CN102008756B

CN102008756B - 一种纳米纤维化丝素蛋白基多孔支架的制备方法

Info

Publication number: CN102008756B
Application number: CN 201010583195
Authority: CN
Inventors: 吕强; 罗峥
Original assignee: Sike Pule Beijing Biotechnology Co ltd; Suzhou University
Current assignee: Sike Pule Beijing Biotechnology Co ltd; Suzhou University
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2030-12-10
Also published as: CN102008756A

Abstract

本发明涉及一种多孔支架材料的制备方法，公开了一种纳米纤维化丝素蛋白基多孔支架的制备方法：将丝素溶液和胶原蛋白溶液在0～20℃下共混静置，促使胶原蛋白同丝素蛋白充分作用，以形成纳米纤维；然后将混合溶液进行冷冻，获得冷冻体；将冷冻体进行冷冻干燥处理，得到纳米纤维化多孔支架材料；将此多孔支架材料放入底部加有水、甲醇、或者乙醇水溶液的真空干燥器，抽真空后静置；获得不溶于水的纳米纤维化多孔支架；获得的多孔支架具有10～1000微米的相互贯通的孔隙，孔壁则是由直径在10～100纳米的纳米纤维组成，同细胞外基质具有相似的纳米和微米级结构，适合细胞的粘附和生长，具有良好的生物相容性。

Description

一种纳米纤维化丝素蛋白基多孔支架的制备方法

技术领域

本发明涉及一种多孔支架材料的制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，制备具有同细胞外基质结构相似的纳米纤维化多孔支架的技术，所制备的材料可应用于生物医学、组织修复、药物释放、组织工程等技术领域。

背景技术

生物医用材料是未来十年最具发展潜力的研究方向和应用领域。用于组织工程和组织修复的生物材料多孔支架，在要求具有良好的生物相容性和可降解性的同时，还应当具有合适的多级结构，从而调控细胞行为，促进正常组织再生。细胞外基质是多孔支架制备的最佳模板，其主要由纳米纤维组成，并进一步形成孔隙在100微米以上的多孔结构。大量研究表明，纳米纤维的形成能有效地调控细胞行为，促进细胞的粘附、生长和增殖，使得生物材料多孔支架具有更好的生物相容性。

丝素蛋白是蚕丝中的主要成分，价格低廉，易于提纯。研究表明，丝素蛋白无毒、无免疫原性、生物相容性良好、可降解、力学性能优良，是制备组织修复和组织工程支架的理想原料。丝素蛋白具有包括Silk I 和Silk II在内的不同结晶结构，晶体种类和晶体含量的不同可以决定丝素蛋白的溶解性和降解性。通过调整其晶体和非晶体结构，丝素蛋白在体内的降解速率可以从1年降低到半个月左右，从而满足不同组织修复和再生的需要。

目前，研究者已经研究出多种制备丝素蛋白多孔支架的方法，包括冷冻干燥法、相分离法、盐析法以及静电纺丝法等，但如上的各种方法都存在各自难以克服的不足。例如，盐析法制备出的丝素蛋白支架孔径一般在400微米以上，而静电纺丝法制备的多孔材料，孔径则一般在100微米以下，用作组织修复和组织工程支架材料都存在一定的限制。冷冻干燥法可以制备出孔径范围较大的多孔支架，但在冷冻过程中，丝素蛋白容易自组装成片状结构，很难形成结构良好的多孔结构。并且，上所有方法所制备出的丝素蛋白基多孔支架，都不具备同细胞外基质相似的纳米纤维结构，在组织相容性方面仍有待提高。

细胞外基质大部分由直径在100纳米以下的纳米纤维组成，具有同细胞外基质结构相似的纳米纤维所组成的多孔支架具有更好的生物相容性，能够显著提高细胞的生长和新生组织的形成。

因此，需要克服现有技术中的上述问题，研发一种利用丝素蛋白制备具有同细胞外基质结构相似的纳米纤维化多孔支架。

发明内容

本发明目的是提供一种纳米纤维化丝素蛋白基多孔支架的制备方法，改善丝素蛋白基多孔支架的组织相容性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种纳米纤维化丝素蛋白基多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

