CN111067662A - 重组胶原蛋白及其双层人造血管支架 - Google Patents

重组胶原蛋白及其双层人造血管支架 Download PDF

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Abstract

本发明提供了胶原蛋白，可用于作为血管支架的的原料。本发明还提供了双层人造血管支架及其制备方法，包括将胶原蛋白、聚已内酯、聚氧化乙烯等按一定流程制备的过程。

Description

重组胶原蛋白及其双层人造血管支架
技术领域
本发明属于多肽技术和生物医学材料领域，具体而言，本发明涉及重组胶原蛋白及其双层人造血管，具有良好的生物相容性，抗渗透性，柔韧性和一定的力学性能。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要组成成分，也是动物体内含量最多的蛋白，所有的多细胞动物都含有丰富的胶原，因此胶原蛋白具有良好的生物相容性。胶原蛋白具有独特的组织结构和生物功能，对维护细胞，组织，器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用及其具有较大的亲和力，良好的生物降解安全性，可降解吸收，作为一种性能优良的生物材料，已经得到广泛的应用在医学领域。常见的胶原蛋白是从牛骨、牛皮、鱼鳞、鱼皮、猪皮等动物组织中分离提取而来，存在动物病毒隐患、应用于人体时会产生异体或异种的排异反应且分子量不确定、分布范围广等缺点和不足。本发明人的前期研究成果很好的克服了这些缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。
由于本发明的胶原蛋白是一种纤维状蛋白，并能与体能蛋白多糖、糖蛋白等成分结合，因而使其加工工艺复杂困难。本发明人通过前期研究，在中国专利申请第201710933005.3号中，公开了一种重组胶原蛋白温敏水凝胶，其通过加入壳聚糖、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠等成分制备而得，具有良好的温敏转变性质和机械强度，特别适用于关节滑膜的修复。
心血管疾病是当今世界威胁人类健康严重的疾病之一，其发病率和死亡率均超过肿瘤性疾病而跃居第一位。患者通常是由于血管的病变导致人体部分血管无法进行正常供血，血管狭窄或者栓塞，若得不到及时的治疗，将会引起患者瘫痪或者死亡，从而危害人体健康。目前治疗上述疾病通常的方法包括血管重建，搭桥或移植手术。其中血管手术大多数来源自体血管作为替代品，来源受到限制严重不足。因此，理想的人造血管支架越来越高的数量要求。目前，纺丝型人造血管支架已广泛地应用于临床，替换人体内已坏损的血管，并取得了较好的治疗效果。
然而，现有技术并没有将该胶原蛋白用于制备人造血管支架，尤其是没有将该胶原蛋白用于采用静电纺丝技术来制备人造血管支架的教导。
静电纺丝技术工艺的原理是利用高电压静电场的作用来实现纺丝液的喷射，喷射过程中，溶剂挥发，高压电源在喷头处加载正向高压此时高压电源在喷头处加载正向高压，溶液喷头形成泰勒锥(Taylor cone)。在电放丝过程中，通过调节和控制纺丝参数，如纺丝液的浓度，电压，针头，转速，纺丝距离等，纤维结构，形貌和组成能得到有效的优化。例如，中国专利申请CN109248340A公开了一种纤维基人造血管的制备方法，将聚已内酯和聚氨酯的混合溶液成丝卷绕，在卷绕层上用N,N-二甲基甲酰胺进行喷涂得到溶剂层；将其作为静电纺丝接收端，进行静电纺丝得到静电纺丝层，在静电纺丝层上用N,N-二甲基甲酰胺进行喷涂，按顺序重复一次上述步骤，得到纤维基人造血管。
中国专利申请CN105232184A公开了一种人造血管及其制备方法和喷头装置，将裁减并缝合成圆筒形的织物作为血管外层管壁，置于金属管内腔，向其内层进行静电纺，从而形成具有双层管壁的人造血管。然而这种人造血管在缝合过程中会出现缝合张力不匀，缝合均匀度差，缝合空洞过大，从而造成覆膜支架在体内疲劳失效。
本发明人没有受现有技术的限制，凭借长期研究的经验并经过艰苦的努力，在精心研究了本发明提供的重组胶原蛋白的性质的前提下，从天文数字般的辅料中令人意外地发现了一种配方，并由此设计了适用的制备流程，从而获得本发明的双层人造血管支架，其具有紧密纳米纤维的内层膜和具有多孔结构和适宜孔隙率的外层膜，有利于细胞向其内部长入，促进细胞的增长与迁移。。
发明内容
本发明的目的是提供重组胶原蛋白及其在制备双层人造血管支架中的应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了重组胶原蛋白，其氨基酸序列
a)如序列表中的SEQ ID NO：1所示；或
b)是对序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
在第二方面，本发明提供了核酸分子，其编码本发明第一方面的重组胶原蛋白。
在第三方面，本发明提供了载体，其含有本发明第二方面的核酸分子。载体优选是表达载体，更优选是酵母表达载体。
在第四方面，本发明提供了宿主细胞，其含有本发明第二方面的核酸分子。宿主细胞可以通过转染或转导本发明第三方面的载体来制备。宿主细胞优选是酵母细胞。
在第五方面，本发明提供了制备本发明第一方面的重组胶原蛋白的方法，其包括，用本发明第四方面的宿主细胞表达本发明第一方面的重组胶原蛋白，然后分离纯化所述重组胶原蛋白。
