且制备过程保持了所负载活性生长因子的结构完整性和生物学活性。支架中，纤维内部及吸附于海绵层或分布于水溶性电纺纳米纤维表面生长因子不同的缓释机制，可协调组织再生过程中的不同需求，满足了对修复过程进行的长期调控。在组织再生的过程中，对生长因子的局部释放及释放时间进行控制，可促进细胞增殖、组织修复的目的。
本发明克服了乳液电纺纤维膜负载活性分子浓度低的问题，将乳液电纺纤维膜与大孔海绵或混合电纺工艺相结合，极大地提高了活性因子的负载率；解决了混合电纺工艺及支架吸附活性因子初期存在的大量突释导致的后期无法供应的问题，部分因子通过乳液电纺的核壳结构，保留在纤维内部，实现了对释放时间的有效控制，及修复过程进行的长期调控。大孔海绵层的引入在一定程度上为新生组织的再生提供了更好的生长空间及表面接触环境。而纤维支架的存在又充分保证了支架的力学支撑。活性分子在支架中的引入，为新生细胞增殖、定向分化、细胞迁移粘附、捕获干细胞从而诱导新生组织的再生功能起到了引导、促进作用。本发明给予通过支架材料自身性能的功能性实现受损组织的再生与重建，为再生医学产业的发展提供新思路和新途径。
附图说明
图1是本发明实施例1新乳液电纺含活性生长因子纳米纤维SEM；
图2是本发明实施例1中乳液电纺含活性生长因子纳米纤维的荧光图像；
图3是本发明实施例3的复合支架表面大孔海绵形貌图；
图4是本发明实施例2的支架中细胞密度图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)将0.40克聚己内酯(PCL，分子量6万)溶解在3.5ml的1，2-二氯甲烷和0.5ml的二甲苯中，并用移液枪滴入20微升的司盘。在磁力搅拌下使PCL完全溶解后，滴入250微升的富含活性生长因子的PRP(含有5％的dextran作为保护剂)。在磁力搅拌下搅拌45分钟。同时将明胶(GE，分子量10万)与成纤维细胞生长因子bFGFb、内皮细胞生长因子VEGF溶解在三氟代乙醇中，配制成总浓度为12w/v％的混合溶液，其中活性生长因子的占固体份的0.05％。
(2)选用单喷头纺丝装置，将步骤(1)的含有PRP的PCL电纺乳液与明胶和活性因子的混合溶液分别装入两个不同的输液通路中，调整溶液的供料速率为20ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为25cm；环境温度为25℃；静电压为24kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收的高分子纤维膜材料。纤维直径为400-1000nm(见图1和图2)；
(3)待消毒灭菌后，将步骤(2)制备的高分子纤维膜材料置于新西兰大白兔皮肤缺损处，以不做处理的皮肤缺损做对照。结果随时间增加，白色纤维膜移植物逐渐降解，创面及移植物新鲜湿润，用纤维膜治疗组创面愈合时间比对照组短，两组新西兰大白兔伤口愈合时间分别为16天和20天，3w左右移植物完全形成新生皮肤；冰冻切片HE染色结果显示形成的新生皮肤结构和正常皮肤基本相同，形成了正常的表皮层、皮下组织层及真皮层，并可见有皮肤附属器——毛发、皮脂腺、汗腺等形成。
实施例2
(1)将0.40克聚乙丙交酯(PLGA，分子量10万)溶解在8mL的三氯甲烷中，并用移液枪滴入50微升的司盘80。在磁力搅拌下使PLGA完全溶解后，滴入250微升的PRP(含有5％的dextran作为保护剂)。在磁力搅拌下搅拌45分钟。同时将明胶(GE，分子量10万)、透明质酸(HA，分子量50万)与成纤维细胞生长因子bFGFb、内皮细胞生长因子VEGF溶解在DMF和水体积比为1∶1的混合溶剂中，其中固定透明质酸浓度为1％；透明质酸与明胶的质量比为100∶20；活性分子所占固体份的0.08％。
(2)选用单喷头纺丝装置，将步骤(1)的含有PRP的PLGA电纺乳液与明胶/透明质酸/活性因子的混合溶液分别装入两个不同的输液通路中，调整溶液的供料速率为20ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为12cm；环境温度为25℃；静电压为22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收的高分子纤维膜材料。纤维平均直径为100-1000nm。将成纤维细胞种到纤维膜材料上，细胞能粘附并增殖(见图4)。
