CN109316633A - 一种丝素蛋白微纳米纤维多孔支架及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丝素蛋白微纳米纤维多孔支架及其应用，酸进入蚕丝内部促使丝纤维发生充分溶胀；多次进行冷冻‑融化处理，促使丝纤维内部原纤间发生分裂；利用冷冻干燥技术获得分裂的丝蛋白微纳米纤维多孔支架。该制备方法简单、易操作，由此制备的丝素蛋白多孔支架内部主要由天然丝蛋白纤维组成，纤维直径10nm~10μm，具有良好的化学稳定性与物理力学性能，同时具有仿生微纳结构，非常适合作为细胞与组织生长的再生医学用支架材料。

Description

一种丝素蛋白微纳米纤维多孔支架及其应用

本发明为发明名称为一种丝素蛋白微纳米纤维多孔支架及其制备方法、申请日为2016年8月19日、申请号为2016106900614发明申请的分案申请，属于产品技术部分。

技术领域

本发明涉及一种丝素蛋白微纳米纤维多孔支架及其制备方法，所制备的材料可应用于组织工程、药物缓释等再生医学领域。

背景技术

由于疾病和事故导致的器官或组织损伤和功能缺失的病人每年都有数百万之多，仅美国每年需要800多万次手术对这类病人进行救治，其经济花费在4000亿美元以上。随着现代医学和外科手术技术的发展，通过组织或器官移植来修复功能损失已经被广泛接受，然而却面临着巨大的供体缺口。通过再生医学手段体在体内或体外形成组织或器官为受损功能的修复提供了新的治疗方案。其中，组织工程支架材料的选择及构建成为该治疗方法的关键之一。

蚕丝蛋白是来源于自然界的天然高分子生物材料，具有优异的力学性质、可控的生物降解性、易加工性，特别是其与胶原同等的生物相容性而成为理想的再生医学支架的原材料。我国是蚕丝的主要生产国，蚕丝产量占世界产量的70%以上。近年来，蚕丝的研究与应用从传统的纺织领域延伸到高新技术领域，如光电子与生物医用材料，特别是作为生物医用材料已经取得了重要进展。

天然蚕丝为纤维状，而生物医用材料要求支架形状具有多样性与可塑性。因此，对天然丝素纤维的再生加工是拓宽其应用范围的必要前提。目前，蚕丝蛋白被加工成再生长丝、纳米纤维膜、丝素膜、多孔支架、水凝胶等，以满足组织工程对支架材料形态及性能的要求。其中，纳米纤维材料以其仿生结构在再生医学领域的应用得到了广泛关注。丝素蛋白纳米纤维的制备方法十分有限，目前主要是通过静电纺丝制备，并取得了预期的生物学效果。然而，静电纺丝加工效率低下，且静电纺纳米纤维为膜片状，难以提供细胞与组织生长所需要的三维空间，因此极大地限制了应用领域与前景。现有技术反复进行膜干燥-溶解制备再生丝素蛋白多孔材料，孔壁由纳米原纤组成，细胞实验证实纳米结构更有利于细胞的黏附与增殖，但该方法的效率低，重复性差，且纳米纤维只是分布在孔壁，并未真正形成纳米纤维材料。

天然蚕丝本身即是纳米纤维材料的集合体，蚕丝内部是有纳米原纤组成。在再生的过程中，蚕丝原有的纳米原纤结构遭到不可逆的破坏，使得再生丝素蛋白材料丧失原有的纳米纤维结构和优异的力学性能。但是作为一种生物医用支架，仿生构建具有细胞外基质纳米纤维结构（直径在100nm以下）仍然是一个重要的研究方向。因此有必要研发一种打开蚕丝原纤间的作用力直接获得丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的制备方法，该方法制备的材料不仅具有仿生结构，同时具有优良的理化性质。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、易操作的丝素蛋白微纳米纤维多孔支架制备方法，及由该方法制备的结构仿生、力学性能优异的丝蛋白多孔材料。

为达到上述目的，本发明提供一种丝蛋白微纳米纤维多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）蚕丝脱胶后，直接浸泡在酸溶液中进行溶胀处理,得到溶胀蚕丝；

