CN106139246A - 一种再生丝蛋白纤维支架及其制备方法 - Google Patents

一种再生丝蛋白纤维支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种再生丝蛋白纤维支架及其制备方法：通过盐‑甲酸在纳米原纤水平溶解蚕丝，经干燥后获得丝蛋白纳米原纤膜；将该膜再次于常温溶解于常规中性盐溶剂中，经透析获得丝蛋白纳米原纤水溶液；调整丝蛋白溶液至合适浓度，然后经过冷冻干燥工艺得到再生丝蛋白纤维支架；该支架经有机溶剂处理后制得水不溶再生丝蛋白纤维支架。本发明所制支架主要由再生丝蛋白纤维组成，纤维直径介于50nm~10μm，该纤维结构非常有利于细胞迁移与组织生长，是理想的组织工程支架。

Description

一种再生丝蛋白纤维支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种丝蛋白纤维支架及其制备方法，所制备的材料可应用于再生医学、药物装载等领域。
背景技术
由于疾病和事故导致的器官或组织损伤和功能缺失的病人每年都有数百万之多，仅美国每年需要800多万次手术对这类病人进行救治，其经济花费在4000亿美元以上。随着现代医学和外科手术技术的发展，通过组织或器官移植来修复功能损失已经被广泛接受，然而却面临着巨大的供体缺口。通过再生医学手段体在体内或体外形成组织或器官为受损功能的修复提供了新的治疗方案。其中，组织工程支架材料的选择及构建成为该治疗方法的关键之一。
蚕丝蛋白是来源于自然界的天然高分子生物材料，具有优异的力学性质、可控的生物降解性、易加工性，特别是其与胶原同等的生物相容性而成为理想的再生医学支架的原材料。我国是蚕丝的主要生产国，蚕丝产量占世界产量的70%以上。近年来，蚕丝的研究与应用从传统的纺织领域延伸到高新技术领域，如光电子与生物医用材料，特别是作为生物医用材料已经取得了重要进展。
丝蛋白多孔支架因具有三维多孔结构，可以为细胞的粘附增殖、及组织的再生提供三维空间，并且有利于营养物质的传输，因此受到了广泛研究。目前，制备丝素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷冻干燥、盐析法、气体发泡法、三维打印等，然而这些方法都依然存在一些难以克服的不足，例如，冷冻干燥法易形成片层结构，不利于细胞与组织生长。现有技术报道了一种反复进行膜溶解控制丝素蛋白自组装形成纳米纤维结构，进而形成多孔支架，但该方法的效率低，重复性差，并且孔壁结构的存在直接限制细胞的迁移与相互作用，组织生长也因此受限。在此方面，利用静电纺丝技术制备的纤维支架被认为是组织工程理想的支架结构。然而静电纺丝技术加工复杂、产量低、且静电纺纤维膜结构致密，也不利于细胞与组织生长。因此，如能构建一种支架材料，具有多孔支架的大孔径高空隙率优点，同时具有纤维状的内部结构特征，将极大促进细胞生长，如细胞增殖与迁移、和组织生长，对组织工程技术临床应用非常有利。
为此，克服现有加工技术与丝蛋白支架结构的上述问题，开发一种制备方法，并构建出有利于细胞与组织生长的丝素蛋白支架对丝素蛋白在生物医用材料领域的应用及再生医学的临床应用都具有非常重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可行的再生丝蛋白多孔材料的制备方法，及由该方法制备的再生丝蛋白纤维支架。
为达到上述目的，本发明提供一种再生丝蛋白纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）脱胶蚕丝溶解于盐-甲酸溶液，然后自然干燥得到含盐丝蛋白膜；
（2）将含盐丝蛋白膜溶解于中性盐溶液中，透析后获得丝蛋白水溶液；
（3）将丝蛋白水溶液注入模具中，冷冻处理，然后经冷冻干燥处理得到再生丝蛋白纤维；
（5）将再生丝蛋白纤维经有机溶剂后处理得到水不溶再生丝蛋白纤维支架。
上述技术方案中，步骤（1）中，所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝中的一种或几种；所述盐为溴化锂、氯化钙、氯化锌、氯化镁、硫氰酸锂、硫氰酸钠、硫氰酸镁、硝酸钙、硝酸铜、碳酸钙、磷酸钙中的一种或几种。
上述技术方案中，步骤（1）中，所述盐-甲酸溶液中甲酸浓度为50～98wt%；盐浓度为1～10w/v%。
上述技术方案中，步骤（2）中，中性盐为氯化钙、溴化锂、硝酸钙、氯化镁、氯化锌、硫氰酸锂；优选为氯化钙、溴化锂、硫氰酸锂。
上述技术方案中，步骤（2）中，所述溶解温度为0～50℃，优选20～37℃。
上述技术方案中，步骤（2）中，所述丝蛋白溶解浓度为0.1～10 wt%，优选1～5wt%。
上述技术方案中，步骤（1）和（2）中的溶剂均可溶解蚕丝，但本发明创造性的先进行步骤（1），然后再进行步骤（2），在此条件下即可获得纤维化的再生丝素蛋白支架，而非多孔丝素蛋白支架；取得了意想不到的技术效果。
本发明还公开了按照上述技术方案制成的再生丝蛋白纤维支架，主要由再生丝蛋白纤维组成，纤维直径为50nm～10μm，支架孔隙率大于80%。
本发明中，盐-甲酸溶解蚕丝主要发生在原纤水平，因此溶解后获得丝蛋白原纤膜；再利用中性盐溶液（如9.3M LiBr溶液）在较低温度下（本发明限制在0~50℃，优选20~37℃）溶解丝蛋白原纤膜，经透析后即可获得由丝蛋白原纤组成的水溶液；该溶液经冷冻处理时会诱导丝蛋白原纤自组装结合形成纤维，经冷冻干燥后即形成纤维状支架（参见本发明说明书附图）。该再生丝蛋白纤维支架具有不同传统丝蛋白多孔材料的纤维结构，该结构作为生物支架材料具有高孔隙率，且非常有利于营养物质的输送、细胞的迁移、组织的生长，是理想的组织工程支架。
