KR20020059382A - 공학처리된 근육 - Google Patents

공학처리된 근육 Download PDF

Info

Publication number
KR20020059382A
KR20020059382A KR1020027002632A KR20027002632A KR20020059382A KR 20020059382 A KR20020059382 A KR 20020059382A KR 1020027002632 A KR1020027002632 A KR 1020027002632A KR 20027002632 A KR20027002632 A KR 20027002632A KR 20020059382 A KR20020059382 A KR 20020059382A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
muscle
collagen
extracellular matrix
fibers
matrix
Prior art date
Application number
KR1020027002632A
Other languages
English (en)
Inventor
바울린개리
우넥개리
심슨데이빗
테라치오루이스
Original Assignee
버지니아 주립대학교 지적재산재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/386,273 external-priority patent/US6592623B1/en
Application filed by 버지니아 주립대학교 지적재산재단 filed Critical 버지니아 주립대학교 지적재산재단
Publication of KR20020059382A publication Critical patent/KR20020059382A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/08—Muscles; Tendons; Ligaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3826—Muscle cells, e.g. smooth muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3873—Muscle tissue, e.g. sphincter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/30—Materials or treatment for tissue regeneration for muscle reconstruction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Braking Arrangements (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)

Abstract

근육 이식편은 세포외 매트릭스, 힘줄 및 근육 세포를 포함한다. 세포외 매트릭스는 일렉트로에어로졸 및/또는 일레트로스펀 중합체 소적의 매트릭스로 구성된다. 심근 및 평활근은 세포외 매트릭스를 맨드릴에 침착시킴으로써 형성될 수 있으며, 세포외 매트릭스는 일정한 피치로 맨드릴 주위에 나선으로 권취한 중합체를 포함한다.