（2）将溶胀蚕丝置入模具中进行冷冻处理，然后进行融化处理；

（3）重复步骤（2）的冷冻处理以及融化处理，最后得到多次冷冻-融化处理的冷冻体；

（4）将步骤（3）得到的冷冻体进行冷冻干燥即得到丝蛋白微纳米纤维多孔支架。

上述技术方案中，步骤（1）中所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、天蚕丝中一种或几种。

上述技术方案中，步骤（1）中所述酸为盐酸、甲酸、乙酸、硫酸、磷酸、氢氟酸中的一种或几种。

上述技术方案中，步骤（1）中，酸溶液的浓度1～98 wt%。

上述技术方案中，步骤（1）中，溶胀处理的时间为25～35分钟；本发明中，酸渗透到蚕丝内部，引起蚕丝体积膨胀，原纤间的作用力受到消弱，经过多次冷冻-融化循环打开蚕丝原纤间的作用力直接获得丝素蛋白微纳米纤维，获得具有仿生结构的生物支架。

上述技术方案中，步骤（2）中，冷冻处理的温度为酸的冰点温度，利用大量渗入溶剂的结冰促使微米级纤维分纤获得纳米纤维。

上述技术方案中，步骤（3）中，重复步骤（2）的冷冻处理以及融化处理5～50次；经过冷冻处理，甲酸在蚕丝内部发生结冰固化，进一步消弱蚕丝内部原纤间的作用力。如此反复多次，原纤发生劈裂分开，再经冷冻干燥工艺即可形成微纳米纤维组成的多孔支架材料，其中微溶的丝蛋白发挥胶粘稳固支架形态的作用。因蚕丝仅在原纤水平发生分裂，蚕丝内部的晶体结构并未受到破坏，由此形成的丝蛋白材料具有良好的化学稳定性与优异的物理力学性能。

本发明还公开了按照上述制备方法制备的丝蛋白微纳米纤维多孔支架，该支架由10nm～10μm的纤维组成，支架孔隙率大于50%，孔径范围为50μm～1mm。

本发明中，蚕丝不溶解于酸，在酸中发生溶胀，酸渗透到蚕丝内部，引起蚕丝体积膨胀，原纤间的作用力受到消弱。经过冷冻处理，酸在蚕丝内部发生结冰固化，进一步消弱蚕丝内部原纤间的作用力。如此反复多次，原纤发生劈裂分开，再经冷冻干燥工艺即可形成微纳米纤维组成的多孔支架材料，其中微溶的丝蛋白发挥胶粘稳固支架形态的作用。因蚕丝仅在原纤水平发生分裂，蚕丝内部的晶体结构并未受到破坏，由此形成的丝蛋白材料具有良好的化学稳定性与优异的物理力学性能，可用于制备细胞与组织生长材料。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）本发明制备方法简单、可操控性强，仅利用酸溶胀并结合多次冷冻-融化处理即可实现蚕丝分纤制取微纳米纤维多孔材料，蚕丝内部的晶体结构并未受到破坏，由此形成的丝蛋白材料具有良好的化学稳定性与优异的物理力学性能。

（2）本发明制备方法无需有机溶剂后处理工序，所制备的丝素蛋白多孔材料由直径介于10nm~10μm丝蛋白纤维组成，具有良好的化学稳定性与物理力学性能。

附图说明

图1为实施例一制得的丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图2为实施例二制得的丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图3为实施例三制得的丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图4为实施例四制得的丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图5为实施例五制得的丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的扫描电镜图；

图6为实施例五制得的丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的X-射线衍射谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.5wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝。

（2）将脱胶蚕丝浸泡于0.1mol盐酸中浸泡30min。

（3）将盐酸浸泡蚕丝置于-20℃冷冻，然后置于4℃复温融化，重复冻-融处理5次后放入-20℃冷冻。

（4）将步骤（3）获得的冷冻体置于冻干机中冷冻干燥成丝蛋白多孔支架。

附图1为上述制得的丝素蛋多孔支架的扫描电镜图片。由图可见多孔支架由未分纤的蚕丝纤维和分纤后的亚微米纤维组成，直径介于10nm~10μm，具有良好的化学稳定性与物理力学性能。

实施例二

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.05wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝。

（2）将脱胶蚕丝浸泡于50 wt%氢氟酸中浸泡30min。

（3）将酸浸泡蚕丝置于-40℃冷冻，然后置于4℃复温融化，重复冻-融处理10次后放入-40℃冷冻。

（4）将步骤（3）获得的冷冻体置于冻干机中冷冻干燥成丝蛋白多孔支架。

附图2为上述制得的丝素蛋多孔支架的扫描电镜图片。由图可见多孔支架由未分纤的蚕丝纤维和分纤后的亚微米纤维组成，直径介于10nm~10μm，具有良好的化学稳定性与物理力学性能。