附图说明
图1为现有技术与实施例一制得的再生丝蛋白水溶液和再生丝蛋白纤维支架的外观与扫描电镜图；
图2为实施例二制得的再生丝蛋白纤维支架的扫描电镜图；
图3为实施例三制得的再生丝蛋白纤维支架的扫描电镜图；
图4为实施例四制得的再生丝蛋白纤维支架的扫描电镜图；
图5为实施例五制得的再生丝蛋白纤维支架的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一
（1）脱胶桑蚕丝溶解于含2%氯化钙的80%甲酸溶液，蚕丝浓度15wt%,溶解后干燥成膜。
（2）将步骤（1）的丝蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解温度30℃，溶解浓度5wt%，透析后获得纯丝蛋白水溶液。
（3）将步骤（2）的丝蛋白水溶液用去离子水稀释至浓度1 wt%。
（4）将1 wt%丝蛋白水溶液置于-20℃冷冻24h，然后于-20℃冻干即为可溶丝蛋白纤维。
（5）将可溶丝蛋白纤维支架浸入75%乙醇处理30min，然后重复步骤（4）获得水不溶再生丝蛋白纤维支架。
对照样为脱胶丝直接溶解于60℃的9.3M LiBr溶液中，然后与实施例一经过同样的透析、稀释、冷冻、冷冻干燥、有机溶剂后处理工艺。附图1为对照样与实施例一获得的丝蛋白水溶液的照片和支架的扫描电镜。由图可见，对照样丝蛋白水溶液为白色，而实施例一丝蛋白水溶液为蓝色；对照样丝蛋白支架内部为片层结构，而实施例一丝蛋白支架内部为纤维结构。采用溴化锂在30℃溶解5wt%的丝素蛋白，可以在不严重破坏蚕丝的条件下溶解获得丝素蛋白水溶液，且5wt%的浓度既保证了适宜的溶解效率，同时避免高浓度透析时易凝胶的问题，最终获得具有较好纤维结构的再生丝素蛋白纤维支架。显然，支架内的片层结构会阻碍细胞的迁移和组织的生长；相反，纤维化的结构有利于营养物质的输送、细胞的迁移及相互作用、和组织的生长融合，因此更适合用作组织工程支架。
实施例二
（1）脱胶桑蚕丝溶解于含5%氯化钙的90%甲酸溶液，蚕丝浓度10wt%,溶解后干燥成膜。
（2）将步骤（1）的丝蛋白膜溶解于氯化钙-乙醇-水三元溶剂，溶解温度30℃，溶解浓度3wt%，透析后获得纯丝蛋白水溶液。
（3）将步骤（2）的丝蛋白水溶液用去离子水稀释至浓度1.5 wt%。
（4）将1.5 wt%丝蛋白水溶液置于-40℃冷冻24h，然后于-40℃冻干即为可溶丝蛋白纤维。
（5）将可溶丝蛋白纤维支架浸入甲醇处理30min，然后重复步骤（4）获得水不溶再生丝蛋白纤维支架。
附图2为实施例二获得的丝蛋白支架的扫描电镜。由图可见，按照实施例二制得的丝蛋白支架内部为纤维结构，非常有利于营养物质的输送、细胞的迁移、组织的生长，是理想的组织工程支架。
实施例三
（1）脱胶桑蚕丝溶解于含5%硝酸钙的88%甲酸溶液，蚕丝浓度20wt%,溶解后干燥成膜。
（2）将步骤（1）的丝蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解温度25℃，溶解浓度6wt%，透析后获得纯丝蛋白水溶液。
（3）将步骤（2）的丝蛋白水溶液用去离子水稀释至浓度0.8 wt%。
（4）将0.8 wt%丝蛋白水溶液置于-20℃冷冻24h，然后于-20℃冻干即为可溶丝蛋白纤维。
（5）将可溶丝蛋白纤维支架浸入50%乙醇处理30min，然后重复步骤（4）获得水不溶再生丝蛋白纤维支架。
附图3为实施例三获得的丝蛋白支架的扫描电镜。由图可见，按照实施例三制得的丝蛋白支架内部为纤维结构，非常有利于营养物质的输送、细胞的迁移、组织的生长，是理想的组织工程支架。
实施例四
（1）脱胶柞蚕丝溶解于含8%氯化钙的98%甲酸溶液，蚕丝浓度5wt%,溶解后干燥成膜。
（2）将步骤（1）的丝蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解温度50℃，溶解浓度2wt%，透析后获得纯丝蛋白水溶液。
（3）将步骤（2）的丝蛋白水溶液用去离子水稀释至浓度1 .5wt%。
（4）将1.5 wt%丝蛋白水溶液置于-20℃冷冻24h，然后于-20℃冻干即为可溶丝蛋白纤维。
（5）将可溶丝蛋白纤维支架浸入甲醇处理30min，然后重复步骤（4）获得水不溶再生丝蛋白纤维支架。
附图4为实施例四获得的丝蛋白支架的扫描电镜。由图可见，按照实施例四制得的丝蛋白支架内部为纤维结构，非常有利于营养物质的输送、细胞的迁移、组织的生长，是理想的组织工程支架。
实施例五
（1）脱胶蓖麻蚕丝溶解于含5%氯化钙的95%甲酸溶液，蚕丝浓度10wt%,溶解后干燥成膜。
（2）将步骤（1）的丝蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解温度37℃，溶解浓度8wt%，透析后获得纯丝蛋白水溶液。
（3）将步骤（2）的丝蛋白水溶液用去离子水稀释至浓度0.5 wt%。
（4）将0.5 wt%丝蛋白水溶液置于-20℃冷冻24h，然后于-20℃冻干即为可溶丝蛋白纤维。
（5）将可溶丝蛋白纤维支架浸入80%乙醇处理30min，然后重复步骤（4）获得水不溶再生丝蛋白纤维支架。
附图5为实施例五获得的丝蛋白支架的扫描电镜。由图可见，按照实施例五制得的丝蛋白支架内部为纤维结构，非常有利于营养物质的输送、细胞的迁移、组织的生长，是理想的组织工程支架。

