CN101879330A

CN101879330A - 一种小口径丝素蛋白管状材料及其制备方法

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Publication number: CN101879330A
Application number: CN2010101890820A
Authority: CN
Inventors: 赵荟菁; 李明忠; 吴徵宇
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: CN101879330B

Abstract

本发明公开了一种小口径丝素蛋白管状材料及其制备方法，属生物医用材料领域。该管状材料由三层材料紧密结合而成，其外层是管状静电纺丝素网，中层是蚕丝脱胶后的熟丝编织成的网管，内层是丝素多孔材料。本发明采用在丝素溶液中浸渍、干燥、固化等方法，可使材料的三层紧密结合，并利用肝素等抗凝血药物对其内层进行处理，材料具有抗凝性；使用由圆柱型中间体(1)、空心圆筒(2)和圆形底座(3)组成的成形模具，得到的管状材料，其内径为1～8毫米，厚度为0.2～2毫米，具有良好的力学特性、生物相容性以及抗凝血性，可用于血管及神经等组织的修复。

Description

一种小口径丝素蛋白管状材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种可用于血管及神经等组织修复的生物医用材料，特别涉及一种具有良好力学性能及生物学性能的小口径管状材料及其制备方法。

背景技术

人体的多种管道系统经常因损伤、病变等原因需要进行修复。以血管为例，全球每年都有数以万计的人由于血管老化、损伤、病变等多方面原因患有血管类疾病。血管缺损修复，特别是小口径血管(直径＜6mm)的修复一直是临床的难点之一。小血管缺损修复包括传统的直接替换及组织再生的方法(组织工程方法)。用生物惰性材料如聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酰胺(PU)等直接替换缺损小血管因血栓栓塞、内膜增生等并发症未能获得成功。况且这些材料不可被生物降解，难以被生物体完全接受，其所带来的慢性免疫反应增加了感染的风险，对血管移植物的长期适应性造成障碍。组织再生的方法是将可降解生物材料或其与种子细胞的复合体植入血管缺损部位作为细胞生长的支架，从而实现体内组织的自然再生。组织再生方法为小血管缺损修复提供了新的思路。然而目前国内外关于组织再生小口径血管支架的研究，大部分因材料的力学性能达不到要求、材料植入生物体后出现免疫排异反应或材料不能对缺损血管进行彻底修复等问题而宣告失败。

用组织再生方法修复缺损小血管，合理构建支架是其成功与否的关键。根据天然血管的结构进行必要的仿生是构建血管修复支架的可行途径。人体血管主要包含三层结构：邻近管腔最内层为内膜，主要是内皮细胞；最外层为外膜，由数层纤维母细胞掺杂于胶原纤维基质所构成；介于内外膜之间的是中膜，由数层平滑肌细胞构成。如果血管再生支架中包含像真血管一样的三层结构，可诱导不同细胞分层生长，那彻底修复缺损血管将成为可能。构建支架的另外一个重要因素就是材料的选择。构成支架的材料应具有良好的生物相容性、生物活性以及生物可降解性。蚕丝由约75％的丝素和约25％的丝胶组成，是较纯的天然蛋白纤维。研究表明丝素蛋白无毒、无刺激性，具有独特的生物活性和一定的生物可降解性，并具有比合成材料和胶原等天然材料更好的生物相容性。蚕丝丝素蛋白已用于化妆品和食品添加剂约30年，蚕丝手术缝合线已临床应用近100年，现已成为最主要的天然材料手术缝合线。文献调查表明，蚕丝丝素材料已被国内外生物材料研究者用于软骨、韧带、血管、皮肤、神经、骨组织的再生研究(Progress in Polymer Science 2007；32：991-1007)。丝素蛋白是较理想的制造小口径血管再生支架的原料。

在本发明之前，公开号为CN 1487025A的中国发明专利中，公开了一种薄壁可降解管状高分子材料及其熔融注射成型方法，该发明利用低压注塑的方法将聚羟基羧酸酯、聚原酸酯、聚酸酐等合成材料制备成型为管状，用于血管、神经导管等生物医用管状材料。公开号为CN 1569253A的中国发明专利“一种组织器官修复材料的制备方法”中，采用3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)复合聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)等高分子材料制备组织修复材料。然而这些合成材料与细胞不具备特异性相互作用，不利于细胞的黏附、铺展和生长。公开号为CN 101264342A的中国发明专利“丝素蛋白小口径血管”中，采用溶液涂覆的方法将丝素溶液涂覆到特制管材模具上，再经过加热干燥制成管或膜状材料；公开号为CN101156967A的中国发明专利“丝素蛋白多孔管的制备及用途”中，采用静电纺的方法制备单层丝蛋白管状材料。上述方法虽有利于黏附血管内皮细胞，但由于未对血管中层和外层的修复提供相应的支架和环境，所以尚不完全具备作为血管再生修复支架的充分条件。