Description

공학처리된 근육{ENGINEERED MUSCLE}
근육 이상은, 이것이 발생단계의 비정상적 상태로부터 야기된 것이든 또는 외상적인 상해 또는 다른 이유로 야기된 것이든 간에 생명체의 한 현실이다. 가로무늬근 조직의 구조적 결함은 상대적으로 기능상 양성인 것에서부터 쇠약하게 하는 심한 장애에 이르기까지 다양하다. 어느 경우에건, 증상은 환자에게 상이한 많은 수준으로 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 얼굴 근육성의 구조적 결함은 환자가 생존하는 능력에 있어 거의 영향을 주지 않을 수 있다. 그러나, 얼굴 근육의 조그마한 미용적 결함이라 할지라도 실질적인 심리적 의미를 가질 수 있다.
앞서 지적된 가로무늬근 이상에 덧붙여, 심혈관 근육 또한 악화 및 질병에 놓여진다. 심장의 선천적인 기형 또한 보통이다. 통상적인 수술 기술은 근본적으로 건강한 심장에 존재하는 미묘한 구조적 및 기능적 관계까지 충분히 복구할 수 없다. 정상 심장은 전기 시그널의 규칙적인 전파와 조화로운 심실벽의 수축을 보장하는 정교한 3차원 구조이다. 심장 근육이 효과적으로 고쳐져야 한다면, 3차원 조직화는 세포 수준에서 다뤄져야 한다.
기능장애 골격근 조직의 재구성을 위한 대안적인 기술은 거의 존재하지 않는다. 그러한 조직을 만들기 위한 시도는 골격근 세포가 콜라겐 겔 내에 트랩핑되도록 하는 실험에 일반적으로 국한되어 왔다. 이들 실험에서, 세포는 콜라겐 겔이 중합됨에 따라 이의 외부로 시딩되거나 겔 내에 문자그대로 엔벨로핑되어졌다. 이어서, 세포는 고르지 않은 콜라겐 겔의 "3차원" 환경 내에서 분화되도록 놓여진다. 이들 콜라겐 겔내에서 세포의 분포는 이들 구조내에서 제한 인자를 나타낸다. 근육 세포가 콜라겐 겔의 외부로 시딩될 때, 이들은 전형적으로 겔의 주변 영역에 집중된 채 남아있다. 근육 세포가 콜라겐 겔이 중합을 수행함에 따라 그 내로 직접 혼입되는 실험은, 보다 조밀하고 균일한 배양액을 제공하지만, 이들 구조물은 이의 생체내 대응물보다 덜 조밀한 채 남아 있다. 보다 중요하게는, 통상적인 조직 배양에서 만들어진 이식편은 일정한 배열 또는 배향을 결여하는 근육 세포로 이루어져 있다. 이들 희박한 세포밀도내 이식편내에서 세포의 고르지 않은 특성은 그 조직의 이용가능성과 통상적 근육으로서 기능하는데 있어서의 이의 능력을 제한한다.
이식편을 고안함에 있어서 다뤄져야 할 부가적 제약은 이식편의 기계적 안정도를 포함한다. 이식편은 정상 조직의 수동 조작, 수술 절차 및 기계적 환경을 견디기에 충분한 구조적 보전성을 지녀야 한다. 정상 골격근은 근육을 구획화하고 조직의 구조를 강화시키는 조밀한 다중층의 연결 조직에 의해 생체내 둘러싸여 있다. 시험관내에서 특정 구조의 이러한 배열을 모방하는 것은, 임의 조밀하게 포위하는 물질이 영양분 확산, 산소 수송 및 물질대사 폐산물의 세포로부터의 제거를 제한하려는 경향이 있기 때문에 어렵다. 폴리에스테르 메쉬와 같은 인공 물질로부터 만들어진 성분들은 배양물의 강도를 증가시키면서 배양물에 이의 탄성 특성의 실질적 부분을 보유하도록 허용함으로써 부분 성공적으로 사용되어져 왔다. 그러나, 합성 물질의 이식편 내로의 혼입은 생체내 염증 반응을 개시할 가능성을 증가시킬 수 있다.
심조직은 조밀한 연결 조직을 결여한다. 그러나, 심장의 근육 세포는 복잡한 격자로 조직화되어 있다. 심장의 개별 근육 세포는 막대 모양의 세포 형태를 가지고 있다. 골격근과 마찬가지로 이들은 복잡한 3차원 패턴에서 공동축을 따라 배향되어 있다. 심장의 각 세포는 기저막에 에워싸여 있으며 복잡한 콜라겐 피브릴의 매트릭스에 의해 인접부에 상호연결되어 있다. 심장내 세포층의 3차원 패턴은 전기 시그널의 규칙적인 전파와 조화로운 심실벽의 수축을 위해 중요하다.
평활근은 다수의 중공성 기관의 지지체를 둘러싼다. 예를 들면, 내장의 경우, 이는 위장과 장관을 에워싼다. 이러한 근육의 수축은 음식물을 혼합하여 소화관을 따라 추진시킨다. 심혈관계에서, 평활근 세포는 동맥과 대정맥의 벽을 에워싸며 혈관의 직경을 조절하는 기능을 한다. 평활근은 골격근 및 심근 세포의 거의 균일한 세포 형상 및 격자형 분포가 결핍되어 있다. 그러나, 평활근 세포는 가늘고 긴 쌍극성 세포 형상을 보인다. 집단으로서 이들은 일련의 중첩 세포층을 따라 조직화된다. 이러한 패턴의 조직화는 평활근으로 하여금 복잡한 패턴으로 수축력을 발휘하도록 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 단점을 극복하고 근육 이식편을 이를 필요로 하는 숙주에 제공하는 것이다. 이식편은 기존 근육을 신장시키거나,근육 결함을 교정하기 위해서 또는 기능장애의 근육 조직을 위한 기능적 및 구조적 대용물로써 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 근육 이식편을 제조하기 위한 방법을 포함한다.
일 양태에서, 근육 이식편은 매트릭스 위에 배치된 일렉트로스펀(electrospun) 섬유 및 근육 세포로부터 만들어진 세포외 매트릭스를 포함한다. 다른 양태에서, 근육 이식편은 근육을 지탱하기 위한 일렉트로스펀 섬유, 압출된 섬유로부터 만들어진 힘줄, 및 세포외 매트릭스 위에 배치된 근육 세포층으로부터 만들어진 세포외 매트릭스를 포함한다. 근육 세포층은 다중층일 수 있다. 다른 변형에서, 일렉트로스펀 섬유는 가교결합될 수 있다. 또한, 배향된 콜라겐 층은 근육 세포가 배향된 콜라겐 층 위에 배치되도록 세포외 매트릭스 위에 침착될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 일렉트로스펀 섬유의 매트릭스를 포함하는 근육을 지탱하기 위한 세포외 매트릭스를 포함한다. 섬유는 전기적으로 대전된 오리피스로부터 접지된 기질 위로 방출되어 매트릭스를 형성한다. 매트릭스는 또한 섬유가 가교결합되도록 가교결합제로 처리될 수 있다.
본 발명은 또한 중합체 섬유를 기질 위로 침착시키기에 효과적인 조건하에서 전기적으로 대전된 중합체 용액을 접지된 표적 기질 위로 압출시켜 세포외 매트릭스를 형성하는 것으로 이루어지는 세포외 매트릭스를 제조하는 방법을 포함한다. 압출된 중합체는 3차원 매트릭스를 형성할 수 있다. 세포외 매트릭스는 더 나아가 그 위에 침착된, 정렬된 콜라겐 섬유의 겔을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 전기적으로 접지된 기질을 제공함으로써 근육 근막초(fascial sheath)를 형성하는 방법을 포함한다. 더 나아가, 콜라겐 용액 저장소를 제공하는데, 여기에서, 저장소는 콜라겐 용액이 저장소를 떠나도록 하게끔 하는 오리피스를 가진다. 콜라겐 용액은 전기적으로 대전된 다음 근육 근막초를 형성하기 위해서 기질 위로 스트리밍된다.
추가 양태에서, 본 발명은 세포외 매트릭스 위에 근육 세포층 형성 방법을 포함한다. 이 방법은 세포외 매트릭스를 제공한 다음 세포외 매트릭스를 회전 벽 생물반응기(rotating wall bioreactor) 내부에 두는 것을 포함한다. 그런 다음, 생물반응기를 근육 세포가 세포외 매트릭스에 달라붙을 때까지 가동시킨다. 대안적으로, 세포외 매트릭스에 달라붙은 근육 세포는 다중층을 형성한다.
본 발명의 다른 양태는 일렉트로에어로졸 소적(小滴)의 매트릭스를 포함하는 세포외 매트릭스를 포함한다. 이 소적은 전기적으로 대전된 오리피스로부터 접지된 기질 위로 방출되어 매트릭스를 형성한다. 매트릭스는 또한 소적이 가교결합되도록 가교결합제로 처리될 수 있다. 또한, 본 발명은 중합체 소적이 기질 위로 침착되기에 효과적인 조건하에서 전기적으로 대전된 중합체 용액을 접지된 표적 기질 위로 스트리밍시켜 세포외 매트릭스를 형성하는 것으로 이루어지는 세포외 매트릭스의 제조방법을 포함한다. 중합체 소적은 3차원 매트릭스를 형성할 수 있다. 세포외 매트릭스는 더 나아가 그 위에 침착된 정렬된 콜라겐 섬유의 겔을 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 이에 관한 보철(prosthesis)이 형성될 맨드릴을 제공하는 것으로 이루어지는 혈관 보철을 형성하는 방법을 제공한다. 세포외 매트릭스는 맨드릴 주변을 따라 예정된 피치로 중합체 섬유를 나선형으로 권취함으로써 형성된다. 그런 다음, 근육 세포는 세포외 매트릭스 위에 침착된다. 이 방법은 더 나아가 맨드릴 주변에 복수의 세포외 매트릭스를 형성하는 것을 포함할 수 있다. 더 나아가, 맨드릴은 둥글거나 또는 예정된 혈관 모양일 수 있다.
본 발명은 근육 이식편 및 이식용으로 고안된 이식편용 세포외 매트릭스에 관한 것이다. 이식편은 기능장애 근육 조직을 위한 기능적 및 구조적 대용물이다.
도 1은 섬유의 일렉트로스펀 매트릭스의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 2a 및 도 2b는 일렉트로스피닝 장치와 회전 벽 생물반응기를 포함하는 일렉트로스피닝 기구의 개략도이다.
도 3은 정렬된 콜라겐의 얇은 겔 주사 전자 현미경 사진이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 정렬된 콜라겐 겔과 고르지 않은 콜라겐 겔 위에 침착된 근육 세포의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 5a 및 도 5b는 어떻게 근육 이식편을 제조할 수 있는지에 대한 개략 설명도이다.
도 6은 비대 기전의 한 유형에 대한 개략 설명도이다.
도 7은 중합체 스트림이 어떤 유형으로 안내되는지에 대한 개략 설명도이다.
도 8은 일렉트로에어로졸 PGA/PLA(50/50) 스캐폴딩 외면의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 9는 18 게이지 니들상에서 생성된, 일렉트로에어로졸 PGA/PLA(50/50) 스캐폴딩 단면도의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 10은 18 게이지 니들상에서 생성된 일렉트로에어로졸 PGA/PLA(50/50) 스캐폴딩 중간-벽 단면도 주사 전자 현미경 사진이다. 이 도면은 도 9에 도시된 바와 같은 동일한 구조물의 고배율을 예시한다.
도 11은 18 게이지 니들상에서 생성된 일렉트로에어로졸 PGA/PLA(50/50) 스캐폴딩 구경면의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 12는 혈관 보철의 일 양태를 제조하는데 사용되는 상이한 다섯 층에 대한 개략 설명도이다.
도 13은 혈관 보철을 제조하기 위해 사용되는 권취장치를 예시한다.
도 14는 얇은 벽 튜브를 갖는 맨드릴의 개략도이다.
도 15는 맨드릴 홀더와 맨드릴의 개략도이다.
도 16은 튜빙 커넥터, 튜빙 및 폴리카보네이트 벽으로 구성된 생물반응기의 개략도이다.
도 17은 생체모방(biomimicking) 혈관 보철 단면의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 18은 생체모방 혈관 보철의 외면 위에 시딩된 배향된 평활근 세포를 보여주는 주사 전자 현미경 사진이다.
도 19는 생체모방 혈관 보철의 외면 위에 시딩된 배향된 평활근 세포를 보여주는 주사 전자 현미경 사진이다.
공학처리되는 근육 이식편은 하나 이상의 하기의 성분들을 포함한다. 이들은 공학처리되는 세포외 매트릭스, 공학처리되는 힘줄, 및 공학처리되는 근육 세포이다. 각 성분은 개별적으로 상세하게 그리고나서 이들의 조립의 관점에서 조합하여 논의될 것이다.
A.공학처리된 세포외 매트릭스
정상인 해부구조에서, 근육은 우리가 세포외 매트릭스로 지칭하는 외부 보호 코팅 내에 들어 있는 배향된 근육 세포 다발이다. 골격근에서, 이 외부 코팅은 근막초로 언급된다. 근막초는 골격근에 대한 지지물과 모양을 제공한다. 근막초는 근육의 보전성을 유지하는 스캐폴딩이거나 세포외 매트릭스이다. 평활근 및 심근은 또한 세포외 매트릭스에 의해 지탱된다. 평활근 및 심장 조직의 세포는 모두 망상구조의 콜라겐 피브릴에 상호연결되어 있다. 평활근은 뚜렷한 근막초를 결여한다. 심장의 전 표면은 심낭이라 불리는 콜라겐으로 구성된 연결 조직의 단단한 외부 코팅으로 싸여있다.
또다른 매트릭스의 유형은 신경 가이드이다. 신경 가이드(신경 안내 채널)는 작은 내경을 갖는 튜브 구조로서, 엑손을 재생하기 위한 유도에 조력하기 위해 절단된 신경 분절의 말단 및 기부 스텀프를 연결하는데 사용된다. 신경 가이드는 엑손의 보다 직접적인 재권취를 위해 재생을 위한 직접 경로를 허용하며, 고르지 않은 엑손 외부성장이 접선위에서 탈선하는 것을 방지하여 재권취되지 않도록 한다. 신경 가이드는 또한 루멘(엑손 스텀프에 의해 방출된 신경활성 분자) 내에서 제어된 환경을 위해서 반흔 조직/주변 조직의 내부성장을 방지하는 동시에 엑손 재생을 조력/촉진하는 것을 허용한다. 반흔 조직/조직 내부성장은 자명하게 엑손 재생을 막거나 방지할 것이다.
공학처리된 본 발명의 세포외 매트릭스는 골격근, 평활근 또는 심장 근육의 요건을 충족하기 위해 통상적으로 구성될 수 있다. 바람직한 양태에서, 세포외 매트릭스는 중합체 섬유를 일렉트로스피닝하거나 중합체 소적(합성 또는 천연)을 일렉트로에어로졸링하여 매트릭스를 기질 위에 직접 형성하거나; 또는 기질 또는 원형 틀(mold), 또는 RCCS 생물반응기(Synthecon)의 중앙 실린더와 같이 다른 표면 위로 향해진 매트릭스를 형성함으로써 생산될 수 있다.
다수의 상이한 종류의 생물반응기가 있는데, 이는 저-전단, 고-양분 관류 환경을 제공하도록 고안된 기구로서 시중에서 구입가능하다. 최근까지, 이용가능한 생물반응기의 대부분은 현탁액에서 세포를 유지하고 양분과 산소를 스파아징에 의하거나 임펠러의 사용을 통해, 또는 다른 스티어링 수단에 의해 전달하였다. RCCS 생물반응기는 회전 벽 생물반응기이다. 이것은 작은 내부 실린더, 일렉트로스피닝 공정을 위한 기질로 구성되며, 이 기질은 보다 큰 외부 실린더 내부에 위치한다. 일렉트로스펀 또는 일렉트로에어로졸 매트릭스가 내부 실린더 위에서 생산될 수 있다 할지라도, 생물반응기 내부의 다른 위치들도 시딩을 위한 매트릭스의 배치용도로 사용될 수 있다. 내부 및 외부 실린더 사이의 갭은 세포를 위한 배양 관 공간으로서 기능한다. 배양 배지는 외부 소수성 막을 통해 산화된다. Synthecon RCCS 생물반응기의 저 전단 환경은 활발한 스티어링 또는 스파아징과 함께 일어나는 양분의 "씻겨 없어지기" 또는 폐해 없이 세포-세포 및 세포-세포외 매트릭스(ECM) 상호작용을 촉진시킨다. 전형적으로, RCCS 기구는 현탁액 내 세포를 유지하기 위해 요구되는 바의 8 내지 60 RPM의 회전율, 및 관의 중앙 축을 따라 고정된 배양액을 위해서는 8 RPM (바람직하게 2-3 RPM)보다 낮은 속도로 가동된다. Synthecon 생물반응기는 표준 조직 배양 인큐베이터에서 사용될 수 있다.
1. 일렉트로스펀 세포외 매트릭스
