CN111265721B - 静电纺不同直径双层人工血管的制备方法 - Google Patents

静电纺不同直径双层人工血管的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种静电纺不同直径双层人工血管的制备方法，属于组织工程技术领域。本发明将PCL和RHC的混合溶液通过静电纺丝技术得到的纳米纤维膜作为内层，然后采用同轴静电纺丝技术对PCL溶液以及PEO溶液进行共纺，随后溶解掉其中的PEO纤维，制备出具有均匀的多孔结构和适宜孔隙率的外层。本发明将单喷头静电纺丝和同轴静电纺丝技术结合，制备方法简单，制备的双层人工血管具有良好的生物相容性、抗渗透性和力学性能，可用于血管组织的修复或置换。

Description

静电纺不同直径双层人工血管的制备方法
技术领域
本发明涉及一种静电纺不同直径双层人工血管的制备方法，属于组织工程技术领域。
背景技术
心血管疾病是当今世界威胁人类健康严重的疾病之一，患者通常是由于血管的病变导致人体部分血管无法进行正常供血，血管狭窄或者栓塞，若得不到及时的治疗，将会引起患者瘫痪或者死亡，从而危害人体健康。目前治疗方法包括血管重建，搭桥或移植手术。其中血管手术大多数以自体血管作为替代品，来源受到限制，严重不足。因此，需要研发理想的人工血管支架。目前，纺丝型人工血管已广泛地应用于临床，替换人体内已坏损的血管，并取得了较好的治疗效果。
静电纺丝技术作为一种制备纳米纤维的方法，其制备的微纳米纤维具有较高的孔隙率和比表面积，模拟了细胞质的环境，有利于细胞的粘附和生长。静电纺丝技术工艺简单，主要原理是利用高电压静电场的作用来实现纺丝液的喷射，喷射过程中，溶剂挥发，高压电源在喷头处加载正向高压，溶液喷头形成泰勒锥。
中国专利申请CN109248340A公开了一种纤维基人工血管的制备方法，将聚己内酯和聚氨酯的混合溶液成丝卷绕，在卷绕层上用N,N-二甲基甲酰胺进行喷涂得到溶剂层；将其作为静电纺丝接收端，得到静电纺丝层，在静电纺丝层上用N,N-二甲基甲酰胺进行喷涂，按顺序重复上述步骤，得到纤维基人工血管。该方法选用的聚己内酯和聚氨酯降解率低，因此制备的人工血管降解率过低，不符合血管替代物的要求。
中国专利申请CN105232184A公开了一种人工血管及其制备方法和喷头装置，将裁减并缝合成圆筒形的织物作为血管外层管壁，置于金属管内腔，向其内层进行静电纺，从而形成具有双层管壁的人工血管。该双层人工血管能够防止手术时管壁渗血，有利于手术后细胞组织的顺利长入。但是缝合过程中会出现缝合张力不匀，缝合均匀度差，缝合空洞过大，造成覆膜支架在体内疲劳失效。
Wang等利用PCL材料通过静电纺丝技术制备出一种人工血管支架，研究发现植入机体后人工血管结构不变，在前6个月血管支架保持了细胞渗透的情况和促进内皮化的作用，12个月后细胞的数量和毛细血管的增长速度开始下降。但是PCL血管支架的降解率低，影响其孔隙率和顺应性，难以作为再生心血管替代物(Wang et al.,2014,The effect ofthick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone)vasculargrafts on macrophage polarization and arterial regeneration.Biomaterials[J],35:5700-5710)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种静电纺不同直径双层人工血管的制备方法。该方法将单喷头静电纺丝和同轴静电纺丝技术结合，制备具有良好生物相容性以及较好机械性能的双层人工血管。