发明内容

本发明目的是提供一种具有良好的生物相容性、一定的力学强度和可被生物降解的小口径丝素蛋白管状材料及其制备方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种小口径丝素蛋白管状材料，它的内径为1～8毫米，管壁厚度为0.2～2毫米；它的结构包括外层、中层和内层，所述的中层为管状熟丝编织网，其外表面覆盖微纳米级丝素纤维网为该管状材料的外层，所述的内层为丝素多孔材料。

提供一种小口径丝素蛋白管状材料的制备方法，包括如下步骤：

(a)用熟丝编织成内径为1～8毫米的管状，制得小口径丝素蛋白管状材料的中层；

(b)将上述管状材料的中层置于质量浓度为3～10％的丝素水溶液中进行浸渍处理后，在40～60℃的温度条件下干燥、固化处理15～60分钟，再将其套装在静电纺丝收集棒上；

(c)将丝素溶解在甲酸或六氟异丙醇溶剂中，制得质量浓度为6～18％的丝素静电纺丝液，采用静电纺丝工艺，在静电纺丝收集棒上的管状材料中层的外表面覆盖微纳米级丝素纤维网，得到管状材料中层与外层的复合体，再将该复合体置于体积浓度为70～90％的甲醇或乙醇溶液中浸泡处理1～4小时；

(d)将步骤(c)制得的中层与外层的复合体套装在成形模具中，在中层的内表面注入丝素与抗凝血药物的混合液，丝素的质量浓度为0.5～5％，按质量计，抗凝血药物为丝素的0.1～5％；再在-10～-80℃的温度条件下预冻，经冷冻干燥处理后，在复合体内层形成丝素多孔材料；

(e)脱模后得到一种结构包括外层、中层和内层的小口径丝素蛋白管状材料。

在本发明中，所述的抗凝血药物为肝素、阿司匹林和潘丁生中的一种。所述静电纺丝的工艺参数为：电压8～20千伏，极距8～15厘米。

所述的成形模具包括圆柱型中间体、空心圆筒和圆形底座，空心圆筒套装在圆柱型中间体的外部，它们同轴安装在圆形底座上；圆柱型中间体的直径为1～8毫米，通过螺丝钉与圆形底座连接；空心圆筒与圆形底座通过卡槽啮合在一起；空心圆筒与圆柱型中间体间的距离为0.2～2毫米。

本发明以丝素为基本原料，构建具有三层结构的小口径丝素蛋白管状材料。该管状材料可被生物降解，具有良好的生物相容性，较高的孔隙率和比表面积，一定的力学强度，其三层仿生结构能为不同修复细胞的生长提供支架，有望彻底修复缺损的血管；它能有效解决目前小口径血管修复材料力学强度、植入后近/远期通畅率不理想等问题，对于医学领域彻底修复缺损血管具有重要的科学意义和实用价值。同时，对开发具有我国自主知识产权的血管及神经等管状修复材料具有广泛和现实的应用前景。

采用本发明所提供的技术方案，具有以下明显的优点：

(1)本发明所制备的小口径丝素蛋白管状材料可生物降解，具有优良的理化性能、生物学性能及一定的整体通透性。其植入生物体后，具有较高的近、远期通畅率。

(2)材料的内层多孔材料及外层静电纺丝素网有利于细胞的黏附、生长、增殖、分化，中层熟丝编织管在血管再生之前承担必要的力学作用。材料各层的孔隙结构使其具有良好的通透性，有利于细胞的必要迁移及营养、代谢产物的转运，可用于体内直接替代、修复缺损小血管或在体外进行细胞培养的血管组织工程支架。

(3)材料各层及整体都是直接制备成型为管状结构，避免了有机粘合剂的使用，无明显应力缺陷。

(4)材料各层的制备条件可以控制，可根据需要调节材料的直径、长度、厚度及各层的孔隙率和孔径尺寸。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种制备小口径丝素蛋白管状材料成形模具的结构示意图；