일렉트로스피닝 공정이 배향되거나 배향되지 않은 중합체 섬유의 조밀한 매트형 매트릭스를 생산하기 위해 사용될 수 있다. "일렉트로스피닝"은 섬유가 전기적으로 대전된 중합체 용액 또는 용융물을 오리피스를 통해 스트리밍함으로써 용액 또는 용융물로부터 형성되는 공정을 의미한다. 일렉트로스피닝은 초박막의 섬유 직물(연속의 다중 필라멘트) 및 조밀한 물질 매트를 생성하기 위해 직물 산업에서 사용되어 왔다. 이 기술에 의해 형성된 중합체 섬유는 40-500 나노미터 직경 범위에 있다. 일렉트로스피닝에 의해 생산된 직물의 기계적 성질(예를 들면, 강도), 다공도, 및 중량은 공정 조건, 제조 공정에 사용되는 물질 및 침착되는 물질의 두께를 조절함으로써 제어될 수 있다. Gibson, P.W., et al., Electrospun Fiber Mats: Transport Properties, 1998 AIchE J.; Deshi, J., et al., Electrospinning Process and Applications of Electrospun Fibers, 1996 J. Electrostatics 35:151.
본 발명에 따른 일렉트로스펀 섬유의 세포외 매트릭스도 유사하게 생산될 수 있다. 임의 중합체가 사용될 수 있는 반면에, 콜라겐 섬유와 같이 천연 중합체 섬유를 일렉트로스피닝하는 것이 바람직하다. 효과적인 다양한 조건들이 콜라겐 매트릭스를 일렉트로스피닝하는데 사용될 수 있다. 하기는 바람직한 방법을 기술하지만, 다른 프로토콜도 동일한 결과를 달성하는데 수행될 수 있다. 도 2a 및 도 2b를참조하면, 콜라겐 섬유를 일렉트로스피닝함에 있어서, 마이크로피펫(10)에 콜라겐 용액을 채우고 이를 접지된 표적(11), 예를 들면, RCCS 생물반응기의 중앙 실린더 내부에 위치한 금속 접지 스크린에 부유시킨다. 콜라겐 용액을 고 전압으로 각 피펫 팁(13)에 충진하기 위해서 미세 와이어(12)를 용액내에 둔다. 각 용액 및 장치 배열을 위해 결정된 특정 전압에서, 피펫 팁에 부유된 콜라겐 용액을 접지된 표적을 향하게 한다. 콜라겐의 이러한 스트림(14)은 접지된 표적에 도달하자 마자 상호연결된 3차원 초박 콜라겐(직물) 매트릭스를 형성하기 위해 모여져서 건조되는 연속 필라멘트를 형성한다. 최소의 전기 전류가 이 공정에 관여하므로, 이러한 스트리밍 공정은, 절차 도중 콜라겐 용액내에서 예상되는 온도 증가가 없으므로 콜라겐을 변성시키지 않는다.
2. 일렉트로에어로졸 세포외 매트릭스
일렉트로스피닝 공정과 마찬가지로, 일렉트로에어로졸링 공정도 중합체 소적의 조밀한 매트형 매트릭스를 생산하는데 사용될 수 있다. "일렉트로에어로졸링"은 소적이 전기적으로 대전된 중합체 용액 또는 용융물을 오리피스를 통해 스트리밍함으로써 용액 또는 용융물로부터 형성되는 공정을 의미한다. 일렉트로에어로졸링 공정은 일렉트로에어로졸 공정이 절차 동안 중합체의 보다 낮은 농축을 활용한다는 점에서 일렉트로스피닝 공정의 변형에 해당한다. 중합체 스프레이(섬유)를 분무 노즐의 충진 팁에서 생산하는 것 대신, 작은 소적이 형성된다. 이들 소적은 그런 다음, 충진된 팁에서부터 접지된 기질로 이동하여 융합된 중합체 소적--모두 직경에 있어서 10 마이크론보다 작은 종류--로 구성된 스폰지 형태의 매트릭스를 형성한다. 도 8 내지 도 11은 50:50 PGA/PLA 세포외 매트릭스의 일렉트로에어로졸 매트릭스의 주사 전자 현미경 사진이다.
앞서 설명한 일렉트로스피닝 공정에서처럼, 일렉트로에어로졸 공정도 효과적인 다양한 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 일렉트로스피닝 공정에서 사용되는 동일한 장치, 예를 들면, 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같은 장치가 일렉트로에어로졸 공정에서 사용될 수 있다. 일렉트로스피닝과의 차이점으로는, 마이크로피펫 저장소 내 용액의 중합체의 농도 및/또는 소적의 스트림을 생성하기 위해서 사용되는 전압을 들 수 있다. 당업자들은 중합체 용액의 농도에 있어서의 차이가 피펫의 팁에서부터 소적의 형성 및 스트림을 수득하기 위해서 특정 전압의 변형을 필요로 할 것임을 자명하게 인식할 것이다.
3. 일렉트로스핀/일렉트로에어로졸 공정 변형
다양한 중합체가 단독으로 또는 조합하여 일렉트로스펀 및/또는 일렉트로에어로졸 매트릭스를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 콜라겐이 세포외 매트릭스를 형성하는데 사용된다. 임의 적당한 콜라겐이 사용될 수 있으며, I형에서 부터 XIV형까지 포함한다. 바람직한 양태에서, I형 및 III형이 사용된다. 콜라겐은 상업적인 출처로부터 구입가능하거나, 또는 업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
다양한 물질이 일렉트로스피닝 또는 일렉트로에어로졸링 용액에 보충될 수 있다. 목적 산물을 암호화하는 DNA(벡터)가 조직-공학처리된 스캐폴딩내로 혼입되기 위한 중합체 용액에 혼합될 수 있다. 시딩된 세포에 의해 스캐폴딩의 소모/재조직화가 이루어지면, 자신의 DNA 내로 벡터를 혼입(즉, 유전공학처리)시킬 수 있어서 목적하는 결과를 야기한다. DNA는 세포내로 이의 흡입을 향상시키기에 효과적인 한 임의 형태일 수 있다. 예를 들면, DNA는 네이키드(예를 들면, 미국 특허 5,580,859; 5,910,488)이거나 또는 복합 또는 캡슐화될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 5,908,777; 5,787,567). DNA를 첨가하는 것과 유사하게, 성장 인자, 또는 맥관형성 인자와 같은 다른 화학 인자를 일렉트로스펀 또는 일렉트로에어로졸 매트릭스내로 혼입하여 조직 재생을 돕는 것이 가능할 수 있다.
일렉트로스피닝 또는 일렉트로에어로졸링 공정은 주어진 용도를 위해 특정 조건을 충족시키기 위해서 조작될 수 있다. 마이크로피펫은 접지된 기질에 대하여 x, y 및 z 평면을 이동하는 프레임 위에 마운팅될 수 있다. 마이크로피펫은 접지된 기질, 예를 들면, 관상 맨드릴의 모든 둘레에 마운팅될 수 있다. 이 방식에서, 콜라겐 또는 마이크로피펫으로부터 스트리밍되는 다른 중합체는 구체적으로 맞춰지거나 유형화될 수 있다. 비록 마이크로피펫이 수동적으로 이동할 수 있긴 하지만, 바람직하게는 마이크로피펫이 마운팅되어 있는 프레임이 마이크로프로세서 및 모터에 의해 제어됨으로써, 콜라겐의 스트림 유형이 특정 매트릭스를 만드는 사람에 의해 미리결정될 수 있게 된다. 예를 들면, 콜라겐 섬유 또는 소적은 특정 방향으로 배향되거나 또는 층을 이룰 수 있거나, 또는 완전하게 무작위 및 무배향으로 프로그래밍될 수 있다.
일렉트로스피닝 공정에서, 중합체 스트림은 분기하여 중합체의 피브릴을 형성할 있다. 분기 정도는 전압, 접지 기하학, 마이크로피펫 팁에서부터 기질까지의거리, 마이크로피펫 팁의 직경, 중합체 농도 등을 포함하나 이에 국한되지는 않은 많은 요인에 의해 변할 수 있다. 이들 변수들은 미세섬유 방직용 직물을 일렉트로스피닝하는 업계의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
접지된 표적의 기하학은 바람직한 매트릭스를 생산하기 위해 변형될 수 있다. 바람직한 양태에서, 회전 벽 생물반응기가 사용된다. 접지된 표적은 일렉트로스피닝 또는 일렉트로에어로졸링 공정에서 내부 실린더 내면에 맞는 실린더이다. 접지 기하학을, 예를 들면, 평면 또는 선형 또는 다중점 접지를 가지도록 변화시킴으로써, 콜라겐을 스트리밍하는 방향이 변하며 특정 적용에 따라 맞춰질 수 있다. 에컨대, 일련의 평행 라인을 포함하는 접지된 표적은 특정 방향으로 일렉트로스펀 콜라겐을 배향시키는데 사용될 수 있다. 접지된 표적은 실린더 맨드릴일 수 있으며, 이로써 관상 매트릭스가 형성될 수 있다. 가장 바람직하게는, 접지면은 그 내에 프로그래밍된 특정 접지 기하학을 명령하는 마이크로프로세서에 의해 제어될 수 있는 가변 표면일 수 있다. 대안적으로, 가령, 접지는 콜라겐을 스트리밍시키는 고정된 마이크로피펫 팁에 따라 x, y, 및 z 평면에서 이동하는 프레임 위에 마운팅될 수 있다. 도 2b에서 접지된 표적은 세로축을 따라 변동할 수 있는 것으로 도시된다.
콜라겐이 그 위에 스트리밍되는 기질은 접지된 표적 자체이거나 또는 마이크로피펫 팁과 접지된 표적 사이에 위치할 수 있다. 기질은 특이한 형태, 예를 들면, 심장 또는 이의 부분 또는 혈관 그래프트의 모양으로 만들어져 특정 모양의 근육을 대체하거나 대용할 수 있다.
기질 모양의 변형을 통해 그리고 일렉트로스펀 또는 일렉트로에어로졸의 특정 배향과 밀도를 프로그래밍함에 의해, 아주 복잡한 근육 패턴이 특정 적용을 위한 특정 근육 형태가 생성되는 것을 가능하도록 복제될 수 있다. 대안적으로, 예를 들면, 콜라겐은 미리 선택된 형태로 스트리밍될 수 있다. 매트릭스의 두께 및 속성은 연골, 상아질 패킹, 또는 다른 유사 보철을 형성하기 위해 미리 선택될 수 있다. 이런 유형의 적용을 위한 개략적 예는 도 7에 도시되어 있다.
일렉트로스피닝 및 일렉트로에어로졸링에 있어서의 다른 변형은 하기를 포함한다:
1. 둘 이상의 상이한 섬유 또는 소적(매트릭스 섬유 또는 소적 정렬)을 동시에 생산하기 위한 상이한 용액(예를 들면, 콜라겐 I 및 III)의 사용. 이 경우에, 단일 성분 용액이 분리된 저장소에 유지될 수 있다.
2. 복합 중합체(섬유 조성물 "블렌드")로 구성된 섬유 또는 소적을 생산하기 위한 동일 저장소에서 혼합 용액(예를 들면, 콜라겐 I 및 III)의 사용. 비생물학적이지만 생물학적으로 적합한 물질이 콜라겐과 같은 생물학적 물질과 혼합될 수 있다. 예를 들면, PVA, PLA, PGA, PEO 등.
3. 상이한 용액을 위해 또는 심지어 동일한 용액을 위해 적용되는 복합 전위의 활용.
4. 둘 이상의 상이한 기하학적 접지된 표적을 가짐(즉, 소형 및 대형 메쉬 스크린).
모든 이들 변형은 광범위의 일렉트로스펀 및 일렉트로에어로졸 세포외 매트릭스를 생산하기 위해서 개별적으로 또는 서로 조합하여 행해질 수 있다.
또한, 일렉트로스펀 및 일렉트로에어로졸 중합체 모두를 포함하는 매트릭스가 형성될 수도 있다. 즉, 섬유 및 소적의 배합이 모방될 특정 구조에 의해 예견되는 일부 적용을 위해 이로울 수 있다. 섬유 및 소적의 이러한 조합은 전기적 대전을 변화시킴에 있어 동일 마이크로피펫 및 용액을 사용함으로써; 접지된 기질로부터 거리를 변화시키거나; 저장소에서 중합체 농도를 변화시키거나; 다중 피펫을 사용함으로써 --일부는 섬유를 스트리밍하기 위한 것이고 나머지는 소적을 스트리밍하기 위한 것--; 당업자가 꾀할 수 있는 방법에 대한 임의 다른 변화에 의해서 수득될 수 있다. 섬유 및 소적은 동일 층에서 함께 층을 이루거나 혼합될 수 있다. 일렉트로스피닝 및 일렉트로에어로졸링 공정의 가능한 조합은 실질적으로 비제한적이다.
일렉트로스펀 또는 일렉트로에어로졸 매트릭스의 안정성, 강성, 및 다른 속성은 화학적으로 변형될 정도로 조절될 수 있다. 일렉트로스펀 또는 일렉트로에어로졸 매트릭스는 비변형된 상태에서 사용될 수 있거나, 또는 특정 적용의 요건에 따라 변형될 수 있다. 매트릭스의 변형은 일렉트로스피닝 또는 일렉트로에어로졸링 공정 동안에 또는 그것이 침착되고 난 후에 행해질 수 있다. 카보디이미드 EDC (1-에틸-3(3 디메틸 아미노프로필)), 카보디이미드 하이드로클로라이드, NHS (n-하이드록시숙신이미드), 또는 UV 광과 같은 가교결합제가 예를 들면, 근막초를 단백질 가수분해 공격으로부터 안정화시키거나 콜라겐 겔의 안정성을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, Van Wachem, et., 1996 Myoblast seeding in acollagen matrix evaluated in vitro, J. Biomedical Materials Res. 30:353-60을 참조.
4. 혈관 보철을 생체모방하기
공학처리되는 세포외 매트릭스 및/또는 근육(배지 성분)의 한 유형은 혈관 보철이다. 성공적인 보철은 보철이 동맥 또는 대체될 다른 혈관 또는 지류를 생체모방한다면 훌륭히 수행될 수 있다. 이러한 보철을 생성하는데 있어서 중요한 것 중의 하나는 보철을 위한 스캐폴딩이 될 세포외 매트릭스의 배향과 층 형성이다.
혈관 보철은 일렉트로스펀 또는 일렉트로에어로졸 중합체(들)의 매트릭스에서 및/또는 콜라겐 겔에서 얇은 콜라겐 섬유(<150㎛)의 권취를 포함한다. 임의 중합체가 사용될 수 있다 할지라도, 천연 중합체가 바람직하다. 일렉트로스펀 PLA 섬유를 사용하는 특정 예에서, 일렉트로스펀 섬유의 매트릭스는 얇은 맨드릴 둘레에서 형성된다. 콜라겐 섬유는 그리고 나서, 일렉트로스펀 섬유의 매트릭스 둘레에서(그 내에 파묻혀) 나선형으로 권취된다. 콜라겐 섬유 및 일렉트로스펀 매트릭스의 복합체는 천연 동맥에서 발견되는 것과 유사한 잔류 응력 환경을 조성시킨다. 권취된 섬유 및 일렉트로스펀 매트릭스의 다중층은 대체될 특정 혈관계를 모방하기 위해서 특정 피치로 배향된 다중층 보철의 각 층으로 조립될 수 있다. 특정 적용은 층의 개수와 두께를 결정할 수도 있다. 소직경의 동맥을 짓기로 꾀해진 일 양태에서, 각 층은 각각이 다양한 피치로 권취된(도 12는 5층 보철을 보여준다) 콜라겐 피브릴 다발/평활근 세포 구조를 가지는 원통형이다. 콜라겐과 세포 성분으로부터 혈관 구조물을 개발하기 위한 종전 시도 모두는 다음 두 가지로 이유로 성공적이지 못했다: 1) 콜라겐은 평활근 세포를 함유하는 겔 형태로 첨가되어 고형 맨드릴 둘레에서 형성되도록 되어졌고(특정 배향 없이) 2) 절차는 고정 상태에서 유지되었다.
각 층을 구성하는 중합체(바람직하게는, 콜라겐 및/또는 기타 천연 중합체)는 본원에 설명된 일렉트로스피닝 및/또는 일렉트로에어로졸링 기술을 사용하여 배향될 수 있다. 대안적으로, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 층은 특정 피치로 맨드릴 둘레에 섬유를 기계적으로 권취함으로써 맨드릴 위에서 형성될 수 있다. 또한 대안적으로, 기계적 권취 및 일렉트로스피닝/일렉트로에어로졸링의 조합은 세포외 매트릭스를 조립하는데 사용될 수 있다.
보철에서 중합체 섬유의 기계적 권취는 세포외 매트릭스 위에 연속적으로 시딩된 근육 세포에 예기치 않은 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 권취된 중합체(콜라겐)에서의 잔류 응력은 나선형으로 권취된 중합체의 방향으로 근육 세포의 성장을 촉진시키는 에너지를 보철에 생성한다. 이 잔류 응력은 또한 천연 동맥에서 발견되는 실제 응력을 모방하기도 한다. 도 17 내지 도 19는 매트릭스 및 권취된 섬유 복합체와 보철에 시딩된 근육 세포의 배향성을 보여준다.