(3)待消毒灭菌后，将步骤(2)制备的高分子纤维膜材料缝合于新西兰大白兔膀胱缺损处，以不含生物活性因子的纤维膜做对照，分别于术后2周、4周、8周行X线膀胱造影后处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测膀胱缺损修复情况。结果移植了含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纤维膜材料的膀胱修复效果最好，组织学分析结果显示新生的膀胱组织结构层次与原膀胱一致。
实施例3
(1)将聚乙丙交酯(PLGA，分子量8万)溶解在8mL的三氯甲烷中，并用移液枪滴入50微升的司盘80。在磁力搅拌下使PLGA完全溶解后，滴入250微升的PRP(含有5％的dextran作为保护剂)。在磁力搅拌下搅拌45分钟。同时将明胶(GE，分子量10万)溶解在水与乙醇体积比为9∶1的混合溶剂中，配制成总浓度为15w/v％的混合溶液。
(2)选用双喷头纺丝装置，将步骤(1)的PLGA溶液与含有活性分子的GE混合溶液分别装入两个不同的输液通路中，调整溶液的供料速率为15ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为12cm；环境温度为25℃；PLGA电纺静电压为18kV，GE电纺静电压为22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纤维膜材料。其中PLGA平均纤维直径在680nm，GE平均纤维直径约360nm。
(3)将(2)所获得的纤维膜浸泡到新配置的、在4℃冰箱中储存2h以上的、含50mM～200mM的碳二亚胺的80/20的丙酮和水的混合溶液中，于4℃冰箱中交联反应12h后，用大量的去离子水浸泡冲洗。
(4)将2％的明胶粘稠水溶液铺展到(2)所获得的纤维膜表面，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥，在纤维膜表面得到一层大孔海绵。随后置于浸泡到含100mM/100mM的碳二亚胺与N-羟基马来酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，对水溶性组分进行交联，于室温反应8小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗。
(5)将(3)所得的双层支架浸泡到含有2％浓度的PRP水溶液中，待取出后置于真空干燥机中抽干水分，即得最终负载高浓度活性生长因子的表面大孔海绵结构的生物支架。(见图3)
(6)将步骤(5)制备的负载高浓度活性生长因子的表面大孔海绵结构的生物支架植入于新西兰大白兔软骨缺损处，术后4、8、12周分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、micro-CT、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测软骨缺损修复情况，以不处理或未负载生长因子的支架材料做对照，比较各组修复软骨缺损的效果。结果显示负载高浓度活性生长因子的表面大孔海绵结构的生物支架组的软骨缺损能完全愈合，能明显促进软骨缺损的修复。
实施例4
(1)将聚己内酯(PCL，分子量8万)溶解在3.5ml的1，2-二氯甲烷和0.5ml的二甲苯中，并用移液枪滴入20微升的司盘。在磁力搅拌下使PCL完全溶解后，滴入250微升的PRP(含有5％的dextran作为保护剂)。在磁力搅拌下搅拌45分钟。同时将明胶(GE，分子量10万)溶解在水与乙醇体积比为9∶1的混合溶剂中，配制成总浓度为15w/v％的混合溶液。
(2)选用双喷头纺丝装置，将步骤(1)的PCL溶液与含有活性分子的GE混合溶液分别装入两个不同的输液通路中，调整溶液的供料速率为15ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为12cm；环境温度为25℃；PCL电纺静电压为24kV，GE电纺静电压为22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收的高分子纤维膜材料。
(3)将2％的明胶粘稠水溶液铺展到(2)所获得的纤维膜表面，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥，在纤维膜表面得到一层大孔海绵。随后置于浸泡到含100mM/100mM的碳二亚胺与N-羟基马来酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，对水溶性组分进行交联，于室温反应8小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗。