实施例三

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.25wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝。

（2）将脱胶蚕丝浸泡于98wt%甲酸中浸泡30min。

（3）将酸浸泡蚕丝置于-80℃冷冻，然后置于20℃复温融化，重复冻-融处理20次后放入-20℃冷冻。

（4）将步骤（3）获得的冷冻体置于冻干机中冷冻干燥成丝蛋白多孔支架。

附图3为上述制得的丝素蛋多孔支架的扫描电镜图片。由图可见多孔支架由蚕丝微米纤维和纳米纤维组成，直径介于10nm~10μm，具有良好的化学稳定性与物理力学性能。

实施例四

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.05wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝。

（2）将脱胶蚕丝浸泡于50wt%甲酸-1wt%盐酸中浸泡30min。

（3）将酸浸泡蚕丝置于-20℃冷冻，然后置于25℃复温融化，重复冻-融处理20次后放入-20℃冷冻。

（4）将步骤（3）获得的冷冻体置于冻干机中冷冻干燥成丝蛋白多孔支架。

附图4为上述制得的丝素蛋多孔支架的扫描电镜图片；由图可见多孔支架主要为纳米级和微米级纤维组成，直径介于10nm~10μm，具有良好的化学稳定性与物理力学性能。

实施例五

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.25wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝。

（2）将脱胶蚕丝浸泡于98%甲酸中浸泡10min。

（3）将酸浸泡蚕丝置于-60℃冷冻，然后置于37℃复温融化，重复冻-融处理50次后放入-20℃冷冻。

（4）将步骤（3）获得的冷冻体置于冻干机中冷冻干燥成丝蛋白多孔支架。

附图5为上述制得的丝素蛋多孔支架的扫描电镜图片；由图可见多孔支架主要由蚕丝微米纤维组成，直径介于10nm~10μm，具有良好的化学稳定性与物理力学性能。

实施例六

（1）天然桑蚕丝用质量分数0.05wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝。

（2）将脱胶蚕丝浸泡于50wt%甲酸中浸泡30min。

（3）将酸浸泡蚕丝置于-20℃冷冻，然后置于4℃复温融化，重复冻-融处理10次后放入-20℃冷冻。

（4）将步骤（3）获得的冷冻体置于冻干机中冷冻干燥成丝蛋白多孔支架。

附图6为上述制得的丝素蛋多孔支架的X-射线衍射图；由图可见多孔支架的结构主要为SilkⅡ结晶结构，具有良好的化学稳定性与物理力学性能。

实施例七

（1）天然柞蚕丝用质量分数0.5wt%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝。

（2）将脱胶蚕丝浸泡于80wt%甲酸中浸泡30min。

（3）将酸浸泡蚕丝置于-20℃冷冻，然后置于4℃复温融化，重复冻-融处理15次后放入-20℃冷冻。

（4）将步骤（3）获得的冷冻体置于冻干机中冷冻干燥成柞蚕丝蛋白多孔支架。

Claims (9)

1.一种丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于，所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架的制备方法包括如下步骤：

（1）蚕丝脱胶后，浸泡在酸溶液中进行溶胀处理，得到溶胀蚕丝；

（2）将溶胀蚕丝置入模具中进行冷冻处理，然后进行融化处理；

（3）重复步骤（2）的冷冻处理以及融化处理，最后一次融化处理后进行冷处理得到冷冻体；

（4）将步骤（3）得到的冷冻体进行冷冻干燥即得到丝蛋白微纳米纤维多孔支架。

2.根据权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于：所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、天蚕丝中的一种或者几种。

3.根据权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于：所述酸为盐酸、甲酸、乙酸、硫酸、磷酸、氢氟酸中的一种或者几种。

4.根据权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于：所述酸溶液的浓度1～98 wt%。

5.根据权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于：溶胀处理的时间为25～35分钟。

6.根据权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于：冷冻处理的温度为酸溶液的冰点温度。

7.根据权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于：步骤（3）中，重复步骤（2）的冷冻处理以及融化处理5～50次。

8.根据权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架，其特征在于：所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架由直径为10nm～10μm的纤维组成，支架孔隙率大于50%，孔径范围为50μm～1mm。

9.权利要求1所述丝素蛋白微纳米纤维多孔支架在制备细胞与组织生长材料中的应用。