또한, 실시예 4에 기재된 특정 양태는 단순, 관상 혈관 그래프트에 관한 것이다. 테이퍼링되거나 및/또는 분기된 도관을 포함하는 보다 복잡한 모양이 만들어질 수도 있다. 필요한 모든 것은, 많은 섬유가 그 둘레에 권취되거나 일렉트로스펀/일렉트로에어로졸 중합체가 그 둘레에 배향될 상이한 형상의 맨드릴이다.
B. 공학처리된 힘줄
공학처리된 근육을 뼈에 정착시키는 공학처리된 힘줄, 또는 연결 조직 지지대는 압출된 콜라겐 섬유 또는 기타 적절한 물질로부터 조립될 수 있다. 콜라겐 섬유가 바람직한데, 그 이유는 콜라겐이 수용자의 면역 체계에 의해 거부될 가능성이 적기 때문이다. 이들 섬유는 근육 이식편의 전체적인 구조적 보전성을 안정화시키기 위해 세포외 매트릭스와 조합하여 기능한다. 공학처리되는 힘줄의 제조를 위해 콜라겐 섬유는 공지된 방법 후에 압출될 수 있다. Kato, Y.P. and Silver, F.H., Formation of Continuous Collagen Fibers: Evaluation of Biocompatibility and Mechanical Properties, 1990 Biomaterials 11:169-75; Kato, Y.P., et. al., Mechanical Properties of Collagen Fibers: A Comparison of Reconstituted Rat Tendon Fibers, 1989 Biomaterials 10:38-42; and U.S. Patent Nos. 5,378,469 and 5,256,418 to Kemp, et. al.
바람직한 콜라겐 압출 장치는 시린지 펌프, 미세내경 튜빙, 탈수통, 재순환 펌프, 세정통, 건조 챔버, 가열 공기 건조기, 및 콜라겐 섬유 권취기를 포함한다. 시린지는 탈기된 콜라겐으로 채워져서 시린지 펌프 위에 마운팅된다. 그런 다음, 콜라겐 용액은 시린지로부터 압출되어, 미세내경 튜빙을 통해 탈수조내로 간다 (Polyethylene glycol in PBS). 이어서, 형성된 콜라겐 섬유는 세정조(포스페이트 완충 식염수, PBS)을 통해 안내되어 건조기 내 권취 시스템에 달라붙는다. 일단 초기 섬유가 형성되어 권취 요소에 달라붙으면 공정은 자동으로 계속된다. 대략 8 cm/분의 압출율로 압출 장치는 길이가 1-10 미터이고 직경이 50-250㎛인 섬유를 만들 수 있다. 생산 후, 섬유 직경은 주사 전자 현미경 및 광학 현미경 평가를 통해 확인될 수 있다. 반응 조건을 변화시킴으로써 중합될 콜라겐 섬유의 직경을 조절한다. 공학처리된 콜라겐 섬유의 물리적 성질은 압출 물질의 조성을 조절함으로써 추가 변형 및 제어될 수 있다. 공학처리된 힘줄의 탄성은 압출됨에 따라 콜라겐 용액 내로 혼입되는 엘라스틴, 피브린 또는 인공 물질에 의해 조절될 수 있다. 공학처리된 이식편을 사용하기 이전에 콜라겐 섬유는 과아세트산 멸균에 의해 멸균된다.
C. 공학처리된 근육 세포
임의 유형의 근육 세포가 본 발명에 사용될 수 있으며, 세포 배양 균주, 형질전환 세포, 일차 근육 세포, 미성숙(embryonic) 근육 세포, 신생아 근육 세포, 미성숙 줄기 세포(stem cell) 등을 포함한다. 바람직한 세포는 줄기 세포 또는 근육 세포(또는 근육 세포 전구체)로서, 이들은 근육이 이식될 숙주로부터 수득된다. Barrofio, A., et al., Identification of Self-Renewing Myoblasts in the Progeny of Single Human Muscle Satellite Cells, 1996 Differentiation 66:47-57; Blau, H.M. and Webster, C., Isolation and Characterization of Human Muscle Cells, 1981 Proc. Natl. Acad. Sci 78:5623-27. "일차 근세포(primary myocyte)"란 용어는 숙주 동물 근육으로부터 직접 수득되며 분화능을 보유하며 최소 회수로 계대한 근육 세포를 의미한다. 그러한 세포는 일반적으로 형질전환되지 않는다.
이식편에 사용될 세포 유형은 공학처리된 근육에 의해 재구성되거나 바로잡거나 신장될 이식 부위 및 용도에 의존한다. 다양한 세포 유형이 사용될 수 있으며, 이는 하기를 포함하나 이에 국한되지는 않는다: 태아 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 가로무늬근 베드로부터의 수반(satellite) 근육 세포, 심근 세포, 평활근 세포, 근육 세포주, 형질전환 세포주 및 통상 공학처리된 세포주. 태아, 신생아, 성인 조직으로부터 분리된 세포도 사용될 수 있다. 태아 심장 근세포는 심장 보철의 제조에 사용될 수 있다. C2C12 근육 세포주의 세포도 골격근 이식편의 제조를 위해 사용될 수 있다. 장기적인 면에서 줄기 세포 집단(성숙 또는 미성숙)이 근육 제조를 위한 이상적인 세포원일 것이다. 줄기 세포는 거의 어느 유형의 들면, 평활근, 심근, 골격근, 연골, 뼈 등)로도 공학처리될 수 있기 때문에 이런 용도를 위해 매력적이다. 이는 근육 이식편으로 치료될 환자로부터 유래될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없는데, 왜냐하면 다른 출처로부터 유래된다 할지라도 면역 반응을 유발하지 않을 것이기 때문이다.
골격근의 경우, 수반 근육 세포는 근육 이식편을 받게 될 피험자의 적당하고 조심스러운 도너 부위로부터 유래된다. 근육 생체조직편은 분리되어 절단에 의해 연결조직이 제거된다. 다양한 프로토콜이 이식편을 공학처리 하기 위해서 근육으로부터 수반 또는 다른 유형의 세포를 분리하는데 활용될 수 있다. 예를 들면, 한 프로토콜은 다음과 같을 수 있다: 분리된 근육 세포를 분할시켜 일정한 교반 하에 트립신-EDTA 분해(또는 기타 적당한 효소)에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리시킨다. 효소 해리 절차가 끝날 쯤에, 분해 배지를 10% 혈청을 첨가하여 억제시킨다. 세포 현탁액을 원심분리에 의해 씻고 샘플을 장래 사용을 위해 액체 질소에 보관한다. 분리된 세포의 균형은 면역분리법을 통하거나 차동 유착의 사용을 통하거나 유동사이토메트리에 의해 수반 세포에서 풍부하게 된다. 유동 사이토메트리는 크기에 의해, 세포주기상에 의해, 또는 표지 되었다면, 세포 표면 마커에 의해 세포를 분리시키는데 사용될 수 있다. 차동 유착에서, 세포를 짧은 배양 기간 동안 배양 용기에 둠으로써 오염된 섬유아세포를 용액으로부터 내보내도록 함으로써 수반 세포에서 잔존하는 세포 집단을 풍부하게 한다. 보다 더 긴 간격의 차동 유착은 수반 세포를 내보내도록 함으로써 오염된 표적물 및 근육 세포로부터 정제될 수 있도록 한다. 마이오겐성 수반 세포를 함유하는 풍부해진 세포 분획은 액체 질소중 -70℃에서 보관된다. 수반 세포를 분리하고 정제하는데 사용된 기술에 관계없이 샘플은 녹여져서 배양 용기에 플레이팅되어 마이오겐 포텐셜에 대해 시험된다. 분화를 겪게 될 세포 무리는 근육 이식편의 제조에 사용된다. 부분 정제 후, 클론을 마이오겐 포텐셜에 대해 시험하는데, 예를 들면, 세포를 콜라겐-코팅 디쉬에 플레이팅하여 유착된 세포들이 근육 세포의 특성을 보이는지를 관찰한다.
일차 세포 분리물로부터의 후보 클론을 적절한 배지, 예를 들면, 10-15% 혈청을 함유하는 적당한 배지에서 희소 배양 조건(예를 들면, 낮은 세포 밀도)에서 배양시켜 충분한 수의 세포를 이로부터 이식편이 패턴화되도록 축적시킨다. 일단 충분한 수의 세포가 수득되면(제조될 이식편의 크기에 의존), 이는 보철 근육의 조립용 생물반응기내로의 삽입에 놓여진다. 생물반응기에서의 근육세포 분화는 고혈청 배지(10-15% 혈청)를 저혈청 배지로 대체함으로써 유도될 수 있다.
제조된 근육에서 사용되는 세포는 유전자 조작에 용이하게 다뤄질 수 있어야 한다. 예를 들면, 맥관형성 인자를 암호화하는 유전자, 성장 인자 또는 구조 단백질은 분리된 세포내로 혼입될 수 있다. 이는 근육 구조물의 제조 전이나 제조 도중 또는 제조 후에 행해질 수 있다. 유용한 유전자는 예를 들면, VEGF, FGF, 및 관련 유전자를 포함한다. 유전자를 세포내로 도입하기 위해서는, 임의 효과적인 방법이 사용될 수 있으며 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터, DNA, 플라스미드 등을 포함한 방법이 사용될 수 있다.
D. 공학처리된 골격근 이식편의 조립
근육 이식편은 세개의 뚜렷한 성분들, 세포외 매트릭스, 공학처리된 힘줄 및 근육 세포 집단을 포함할 수 있다. 앞서 상술한 바와 같이, 콜라겐 섬유 및 다른 생물학적으로 적합한 물질로 구성된 세포외 매트릭스 RCCS 생물반응기 (또는 적당한 대체물)의 내부 실린더의 외면 위에서 만들어진다. 이 섬유 매트의 구조적 성질은 만들어진 섬유의 직경, 반응에 사용되는 물질의 상대농도(예를 들면, 콜라겐 I형 내지 III형 또는 다른 혼입 물질의 농도), 및 기타 반응 조건에 의해 조절된다.
일 바람직한 양태에서, 콜라겐 또는 다른 적당한 매트릭스 물질의 얇은 겔 매트릭스가 근육 세포 유착, 분화, 및/또는 정렬을 향상시키기 위해서 세포외 매트릭스의 표면 위에 적용될 수 있다. 겔 매트릭스는 일렉트로스피닝, 분무, 액침, 살포, 적하 등을 포함하는 임의 적절한 방식으로 적용될 수 있다. Simpson, et. al., Modulation of Cardiac Phenotype in vitro by the Composition and Organization of the Extracellular matrix, 1994 J. Cell Physiol. 161:89:105. 바람직한 일 양태에서, 얇은 겔 내 콜라겐 섬유는 공동축을 따라 정렬된다. 예를 들면, 정렬된 매트릭스는 이의 콜라겐 일렉트로스펀 코팅을 가지고 RCCS 생물반응기의 실린더 중심 코어를 콜라겐 빙냉 중성 원액(1 ㎎/㎖) (I형 또는 III형 또는 이의 혼합물) 내로 액침함으로써 생성될 수 있다. 매우 짧은 간격(1-3초) 후, 실린더를 용액으로부터 제거하고 과량의 콜라겐이 실린더의 원위 말단으로부터 중력에 의해 배출되도록 한다. 실린더의 배향성은 이 공정 내내 일정하게 즉, 그것이 액침된 콜라겐 용액에 대해 수직으로 유지된다. 이는 과량의 콜라겐이 실린더의 장축으로부터 배출되도록 가능케 한다. 그리고 나서, 실린더를 인큐베이터, 예를 들면, 37℃로 맞춰진 인큐베이터내에 두어 콜라겐이 약 60분 내지 그 이상 중합되도록 한다. 중합이 완결된 후, 정렬된 콜라겐 섬유를 기초를 이루는 근막초 위에서 건조되도록 한다. 이들 절차들은 배출된 실린더 축을 따라 배열된 정렬된 콜라겐 피브릴의 박층을 야기한다. 도 3 참조. 콜라겐을 정렬시키는 다른 방법, 예를 들면, 설명된 일렉트로스피닝 시스템을 사용하거나 콜라겐 용액에서 코어의 액침 후 원심분리를 사용하는 것이 이용될 수 있다. 이 단계를 마침에 있어서, 콜라겐이 어떤식으로 정렬되었는지에 상관없이, 중앙 RCCS 실린더는 정렬 콜라겐의 박층으로 피복되거나 코팅된 일렉트로스펀 콜라겐 섬유(세포외 매트릭스)의 매트형 코팅을 가진다.
필요시, 세포외 매트릭스는 폴리에스테르 메쉬 및 기타 합성 물질과 같은 다른 물질도 혼입할 수 있다.
또한, 이미 설명한 바와 같이, 콜라겐 섬유의 얇은 겔에 대한 필요성은 일렉트로스펀 매트릭스가 일렉트로스피닝 공정 중에 충분히 배향되면 제거될 수 있다. 달리 설명하면, 추가의 배향 콜라겐의 겔 층은 콜라겐 또는 다른 중합체의 세포외매트릭스(골격근의 예에서 근막초)가 비배향성일 때만 필요하다.
이어서 대직경의 압출 콜라겐 섬유(공학처리된 힘줄)가 정렬 콜라겐 겔 상에 적용된다. 이식편의 기계적 성질이 이 단계에서 두 개별 부위에서 조절된다. 첫째, 각 압출 섬유의 두께 및 이식편에 첨가된 이러한 필라멘트의 수에 의해 조절된다. 둘째, 보철의 장축에 대한 이들 섬유의 배향에 의해 조절된다. 이식편은 이들 섬유를 파동 패턴으로 적용함으로써 더욱 경직되거나 덜 경직될 수 있다. 큰 섬유는 또한 원위 말단에 매트릭스를 중첩시키는 것만으로, 즉 공학처리된 근육의 전체 길이를 러닝할 필요 없이 매트릭스에 부착될 수 있다. 사용된 배향에 상관없이, 압출된 섬유의 말단을 이식편의 원위 말단으로부터 돌출시킨다. 이 단계의 마침에 있어서, 대직경의 콜라겐 섬유가 정렬 콜라겐 겔의 섬유에서 건조된다. 대안의 제작 공정이 이식편의 기계적 성질을 추가로 상업화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 1차로 대직경의 콜라겐 섬유, 일렉트로스피닝으로 침착된 콜라겐 섬유, 이어서 대직경의 콜라겐 섬유, 정렬 콜라겐 겔 및 주변 세포의 또다른 층이 놓일 수 있다. 이 조립 공정의 다른 순열도 가능하다.
힘줄은 또한 힘줄 섬유아세포와 합성 근육층을 조합함으로써 원위치에서 형성될 수도 있다. 예를 들면, 힘줄 섬유아세포는 또한 수용자 자신의 힘줄로부터 수확될 수 있다. 이러한 세포를 본원에 설명된 바와 같이 합성된 근육층의 말단에 둔다. 힘줄을 생물반응기에서 근육층과 함께 성장시킨다. 힘줄 섬유아세포는 본원의 정렬 기질의 사용으로 또는 다른 배향 방법으로 배향성으로 성장하도록 조장된다. 이 방법이 선택되면, 압출 힘줄과 배양 힘줄의 조합이 특정 적용을 위해 바람직할수 있지만, 본원에서 설명된 압출 콜라겐 힘줄은 불필요하게 된다.
제작 공정의 최종 단계에서, 공학처리된 근막초 및 정렬 콜라겐과 대직경의 콜라겐 섬유의 오버레이 층을 지니는 내부 실린더가 RCCS 생물반응기에 로딩된다. 피실험자 또는 적합성 도너로부터 분리된 수반 근모세포와 같은 근육 세포가 챔버에 로딩되고 콜라겐계 기질과 상호반응한다. RCCS 생물반응기가 바람직하게 이 단계에서 사용되는데 그 이유는 매우 저 전단 환경에서 매우 풍부한 영양물을 제공하기 때문이다. 그러나, 다른 배양 용기가 사용될 수도 있다. 이러한 조건하에서, 다중층(48시간에 8-12 층)의 정렬 세포를 포함하는 근육 세포 배양액의 조립이 가능하다. 근육 이식편의 조립에서, 세포는 현탁 배양액으로부터 서서히 고갈되고 콜라겐 매트릭스(직접 일렉트로스펀 매트릭스에 또는 콜라겐 겔 코팅에)에 플레이팅되어, 공학처리된 조직의 3차원 배열을 형성한다. 추가의 수반 세포가 필요시 생물반응기에 첨가되어 추가의 세포층을 조합한다. 목적하는 대부분의 세포가 근막초에 플레이팅되면, 이들은 예를 들어, 혈청 배지로의 전달에 의해 근관으로 분화된다. 또한, 배양액내 조직 또는 세포로의 산소 전달을 증가시키기 위해 시험관내에서 사용될 수 있는 인공 산소 운반체가 있다. 이들은 근육이 제작될 때 수반 세포와 함께 반응기 중으로 혼합될 것이다. 이들 운반체가 배양 배지의 산소 함량을 증가시킨다는 점에서 이들은 기본적으로 적혈구처럼 기능한다.
임의의 적당한 배양 배지(혈청 및 다른 비규정 성분, 규정 배지 또는 이들의 배합물, RPMI 등을 포함하는 배지를 포함)가 사용되어 세포를 성장시킬 수 있다.