在第六方面，本发明提供了双层人造血管支架，其由如下方法制备：
(1)将聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；
(2)用步骤(1)获得的纺丝溶液进行纺丝，得到内层纤维层；
(3)将步骤(2)获得的内层纤维层加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液中交联，任选进行清洗和干燥，得到内层；和
(4)以步骤(3)获得的内层为基底，用聚氧化乙烯溶液和聚已内酯的六氟异丙醇溶液进行纺丝，包裹在基底上形成外层，然后溶解掉聚氧化乙烯，得到双层人造血管支架。
在本文中，重组胶原蛋白可以是重组人源胶原蛋白。例如，本发明的重组人源胶原蛋白可以是中国专利ZL 200610098297.5所公开的方法获得的重组人源胶原蛋白，更优选的是，通过中国专利ZL 201110327865.5提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物(尤其是非哺乳动物)胶原蛋白而言，对人体的使用安全性更为可靠。在本发明的一个具体实施方式中，重组胶原蛋白优选是本发明第一方面的重组胶原蛋白。
优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，内层与外层的厚度比为0.5:1～0.5:1.5。
也优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，聚已内酯的六氟异丙醇溶液的浓度为11～15wt％。
还优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液的浓度为6～10wt％。
另外优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的80～100％(V/V)乙醇溶液，更优选1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液的浓度为2.5～3.5mM。
还优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，聚氧化乙烯溶液是聚氧化乙烯的80～100％(V/V)乙醇溶液，更优选聚氧化乙烯溶液的浓度为4～6wt％。
另外还优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，在步骤(1)中，聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液的体积比为3：1～1：3。
本发明人发现，接收距离优选为10-20cm，若接收距离过大，导致纤维的直径过细，孔隙率过大，容易降低血管的抗渗透性；若接收距离过小，易导致纺丝溶剂没有足够的时间挥发，易变性和粘结，纤维的直径过粗，血管壁过于致密，导致很难实现物质交换功能。
优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，在步骤(3)中，所述交联是于37℃交联4h。
也优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，在步骤(3)中，所述清洗是用乙醇溶液和水清洗。
还优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，在步骤(3)中，所述干燥是冷冻干燥。
本发明人还发现，正向电压优选为15-30KV，若电压过大，会使纤维的鞭动加剧且不可控，导致得到的管壁结构分布不均匀，纤维粗细不等；若电压过小，射出的纤维所带电荷不足，成丝及附着速度慢，效率低下，且纤维附着强度低，结构苏松。
因此，优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，在步骤(2)中，采用单喷头静电纺丝工艺进行，所述纺丝是用21G针头进行纺丝，优选所述纺丝的条件是：正向电压为15～20KV，负向电压为3KV，挤出速度为0.4ml/h，以带有不锈钢管的旋转电机为接收器，接收距离为15cm和旋转速度为100rpm。在本发明的一个具体实施方式中，不锈钢管的直径为2-6mm。
也优选在本发明第六方面的双层人造血管支架中，在步骤(4)中，采用双喷头共纺静电纺丝工艺进行，所述纺丝是以聚已内酯的六氟异丙醇溶液用22G针头并以聚氧化乙烯溶液用21G针头进行纺丝，优选所述纺丝的条件是：正向电压为15～20KV，负向电压为3KV，以包裹有内层的不锈钢管为接收器，旋转速度100rpm，环境温度为37℃，相对湿度为20％，以聚已内酯的六氟异丙醇溶液用22G针头的挤出速度为1ml/h，以聚已内酯的六氟异丙醇溶液用22G针头的接收距离为15cm，以聚氧化乙烯溶液用21G针头的挤出速度为2ml/h，并以聚氧化乙烯溶液用21G针头的接收距离为15cm。
本发明第六方面的双层人造血管支架优选直径为150nm～2.5μm。其中，内层直径基本分布在150nm～700nm之间，外层直径基本分布在400nm～2.5μm之间。
在第七方面，本发明提供了本发明第六方面的双层人造血管支架的制备方法。优选地，本发明第七方面的制备方法包括如下步骤：