1）按常规方法先将蚕丝经脱胶、溶解、透析得到丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.1～20%；将胶原溶解到质量浓度为0.01-0.1%的乙酸溶液中，得到胶原蛋白溶液，所述胶原蛋白溶液的质量浓度为0.01%～2%；

2）将丝素蛋白溶液同胶原蛋白溶液共混，混合后，丝素蛋白和胶原蛋白的质量比为100∶2～20，在0～20℃的条件下静置10分钟～24小时，得到丝素蛋白和胶原蛋白的混合溶液；

3）将丝素蛋白和胶原的混合溶液注入模具中，在-10～-80℃的低温条件下经过1～24小时的冷冻过程，进行冷冻处理获得冷冻体；对冷冻结晶体进行冷冻干燥处理，得到可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架；

4）将可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架放置在真空干燥器中，进行真空处理20分钟～24小时，获得不溶于水的纳米纤维化丝素蛋白多孔支架；所述真空干燥器底部含有水、甲醇水溶液或乙醇水溶液。

上述技术方案中，步骤1）中，将丝素蛋白溶液在0～80℃条件下放置1～48小时。

上述技术方案中，步骤4）中，甲醇水溶液的体积浓度1～100%；乙醇水溶液体积浓度为1～100%。

优选的技术方案中，一种纳米纤维化丝素蛋白基多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

1）按常规方法先将蚕丝经脱胶、溶解、透析得到纯的丝素蛋白水溶液，所述丝素蛋白水溶液的质量浓度为0.5%～5%，并在0～10℃下静置30分钟以上；将胶原溶解到质量浓度为0.01～0.1%的乙酸溶液中，所述胶原蛋白水溶液的质量浓度为0.05%～0.5%，并在0～10℃下静置30分钟至2小时；

2）在0～10℃下，混合均匀丝素蛋白水溶液和胶原蛋白水溶液，混合后，丝素蛋白的质量浓度为0.2%～3%，胶原蛋白的质量浓度为0.02%～0.2%，静置4～10小时，得到丝素蛋白和胶原蛋白的混合溶液；

3）将丝素蛋白和胶原的混合溶液注入模具中，在-10～-30℃的低温条件下经过20～24小时的冷冻过程，进行冷冻处理获得冷冻体；将冷冻体进行冷冻干燥处理，获得可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架；

4）将可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架放置在真空干燥器中，进行真空处理4小时以上，获得不溶于水的纳米纤维化丝素蛋白多孔支架；所述真空干燥器底部含有水、甲醇水溶液或乙醇水溶液，在抽真空后，干燥器中形成水、甲醇或者乙醇的饱和蒸汽，从而促进丝蛋白的结构转变。

进一步优选的技术方案中，步骤1）中，所述丝素蛋白水溶液的质量浓度为1%～2%；所述胶原蛋白水溶液的质量浓度为0.075%～0.2%；步骤2）中，混合均匀丝素蛋白水溶液和胶原蛋白水溶液时，取等体积的丝素蛋白水溶液和胶原蛋白水溶液。

本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架，所述纳米纤维化多孔支架由纳米纤维构成，所述纳米纤维直径在10-100纳米之间；所述纳米纤维化多孔支架具有孔径为10～1000微米的相互贯通的孔隙，孔隙率在80%以上。