분화 과정의 완료로, 골격근 이식편이 피실험자의 재구성 부위로의 이식을위해 준비된다. 이식편은 생물반응기의 중앙 실린더로부터 제거된다. 이식편의 크기 및 두께는 두 상이한 수준으로 - 첫째, 중앙 실린더로 조립된 세포층의 수, 둘째, 근육 이식편을 작제하기 위해 사용된 조직 시이트의 크기에 의해 공정의 이 단계에서 조절된다. 이 후자의 절차는 트리밍(예: 직사각형 시이트로 - 도 5a), 스택킹 및 공학처리된 근육의 목적하는 구조로의 롤링(도 5b)을 포함한다. 이와 달리, 공학처리된 근육은 예를 들면, 편평한 시이트로서 얼굴 근육의 재구성을 위해 직접 이식되거나 중첩될 수 있다. 공학처리된 근육이 근육 층의 축 골격을 재구성하기 위해 사용되면, 이는 공학처리된 근육(21)의 말단으로부터 돌출된 대직경의 콜라겐 섬유(20)를 통해, 근막초 자체의 원위 말단을 통해, 또는 이들 방법의 조합을 통해 이식 부위에 부착될 수 있다.
조직이 선천성 심장 결함을 치료하거나 심근의 다른 기능장애 영역을 치료하거나 얼굴 표정 근육을 복구하기 위해 사용되면, 이는 피브린 글루로 적소에 봉합 또는 부착될 수 있다. 조립 공정을 수정함으로써, 심장 근육 또는 평활근의 재구성을 위한 이식편이 조립될 수 있다. 일반적으로, 주요 수정은 본 출원에서 설명된 공학처리된 세포외 매트릭스 및 연결 지주 또는 힘줄의 상대 패턴에 있을 수 있다. 심장 조직 및 평활근은 힘줄이 부족하다. 그러나, 대직경의 콜라겐 섬유의 사용이 이식편에 기계적 강도를 제공하기 위해 여전히 바람직할 수 있다. 심장 이식편의 경우에는, 큰 섬유가 이식편을 조립하거나 조작하기 위한 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 이러한 이식편 조합의 핵심적인 공통 특징은 조직화의 생체내 패턴으로 세포로 구성된 다중층 이식편의 제작능이다.
이식된 근육 조직의 혈관형성은 수술 후 수일 내에 원위치에서 일어날 것이다. 이는 상기에서 언급한 바와 같이, 펩타이드 또는 유전자 요법으로 투여된 맥관형성 및 성장-촉진 인자에 의해 추가 자극될 수 있다. 공학처리된 조직에 혈관을 공급하기 위한 또다른 대안은 근육을 망(omentum)에 일시적으로 이식하는 것이다. 망은 공학처리된 조직의 유지를 위해 리빙 인큐베이터처럼 탭핑되고 사용될 수 있는 대규모의 풍부한 혈관 공급을 가진다. 공학처리된 조직이 생물반응기로부터 제거될 것이고 망에 랩핑될 것이며 주변 조직으로부터의 영양물과 산소의 확산에 의해 유지될 것이다. 이와 달리 또는 이 접근법과 아울러, 공학처리된 조직은 망의 내생성 혈관 공급에 직접 연결될 수 있다. 혈관은 부분적으로 천공되거나 절단되거나 망 없이 간단히 절개될 수 있다. 이어서 공학처리된 조직은 혈관 주변에서 랩핑될 수 있다. 공학처리된 조직은 천공 혈관으로부터 누설되는 영양물에 의해 또는 혈관이 손상되지 않았다면 영양물의 간단한 확산에 의해 유지될 것이다. 전략에 상관없이, 공학처리된 조직은 망과 이의 풍부한 혈관 공급으로 둘러싸일 것이다. 또한 근육을 내생성 혈관계로 공학처리하는 것도 가능하다. 이식편 수용자에서 이 혈관계는 인공 혈관 또는 도너로부터 절단된 혈관으로 구성될 수 있다. 이어서 공학처리된 조직은 혈관 주변에서 조립될 것이다. 이러한 혈관을 공학처리된 근육의 조립 중에 또는 그 후에 근육으로 엔벌로핑함으로써, 공학처리된 조직은 수용자의 혈관계에 부착될 수 있는 혈관을 가질 것이다. 이 예에서, 망의 혈관은 절단될 것이다. 공학처리된 근육의 혈관은 망 혈관의 두 자유 말단에 삽입되고 연결될 것이다. 혈액은 망 혈관으로부터 근육의 혈관계로 이동하고, 이어서 근육을 통해 이동하여망 혈관으로 다시 흐른다. 망의 조직을 랩핑하고 이를 망 혈관에 연결함으로써, 공학처리된 조직은 제작 중에 근육에 도입된 망 및 혈관으로부터 영양물의 확산에 의해 유지될 것이다. 적당한 시간 후에, 근육은 망 "인큐베이터"로부터 제거될 것이고 수용자의 정확한 부위에 위치한다. 이러한 유형의 전략을 사용함으로써 공학처리된 근육이 생물반응기로부터 제거된 후 초기 수일 동안 영양물이 풍부한 환경에서 유지될 수 있다. 망의 환경은 또한 이식된 조직에서 신생 혈관의 형성을 촉진하는 능력을 가진다. 이 망 인큐베이터 전략은 또한 이미 설명된 다른 맥관형성 전략과 조합될 수 있다.
전술한 공학처리된 근육은 여러 측면에서 유리하다. 첫째, 이식편의 연결 백본 지지체가 천연 물질을 포함한다. 이 물질은 낮은 항원성 잠재력을 가지고 초를 생성하기 위해 사용된 상이한 콜라겐 이소형의 상대 농도, 사용된 섬유의 두께 및 매트릭스에 존재하는 화학적 가교결합 정도를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 이의 구조적 성질이 다수의 상이한 부위에서 조절될 수 있다. 다음에, 이식편은 이식편의 구조적 성질을 추가로 수정하고 공학처리된 근육을 이식 부위에 고정시키기 위한 수단을 제공하기 위해 대직경의 콜라겐 섬유를 사용한다. 이러한 섬유는 수술 봉합선(>250 ㎛)을 제조하기 위해 사용되는 섬유와 매우 유사하지만, 압출 공정은 섬유 직경의 양호한 조절 및 통상의 봉합선보다 훨씬 작은 직경(반응 조건에 따라 50 내지 200 ㎛)을 가지는 섬유의 제작을 허용한다. 다른 실험실의 예비 연구가 래트에서 힘줄 생성 및 래트의 실험용 복부 상처의 치료를 위한 직포 시이트의 형성에서 압출 콜라겐 섬유의 효율을 보여준다. 대직경의 압출 콜라겐 섬유의 이식은이러한 실험에서 백그라운드 수준 이상으로 염증을 유도하지 않았다.
이식편을 작제하기 위해 사용된 줄기 세포 또는 근육 세포가 근육 재구성을 필요로 하는 피실험자 또는 다른 합당한 도너로부터 분리될 수 있다. 이는 면역 반응을 유도하지 않을 세포를 사용하는 자명한 장점을 가지는데, 그 이유는 이들이 재구성을 필요로 하는 피실험자(자가이식 조직)로부터 기원하기 때문이다. 상대적으로 작은 근육 생체검사가 이식편을 작제하기에 충분한 수의 세포를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 이는 주변 근육 세포를 위한 도너 부위로 작용하는 내생성 근육 조직에의 기능적 결함 및 손상을 최소화한다.
이 근육 보철 특유의 또다른 요소는 각 근육 세포의 형태 및 이들의 3차원 배열이다. 배양액은 생체내-유사 패턴의 조직화에서 공통 축을 따라 분포된 근육 세포의 선형 3차원 배열로 구성된다. 이는 규정된 방향을 따라 수축력을 유도할 수 있는 이식편을 배치할 수 있게 하고, 기능장애 근육층의 구조적 및 기능적 복구를 허용한다. 이 특징은 손상된 근육의 기계적 및 전기적 성질을 모두 복구하는데 필수적인 심장 근육에서 특히 중요하다. 콜라겐의 랜덤 겔로 제조된 배양액은 이 특이한 정렬이 결여되었다. 도 4a(정렬)와 도 4b(랜덤)를 비교한다. 랜덤 배양액은 재구성에 사용하기에 부적당한데 그 이유는 이들이 심장의 손상되지 않은 골격근과 각 세포층의 특성을 보이는 잘 규정된 배향이 결여되었기 때문이다. 손상되지 않은 근육의 높은 극성은 수축 중에 규정된 축을 따라 기계적 힘을 효과적으로 및 효율적으로 적용하게 한다. 이 성질은 또한 조직을 통한 전기 임펄스의 전도를 촉진한다.
전략은 이식편 내에서 혈관 요소의 형성을 촉진하도록 수행되어야 한다. 다수의 옵션이 이용 가능하다. 첫째, 공학처리된 조직이 원위치에 위치하면 이식편에 혈관 요소의 형성을 촉진하기 위해 혈관모세포 및/또는 내피 세포가 시딩될 수 있다. 둘째, 맥관형성 펩타이드가 삼투압 펌프를 통해 공학처리된 조직으로 도입될 수 있다. 삼투압 펌프의 사용은 활성 펩타이드 또는 언급한 바와 같은 맥관형성 펩타이드 또는 성장 인자를 해당 부위에 생물학적으로 효율적이고 비용-효과적인 방법으로 직접 전달할 수 있게 한다. 허혈성 골격근의 혈관층으로의 실험이 이 접근법의 효율을 입증하였다(Hopkins et al., Controlled delivery of vascular endothelial growth factor promotes neovascularization and maintains the limb function in a rabbit model of ischemia, 1997 J. of Vascular Surgery 27:886-95). 허혈성 토끼의 후지에 전달된 VEGF는 허혈성 대조에 비해 모세관 층 성장을 촉진하고, 혈관 분기를 증가시키며 근육 기능을 개선한다. 이식 초기에, 손상되지 않은 근육 이식편의 초기 근육 퇴행(Faulkner et al., Revascularization of skeletal muscle transplanted into the hamster cheek pouch: Interavital and light microscopy, 1983 Microvascular Res. 26:49-64)이 근육 분화 직전에 공학처리된 근육 조직을 이식하는 것이 바람직할 수 있음을 설명해준다. 대안의 접근법은 완전히 분화된 근육 작제물에 이들이 원위치에 이식되기 직전에 추가의 수반 세포 및/또는 내피 세포 및/또는 혈관모세포가 "시딩"되는 것이다. 또한, 망 "인큐베이터"의 사용은 이미 설명되었다.
골격근의 생체내 탈신경은 유효한 조직의 위축 발생을 촉진한다. 대부분은,이 반응이 유발되는 것 같은데 그 이유는 탈신경이 유효 근육에서 관찰되는 휴면 긴장 정도를 감소시키기 때문이다(Thomsen and Luco 1944; Gutman et al., 1971). 시험관내에서, 탈신경의 효과는 긴장을 제거된 근육에 적용함으로써 실질적으로 극복될 수 있다. 심장 근육은 또한 이의 주변 기계적 환경에 매우 민감하다. 근육 대부분이 이를 이식할 때 긴장하에 둠으로써 공학처리된 보철에 초기에 유지될 수 있다. 이식편의 비대 또는 스트레칭을 촉진하는 다른 방법도 이용가능하다. 기계적 스트레처가 이식편을 팽팽하게 하거나 느슨하게 하기 위해 이식편 말단의 "힘줄"을 링 클램프에 부착시킴으로써 생물반응기에서 사용될 수 있다. 도 6은 섬유가 두 말단 지지체(30)에 의해 생물반응기의 내부 실린더 표면에서 제자리에(세로로 목적하는 배향으로) 어떻게 유지될 것인지를 도해한다. 도 6은 또한 초기 세포 시딩/발달 단계 중에 특정 예비컨디셔닝 조직(근육, 혈관 및 창자)을 위한 기계적 스트레칭(잘 정의된 %의 스트레치)을 허용하기 위해 생물반응기에 첨가된 모터 구동 스크류(31)의 사용을 도해한다. 스트레칭은 이식 후에 찢어질 가능성이 적은 더 크고, 더 두껍고 더 강한 세포/조직을 만든다. 스트레칭은 또한 근육 세포를 추가로 정렬하기 위해서도 사용될 수 있다. 전기적 페이싱(pacing) 또는 약물 자극 또한 사용될 수 있다. 특히, 전기적 페이싱이 매우 효과적이고 조절하기가 용이하다.
골격근에 중추신경계에 의해 부여되는 제 2 수준의 조절은 더욱 근본적이다. 신경 인풋(input)이 조직의 작용을 직접 조절한다. 완전 기능성 근육 보철을 달성하기 위해 이를 중추신경계의 조절하에 둘 필요가 있다. 바람직하게는, 공학처리된 이식편은 해당 영역에 인접한 근육층에 이식될 수 있어 생체내 환경에 적응하게 된다. 적응 후에 자가이식 이식편은 아마 원래 이식 부위로부터 발생되는 모터 유니트의 일부로 이동하여, 재구성을 필요로 하는 부위 내에 재배치될 것이다. 삼투압 펌프 또는 기타 수단에 의해 이식편 조직에 전달된 성장 펩타이드의 사용을 통해 운동 뉴런의 비성장을 유도하는 것도 가능할 수 있다. 심장 조직 대부분은 중추신경계에 의한 더 엄격한 조절에 가해지지 않는다. 그러나, 이는 기계적 활성의 변화에 민감하다. 제작 공정 중에 또는 후에 심장 근육 이식편의 심장 근육 비대를 촉진하기 위한 스트레칭, 전기 자극 또는 약리학제 사용에 의한 예비-스트레싱에 의해, 이는 생체내 환경의 영역을 위해 더욱 양호하게 제조될 수 있다.
실시예 1(세포외 매트릭스의 일렉트로스피닝)
세포외 매트릭스는 폴리-락트산/폴리-글리콜산(PLA/PGA; 50/50 - RESOMERRRG 503, 독일 소재의 Boehringer Ingelheim) 및 폴리(에틸렌-코-비닐) 아세테이트(미국 위스콘신 밀워키 소재의 Aldrich Chemical Company, Inc.,) 중합체로 제조된다. 디클로로메탄(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)에 용해된 두 중합체의 농도는 0.19 g/㎖ RESOMERRRG 503 및 0.077 g/㎖ 폴리(에틸렌-코-비닐)아세테이트이다. 일렉트로스피닝 기구는 유리 피펫(전체 길이 대략 21 cm, 테이퍼링 팁 구비, 0.33 mm로 추정되는 입구, 정확한 측정치가 수집되지는 않음), 0.32 mm 직경의 은-코팅 구리 와이어, 20 ×20 메쉬 316 스테인레스강 스크린, 두 개의 큰 클램프 홀더(중합체 코팅), 바닥 지지체 및 Spellman CZE1000R 전원 장치(0-30,000볼트, 미국 뉴욕 휴퓨지 소재의 Spellman High Voltage Electronic Corp.)로 구성된다. 물리적 기구는 바닥으로부터 대략 12 인치에 유리 피펫을 구비한 상단 클램프 홀더를 가지는데 피펫 팁(바닥에 대략 45도 각의 피펫)은 바닥을 향해 있다. 이어서, 와이어를 유리 피펫의 상단에 두고 피펫 팁이 과정 중 유지되는 곳에 도달할 때까지 삽입한다. 두번째 클램프 홀더를 유리 피펫의 축에 대략 수직으로 스크린(접지된 표적)을 홀딩하기 위해 바닥 위 대략 6 인치에 둔다. 피펫 팁과 접지된 스크린 간의 거리는 대략 10 cm이다. 고 전압의 전원 장치로부터의 양극 리드부는 유리 피펫의 상단에 걸린 와이어에 부착되고 반면 음극(지면) 리드부는 스테인레스강 스크린에 직접 부착된다. 이어서 유리 피펫을 적당한 용액으로 충진하고 전원 장치를 켠 다음 일렉트로스피닝이 개시될 때(즉, 유리 피펫의 팁으로부터 섬유가 슈팅될 때)까지 조절한다. 이 용액의 스트림(스플레이)은 피펫 팁과 접지된 표적 사이에서 멀티필라멘트(전기장 구동 현상)로 전환되는 모노필라멘트로서 개시된다. 이는 표적 부위에서 축적되는 "웹형" 구조의 형성을 허용한다. 접지된 표적에 도달하면, 멀티필라멘트를 수집하고 건조시켜 3-D 상호연결 중합체 매트릭스(섬유)를 형성한다. 설명된 장치는 도 2a 및 2b에 도해된 기구와 개념상 동일하다. 모든 설명된 연구 및 용액은 실온에서의 연구 및 용액이다. 이러한 예비 연구에 의해 생성된 섬유의 직경은 1-100 마이크론 범위이고 두 중합체 용액이 평가된다. 생성된 매트릭스의 두께는 측정되지 않았다. 그러나, 생성될 수 있는 매트릭스의 두께는 이용되고 특정 영역에 축적된 중합체 용액의 양(스피닝 시간) 의존성이다. 따라서, 샘플을 가로지르는 두께가 다양한 매트릭스 생성능을 허용한다. 매트릭스를 형성하는섬유의 주사 전자 현미경사진이 도 1에 도시되었다.
실시예 2(골격근의 3차원 단편의 제작)