(1)将聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；
(2)用步骤(1)获得的纺丝溶液进行纺丝，得到内层纤维层；
(3)将步骤(2)获得的内层纤维层加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液中交联，任选进行清洗和干燥，得到内层；和
(4)以步骤(3)获得的内层为基底，用聚氧化乙烯溶液和聚已内酯的六氟异丙醇溶液进行纺丝，包裹在基底上形成外层，然后溶解掉聚氧化乙烯，得到双层人造血管支架。
更优选地，本发明第七方面的制备方法也优选本发明第六方面的各个优选的方面。
在第八方面，本发明提供了本发明第一方面的重组胶原蛋白在制备血管支架中的应用。
优选在本发明第八方面的应用中，双层人造血管支架是用作为血管支架，更优选是本发明第六方面的双层人造血管支架。
本发明的有益效果在于：本发明采用的原料为重组胶原蛋白，具有良好的生物降解安全性，可降解吸收，是一种性能优良的生物材料，由其制备的双层人造血管支架内层具有纳米纤维分布均匀，其外层具有多孔结构与适宜的孔隙率，有利于细胞在支架上生长，粘附和浸润促进生长；精心摸索出的配方组合及根据特定工艺制备出的双层人造血管支架具有良好的力学性能、抗渗透性、结构可塑性和生物相容性，有望在临床推广应用；本发明工艺简单，易于操作。
为了便于理解，下面将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别说明的是，具体实施例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然，本领域及相关领域的普通技术人员均可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变或丰富应用领域，这些修正和改变或在其他领域的应用也纳入本发明的范围。
附图说明
图1为本发明双层人造血管支架的制备方法的示意图。
图2为本发明制备的双层人造血管支架外观形貌图，其中，A,B为双层人造血管支架的外观图；C,D为双层人造血管界面支架的电镜图；E为本发明实施例一制备双层人造血管的纤维内层的电镜图；F为本发明制备双层人造血管的纤维外层的电镜图。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的实验手册中所列方法来实施；其中的试剂均可通过商业渠道获得。
实施例1本发明的重组胶原蛋白的制备
根据本发明人研究设计的重组胶原蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成其编码基因并克隆入pPIC9K载体，电转化入Pichiapastoris酵母表达菌株GS115。将检测阳性的转化子经BMGY培养基培养24小时后，以10％(V/V)的量接种于发酵培养基(配方：甘油40g、K2SO4 18.2g、H3PO4 26.7ml、CaSO4.2H2O0.93g、MgSO4 14.9g、KOH 4.13g，用水定容至1L)以29℃培养，控制溶氧为22～25％，培养4小时后，加入甲醇至终浓度0.5％(V/V)来诱导表达，于29℃继续振荡培养72小时，期间每隔24小时补加100％甲醇以保持甲醇的终浓度为0.5％(V/V)。发酵液取上清液电泳，经归一法计算，本发明的重组胶原蛋白的表达量为13g/L。
发酵液过滤去除菌体和固体杂质，用中空纤维超滤膜浓缩脱盐，然后将浓缩液上样于用pH为5.0的10mM柠檬酸缓冲液平衡的CM Sepharose FF层析柱，用含0.5M NaCl的pH值为5.0的10mM柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，再，用中空纤维超滤膜浓缩脱盐，冷冻干燥浓缩液，即得本发明的重组胶原蛋白。
实施例2本发明的双层人造血管支架的制备1
参照图1的流程进行，具体而言：
a、静电纺丝溶液的配置
称取聚已内酯(PCL)和重组胶原蛋白(RHC)，在室温条件下搅拌溶解于六氟异丙醇中，得到了13wt％PCL和8wt％RHC透明溶液。将13wt％PCL溶液和8wt％RHC溶液按照2:1的体积比例进行混合获得了PCL/RHC纺丝溶液。用于制备双层人造血管的内层。
称取聚氧化乙烯(PEO)和聚已内酯，在温室条件下PEO溶于90％乙醇溶液中获得了5wt％PEO溶液，聚已内酯溶于六氟异丙醇中获得了13wt％PCL溶液。用于制备双层人造血管的外层。
b、内层纤维层的制备
将PCL/RHC纺丝溶液置于5ml注射器中，选用21G金属针头进行纺丝。纺丝条件包括：正向电压：15-20KV，负向电压3KV，注射器挤出速度0,4ml/h，接收距离设为15cm，采用带有不锈钢管的旋转电机收集纤维，旋转速度100rpm，得到了内层纤维层。
c、PCL/RHC交联制备纳米纤维膜
称取一定量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶于90％乙醇中，配得3mM EDC溶液作为交联溶液。将制得的内层血管浸泡于EDC溶液中，于37℃交联4h。交联后的内层纳米纤维膜分别于70％，50％，20％酒精和去离子水中清洗，然后进行冷冻干燥得到了双层人造血管的内层。
d、外层纤维层的制备