上述纳米纤维化多孔支架的结晶结构和组成可调，降解速率可调。

本发明的原理是：丝素蛋白在水溶液中存在缓慢的自组装过程，能够逐渐由分散的分子自组装成纳米球或者进一步组装成纳米线，一旦组装成功，丝素蛋白能够在相对较长时间保持稳定，在水溶液中能够稳定存在。如上自组装过程受到温度、亲疏水作用力、溶液浓度、离子强度、pH值、以及时间等的影响，因此通过调控各种简单的物理因素，就可以可控的制备出不同尺寸的丝素蛋白纳米球和纳米线。在本发明中，通过将丝素蛋白和胶原蛋白的混合温度降低到20℃以下，并延长静置时间，提高丝素蛋白同胶原蛋白相互作用的程度，有效促进了丝素蛋白纳米纤维的形成；同时，本发明所提供的后处理方法，通过在饱和水、甲醇或者乙醇等的真空环境中对丝素蛋白支架进行处理，成功获得了具有不同晶体组成的丝素蛋白多孔支架，在有效降低甚至是取消有毒溶剂使用的基础上，实现了丝素蛋白多孔支架的降解可控。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1）本发明获得的多孔支架具有10～1000微米的相互贯通的孔隙，孔壁则是由直径在10～100纳米的纳米纤维组成，同细胞外基质具有相似的纳米和微米级结构，适合细胞的粘附和生长，生物相容性显著提高，有利于组织修复和组织工程的应用；同时不同的后处理方式能够有效调控丝素蛋白的二级结构，从而具有不同的降解性能，以满足不同组织再生的需要；整个制备过程不需要添加任何化学交联剂或者发泡剂，有效保持了丝素蛋白良好的生物相容性。

2）由于制备过程都是在低于常温、水环境下完成，所制备过程温和、易控，不会引起丝素蛋白生物相容性的降低。

3）在制备过程中，可以通过调节冷冻温度、溶液浓度等参数，控制冰晶的大小，从而方便地达到控制丝素蛋白多孔支架孔结构的目的，满足不同应用的要求。

4）后处理过程中，通过更换处理溶液，能够有效地控制所制备丝素蛋白多孔支架的晶体结构，从而达到控制其降解速率的目的。

附图说明

图1是实施例一中制备的丝素蛋白/胶原多孔支架和普通冷冻干燥法制备的多孔支架材料的扫描电镜图；其中（a）为普通冷冻干燥法制备的多孔支架，（b）为实施例一技术方案制备的丝素蛋白/胶原多孔支架。

图2是实施例一中制备的丝素蛋白/胶原多孔支架和普通冷冻干燥法制备的多孔支架材料的红外结果。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

本实施例所提供的丝素蛋白多孔支架制备步骤如下：

1）将5克蚕茧加入2升质量浓度为0.5%的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理40分钟，脱去外部的丝胶蛋白，充分洗涤后获得纯的丝素蛋白。将干燥后的丝素蛋白在60℃左右溶解到9.3摩尔/升的溴化锂溶液中，获得丝素蛋白混合溶液。

2）将丝素蛋白混合溶液加入纤维素透析膜，用去离子水进行透析，去除溴化锂，得到纯的丝素蛋白水溶液。

3）将丝素蛋白质量浓度调节到1%，放置到4℃下1小时，使溶液温度稳定在4℃。

4）将胶原蛋白溶液稀释到0.075%，放置到4℃下1小时，使溶液温度稳定在4℃。

5）在4℃条件下，将同体积的丝素蛋白溶液和胶原蛋白溶液共混，放置6小时。

6）将混合溶液注入到模具中，在-20℃冷冻24小时，得到丝素蛋白/胶原蛋白冷冻体。

7）将冷冻后的丝素蛋白/胶原蛋白混合物放入冷冻干燥机，经48小时冷冻干燥处理，获得可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架。

8）将此多孔支架放入底部加有水的真空干燥器中，真空处理6小时，获得不溶于水的丝素蛋白/胶原蛋白多孔支架。

参见附图1，它是按上述技术方案制备的丝素蛋白多孔支架和普通冷冻干燥法制备出的多孔支架的扫描电镜图。由此可以看出，普通冷冻干燥法制备出的丝素蛋白支架为片状结构，孔壁中没有纳米纤维存在；而本技术方案制备出的丝素蛋白/胶原蛋白多孔支架，不仅形成了良好的多孔结构，孔直径在200-400微米之间，同时孔壁完全由纳米纤维组成，纤维直径小于100nm。

参见附图2，它是按上述技术方案制备的丝素蛋白/胶原蛋白多孔支架的红外光谱图。从中可以发现，丝素蛋白/胶原蛋白多孔支架的特征吸收峰出现在1650和1630cm-1，表明其同时存在silk I和silk II晶体结构。