정렬된 콜라겐 겔을 Simpson et al., 1994(Journal of Cell Physiology)의 방법으로 실라스틱막(Speciality Manufacturing)으로 제조한다. 실라스틱막을 오토클레이브에서 멸균하여 전기 방전에 2분 노출시켜 고무를 더욱 친수성으로 만든다. 이어서 정렬 콜라겐을 처리된 실라스틱 고무의 표면에 적용한다. 간략하게 설명하면, 0.2 N HEPES 500 ㎕를 10X MEM 500 ㎕와 50 ㎖ 원심분리관에서 혼합하고 얼음 상에 둔다. 멸균 조건하에서 콜라겐 1형 3.5 ㎖(0.012 HCL 중 3 mg/㎖, Collagen Corporation)를 HEPES/10XMEM 용액의 상단에 오버레이하고, 전도에 의해 혼합한 다음 빙냉 포스페이트 완충 식염수로 10 ㎖의 최종 용적이 되게 희석한다. 멸균 및 처리된 실라스틱막(70 mm ×30 mm)을 100 mm 배양 디쉬에 둔다. 빙냉 콜라겐 용액 1 밀리리터(최종 농도 콜라겐 1.05 mg/용액 ㎖)를 실라스틱막의 직사각형 조각의 일단에 적용한다. 콜라겐을 멸균 세포 스크랩퍼로 실라스틱막의 장축을 가로질러 단일 연속 스트로크로 풀링한다. 이어서 실라스틱막을 함유하는 디쉬를 팁핑하고 콜라겐을 적용된 축을 따라 막을 가로질러 배수시킨다. 디쉬를 뚜껑을 덮어 37℃ 인큐베이터에 1시간 동안 두어 콜라겐이 중합되게 한다. 이러한 절차에 의해 실라스틱막에 정렬된 콜라겐 피브릴의 박층이 생성된다. 이어서, 막을 습식 대기에서 12 내지 24시간 동안 건조시킨다. 이러한 과정은 콜라겐을 모으고 정렬된 콜라겐 피브릴을 교란함이 없이 부분적으로 건조시키게 된다. 이어서, 실라스틱막을 멸균 라미나 유동 후드하에서 추가로 30 내지 60분간 완전히 건조시킨다. 콜라겐의 완전건조는 피브릴을 추가 조작을 위해 고무에 고정시킨다. 실라스틱막은 이러한 실험에서 단독으로 사용되어 공학처리된 근육의 제작을 위해 용이하게 조작될 수 있는 지지면을 제공한다.
균일하게 배열된 콜라겐 피브릴을 함유하는 실라스틱막의 단편(22 mm x 22 mm)을 절단하여 멸균 35 mm 배양 디쉬에 옮긴다. 마우스 c2c12 골격근 세포주의 세포를 실라스틱막에 놓고 DMEM-F12(50:50 DMEM:F12 믹스, 10% 말 혈청, 5% FBS + 펜스트렙 및 젠티마이신 보충)에서 3 내지 5일간 배양한 다음 균일하게 배열된 세포의 융합성 배양액을 형성시킨다. 이들 배양액은 배양액의 추가 조립을 위한 주형층으로 작용한다. 실리콘 그리스의 박층을 정렬된 c2c12 세포의 배양액을 함유하는 실라스틱 고무 조각의 밑면에 배치한다. 실리콘 그리스는 배양액을 RCCS Bioreactor(Synthecon, Inc)의 배양실내 상이한 위치에 고정하는 무독성 접착제로 작용한다. 예비 실험에서, 생물반응기 배양 용기내 몇몇 상이한 위치가 정렬된 근육의 3차원 배열 제작을 위한 시도에 사용된다.
c2c12 세포의 정렬 배양액을 회전하는 생물반응기 배양 용기의 뒤 벽면, 세포 윗쪽에 배치하고, 실리콘 그리스 박층으로 적소에 유지시킨다. 용기를 닫은 다음 배양 배지(50:50; DMEM:F12 믹스, 10% 말 혈청, 5% PBS+펜스트렙 및 젠티마이신 보충)로 채운다. 시린지 포트를 개봉하여 1백만개의 c2c12 세포를 단일 세포 현탁액으로서 생물반응기 용기에 가한다. 장치를 용기의 회전 속도를 제어하는 제어 액슬상에 장착한다. 이어서, 전 장치를 C02인큐베이터(37℃) 안에 넣고 분당 3회전으로 회전하도록 세팅한다. 24시간 간격으로, 추가로 1백만개의 c2c12 세포를 반응기 챔버에 가한다.
회전속도를 저속으로 세팅함으로써, 현탁액에 첨가된 세포를 주형 배양액에 점진적으로 시딩한다. 용기에서 48시간 혼합 후, 주형 배양액을 분리하고 전자 현미경 검사를 준비한다. RCCS 반응기에서 제조한 배양액은 공동축을 따라 배열된 c2c12 세포의 다중층으로 구성된다. 생물반응기 안에서의 몇몇 상이한 위치와 조건을 다중층 배양액 구성능에 대해 분석한다. 이러한 실험 실행에서, 회전 방향에 수직인 배향으로 반응기의 뒤 벽면에 배열된 세포가 가장 효과적인 것으로 판명되었다. 용기 안의 다른 부위도 외벽, 중앙 코어 및 외측 원통형 벽을 포함한 다중층 배양액의 조립을 촉진하였다. 유동 방향으로 배향되었던 정렬된 배양액도 다중층 조립을 촉진할 수 있지만, 회전 방향에 수직으로 배향된 배양액만큼 효과적이지는 않다.
다른 실험에서, 정렬된 콜라겐 겔을 기술된 바와 같이 실라스틱막상에 준비하고 RCCS 생물반응기 챔버 안에 직접 넣는다(즉, 실험은 정렬된 콜라겐 피브릴이 세포의 융합성 주형층의 1차 성장 없이 다중층 조립을 촉진할 수 있는지를 측정하기 위해 디자인됨). 정렬된 콜라겐만으로 구성된 주형은 대략 다중층 배양액의 조립 촉진에서 융합성 세포층을 함유하는 주형만큼 동등하게 효과적이었다. 또한, 이러한 콜라겐 주형은 생물반응기상에 상이한 위치에 배치된다. 이들은 융합 세포층과 동일하게 행동하며, 즉 회전축에 수직으로 배향된 뒤 벽면의 콜라겐 코팅 막이 다중층 조립 촉진에서 가장 효과적이었다.
정렬된 콜라겐상에 침착된 근육 세포의 주사 전자 현미경 사진을 도 4a에 나타내었다.
실시예 3(세포외 매트릭스의 일렉트로에어로졸 생성)
튜브 형태의 세포외 매트릭스를 제조한다. 실시예 1에 기재된 일렉트로스피닝처럼, 일렉트로에어로졸 과정은 중합체 저장소, 분무 노즐 및 접지된 맨드릴을 포함한다. (도 2a 및 2b 참조). 본 실험에서, 중합체 저장소 및 분무 노즐은 각각 1.0 ml 시린지(마이너스 플런저) 및 단순 플라스틱 피펫 팁(Gel Loading Tip, Fisher Scientific)이다. 접지된 맨드릴은 스테인레스강 니들(18 게이지, 길이 약 8 cm)로 구성된다. 주의: 에어로졸/매트릭스 생성에 앞서, 맨드릴을 바셀린으로 포화된 헥산 용액으로 처리하여 형성된 작제물을 맨드릴로부터 용이하게 제거시킨다. 사용된 중합체 용액은 메틸렌 클로라이드에서 0.189 g/ml 농도의 폴리락트산/폴리글리콜산(PLA/PGA; 50/50)이다. 미세 와이어를 들어갈 수 있는 한 깊게 피펫 팁 안으로 넣는다. 이러한 팁으로는, 와이어가 멀리까지 통과할 수 없고, 따라서 와이어가 통과하여 머무는 지점에서 팁의 대략 1/4 인치를 절단한다. 당해 시험에서 와이어는 12,000 볼트로 대전된다(Spellman High Voltage Power Supply). 전위를 인가하면, 중합체 에어로졸은 피펫 팁에 모이기 시작하고 접지된 맨드릴쪽으로 향하게 된다. 이어서, 에어로졸이 맨드릴 주위에서 수집된다. 총 4 ml의 중합체 용액을 사용하여 예를 들면 신경 가이드의 작제에 사용될 수 있는 세포외 매트릭스를 생성시킨다. 단계 1 은 저장소/시린지를 1 ml의 중합체 용액으로 채우고, 용액을 대전시켜 에어로졸을 생성시키는 것이다. 저장소를 비우면, 맨드릴은 90도 회전되고(단계2) 단계 1을 반복한다. 이어서, 이들 단계를 완전한 작제물/신경 가이드에 대해 4회 반복한다. 도 8 내지 11은 당해 절차에 의해 생성된 세포외 매트릭스의 주사 전자 현미경 사진이다.
평가된 중합체 -- 폴리락트산/폴리글리콜산(PLA/PGA; 50/50)은 완전히 건조된 연질의 스폰지성, 그러나 상당히 견고한 작제물을 제공한다. 주지되는 바와 같이, 기계적 성질은 사용된 중합체, 에어로졸 입자 직경, 및 전체 메쉬(매트릭스 패킹) 구조에 의존하게 될 것이다.
상이한 물질과 맨드릴로 작업할 경우, 당해 기술은 분기 또는 다른 복잡한 기하를 갖는 심리스(seamless) 작제물(즉, 심장 판막, 혈관 그래프트, 내장, 및 연골(무릎, 코, 귀)을 형성할 수 있음에 주목하여야 한다.
실시예 4(혈관 보철의 작제)
본 실시예는 콜라겐 쓰레드(평직 내장 봉합선 Plain gut suture - 콜라겐), 동맥 세포 성분(평활근 세포(SMC), 섬유아세포(FB), 및 내피 세포(EC), 콜라겐(I, III & IV형), 및 피브로넥틴(동맥의 모든 주 성분)으로부터의 소직경 혈관 보철의 개발에 초점을 둔다. 본원에서 기술되는 것과 같은 소직경 동맥은 다양한 피치의 나선으로 배열되는 평활근 세포의 원통형 층(3 내지 6개 층)으로 구성된다. 혈관 보철의 일례의 배열은 도 12에 제시된 층을 갖는다.
--권취 장치
권취 장치(도 13)는 두 말단 지지체(50), 얇은 벽 튜빙(51), 유리봉(52), 베이딩실(bathing chamber)(53), 봉합선 이동 시스템(54), 및 맨드릴 회전시스템(55)으로 구성될 것이다. 두 말단 지지체(50)는 얇은 벽 튜빙(51)의 외경과 매치되도록 중앙에 구멍이 뚫어지게 된다. 유리봉(52)은 그래프트를 원통형으로 유지하기 위해 콜라겐 쓰레드 권취 동안 얇은 벽 튜빙(51)을 통해 놓이게 되고 일단 생물반응기에서 제거될 것이다. 맨드릴 회전 시스템(55)은 그래프트 맨드릴의 회전을 규정 속도로 허용할 것이다. 봉합선 이동과 안내 시스템(54)은 맨드릴 위에 장착될 것이고 쓰레드를 규정 속도로 맨드릴을 가로질러 이동하도록 레일과 모토 구동 시스템으로 구성될 것이다. 쓰레드 안내 속도와 맨드릴 회전 속도의 조합은 중막의 층 2 내지 4에서 콜라겐 쓰레드의 피치 조절을 허용할 것이다. 층 1과 5의 피치는 높고 목적하는 피치를 생성하도록 디자인되는 맨드릴 말단 지지체 사이에 봉합선을 위빙함으로써 예비제작될 것이다. 베이딩실은 맨드릴이 권취 절차 동안 생리식염수 또는 콜라겐 용액에 유지되도록 허용할 것이다. 전 장치는 스팀 또는 에틸렌 옥사이드에 의한 멸균을 허용하도록 알루미늄, 304호 스테인레스강(304SS), 유리, 및 폴리카보네이트로부터 구축될 것이다.
--보철 맨드릴, 맨드릴 홀더, 및 생물반응기
맨드릴(60)(도 14)은 유리봉(52), 얇은 벽 튜빙(51), 및 두 말단 지지체(50)로 구성될 것이다. 말단 지지체(50)는 304 SS로 구성될 것이다. 얇은 벽 튜빙(51)의 정확한 조성(사용이 필요하든 말든)은 현재로서는 알려져 있지 않다. 맨드릴 홀더(65)(도 15)는 생물반응기 안에 배치될 때 혈관 작제물을 유지할 것이다. 이는 주로 베이딩실을 배가하는 말단 지지 시스템이다. 맨드릴 홀더(65)는 생리식염수 또는 배지-199로 충진될 것이다. 맨드릴 홀더(65)는 스팀이나 에틸렌 옥사이드에의해 멸균될 수 있는 폴리카보네이트로 구성될 것이다. 생물반응기(도 16)는 튜빙 커넥터(70), 튜빙(71), 폴리카보네이트 벽(72), 및 맥동 펌프(비도시)로 구성될 것이다.
--방법
중막의 내부 실린더(루멘 영역)는 평직 내장 봉합선(0.23 mm 직경, L = 6 m; H. Hess & Co.)을 각각의 봉합간의 0.2 내지 0.5 mm 공간으로 고 피치로(75°, 용기의 장축에 거의 평행) 말단 지지체 사이에 스트린징(위빙)함으로써 전개될 것이다. 평직 내장 봉합선을 위빙한 후, 맨드릴은 인간 배꼽 동맥 SMC(UASMC)의 현탁액을 함유하는 생물반응기에 넣어지게 된다. 현탁액은 2 x 106UASMC/ml, 콜라겐 용액(46% I형 & 54% III형; 정상 혈관 조직의 조성물; Imedex), 4 x PBS, 및 콜라겐 농도를 3 mg/ml로 만들 증류수로 구성될 것이다. 37℃에서 5분 후, 맨드릴 주위에서 겔화가 일어나게 되고 맨드릴은 생물반응기 안의 홀더에 옮겨진다. 맨드릴 홀더의 웰은 2 x 106UASMC/ml를 함유하는 배지-199(M-199)(10% FBS) 용액을 함유할 것이다. 콜라겐 혼합물은 24시간 동안 초기 원통형 층을 형성하도록 허용될 것이다. 생물반응기에서 24시간 동안, 그래프트는 제 1 중막층에 대한 맨드릴의 얇은 벽 튜빙을 통해 맥동류(유량: 90 ml/분; 주파수 60 Hz; 진폭＜그래프트 외경의 5%)를 갖게 된다. 후속 중막 층 동안, 얇은 벽 튜빙은 중막 층 및 직접 기계력으로의 관류(영양분 저달)를 허용하도록 제거될 것이다. 중막과 외막 발생 동안 이러한 맥동류의 이점은 세포 성분이 주위(신장-이완) 힘에 노출되게 된다는 점이다. 이는정적인 조건하에서 맨드릴상에 전개된 혈관 보철과 비교시 현저한 기계적 구조적 성질에 기여할 것으로 소망된다. 24시간 후, 제 2 원통형 층은 대략 0.2 내지 0.5 mm의 공간 간격으로 저 피치(15°, 본질적으로 용기의 장축에 수직)로 평직 내장 봉합선을 권취함으로써 개시된다. 봉합선 권취 후에, 프로토콜은 초기 층에 대해 기술한 바와 정확하게 같다. 층 3 내지 5도 각각 -15°, 15°, 및 -75°의 봉합선 피치로 기술된 프로토콜을 따른다(도 12). 모든 절차는 라미나 유동 멸균 워크스테이션하에서 수행될 것이다. 생물반응기 장치(맥동류 시스템)는 37℃, 5% CO2및 일정 습도에서 인큐베이터 안에 수용될 것이다. 스캐폴딩으로서 생체흡수성 봉합선의 사용으로 인해 어떠한 합병증도 예상되지 않는다. 생체흡수성 봉합선은(비-흡수성에 비해) 염증과 반흔 조직이 더 적으면서 문합성 혈전 또는 과형성이 거의 내지는 전혀 보이지 않는 것으로 나타났다. 혈관성 문합에서, 흡수성 봉합선의 완전한 가수분해성 분해(@ 7 mo.) 뒤에는 중막의 연결 조직을 포함한 용기의 거의 완전한 재생이 뒤따른다.
외막 등가 구조는 섬유아세포(FB)(5 x 105FB/ml) 및 콜라겐 I 및 III형(3 mg/ml)에 의한 중막 발생에 의해 전개될 것이다. 사용되는 섬유아세포는 인간 피부 섬유아세포(HDF)가 될 것이다. FB 및 콜라겐의 3층이 외막 층의 구축을 위해 중막 작제물에 첨가될 것이다. 소직경 동맥에서, 외막은 혈관벽 두께의 절반까지 점유할 수 있다. 따라서, 외막 성분의 다중층이 필요하다.
동맥내막은 외막-중막 작제물의 내피세포(EC) 시딩에 의해 전개될 것이다.EC 시딩에 앞서, 외막-중막 작제물은 맨드릴 말단 지지체로부터 제거되어 캐뉼레이션될 것이다. EC 시딩, 신동맥내막 발생에서의 첫 단계는 루멘 표면을 인간 피브로넥틴과 콜라겐 IV형으로 코팅하는 것이다. EC 시딩은 M-199(20% FBS)에 현탁시킨 EC(5 x 106EC/ml)를 작제물의 루멘 속에 주입함으로써 달성된다. 이어서, 캐뉼라를 밀봉하고 작제물을 M-199 및 20% FBS를 함유하는 튜브에 밤새 넣어 두어 EC가 작제물에 달라 붙게 한다. 이 시간 동안 튜브와 작제물을 1/8 r.p.m.으로 회전시켜 루멘 표면 표면상에 EC를 균일하게 분포시킨다. EC 흡착기 후, 완전한 혈관 보철이 생물반응기에 다시 배치되고 10일간 생리학적 맥동류(유량: 90 ml/분; 주파수 60 Hz; 진폭＜그래프트 외경의 5%)에 직접 노출된다. 혈관 작제물은 M-199 및 10% FBS에서 외부적으로 베이딩되고 이 동안 순환 배지는 M-199 및 20% FBS가 될 것이다. 순환 및 베이딩 배지를 2일마다 보충한다.
추가의 고심 없이, 당업자는 선행 설명을 사용하여 본 발명을 최대한도로 이용할 수 있을 것으로 믿는다. 따라서, 선행의 바람직한 특정 양태는 단지 설명에 불과하며 어떤 식으로도 개시내용의 나머지를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 상기 상세한 설명 및 도면에서 인용된 모든 출원, 특허, 및 공보의 전 개시내용은 본원에서 참조로 인용된다.