图中，1、圆柱型中间体；2、空心圆筒；3、圆形底座。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

参见附图1，它是本实施例提供的一种制备小口径丝素蛋白管状材料成形模具的结构示意图；圆柱型中间体1套装在空心圆筒2的外部，它们同轴安装在圆形底座3上；圆柱型中间体的直径为1.5毫米，高度为5厘米，通过螺丝钉与圆形底座连接；空心圆筒高度为4厘米，与圆柱型中间体的间距为0.3毫米，通过卡槽与圆形底座啮合在一起。

本实施例提供了一种小口径丝素蛋白管状材料，制备步骤如下：

1)将1公斤茧壳放入50升质量浓度为0.5％的中性皂溶液中，于98～100℃处理2小时，使茧壳脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用5升9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。

2)用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液，调节丝素蛋白溶液质量浓度为3％。

3)将丝素蛋白溶液倒入聚乙烯器皿中，常温晾干，得到丝素蛋白膜，将其粉碎后得到丝素蛋白粉末。

4)用电子天平称取丝素蛋白粉末0.3克，溶于4.7克六氟异丙醇中，搅拌12小时至其完全溶解，得到浓度为6％(w/w)的静电纺丝溶液。

5)利用12锭编织机，将规格为2*2(将2根20～22旦的并捻丝合股)的熟丝编织成内径为2毫米、长度为4厘米的管状物，作为小口径丝素蛋白管状材料的中层。

6)将该中层编织管在质量浓度为3％的纯丝素水溶液中浸渍30分钟，再将其在60℃的烘箱中干燥、固化30分钟。将得到的产物套装在直径为1毫米的静电纺设备收集棒上，作为收集装置。

7)将步骤4中已配好的6％(w/w)的静电纺丝溶液装入静电设备的注射装置中，选择静电纺电压10千伏，注射装置推注速率0.3毫升/小时，极距8厘米，采用旋转的上述收集装置直接收集为管状。

8)将步骤7制得的管状物从收集棒上取下，在75％(v/v)的乙醇溶液中浸泡2小时，用去离子水冲洗数次后干燥，得到小口径丝素蛋白管状材料中层及外层的复合体。

9)将复合体套装到成形模具的圆柱型中间体上，向圆柱型中间体及复合体的空隙处灌注丝素及抗凝血药物肝素的混合液，按质量计，肝素为丝素的0.5％，溶液的丝素质量浓度为5％；将其放入-20℃的冰箱中快速冷冻6小时，形成冷冻体。

10)将该冷冻体放入冷冻干燥箱中干燥24小时，脱模后得到内径为1.5毫米、厚度为0.3毫米、长度为4厘米的小口径丝素蛋白管状材料；它的结构包括外层、中层和内层，中层为管状熟丝编织网，其外表面覆盖微纳米级丝素纤维网为该管状材料的外层，内层为丝素多孔材料。

实施例二：

1)将1公斤生丝放入30升质量浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理2小时，使生丝脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用8升摩尔比为1∶8∶2的氯化钙、水、乙醇溶液，在75±5℃下搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。

2)用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除氯化钙等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液，调节丝素蛋白溶液质量浓度为6％。

4)用电子天平称取丝素蛋白粉末0.45克，溶于2.55克无水甲酸中，搅拌12小时至其完全溶解，得到浓度为15％(w/w)的静电纺丝溶液。

5)利用24锭编织机，将规格为4*2(将4根20～22旦的并捻丝合股)的熟丝编织成内径为4毫米、长度为10厘米的管状物，作为小口径丝素蛋白管状材料的中层。

6)将该中层编织管在质量浓度为6％的纯丝素水溶液中浸渍30分钟，再将其在40℃的烘箱中干燥、固化50分钟。将得到的产物套装在直径为3毫米的静电纺设备收集棒上，作为收集装置。

7)将步骤4中已配好的15％(w/w)的静电纺丝溶液装入静电设备的注射装置中，选择静电纺电压15千伏，注射装置推注速率0.8毫升/小时，极距10厘米，采用旋转的上述收集装置直接收集为管状。

8)将步骤7制得的管状物从收集棒上取下，在80％(v/v)的乙醇溶液中浸泡2小时，用去离子水冲洗数次后干燥，得到小口径丝素蛋白管状材料中层及外层的复合体。

9)参照实施例1的结构，提供一种制备小口径丝素蛋白管状材料成形模，将复合体套装到成形模具的圆柱型中间体上，圆柱型中间体的直径为3毫米，高度为11厘米，与空心圆筒的间距为0.8毫米，空心圆筒高度为10厘米，向圆柱型中间体及复合体的空隙处灌注丝素及阿司匹林的混合液，阿司匹林占丝素质量的3％，溶液的丝素质量浓度为3％；将其放入-40℃的冰箱中快速冷冻6小时，形成冷冻体。

10)将该冷冻体放入冷冻干燥箱中干燥24小时，脱模后得到内径为3毫米、厚度为0.8毫米、长度为10厘米的小口径丝素蛋白管状材料。

实施例三：

1)将200克茧壳放入10升质量浓度为0.3％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理2小时，使茧壳脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用100毫升9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃下搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。

2)用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液，调节丝素蛋白溶液质量浓度为9％。

4)用电子天平称取丝素蛋白粉末0.9克，溶于4.1克无水甲酸中，搅拌12小时至其完全溶解，得到浓度为18％(w/w)的静电纺丝溶液。

5)利用32锭编织机，将规格为8*2(将8根20～22旦的并捻丝合股)的熟丝编织成内径为7毫米、长度为18厘米的管状物，作为小口径丝素蛋白管状材料的中层。

6)将该中层编织管在质量浓度为9％的纯丝素水溶液中浸渍30分钟，再将其在60℃的烘箱中干燥、固化20分钟。将得到的产物套装在直径为6毫米的静电纺设备收集棒上，作为收集装置。

7)将步骤4中已配好的18％(w/w)的静电纺丝溶液装入静电设备的注射装置中，选择静电纺电压20千伏，注射装置推注速率1.5毫升/小时，极距15厘米，采用旋转的上述收集装置直接收集为管状。

8)将步骤7制得的管状物从收集棒上取下，在90％(v/v)的甲醇溶液中浸泡2小时，用去离子水冲洗数次后干燥，得到小口径丝素蛋白管状材料中层及外层的复合体。

9)参照实施例1的结构，提供一种制备小口径丝素蛋白管状材料成形模，将复合体套装到成形模具的圆柱型中间体上，圆柱型中间体的直径为6毫米、高度为19厘米，圆柱型中间体与空心圆筒的间距为1.2毫米，空心圆筒高度为18厘米，向圆柱型中间体及复合体的空隙处灌注丝素及肝素的混合液，肝素占丝素质量的1％，溶液的丝素质量浓度为0.5％，将其放入-80℃的冰箱中快速冷冻6小时，形成冷冻体。

10)将该冷冻体放入冷冻干燥箱中干燥24小时，脱模后得到内径为6毫米、厚度为1.2毫米、长度为18厘米的小口径丝素蛋白管状材料。

Claims

1.一种小口径丝素蛋白管状材料，其特征在于：它的内径为1～8毫米，管壁厚度为0.2～2毫米；它的结构包括外层、中层和内层，所述的中层为管状熟丝编织网；所述中层的外表面覆盖微纳米级丝素纤维网，为该管状材料的外层；所述中层的内表面与内层紧密结合，所述内层为丝素多孔材料。

2.一种小口径丝素蛋白管状材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(b)将管状材料的中层置于质量浓度为3～10％的丝素水溶液中进行浸渍处理后，在40～60℃的温度条件下干燥、固化处理15～60分钟，再将其套装在静电纺丝收集棒上；

3.根据权利要求2所述的一种小口径丝素蛋白管状材料的制备方法，其特征在于所述静电纺丝的工艺参数为：电压8～20千伏，极距8～15厘米。

4.根据权利要求2所述的一种小口径丝素蛋白管状材料的制备方法，其特征在于所述的抗凝血药物为肝素、阿司匹林和潘丁生中的一种。

5.根据权利要求2所述的一种小口径丝素蛋白管状材料的制备方法，其特征在于：所述的成形模具包括圆柱型中间体(1)、空心圆筒(2)和圆形底座(3)，空心圆筒(2)套装在圆柱型中间体(1)的外部，它们同轴安装在圆形底座(3)上；圆柱型中间体(1)的直径为1～8毫米，通过螺丝钉与圆形底座(3)连接；空心圆筒(2)与圆形底座(3)通过卡槽啮合在一起；空心圆筒(2)与圆柱型中间体(1)间的距离为0.2～2毫米。