实现本发明目的的技术方案如下：
静电纺不同直径双层人工血管的制备方法，具体步骤如下：
步骤1、静电纺丝溶液的配置：
聚己内酯(PCL)和重组人源胶原蛋白(RHC)分别在室温条件下搅拌溶解于六氟异丙醇(HFIP)中，将PCL溶液和RHC溶液混合得到PCL/RHC纺丝溶液，作为内层静电纺丝溶液，所述的PCL/RHC纺丝溶液中，PCL与RHC的质量比为15～30:8；
将PCL溶于HFIP中得到PCL溶液，将聚氧化乙烯(PEO)溶于90％乙醇溶液中得到PEO溶液,作为外层静电纺丝溶液；
步骤2、内层纤维层的制备：
采用静电纺丝技术，将PCL/RHC纺丝溶液在不锈钢管表面收集成内层PCL/RHC纳米纤维层，静电纺丝参数为：正向电压15～20KV，负向电压3KV，注射器挤出速度为0.6mL/h，接收距离为15～20cm，旋转速度100rpm，温度为37℃，湿度为20％；
步骤3、EDC交联PCL/RHC纳米纤维层：
将内层PCL/RHC纳米纤维层浸泡在碳二亚胺(EDC)溶液中交联，交联后的内层纳米纤维膜分别于70％、50％、20％酒精以及水中清洗，冷冻干燥得到双层人工血管的内层；
步骤4、外层纤维层的制备：
采用同轴静电纺丝技术，将PCL溶液与芯层相连，注射器挤出速度1mL/h，PEO溶液与壳层相连，注射器挤出速度3mL/h，接收距离均为15～20cm，静电纺丝参数为：正向电压15～20KV，负向电压3KV，旋转速度100rpm，温度为37℃，湿度为20％，同轴静电纺丝共纺过程结束得到双层血管，将双层血管置于水中去除PEO，得到了双层血管支架。
优选地，步骤1中，所述的重组人源胶原蛋白为由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生。
优选地，步骤1中，所述的PCL溶液的浓度为12～15wt％，RHC溶液的浓度为8wt％。
优选地，步骤1中，所述的PEO溶液的浓度为4wt％。
优选地，步骤1中，所述的不锈钢管的直径为1mm～2.5mm。
优选地，步骤3中，交联温度为37℃，交联时间为4h。
优选地，步骤3中，EDC溶液的浓度为3mM。
优选地，步骤4中，内层与外层的厚度比为50:100～150:200μm。
本发明的人工血管制备时，静电纺丝接收距离可以为15～20cm。若接收距离过大，导致纤维的直径过细，孔隙率过大，容易降低血管的抗渗透性。若接收距离过小，易导致纺丝溶剂没有足够的时间挥发，易变性和粘结，纤维的直径过粗，血管壁过于致密，导致很难实现物质交换功能。
本发明的人工血管制备时，静电纺外加电压可以为15～20KV。若电压过大，会使纤维的鞭动加剧且不可控，导致得到的管壁结构分布不均匀，纤维粗细不等，若电压过小，射出的纤维所带电荷不足，成丝及附着速度慢，效率低下，且纤维附着强度低，结构疏松。
本发明制得的双层人工血管支架中的纤维为纳米纤维，内层的纳米纤维直径主要分布为140nm～600nm，外层的纳米纤维直径主要分布为500nm～2.5μm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明采用PCL和重组人源胶原蛋白作为内层的制备材料，PCL具有良好的生物相容性、可塑性、力学性能以及良好的渗透性，但其存在亲水性较差，降解速度较慢等缺点。RHC具有良好的生物相容性，是细胞外基质的主要成分，但是胶原蛋白成膜能力不强，机械性能较差且降解速率快。本发明将PCL和RHC的混合溶液作为内层制备材料，制备方法简单，制得的双层人工血管支架的内层中纳米纤维分布均匀。本发明采用PCL和PEO作为外层的制备材料，PEO具有良好的水溶性，利用同轴静电纺丝技术和牺牲纤维法(牺牲PEO)结合获得多孔结构和适宜孔隙率的纤维膜，去除PEO后的外层具有多孔结构与适宜的孔隙率，有利于细胞在支架上生长，粘附和浸润促进生长，作为双层人工血管的外层。综上所述，本发明制备的人工血管具有良好的力学性能、抗渗透性、结构可塑性以及生物相容性。