(4)将(3)所得的双层支架浸泡到含有2％浓度的成纤维细胞生长因子(bFGF)及骨形成蛋白-2(BMP-2)的水溶液中，待取出后置于真空干燥机中抽干水分，即得最终负载高浓度活性生长因子的双层生物支架。
(5)将步骤(4)制备的双层生物支架置于大鼠颅骨缺损处，以不处理或未负载生长因子的支架材料做对照，术后4、8、12周分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、micro-CT、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测软骨缺损修复情况，比较各组修复颅骨缺损的效果。结果显示负载高浓度活性生长因子的表面大孔海绵结构的生物支架组的颅骨缺损修复效果最好，表明该生物支架能诱导骨再生促进骨缺损的修复。
实施例5
(1)将聚乙丙交酯(PLGA，分子量8万)溶解在8mL的三氯甲烷中，并用移液枪滴入50微升的司盘。在磁力搅拌下使PLGA完全溶解后，滴入250微升的PRP(含有5％的dextran作为保护剂)。在磁力搅拌下搅拌45分钟。同时将明胶(GE，分子量10万)溶解在水与乙醇体积比为9∶1的混合溶剂中，配制成总浓度为15w/v％的明胶溶液，随后将摩尔质量比为1∶4的EDC与NHS快速溶解在该溶液中。
(2)选用双喷头纺丝装置，将步骤(1)的PLGA溶液与含有活性分子的GE混合溶液分别装入两个不同的输液通路中，调整溶液的供料速率为15ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为12cm；环境温度为25℃；PLGA电纺静电压为18kV，GE电纺静电压为22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纤维膜材料。
(3)将2％的明胶粘稠水溶液铺展到(2)所获得的纤维膜表面，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥，在纤维膜表面得到一层大孔海绵。随后置于浸泡到含100mM/100mM的碳二亚胺与N-羟基马来酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，对水溶性组分进行交联，于室温反应8小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗。
(4)将(3)所得的双层支架浸泡到含有2％浓度的PRP水溶液中，待取出后置于真空干燥机中抽干水分，即得最终负载高浓度活性生长因子的双层生物支架。
(5)将步骤(4)制备的双层生物支架植入到皮质缺损的大鼠脑缺损处，以植入不含生物活性因子的生物支架为对照，分别于术后2周、4周处死动物，进行脑组织切片，HE染色，免疫荧光染色，比较各组生物支架上神经细胞生长、迁移及分化情况。结果显示负载高浓度活性生长因子的表面大孔海绵结构的生物支架组神经细胞和血管内皮细胞长入最多，且大量表达神经干细胞标志物，表明该生物支架具有诱导干细胞迁移、增殖及分化等作用，可有效用于修复中枢神经系统损伤。
实施例6
(1)将聚己内酯(PCL，分子量8万)溶解在3.5ml的1，2-二氯甲烷和0.5ml的二甲苯中，并用移液枪滴入20微升的司盘。在磁力搅拌下使PCL完全溶解后，滴入250微升的富含生物活性因子的PRP(含有5％的dextran作为保护剂)。在磁力搅拌下搅拌45分钟。同时将海藻酸钠与明胶按质量比10∶90为(GE，分子量10万)溶解在水中，明胶浓度固定为10％的混合溶液。
(2)选用双喷头纺丝装置，将步骤(1)的PCL溶液与含有活性分子的GE混合溶液分别装入两个不同的输液通路中，调整溶液的供料速率为15ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为12cm；环境温度为25℃；PCL电纺静电压为24kV，GE电纺静电压为22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纤维膜材料。
(3)将(2)所获得的纤维膜浸泡到新配置的10％CaCl2的乙醇和水体积比为80∶20的混合溶液中，待反应12h后，用大量的去离子水浸泡冲洗。
(3)将2％的明胶粘稠水溶液铺展到(2)所获得的纤维膜表面，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥，在纤维膜表面得到一层大孔海绵。随后置于浸泡到含100mM/100mM的碳二亚胺与N-羟基马来酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，对水溶性组分进行交联，于室温反应8小时后，用大量的去离子水浸泡冲洗。