Claims (10)

1.一种再生丝蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）脱胶蚕丝溶解于盐-甲酸溶液，然后自然干燥得到含盐丝蛋白膜；
（2）将含盐丝蛋白膜溶解于中性盐溶液中，透析后获得丝蛋白水溶液；
（3）将丝蛋白水溶液注入模具中，冷冻处理，然后经冷冻干燥处理得到再生丝蛋白纤维；
（4）将再生丝蛋白纤维经有机溶剂后处理得到再生丝蛋白纤维支架。
2.根据权利要求1所述再生丝蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝中的一种或几种；所述盐为溴化锂、氯化钙、氯化锌、氯化镁、硫氰酸锂、硫氰酸钠、硫氰酸镁、硝酸钙、硝酸铜、碳酸钙、磷酸钙中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述再生丝蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述盐-甲酸溶液中甲酸浓度为50～98wt%；盐浓度为1～10w/v%。
4. 根据权利要求1所述再生丝蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，中性盐为氯化钙、溴化锂、硝酸钙、氯化镁、氯化锌、硫氰酸锂，所述丝蛋白水溶液浓度为0.1～10 wt%。
5.根据权利要求1所述再生丝蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述溶解温度为0～50℃。
6.根据权利要求1所述再生丝蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，冷冻处理条件-80℃～-10℃。
7.根据权利要求1所述再生丝蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，有机溶剂为醇。
8.根据权利要求1所述再生丝蛋白纤维支架的制备方法制备的再生丝蛋白纤维支架。
9.根据权利要求8所述再生丝蛋白纤维支架，其特征在于：所述再生丝蛋白纤维支架由直径为50nm~10μm的再生丝蛋白纤维组成，支架孔隙率大于80%。
10.权利要求8所述再生丝蛋白纤维支架在制备组织支架中的应用。
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