附图说明
图1为本发明的静电纺不同直径双层人工血管的制备方法的流程示意图，其中A为双层内层人工血管的制备流程示意图，B为双层外层人工血管的制备流程示意图。
图2为本发明制备的双层人工血管支架外观形貌图，其中A、B为双层人工血管支架的外观图，C为实施例1制备的双层人工血管的纤维内层的电镜图，D为实施例1制备的双层人工血管的纤维外层的电镜图。
图3为各实施例和对比例1制备的双层人工血管支架的轴向拉伸测试结果图。
图4为各实施例和对比例1制备的双层人工血管支架的生物相容性检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
步骤1、静电纺丝溶液的配置
称取PCL和RHC，在室温条件下搅拌溶解于六氟异丙醇中，得到15wt％PCL和8wt％RHC透明溶液。将15wt％PCL溶液和8wt％RHC溶液按照2:1的体积比例进行混合，得到PCL/RHC纺丝溶液。用于制备双层人工血管的内层。
称取PCL和聚氧化乙烯(PEO)，在室温条件下PCL溶于HFIP中得到15wt％PCL溶液，PEO溶于90％乙醇溶液中得到4wt％PEO溶液。用于制备双层人工血管的外层。
步骤2、内层纤维层的制备
将PCL/RHC纺丝溶液置于5ml注射器中，选用21G金属针头进行纺丝。纺丝条件包括：正向电压15～20KV，负向电压3KV，注射器挤出速度0.6ml/h，接收距离为15cm，采用带有不锈钢管的旋转电机收集纤维，旋转速度100rpm，得到内层纤维层。
步骤3、EDC交联PCL/RHC纳米纤维膜
称取EDC溶于90％乙醇中，配制3mM EDC溶液作为交联溶液。将制得的内层纤维层浸泡于EDC溶液中，于37℃交联4h。交联后的内层纳米纤维膜分别于70％，50％，20％酒精和去离子水中清洗，然后冷冻干燥得到双层人工血管的内层。
步骤4、外层纤维层的制备
以步骤3得到的内层纤维层为基底，继续制备外层纤维层，具体为：将15wt％PCL溶液和4wt％PEO溶液转移至两个5ml的注射器中。一个注射器中装有PCL溶液与芯层相连，注射器挤出速度1ml/h；另一个注射器中装有PEO溶液与壳层相连，注射器挤出速度3ml/h；接收距离为15cm。正向电压15～20KV，负向电压3KV。以不锈钢管上含有内层膜为接收器，旋转速度100rpm，环境温度控制为37℃，湿度为20％。同轴静电纺丝共纺过程结束得到双层血管，将双层血管放入去离子水中，PEO纤维溶解后，得到了双层血管支架(BS1)。
图2为本实施例制备的双层人工血管支架外观形貌图。A，B为双层人工血管支架的外观图，C为双层人工血管的纤维内层的电镜图，D为双层人工血管的纤维外层的电镜图。从图中可以看出，内层纤维的直径为299.49±91.60nm，孔隙率为48.97±1.02％；外层纤维的直径为1189.80±417.70nm，孔隙率为76.85±2.97％。
图3为本发明制备的双层人工血管支架的轴向拉伸测试结果图。从图中可以看出，BS1的断裂伸长率最高达116.07±7.49％，远远超过原生隐静脉(11％)和股动脉(63～76％)，BS1的杨氏模量为4.08±0.75MPa，高于冠状动脉(1.41±0.72MPa)。
图4为本发明制备的双层人工血管支架的生物相容性检测结果图，选用CCK-8法来检测支架的细胞毒性。从图中看出，培养7天后本实施例的内层上HUVEC细胞量最大。
实施例2
步骤1、静电纺丝溶液的配置
称取PCL和RHC，在室温条件下搅拌溶解于六氟异丙醇中，得到15wt％PCL和8wt％RHC透明溶液。将15wt％PCL溶液和8wt％RHC溶液按照1:1的体积比例进行混合，得到PCL/RHC纺丝溶液。用于制备双层人工血管的内层。
称取PCL和PEO，在室温条件下PCL溶于HFIP中得到15wt％PCL溶液，PEO溶于90％乙醇溶液中获得了4wt％PEO溶液。用于制备双层人工血管的外层。
步骤2、内层纤维层的制备
将PCL/RHC纺丝溶液置于5ml注射器中，选用21G金属针头进行纺丝。纺丝条件包括：正向电压15～20KV，负向电压3KV，注射器挤出速度0.6ml/h，接收距离为15cm，采用带有不锈钢管的旋转电机收集纤维，旋转速度100rpm，得到内层纤维层。
步骤3、EDC交联PCL/RHC纳米纤维膜
称取EDC溶于90％乙醇中，配制3mM EDC溶液作为交联溶液。将制得的内层纤维层浸泡于EDC溶液中，于37℃交联4h。交联后的内层纳米纤维膜分别于70％，50％，20％酒精和去离子水中清洗，然后进行冷冻干燥得到双层人工血管的内层。
步骤4、外层纤维层的制备
以步骤3得到的内层纤维层为基底，继续制备外层纤维层，具体为：将15wt％PCL溶液和4wt％PEO溶液转移至两个5ml的注射器中。一个注射器中装有PCL溶液与芯层相连，注射器挤出速度1ml/h；另一个注射器中装有PEO溶液与壳层相连，注射器挤出速度3ml/h；接收距离为15cm。正向电压15～20KV，负向电压3KV。以不锈钢管上含有内层膜为接收器，旋转速度100rpm，环境温度控制为37℃，湿度为20％。同轴静电纺丝共纺过程结束得到双层血管，将双层血管放入去离子水中，PEO纤维溶解后，得到双层血管支架(BS2)。
图3为本发明制备的双层人工血管支架的轴向拉伸测试结果图。从图中可以看出，BS2的断裂伸长率为85.7±3.49％，超过原生隐静脉(11％)和股动脉(63-76％)，BS2的杨氏模量为2.19±0.20MPa，仍然高于冠状动脉(1.41±0.72MPa)。
图4为本发明制备的双层人工血管支架的生物相容性结果图，选用CCK-8法来检测支架的细胞毒性。从图中看出培养7天后本实施列的内层上HUVEC细胞量比实施例1少，但超过孔板对照组。
对比例1
步骤1、静电纺丝溶液的配置
称取聚己内酯PCL和RHC，在室温条件下搅拌溶解于六氟异丙醇中，得到15wt％PCL和8wt％RHC透明溶液。将15wt％PCL溶液和8wt％RHC溶液按照1:2的体积比例进行混合，得到PCL/RHC纺丝溶液。用于制备双层人工血管的内层。
称取PCL和PEO，在室温条件下PCL溶于HFIP中得到15wt％PCL溶液，PEO溶于90％乙醇溶液中得到4wt％PEO溶液。用于制备双层人工血管的外层。
步骤2、内层纤维层的制备
将PCL/RHC纺丝溶液置于5ml注射器中，选用21G金属针头进行纺丝。纺丝条件包括：正向电压15～20KV，负向电压3KV，注射器挤出速度0.6ml/h，接收距离为15cm，采用带有不锈钢管的旋转电机收集纤维，旋转速度100rpm，得到了内层纤维层。
步骤3、EDC交联PCL/RHC纳米纤维膜
称取EDC溶于90％乙醇中，配制3mM EDC溶液作为交联溶液。将制得的内层纤维层浸泡于EDC溶液中，于37℃交联4h。交联后的内层纳米纤维膜分别于70％，50％，20％酒精和去离子水中清洗，然后进行冷冻干燥得到了双层人工血管的内层。
步骤4、外层纤维层的制备
以步骤3得到的内层纤维层为基底，继续制备外层纤维层，具体为：将15wt％PCL溶液和4wt％PEO溶液转移至两个5ml的注射器中。一个注射器中装有PCL溶液与芯层相连，注射器挤出速度1ml/h；另一个注射器中装有PEO溶液与壳层相连，注射器挤出速度3ml/h；接收距离为15cm。正向电压15～20KV，负向电压3KV。以不锈钢管上含有内层膜为接收器，旋转速度100rpm，环境温度控制为37℃，湿度为20％。同轴静电纺丝共纺过程结束得到双层血管，将双层血管放入去离子水中，PEO纤维溶解后，得到双层血管支架(BS3)。
图3为本发明制备的双层人工血管支架的轴向拉伸测试结果图。从图中可以看出，BS3的断裂伸长率为74.83±2.50％，高于原生隐静脉(11％)和股动脉(63-76％)相似，BS3的杨氏模量为2.16±0.18MPa，仍然高于冠状动脉(1.41±0.72MPa)。
图4为本发明制备的双层人工血管支架的生物相容性，选用CCK-8法来检测支架的细胞毒性。从图中看出培养7天后本对比例的内层上HUVEC细胞量最少，但仍然超过孔板对照组。

Claims (1)

1.静电纺不同直径双层人工血管的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1、静电纺丝溶液的配置
称取PCL和RHC，在室温条件下搅拌溶解于六氟异丙醇中，得到15 wt% PCL和8 wt% RHC透明溶液，将15 wt% PCL溶液和8 wt% RHC溶液按照2:1的体积比例进行混合，得到PCL/RHC纺丝溶液，用于制备双层人工血管的内层，所述的RHC为由保藏编号为CGMCC No. 5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生的重组人源胶原蛋白；
称取PCL和聚氧化乙烯，在室温条件下PCL溶于HFIP中得到15 wt% PCL溶液，PEO溶于90%乙醇溶液中得到4 wt% PEO溶液，用于制备双层人工血管的外层；
步骤2、内层纤维层的制备
将PCL/RHC纺丝溶液置于5 ml注射器中，选用21 G金属针头进行纺丝，纺丝条件包括：正向电压15~20 KV，负向电压3 KV，注射器挤出速度0.6 ml/h，接收距离为15 cm，采用带有不锈钢管的旋转电机收集纤维，旋转速度100rpm，得到内层纤维层；
步骤3、EDC交联PCL/RHC纳米纤维膜
称取EDC溶于90%乙醇中，配制3 mM EDC溶液作为交联溶液，将制得的内层纤维层浸泡于EDC溶液中，于37ºC交联4 h，交联后的内层纳米纤维膜分别于70%、50%、20% 酒精和去离子水中清洗，然后冷冻干燥得到双层人工血管的内层；
步骤4、外层纤维层的制备
以步骤3得到的内层纤维层为基底，继续制备外层纤维层，具体为：将15 wt% PCL溶液和4 wt% PEO溶液转移至两个5 ml的注射器中，一个注射器中装有PCL溶液与芯层相连，注射器挤出速度1 ml/h；另一个注射器中装有PEO溶液与壳层相连，注射器挤出速度3 ml/h；接收距离为15 cm；正向电压15~20 KV，负向电压3 KV；以不锈钢管上含有内层膜为接收器，旋转速度100 rpm，环境温度控制为37ºC，湿度为20%；同轴静电纺丝共纺过程结束得到双层血管，将双层血管放入去离子水中，PEO纤维溶解后，得到了双层血管支架。
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