以步骤c得到的内层纤维层为基底，继续制备外层纤维层，具体为：将13wt％PCL溶液和5wt％PEO溶液转移至两个5ml的注射器中。一个注射器中装有PCL溶液与22G针头相连，注射器挤出速度1ml/h，接收距离为15cm。另一个注射器中装有PEO溶液与21G针头相连，注射器挤出速度2ml/h，接收距离为15cm。两个针头统与正向电压电源为15-20KV,负向电压3KV。以不锈钢管上含有内层膜为接收器，旋转速度100rpm，环境温度控制为37℃，湿度为20％。静电纺丝共纺过程结束得到双层血管，将双层血管放入去离子水中，PEO纤维溶解后，得到了双层血管支架(图2)。
实施例3本发明的双层人造血管支架的制备2
a、静电纺丝溶液的配置
基本同实施例2的步骤a，所不同的是，将13wt％PCL溶液和8wt％RHC溶液按照1:1的体积比例进行混合获得了PCL/RHC纺丝溶液。
b、内层纤维层的制备
同实施例2的步骤b。
c、PCL/RHC交联制备纳米纤维膜
同实施例2的步骤c。
d、外层纤维层的制备
同实施例2的步骤d。
实施例4本发明的双层人造血管支架的制备3
a、静电纺丝溶液的配置
基本同实施例2的步骤a，所不同的是，将13wt％PCL溶液和8wt％RHC溶液按照1:2的体积比例进行混合获得了PCL/RHC纺丝溶液。
b、内层纤维层的制备
同实施例2的步骤b。
c、PCL/RHC交联制备纳米纤维膜
同实施例2的步骤c。
d、外层纤维层的制备
同实施例2的步骤d。
Figure BDA0002260287600000081
Figure BDA0002260287600000091
Figure BDA0002260287600000101
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杨树林
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Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn
20 25 30
Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro
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Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly
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Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly
100 105 110
Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln
115 120 125
Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro
130 135 140
Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly
145 150 155 160
Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn
165 170 175
Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln
180 185 190
Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly
195 200 205
Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn
210 215 220
Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly
245 250 255
Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser
260 265 270
Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro
275 280 285
Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly
290 295 300
Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro
325 330 335
Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly
340 345 350
Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser
355 360 365
Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro
370 375 380
Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly
385 390 395 400
Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn
405 410 415
Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro
420 425 430
Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly
435 440 445
Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser
450 455 460
Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro
465 470 475 480
Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly
485 490 495
Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln
500 505 510
Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu
515 520 525
Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly
530 535 540
Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln
545 550 555 560
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro
565 570 575
Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly
580 585 590
Asn Gln Gly Pro Ala Gly Gly
595

Claims (10)

1.重组胶原蛋白，其氨基酸序列
a)如序列表中的SEQ ID NO：1所示；或
b)是对序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
2.核酸分子，其编码权利要求1所述的重组胶原蛋白。
3.载体或宿主细胞，其含有权利要求2所述的核酸分子。
4.制备权利要求1所述的重组胶原蛋白的方法，其包括，用权利要求3所述的宿主细胞表达权利要求1所述的重组胶原蛋白，然后分离纯化所述重组胶原蛋白。
5.双层人造血管支架，其由如下方法制备：
(1)将聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液混合，得到纺丝溶液；
(2)用步骤(1)获得的纺丝溶液进行纺丝，得到内层纤维层；
(3)将步骤(2)获得的内层纤维层加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液中交联，任选进行清洗和干燥，得到内层；和
(4)以步骤(3)获得的内层为基底，用聚氧化乙烯溶液和聚已内酯的六氟异丙醇溶液进行纺丝，包裹在基底上形成外层，然后溶解掉聚氧化乙烯，得到双层人造血管支架。
6.权利要求5所述的双层人造血管支架，其中，
内层与外层的厚度比为0.5:1～0.5:1.5；
聚已内酯的六氟异丙醇溶液的浓度为11～15wt％；
重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液的浓度为6～10wt％；
1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的80～100％(V/V)乙醇溶液，优选1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液的浓度为2.5～3.5mM；
聚氧化乙烯溶液是聚氧化乙烯的80～100％(V/V)乙醇溶液，优选聚氧化乙烯溶液的浓度为4～6wt％；和/或，
在步骤(1)中，聚已内酯的六氟异丙醇溶液和重组胶原蛋白的六氟异丙醇溶液的体积比为3：1～1：3。
7.权利要求5所述的双层人造血管支架，其中，在步骤(2)中，所述纺丝是用21G针头进行纺丝，优选所述纺丝的条件是：正向电压为15～20KV，负向电压为3KV，挤出速度为0.4ml/h，以带有不锈钢管的旋转电机为接收器，接收距离为15cm和旋转速度为100rpm。
8.权利要求5所述的双层人造血管支架，其中，在步骤(3)中，所述交联是于37℃交联4h；所述清洗是用乙醇溶液和水清洗；和/或，所述干燥是冷冻干燥。
9.权利要求5所述的双层人造血管支架，其中，在步骤(4)中，所述纺丝是以聚已内酯的六氟异丙醇溶液用22G针头并以聚氧化乙烯溶液用21G针头进行纺丝，优选所述纺丝的条件是：正向电压为15～20KV，负向电压为3KV，以包裹有内层的不锈钢管为接收器，旋转速度100rpm，环境温度为37℃，相对湿度为20％，以聚已内酯的六氟异丙醇溶液用22G针头的挤出速度为1ml/h，以聚已内酯的六氟异丙醇溶液用22G针头的接收距离为15cm，以聚氧化乙烯溶液用21G针头的挤出速度为2ml/h，并以聚氧化乙烯溶液用21G针头的接收距离为15cm。
10.权利要求1～4之一所述的重组胶原蛋白在制备血管支架中的应用，或者，权利要求5～9之一所述的双层人造血管支架的制备方法。
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