实施例二：

将5克蚕茧加入2升质量浓度为0.5%的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理40分钟，脱去外部的丝胶蛋白，充分洗涤后获得纯的丝素蛋白。将干燥后的丝素蛋白在60℃左右溶解到9.3摩尔/升的溴化锂溶液中，获得丝素蛋白混合溶液。

将丝素蛋白混合溶液加入纤维素透析膜，用去离子水进行透析，去除溴化锂，得到纯的丝素蛋白水溶液。

将丝素蛋白溶液在60℃放置24小时，随后将丝素蛋白质量浓度调节到2%，放置到4℃下1小时，使溶液温度稳定在4℃。

将胶原蛋白溶液稀释到0.2%，放置到4℃下1小时，使溶液温度稳定在4℃。

在4℃条件下，将同体积的丝素蛋白溶液和胶原蛋白溶液共混，放置6小时。

将混合溶液注入到模具中，在-20℃冷冻24小时，得到丝素蛋白/胶原蛋白冷冻体。

将冷冻后的丝素蛋白/胶原蛋白混合物放入冷冻干燥机，经48小时冷冻干燥处理，获得可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架。

将此多孔支架放入底部加有水的真空干燥器中，真空处理6小时，获得不溶于水的丝素蛋白/胶原蛋白多孔支架。此多孔支架的孔径在100-200微米，孔隙率在90%以上，晶体结构为silk I和silk II共存。

实施例三：

将丝素蛋白溶液在60℃放置24小时，随后将丝素蛋白质量浓度调节到1%，放置到4℃下1小时，使溶液温度稳定在4℃。

将胶原蛋白溶液稀释到0.075%，放置到4℃下1小时，使溶液温度稳定在4℃。

将此多孔支架放入底部加有80%乙醇溶液的真空干燥器中，真空处理6小时，获得不溶于水的丝素蛋白/胶原蛋白多孔支架。此多孔支架的孔径在200微米以上，孔隙率在90%以上，主要晶体结构为silk II。

实施例四：

将此多孔支架放入底部加有80%甲醇溶液的真空干燥器中，真空处理6小时，获得不溶于水的丝素蛋白/胶原蛋白多孔支架。此多孔支架的孔径在200微米以上，孔隙率在90%以上，主要晶体结构为silk II。

Claims

1.一种纳米纤维化丝素蛋白基多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按常规方法先将蚕丝经脱胶、溶解、透析得到丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.1～20%；将胶原溶解到质量浓度为0.01～0.1%的乙酸溶液中，得到胶原蛋白溶液，所述胶原蛋白溶液的质量浓度为0.01%～2%；

2）将丝素蛋白溶液同胶原蛋白溶液共混，混合后，丝素蛋白和胶原蛋白的质量比为100∶2～20；在0～20℃的条件下静置10分钟～24小时，得到丝素蛋白和胶原蛋白的混合溶液；

3）将丝素蛋白和胶原蛋白的混合溶液注入模具中，在-10～-80℃的低温条件下经过1～24小时的冷冻过程，进行冷冻处理获得冷冻体；对冷冻结晶体进行冷冻干燥处理，得到可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）中，将丝素蛋白溶液在0～80℃条件下放置1～48小时。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

4）将可溶的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架放置在真空干燥器中，进行真空处理4小时以上，获得不溶于水的纳米纤维化丝素蛋白多孔支架；所述真空干燥器底部含有水、甲醇水溶液或乙醇水溶液。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述丝素蛋白水溶液的质量浓度为1%～2%；所述胶原蛋白水溶液的质量浓度为0.075%～0.2%；步骤2）中，混合均匀丝素蛋白水溶液和胶原蛋白水溶液时，取等体积的丝素蛋白水溶液和胶原蛋白水溶液。

5.采用权利要求1、2、3或4中的一种的制备方法制备得到的丝素蛋白/胶原蛋白纳米纤维化多孔支架，其特征在于，所述纳米纤维化多孔支架由纳米纤维构成，所述纳米纤维直径在10～100纳米之间；所述纳米纤维化多孔支架具有孔径为10～1000微米的相互贯通的孔隙，孔隙率在80%以上。