Claims (48)

  1. 일렉트로에어로졸 소적의 매트릭스를 포함하는 세포외 매트릭스.
  2. 제 1 항에 있어서, 소적이 하나 이상의 전기적으로 대전된 오리피스로부터 접지된 기질 상으로 방출되어 매트릭스를 형성하는 세포외 매트릭스.
  3. 제 1 항에 있어서, 매트릭스가 가교결합제로 처리되어 소적이 가교결합되는 세포외 매트릭스.
  4. 제 1 항에 있어서, 소적이 직경이 10 ㎛ 미만인 세포외 매트릭스.
  5. 제 1 항에 있어서, 소적이 콜라겐으로 구성되는 세포외 매트릭스.
  6. 전기적으로-대전된 중합체 용액을 기질상에 중합체 소적을 침착시키기에 유효한 조건하에서 접지된 표적 기질상에 스트리밍하여 세포외 매트릭스를 형성하는 단계를 포함하는, 세포외 매트릭스의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 중합체가 모세관 피펫으로부터 압출되는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 중합체 소적이 3차원 매트릭스를 형성하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 중합체가 콜라겐을 포함하는 방법.
  10. 제 6 항에 있어서, 정렬된 콜라겐 섬유의 겔을 세포외 매트릭스상에 침착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 주변에 보철이 형성될 맨드릴을 제공하고,
    맨드릴 주위에 일정한 피치로 나선식으로 중합체 섬유를 권취하는 단계를 포함하는 세포외 매트릭스 층을 형성한 다음,
    근육 세포를 세포외 매트릭스상에 침착시키는 단계를 포함하는, 혈관 보철의 형성 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 맨드릴 주위에 복수의 세포외 매트릭스 층을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 맨드릴이 원형인 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 맨드릴이 소정 혈관의 형상인 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 중합체 섬유의 일정 피치가 보철내 각각의 인접 층에 대해 상이한 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 세포외 매트릭스가 콜라겐 겔을 포함하는 방법.
  17. 제 11 항에 있어서, 세포외 매트릭스가 일렉트로스펀 섬유를 포함하는 방법.
  18. 제 11 항에 있어서, 세포외 매트릭스가 일렉트로에어로졸 소적을 포함하는 방법.
  19. 일렉트로스펀 섬유를 포함하는 근육 지지를 위한 세포외 매트릭스,
    압출 섬유를 포함하는 힘줄, 및
    세포외 매트릭스 상에 침착되는 근육 세포층을 포함하는 근육 이식편.
  20. 제 19 항에 있어서, 근육 세포층이 다중층인 근육 이식편.
  21. 제 19 항에 있어서, 일렉트로스펀 섬유가 콜라겐 섬유를 포함하는 근육 이식편.
  22. 제 19 항에 있어서, 일렉트로스펀 섬유가 가교결합되는 근육 이식편.
  23. 제 19 항에 있어서, 세포외 매트릭스상에 침착된 콜라겐의 배향층을 추가로 포함하고 근육 세포가 콜라겐의 배향층에 배치되는 근육 이식편.
  24. 제 19 항에 있어서, 근육 세포와 힘줄이 평행 방향으로 배향되는 근육 이식편.
  25. 일렉트로스펀 섬유 및 근육 세포층을 포함하는 근육 지지를 위한 세포외 매트릭스를 포함하고 근육 세포층이 세포외 매트릭스상에 배치되는 근육 이식편.
  26. 제 25 항에 있어서, 근육 세포층이 다중층인 근육 이식편.
  27. 제 25 항에 있어서, 일렉트로스펀 섬유가 콜라겐 섬유를 포함하는 근육 이식편.
  28. 제 25 항에 있어서, 일렉트로스펀 섬유가 가교결합되는 근육 이식편.
  29. 제 25 항에 있어서, 세포외 매트릭스상에 침착된 콜라겐의 배향층을 추가로포함하고 근육 세포가 콜라겐의 배향층상에 배치되는 근육 이식편.
  30. 일렉트로스펀 섬유의 매트릭스를 포함하는 근육 지지를 위한 세포외 매트릭스.
  31. 제 30 항에 있어서, 섬유가 하나 이상의 전기적으로 대전된 오리피스로부터 접지된 기질상으로 방출되어 매트릭스를 형성하는 세포외 매트릭스.
  32. 제 30 항에 있어서, 매트릭스가 가교결합제로 처리되고 섬유가 가교결합되는 세포외 매트릭스.
  33. 제 30 항에 있어서, 섬유가 직경이 5 내지 500 ㎛인 세포외 매트릭스.
  34. 제 30 항에 있어서, 섬유가 콜라겐으로 구성되는 세포외 매트릭스.
  35. 전기적으로-대전된 중합체 용액을 기질상에 중합체 섬유를 침착시키기에 유효한 조건하에서 접지된 표적 기질상에 스트리밍하여 세포외 매트릭스를 형성하는 단계를 포함하는, 세포외 매트릭스의 제조방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 중합체가 모세관 피펫으로부터 압출되는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서, 중합체 섬유가 3차원 매트릭스를 형성하는 방법.
  38. 제 35 항에 있어서, 중합체가 콜라겐을 포함하는 방법.
  39. 제 35 항에 있어서, 정렬된 콜라겐 섬유의 겔을 세포외 매트릭스상에 침착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 전기적으로 접지된 기질을 제공하고,
    콜라겐 용액이 저장소를 떠나도록 허용하는 오리피스가 있는 콜라겐 용액 저장소를 제공한 다음,
    콜라겐 용액을 전기적으로 대전시키고 콜라겐을 기질상에 스트리밍하여 근육 근막초를 형성하는 단계를 포함하는, 근육 근막초의 형성방법.
  41. 근막초를 제공하고,
    콜라겐 층을 근막초에 침착시키며,
    힘줄을 근막초에 라미네이팅한 다음,
    근육 세포를 콜라겐상에 침착시키는 단계를 포함하는, 근육 이식편의 형성방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 콜라겐 층을 근막초에 정렬시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 힘줄을 근막초에 콜라겐의 정렬과 동일한 방향으로 라미네이팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제 41 항에 있어서, 근막초가 콜라겐 섬유를 기질상에 일렉트로스피닝함으로써 형성되는 방법.
  45. 제 41 항에 있어서, 힘줄이 콜라겐 섬유를 압출함으로써 형성되는 방법.
  46. 제 41 항에 있어서, 근육 세포가 근육 이식편이 안치될 환자로부터 수득된 수반 근육 세포인 방법.
  47. 세포외 매트릭스를 제공하고,
    세포외 매트릭스를 회전 벽 생물반응기 내측에 배치하며,
    근육 세포를 포함하는 배양 배지를 생물반응기에 로딩한 다음,
    근육 세포가 세포외 매트릭스에 부착할 때까지 생물반응기를 가동시키는 단계를 포함하는, 세포외 매트릭스상에 근육세포층을 형성하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 세포외 매트릭스에 부착된 근육 세포가 다중층을 형성하는 방법.
KR1020027002632A 1999-08-31 2000-08-02 공학처리된 근육 KR20020059382A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/386,273 1999-08-31
US09/386,273 US6592623B1 (en) 1999-08-31 1999-08-31 Engineered muscle
US51208100A 2000-02-24 2000-02-24
US09/512,081 2000-02-24
PCT/US2000/020974 WO2001015754A1 (en) 1999-08-31 2000-08-02 Engineered muscle