(4)将(3)所得的双层支架浸泡到含有2％浓度的内皮细胞生长因子(VEGF)及成纤维细胞生长因(bFGF)的水溶液中，待取出后置于真空干燥机中抽干水分，即得最终负载高浓度活性生长因子的双层生物支架。
(5)将步骤(4)制备的负载高浓度活性生长因子的双层生物支架植入到新西兰大白兔尿道缺损处，以植入不含生物活性因子的生物支架为对照，分别于术后2周、4周及8周行尿路造影等检查后处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测尿道缺损修复情况，比较各组修复缺损的效果。结果显示负载高浓度活性生长因子的表面大孔海绵结构的生物支架组的尿道缺损修复效果最好，新生的尿道组织与正常尿道组织结构一致。表明该生物支架能诱导尿道上皮细胞再生，促进尿道缺损的修复。
Claims (10)
1.一种仿生三维立体组织工程支架，其特征在于：包括由生物高分子物质通过静电纺丝形成的高分子纤维膜，高分子纤维膜上负载有活性生长因子，以生物高分子物质为100重量份计，活性生长因子为0-0.1重量份但不为零；所述高分子纤维膜是由生物高分子物质通过静电纺丝形成的纳米纤维膜，或由生物高分子物质与亲水性生物高分子物质通过静电纺丝形成的复合纳米纤维膜，活性生长因子均匀分布在纳米纤维膜内部。
2.一种仿生三维立体组织工程支架，其特征在于：包括由生物高分子物质通过静电纺丝形成的高分子纤维膜，在高分子纤维膜上覆盖有一层大孔海绵层，在高分子纤维膜和大孔海绵层上负载有活性生长因子；所述高分子纤维膜是由生物高分子物质通过静电纺丝形成的纳米纤维膜，或由生物高分子物质与亲水性生物高分子物质通过静电纺丝形成的复合纳米纤维膜；以生物高分子物质为100重量份计，活性生长因子为0-0.1重量份但不为零；所述100重量份生物高分子物质中，用于形成高分子纤维膜的生物高分子物质为50-100重量份但不为100，用于形成大孔海绵层的生物高分子物质为0-50重量份但不为零。
3.如权利要求1或2所述的仿生三维立体组织工程支架，其特征在于：所述的用于形成高分子纤维膜的生物高分子物质的分子量为5～20万，选自乳酸-羟基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己内酯或聚乙交酯中的一种或几种的混合物；
所述的用于形成高分子纤维膜的亲水性生物高分子物质和用于形成大孔海绵层的生物高分子物质的分子量为5～100万，选自透明质酸、丝蛋白、硫酸软骨素、肝素、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、核酸、血清纤维结合蛋白或多肽中的一种或几种的混合物；
所述的活性生长因子选自表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子bFGF、内皮细胞生长因子VEGF、转化生长因子TGF-β、胰岛素样生长因子IGF、CD31抗体、CD24抗体、层粘连蛋白、趋化因子S D F-1、神经细胞生长因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生长肽OPG、血小板衍生生长因子PDGF、富血小板血浆(PRP)、含多种生长因子的富血小板血浆中的一种或几种的混合物。
4.一种仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将生物高分子物质溶解在第一溶剂中，然后加入表面活性剂和活性生长因子，得到高分子纺丝液；或将生物高分子物质和亲水性生物高分子物质的混合物溶解在第二溶剂中，然后加入活性生长因子，得到高分子纺丝液；
b、选用多喷头或单喷头纺丝装置，将步骤a所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝，得到可作为仿生三维立体组织工程支架的负载有活性生长因子的高分子纤维膜，纤维直径为50nm～5000nm。
5.一种仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将生物高分子物质溶解在第一溶剂中，然后加入表面活性剂和活性生长因子，得到高分子纺丝液；或将生物高分子物质和亲水性生物高分子物质的混合物溶解在第二溶剂中，然后加入活性生长因子，得到高分子纺丝液；
b、选用多喷头或单喷头纺丝装置，将步骤a所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝，得到高分子纤维膜，纤维直径为50nm～5000nm；
c、在步骤b所获得的高分子纤维膜上涂覆一层2％的明胶粘稠水溶液，然后将纤维膜冷冻干燥，然后置于第一交联剂溶液中进行交联反应过夜，用大量的去离子水浸泡冲洗，得到高分子纤维膜上覆盖大孔海绵层的复合支架；
或者将步骤b所获得的高分子纤维膜浸泡到第一交联剂溶液中，于室温反应6～12小时后，再在纤维膜表面上涂覆一层2％的明胶粘稠水溶液，然后将纤维膜冷冻干燥，然后置于第一交联剂溶液中进行交联反应过夜，用大量的去离子水浸泡冲洗，得到高分子纤维膜上覆盖大孔海绵层的复合支架；
d、将步骤c所获得的复合支架浸泡于含有活性生长因子的溶液中，然后取出置于真空干燥机中抽干水分，即得到负载有高浓度活性生长因子的仿生三维立体组织工程支架。
6.一种仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将生物高分子物质溶解在第一溶剂中，然后加入表面活性剂和活性生长因子，得到高分子纺丝液；或将生物高分子物质和亲水性生物高分子物质的混合物溶解在第二溶剂中，然后加入第二交联剂溶液，得到高分子纺丝液；
b、选用多喷头或单喷头纺丝装置，将步骤a所得高分子纺丝液装入静电纺丝设备的储液装置中进行静电纺丝，得到高分子纤维膜，纤维直径为50nm～5000nm；
c、在步骤b所获得的高分子纤维膜上涂覆一层2％的明胶粘稠水溶液，然后将纤维膜冷冻干燥，然后置于第一交联剂溶液中进行交联反应过夜，用大量的去离子水浸泡冲洗，得到高分子纤维膜上覆盖大孔海绵层的复合支架；
d、将步骤c所获得的复合支架浸泡于含有活性生长因子的溶液中，然后取出置于真空干燥机中抽干水分，即得到负载有高浓度活性生长因子的仿生三维立体组织工程支架。
7.如权利要求4或5或6所述的仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其特征在于，用于形成高分子纤维膜的生物高分子物质的分子量为5～20万，选自乳酸-羟基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己内酯或聚乙交酯中的一种或几种的混合物；
用于形成高分子纤维膜的亲水性生物高分子物质和用于形成大孔海绵层的生物高分子物质的分子量为5～100万，选自透明质酸、丝蛋白、硫酸软骨素、肝素、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、核酸、血清纤维结合蛋白或多肽中的一种或几种的混合物；
所述活性生长因子选自表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子bFGF、内皮细胞生长因子VEGF、转化生长因子TGF-β、胰岛素样生长因子IGF、CD31抗体、CD24抗体、层粘连蛋白、趋化因子SDF-1、神经细胞生长因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生长肽OPG、血小板衍生生长因子PDGF、富血小板血浆(PRP)、含多种生长因子的富血小板血浆中的一种或几种的混合物。
8.如权利要求4或5或6所述的仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述第一溶剂选自1，2-二氯甲烷、二甲苯、氟代试剂、氯仿、DMF、THF中的一种或几种；所述第二溶剂选自水、氟代试剂或水与乙酸、乙醇、DMF、甘油的混合溶剂；所述表面活性剂选自司盘或吐温。
9.如权利要求5或6所述的仿生三维立体组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述第一交联剂溶液是由碳二亚胺与丙酮和水的混合溶剂新配制的溶液，温度为4℃，其中碳二亚胺的浓度为50mM～200mM，丙酮和水的混合溶剂中，丙酮与水的重量比为80∶20；所述第二交联剂溶液为新配制的碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，其中碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔质量比为1∶3。
10.如权利要求4或5或6所述的仿生三维立体组织工程支架，其特征在于：所述的静电纺丝的工艺条件为：溶液的供料速率为5～50ul/min，喷丝头与接地的收集器之间的距离为8～20cm；环境温度为20～50℃；静电压为10～30kV。
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