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020059382A true KR20020059382A (ko) 2002-07-12

Family

ID=27011345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027002632A KR20020059382A (ko) 1999-08-31 2000-08-02 공학처리된 근육

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP1212107B1 (ko)
JP (2) JP2003508130A (ko)
KR (1) KR20020059382A (ko)
AT (1) ATE297229T1 (ko)
AU (1) AU6617300A (ko)
BR (1) BR0013639A (ko)
CA (1) CA2383145A1 (ko)
DE (1) DE60020721T2 (ko)
MX (1) MXPA02002268A (ko)
PL (1) PL353742A1 (ko)
WO (1) WO2001015754A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101318393B1 (ko) * 2011-06-15 2013-10-15 한국기계연구원 세포배양지지체의 제조장치 및 세포배양지지체의 제조방법
US9126366B2 (en) 2011-06-15 2015-09-08 Korea Institute Of Machinery & Materials Apparatus and method for manufacturing cell culture scaffold

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020081732A1 (en) 2000-10-18 2002-06-27 Bowlin Gary L. Electroprocessing in drug delivery and cell encapsulation
US7615373B2 (en) 1999-02-25 2009-11-10 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Electroprocessed collagen and tissue engineering
EP1315756A2 (en) 2000-09-01 2003-06-04 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Electroprocessed fibrin-based matrices and tissues
AU2001287023A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-13 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Plasma-derived-fibrin-based matrices and tissue
JP2004508137A (ja) * 2000-09-12 2004-03-18 ヴァージニア　コモンウェルス　ユニバーシティ 高圧出血に対する処置
US20040013715A1 (en) 2001-09-12 2004-01-22 Gary Wnek Treatment for high pressure bleeding
AU2002224387B2 (en) * 2000-10-18 2008-02-14 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Electroprocessing in drug delivery and cell encapsulation
ATE402002T1 (de) 2000-11-17 2008-08-15 Univ Virginia Commonwealth Elektroverarbeitetes kollagen
US7134857B2 (en) 2004-04-08 2006-11-14 Research Triangle Institute Electrospinning of fibers using a rotatable spray head
US7762801B2 (en) 2004-04-08 2010-07-27 Research Triangle Institute Electrospray/electrospinning apparatus and method
US7592277B2 (en) 2005-05-17 2009-09-22 Research Triangle Institute Nanofiber mats and production methods thereof
US7297305B2 (en) 2004-04-08 2007-11-20 Research Triangle Institute Electrospinning in a controlled gaseous environment
US8412503B2 (en) * 2006-10-17 2013-04-02 Shoji Yamamoto Simulation system of cardiac function, simulation method of cardiac function, simulation program of cardiac function, and composite material sheet
CA2740008C (en) 2008-10-09 2017-01-31 Mimedx, Inc. Methods of making biocomposite medical constructs and related constructs including artificial tissues, vessels and patches
JP2011130995A (ja) * 2009-12-25 2011-07-07 Japan Health Science Foundation 管腔構造体及び管腔構造体の製造方法
US10227568B2 (en) 2011-03-22 2019-03-12 Nanofiber Solutions, Llc Fiber scaffolds for use in esophageal prostheses
CA2855880C (en) 2011-11-02 2021-01-05 Mimedx Group, Inc. Implantable collagen devices and related methods and systems of making same
WO2013078051A1 (en) 2011-11-21 2013-05-30 Johnson Jed K Fiber scaffolds for use in tracheal prostheses
US9884027B2 (en) 2012-01-12 2018-02-06 Nanofiber Solutions, Inc. Nanofiber scaffolds for biological structures
WO2014145864A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Nanofiber Solutions, Llc Biocompatible fiber textiles for implantation
WO2015048224A1 (en) 2013-09-25 2015-04-02 Johnson Jed K Fiber scaffolds for use creating implantable structures
WO2015125488A1 (en) 2014-02-20 2015-08-27 Okinawa Institute Of Science And Technology School Corporation Controllable and reversible ph-responsive rollable 2d nano structures
US10166315B2 (en) 2015-05-04 2019-01-01 Nanofiber Solutions, Inc. Chitosan-enhanced electrospun fiber compositions
US10953097B2 (en) 2015-11-02 2021-03-23 Nanofiber Solutions. Llc Electrospun fibers having contrast agents and methods of making the same
US11547551B2 (en) 2016-03-02 2023-01-10 The Regents Of The University Of Michigan Engineered tendon graft for rotator cuff repair
US10898608B2 (en) 2017-02-02 2021-01-26 Nanofiber Solutions, Llc Methods of improving bone-soft tissue healing using electrospun fibers
CN108434525A (zh) * 2018-03-06 2018-08-24 西安交通大学 一种带血管网的人工肌组织及其制备方法
JP2022513442A (ja) 2018-12-11 2022-02-08 ナノファイバー ソリューションズ、エルエルシー 電界紡糸繊維を使用した慢性創傷の治療方法
EP4130246A4 (en) 2020-03-26 2024-04-24 Univ Osaka MUSCLE TISSUE PRODUCED BY BIOPRINTING
CN113875878A (zh) * 2021-08-31 2022-01-04 深圳市星期零食品科技有限公司 一种植物蛋白肉仿生纤维的加工方法
CN115029867A (zh) * 2022-06-22 2022-09-09 北京建筑大学 一种胞外聚合物复合纳米纤维膜的制备方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0005035B1 (en) * 1978-04-19 1981-09-23 Imperial Chemical Industries Plc A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning
GB2142870B (en) * 1983-07-06 1986-06-04 Ethicon Inc Manufacturing vascular prostheses by electrostatic spinning
US4600533A (en) * 1984-12-24 1986-07-15 Collagen Corporation Collagen membranes for medical use
US4738740A (en) * 1985-11-21 1988-04-19 Corvita Corporation Method of forming implantable vascular grafts
US5863531A (en) * 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
GB8616416D0 (en) * 1986-07-04 1986-08-13 Ethicon Inc Polyurethane medical prostheses
GB2195251A (en) * 1986-09-02 1988-04-07 Ethicon Inc Improvements in synthetic vascular grafts
EP0334567A3 (en) * 1988-03-21 1990-04-25 Ethicon, Inc. Improvements in synthetic vascular grafts
US5162430A (en) * 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
GB8917916D0 (en) * 1989-08-04 1989-09-20 Ethicon Inc Improvements in synthetic vascular grafts and their methods of manufacture
JPH03161563A (ja) * 1989-11-17 1991-07-11 I C I Japan Kk 繊維状集合体
US5171579A (en) * 1991-10-11 1992-12-15 Genetics Institute, Inc. Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins
DE4219321A1 (de) * 1992-06-12 1993-12-16 Draenert Klaus Polymergranulat und Verfahren zu seiner Herstellung
EP0952792B1 (en) * 1994-06-06 2003-08-27 Case Western Reserve University Biomatrix for tissue regeneration
US5714359A (en) * 1995-10-12 1998-02-03 The University Of Akron Apparatus and method for electrostatic endothelial cell seeding in a vascular prosthesis

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101318393B1 (ko) * 2011-06-15 2013-10-15 한국기계연구원 세포배양지지체의 제조장치 및 세포배양지지체의 제조방법
US9126366B2 (en) 2011-06-15 2015-09-08 Korea Institute Of Machinery & Materials Apparatus and method for manufacturing cell culture scaffold

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA02002268A (es) 2003-08-20
WO2001015754A1 (en) 2001-03-08
JP2011131076A (ja) 2011-07-07
DE60020721T2 (de) 2006-03-16
EP1212107A1 (en) 2002-06-12
DE60020721D1 (de) 2005-07-14
EP1212107B1 (en) 2005-06-08
CA2383145A1 (en) 2001-03-08
JP2003508130A (ja) 2003-03-04
PL353742A1 (en) 2003-12-01
AU6617300A (en) 2001-03-26
BR0013639A (pt) 2004-06-15
ATE297229T1 (de) 2005-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20020059382A (ko) 공학처리된 근육
US20040009600A1 (en) Engineered muscle
Allmeling et al. Use of spider silk fibres as an innovative material in a biocompatible artificial nerve conduit
Yan et al. Implantable nerve guidance conduits: Material combinations, multi-functional strategies and advanced engineering innovations
Boland et al. Electrospinning collagen and elastin: preliminary vascular tissue engineering
US9107739B2 (en) Small diameter vascular graft produced by a hybrid method
US8652215B2 (en) Nanofilament scaffold for tissue regeneration
JP4624800B2 (ja) 細胞の成長を促進するための工学設計骨格
US7759082B2 (en) Electroprocessed fibrin-based matrices and tissues
JP4485124B2 (ja) 電気処理されたコラーゲン
CN111714706B (zh) 可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管
US20140379072A1 (en) Tissue-Engineered Vascular Graft and Its Fabrication Approach
WO2008069760A1 (en) Three-dimensional porous hybrid scaffold and manufacture thereof
US20100221304A1 (en) Bionanocomposite Materials and Methods For Producing and Using the Same
Mo et al. Electrospun nanofibers for tissue engineering
CN104689376A (zh) 一种神经导管及其制备方法
Riva et al. Beyond the limiting gap length: peripheral nerve regeneration through implantable nerve guidance conduits
Fine et al. Nerve regeneration
JP2010163435A (ja) 電気処理されたコラーゲン
Yucel et al. Nanotechnology in biomaterials: nanofibers in tissue engineering
Cirillo et al. 16.1 Pathophysiology of nerve degeneration and regeneration
Soffer Design of silk-based electrospun tubular scaffolds for tissue-engineered vascular grafts
SHAN Polymeric Nanofiber Conduits for Peripheral Nerve Regeneration
Zhang Silk-based tissue-engineered small diameter vascular graft
AU2011203262A1 (en) Electroprocessed fibrin-based matrices and tissues

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid