KR20120097948A - 생분해성 고분자를 이용한 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생분해성 고분자를 포함하는 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법에 관한 것으로 특히 PLGA 나노섬유와 PCL 마이크로섬유를양방향에서 동시에 전기방사하여 생체모방적인 조직공학용 지지체를 제조하고 그 형태와 재료의 특성으로 인해 생분해성 조절 용이, 세포부착능 향상, 세포배양효율 향상을 특징으로 하는 하이브리드섬유 시트형태의 세포배양 기재 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 하이브리드 섬유 시트는 나노섬유의 단점인 삼차원 배양문제와 마이크로섬유의 단점인 세포배양효율 저하를 효과적으로 해결하고 각각의 장점인 세포 퍼짐성(spreading), 세포부착능력, 삼차원 배양능력 등의 특성이 대폭 향상되었다.

Description

생분해성 고분자를 이용한 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법 {Nano/micro hybrid fiber non-woven fabric using biodegradable polymers and method for preparing the same}

본 발명은 생분해성 고분자를 이용한 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특히, PLGA 나노섬유와 PCL 마이크로섬유를 양방향에서 동시에 전기방사하여 생체모방적인 조직공학용 지지체를 제조하고 그 형태와 재료의 특성으로 인해 생분해성 조절 용이, 세포부착능 향상, 세포배양효율 향상을 특징으로 하는 하이브리드섬유 시트 형태의 세포배양 기재와 그 제조방법 및 양방향에서 동시 방사가 가능한 전기방사 시스템, 방사장치 시스템, 전기방사용 챔버 시스템, 조직공학용 지지체에 관한 것이다.

종래 조직공학용 지지체는 생체재료 (biomaterials)라는 개념에 포함되는 항목으로 생체재료 중에서도 생분해성 고분자 (biodegradable polymers)로 대부분 연구되어 왔다. 또한, 일반적인 생체재료는 두개골과 치아 등에 쓰이는 대체물처럼 조직을 대체할 수 있는 충분한 물성을 가지고 면역학적인 거부반응이 없도록 생체적합성을 가지는 물질을 주로 의미하였으나, 조직공학용 지지체의 경우에는 대체조직에 적합한 적당한 물성을 가지고 생체적합성을 가지는 것은 물론, 지지체로 인해 조직이 충분히 형성되었을 경우 생분해되어 체내로 흡수되는 생분해성을 가져야 한다는 점에서 차이가 있다.

상기 이러한 조직공학용 지지체를 이용하여 만든 인공 조직을 체내에 이식하게 되면 체내 이식 초기에는 지지체로 인해 이식된 조직 세포들이 신체 내에서 사멸하지 않고 본래의 기능을 유지하는 기반을 제공하고 시간이 경과함에 따라서 생분해성 고분자는 점차 소멸하고 신체 내부에 충분히 적응한 이식 세포만으로 구성된 자연 조직과 동일한 형태와 기능을 지닌 조직을 형성할 수 있게 되어야 된다.

따라서, 이와 같이 조직공학용 지지체로 이용되는 생분해성 고분자는 생체 내에서 서서히 화학적 분해가 일어나면서 그 형태와 무게가 점차 소멸되는 고분자를 총칭하는 것인 바, 대표적으로, 천연고분자로는 콜라겐 (collagen), 섬유결합소 (fibronectin), 젤라틴 (gelatin), 키토산 (chitosan), 알긴산 (alginic acid), 히아루론산 (hyaluronic acid) 등이 널리 이용되고 있으며, 합성 고분자로는 poly(lactic acid) (PLA), poly(glycolic acid) (PGA), poly(D,L-lactic-co- glycolic acid) (PLGA)와 그 유사 공중합체들과 poly(ε-caprolactone) (PCL), polyanhydrides, polyorthoesters 등이 이용되고 있다.

또한, 이를 사용하여 조직세포의 담체를 제작하여 세포와 함께 체내에 이식하게 되면, 세포가 신체 조직에 적응하여 조직을 형성하는 도중에 생분해성 고분자는 차차 분해되어 사라지므로 재수술을 통해 고분자를 제거하는 불편을 덜 수 있으며 이물질 삽입에 의한 만성적인 면역반응 또한 감소하는 효과를 기대할 수 있게 된다. 또한 체내분해성 고분자는 생체내에서 이물반응을 일으키지 않아야 하며, 전혀 무해한 물질로 분해되어야 함은 물론 적절한 가공 특성 및 강도를 지녀야 한다.

또한, 이러한 생분해성 고분자를 이용한 조직공학용 다공성 지지체는 여러 방법으로 제조될 수 있다. 동결건조법 (freeze-drying), 용매 캐스팅법 (solvent casting), 미립자 소결법 (microsphere sintering), 상분리법 (phase separate), 세포제거 조직 (decellularized tissue) 및 전기방사법 (electrospinning) 등이 있다. 그중 실제 생체내 세포외기질 (extracellular matrix: ECM)과 유사한 구조와 형태 즉, 약 50-150 nm 직경을 갖는 복잡한 섬유형태의 3차원 망상구조를 가지는 생체적합성 재료가 이상적인 지지체라 할 수 있다.

한편, 이러한 극세섬유를 제조하는 방사기술로는 종래 복합방사 (conjugate spinning), 멜트블로운 방사 (melt blown spinning), 플래시 방사 (plash spinning), 전기방사 (electrospinning) 등이 알려져 있으나, 상기 방법에 의해 제조되는 기존 섬유시트들인 나노섬유나 마이크로섬유는 각각 표면적과 기공에 있어서 세포 침투나 세포 퍼짐등의 원활성과 관련하여 적지않은 문제점을 지니고 있었던 바, 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 본원 발명과 같이, 적용 고분자의 다양성, 제조공정의 단순성, 상용화의 가능성, 다양한 기술로의 응용성 등을 고려하여 초극세사 제조에 있어서 가장 적합한 기술로 인정받고 있는 전기방사법을 통해, 생분해성 고분자를 이용하여 나노섬유와 마이크로섬유를 하이브리드화 시키는 기술 및 연구에 관해서는 찾아보기 힘든 실정이었다.

이에 본 발명자는 전 세계적으로 연구가 활발히 진행되고 있는 조직공학용 지지체의 개발을 위해, 전기방사법을 이용하여 나노섬유와 마이크로섬유를 양방향에서 동시에 방사한 삼차원 나노/마이크로 하이브리드섬유를 제조하여 세포부착성 및 세포배양효율을 향상시키는 이상적인 조직공학용 지지체의 개발을 위해 예의 노력을 계속 하던 중, 본 발명과 같이 생체 적합적이면서도 생분해성 고분자인 poly (lactic-co-glycolic acid)(PLGA)와 poly(ε-caprolactone)(PCL)을 이용하여 PLGA가 나노섬유로 PCL이 마이크로섬유로 이루어진, 나노/마이크로 하이브리드 섬유 부직포에 관한 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 서로 다른 두 종류의 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 각각의 용액을 제조하는 단계, 상기 제조된 각 용액을 전기방사법을 이용하여 양 방향에서 각 생분해성 고분자의 나노섬유와 마이크로섬유를 동시에 방사하여 나노/마이크로 하이브리드섬유 시트를 제조하는 단계 및 상기 제조된 하이브리드섬유 시트의 잔류용매를 제거하여 수득하는 단계를 포함하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조되고, 그 단면의 평균 직경이 각각 10~1000 nm인 나노섬유, 1~100 μm인 마이크로섬유인 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 양방향에서 동시 방사가 가능한 전기방사 시스템, 주사기펌프와 용액 토출 장치는 피스톤 막대로 연결하여 챔버 외부에서 밀어주는 방식으로 수행되는 방사장치 시스템, 습도조절용 에어콘, 용매 휘발 및 섬유화 촉진용 온열기, 휘발성 용매 제거용 배기시스템을 갖춘 전기방사용 챔버 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피부, 근육, 연골, 간, 혈관, 신경, 각막세포, 줄기세포 등의 세포배양이 가능한 조직공학용 지지체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 서로 다른 두 종류의 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 각각의 용액을 제조하는 단계, b) 상기 제조된 각 용액을 전기방사법을 이용하여 양 방향에서 각 생분해성 고분자의 나노섬유와 마이크로섬유를 동시에 방사하여 나노/마이크로 하이브리드섬유 시트를 제조하는 단계 및 c) 상기 제조된 하이브리드섬유 시트의 잔류용매를 제거하여 수득하는 단계를 포함하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용되는 생분해성 고분자는 PHB(poly-hydroxy butyrate), PHBV(3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate), PGA[(poly)glycolic acid], PLA[(poly)lactic acid], PLGA(polylactic-co-glycolic acid), PCL[poly(e-caprolactone)], 폴리다이옥사논(polydioxanone), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 폴리아하이드라이드(polyanhydride), γ-PGA, 젤라틴(gelatin), 실크(silk), 콜라겐(collagen), 셀룰로오스(cellulose), 알긴산(alginic acid) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 조건에서 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용되는 생분해성 고분자는 PLGA(polylactic-co-glycolic acid)와 PCL[poly(e-caprolactone)]인 것을 특징으로 하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 PLGA와 PCL은 그 분자량이 각각 1000~500,000 g/mol인 것을 특징으로 하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 제1항의 b) 단계에 따른 전기방사는 PLGA 용액, PCL 용액의 농도가 각각 0.1~50중량%, 전압 5~100kV, 유체속도 0.1~5ml/h, 방사거리 3~50cm 및 습도 1~50%의 조건으로 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용되는 유기용매는 트리플루오로아세트산(TFA, trifluoro acetic acid), 디메틸포름아마이드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide), TFE(trifluoro ethylene), 아세톤(acetone), HFIP(hexa fluoro isopropanol), MC(methylene chloride), THF(tetrahydrofuran), 아세트산(acetic acid) 및 포름산(formic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합용매인 것을 특징으로 하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 b) 단계는 나노섬유와 마이크로섬유의 조성비가 각각 1:99 ~ 99:1 인 조건에서 수행될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되고, 그 단면의 평균 직경이 각각 10~1000 nm인 나노섬유, 1~100 μm인 마이크로섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, 양방향에서 동시 방사가 가능한 전기방사 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 시스템의 양방향에서 동시 방사된 나노섬유와 마이크로섬유를 이용하여 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포를 제조하는 것을 특징으로 하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 상기 시스템에 의해 제조된 부직포는 양방향에서 동시에 방사함으로써 층 분리없이 상호연결(interconnection)되는 것을 특징으로 하여 수행될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, 상기 제조방법에 있어서, 주사기펌프와 용액 토출 장치는 피스톤 막대로 연결하여 챔버 외부에서 밀어주는 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방사장치 시스템을 제공할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, 챔버내의 환경을 전기방사에 최적조건으로 유지하기 위해 습도조절용 에어콘, 용매 휘발 및 섬유화 촉진용 온열기, 휘발성 용매 제거용 배기시스템을 갖춘 것을 특징으로 하는 전기방사용 챔버 시스템을 제공할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, 피부, 근육, 연골, 간, 혈관, 신경, 각막세포, 줄기세포 등의 세포배양이 가능한 조직공학용 지지체를 제공한다.

상기 본 발명에서는 FDA승인을 받은 생분해성 합성고분자를 사용하여 안정적인 기계적 물성과 양방향에서 동시에 방사함으로 인해 나노섬유와 마이크로섬유가 층을 이루지 않는 상호연결(interconnection)이 된 진정한 의미의 생체모방적 세포배양 지지체를 제조하고자 하였다.

또한, 최근에는 마이크로섬유 위에 나노섬유를 방사하는 방식을 여러번 반복하는 방법으로 층을 이루는 복합섬유 지지체를 이용하고 있으나 이는 나노섬유와 마이크로섬유가 각각의 층을 이루고 있기 때문에 세포들이 일부 마이크로섬유 위에 자라고 결국에는 나노섬유 위에서 대부분 성장하는 형태를 띄기 때문에 세포증식거동이나 배양효율이 나노섬유와 큰 차이가 없는 것이 문제점으로 지적되고 있다(참조: Suk Hee Park, Taek Gyoung Kim, Hyo Chan Kim, Dong-Yol Yang, Tae Gwan Park, Acta Biomaterialia, 4, 1198-1207, 2008.). 본 발명에서는 양방향에서 나노섬유와 마이크로섬유를 동시에 방사하여 나노섬유와 마이크로섬유가 층을 이루지 않는 상호연결(interconnection)이 월등히 향상된 섬유 시트를 제조하여 세포의 증식성과 세포배양 효율을 월등히 향상시키고자 하였다.

위와 같이 전기방사를 이용한 나노섬유와 마이크로섬유를 포함하는 복합적인 형태의 조직공학용 지지체를 제조하려는 기술들은 이미 보고되었다. 하지만 기존의 기술에서는 하나의 공정으로 두가지 다른 재료를 지니는 나노/마이크로 하이브리드섬유를 제조하지 못하였으며, 표면에만 나노섬유가 집중되어 있어 하이브리드 섬유의 주요특성인 삼차원적인 세포배양은 힘들다고 보아야 할 것이다. 그리고 천연고분자를 사용하였기에 기계적인 물성이 낮고 그 형태와 재료특성으로 인해 세포부착성과 세포배양효율은 떨어질 것으로 보인다. 또한, 나노섬유와 마이크로섬유가 각각 층을 이루고 있어 세포증식거동과 배양효율이 높지 않다는 문제점이 가지고 있기 때문에, 본 발명에서는 다른 형태와 다른 구성 고분자를 사용하고 양방향에서 동시에 방사하여 나노섬유와 마이크로섬유가 층을 이루지 않는 상호연결(interconnection)된 부직포를 제조하였다.

본 발명은 상기와 같은 의학적, 기술적 문제점을 해소하기 위해 생분해성 고분자인 PLGA, PCL를 주성분으로 하여 부직포 형태의 나노/마이크로 하이브리드 섬유 시트를 전기방사법으로 제조하고 이를 조직공학용 세포배양 기재로 활용하고자 하였다.

전기방사로 제조된 나노섬유는 세포외기질 (ECM)과 유사한 morphology를 가지고 있어 표면적이 크고 세포배양시 세포들의 접착이나 증식, 퍼짐 (spreading)이 우수하여 조직공학용 지지체로서 많은 연구가 진행되었다. 하지만 나노섬유는 기공이 너무 작아 세포의 침투가 원활하지 못하고 두께가 얇고 삼차원적인 배양은 하지 못한다는 단점을 가지고 있다. 또한 섬유가 너무 얇아 기계적인 물성도 약하다는 단점을 가지고 있다.

또한 마이크로섬유의 경우에는 지지체를 두껍게 제조할 수 있고 기공이 크기 때문에 세포들의 침투가 원활히 이루어진다는 장점을 가지고 있으나 기공이 큰 만큼 세포의 유출이 심하고 세포의 퍼짐 (spreading)이 힘들어 세포를 배양하기에는 힘든 점이 많았다.

따라서 본 발명에서는 나노섬유와 마이크로섬유를 양방향에서 동시에 방사한 하이브리드섬유를 제조하여 나노섬유와 마이크로섬유의 단점과 기존의 하이브리드섬유가 갖던 문제점을 보완하고자 하였다.

본 발명에서는 이상적인 조직공학용 지지체를 설계한 후, 공정이 간단한 전기방사기술을 이용하여 PLGA와 PCL을 사용하여 양방향에서 동시에 방사된 하이브리드 섬유시트의 제조방법을 고안하여 새로운 형태의 나노/마이크로 하이브리드 섬유시트를 제조하였고, 이와 같은 하이브리드 섬유시트는 PLGA와 PCL이라는 생분해성 고분자를 사용하였기 때문에 인체에 안전하고 섬유시트 형태의 특성상 유연하고 비표면적이 큰 다공성 소재로써 조직공학용 지지체로서의 응용이 용이하고 생분해속도의 조절이 쉽다. 특히 양방향에서 동시에 방사하여 나노섬유와 마이크로섬유가 층을 이루지 않는 상호연결(interconnection)된 형태의 섬유시트를 제조하여 기존의 섬유시트들의 문제점들을 해결하였고 세포증식성과 세포배양 효율이 대폭 향상되었다. 결과적으로 본 발명에서 제공된 하이브리드 섬유시트는 위 요소들의 효과로 인하여 조직공학용 세포배양 기재로서의 역할을 극대화할 수 있게 되는 것이다.

도 1은 전기방사장치 시스템 구성도이다.
도 2는 PLGA 나노섬유 시트의 전자현미경 사진이다.
도 3은 PCL 마이크로섬유 시트의 전자현미경 사진이다.
도 4는 양방향에서 동시에 전기방사하는 시스템을 도식화한 그림이다.
도 5는 나노섬유와 마이크로섬유를 복합시킨 하이브리드 섬유시트의 전자현미경 사진이다. (a: 나노섬유의 유체속도가 0.010 ml/min인 하이브리드섬유, b: 나노섬유의 유체속도가 0.013 ml/min인 하이브리드섬유)
도 6은 나노섬유와 마이크로섬유의 표면형태와 평균직경을 보여주는 전자현미경 사진과 그래프이다. (a: 나노섬유의 평균직경분포와 전자현미경사진, b: 마이크로섬유의 평균직경분포와 전자현미경사진 )
도 7은 나노섬유와 마이크로섬유, 하이브리드섬유의 생분해 거동결과를 나타낸 사진이다. (a: 나노섬유, b: 마이크로섬유, c: 하이브리드섬유 )
도 8은 다양한 섬유시트의 세포 증식거동(1일차)의 결과를 나타낸 전자현미경 사진이다. (a: nanofibers, b: microfibers, (c, d): 18% hybrid fibers (x 300, x 500), (e, f): 23% hybrid fibers (x 300, x 500))
도 9는 다양한 섬유시트의 세포 증식거동(5일차)의 결과를 나타낸 전자현미경 사진이다. (a: nanofibers, b: microfibers, (c, d): 18% hybrid fibers (x 300, x 500), (e, f): 23% hybrid fibers (x 300, x 500))
도 10은 다양한 섬유시트의 세포 증식거동(9일차)의 결과를 나타낸 전자현미경 사진이다. (a: nanofibers, b: microfibers, (c, d): 18% hybrid fibers (x 300, x 500), (e, f): 23% hybrid fibers (x 300, x 500))
도 11은 다양한 섬유 시트의 MTT 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 세포파종수에 따른 하이브리드섬유의 MTT 결과를 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 생분해성 고분자인 PLGA, PCL을 주성분으로 하여 부직포 형태의 나노/마이크로 하이브리드 섬유 시트를 전기방사법으로 제조하고 이를 조직공학용 세포배양 기재로서 적용하였다.

상기 나노섬유와 마이크로섬유에 이용되는 고분자는 키토산, 폴리감마글루탐산 및 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)(PHBV)를 사용할 수 있으며 생체 적합한 PLGA 및 PCL, 친수성 고분자인 PEO 및 PVA를 균일하게 혼합하여 전기방사에 이용할 수 있다. 생체유래 고분자는 인체내에서 이물반응이 적고 생분해 시 분해산물의 독성이 없어서 안전성을 부여할 수 있다.

본 발명에서는 하이브리드 섬유 시트를 만들기 위해 전기방사법을 이용하였다. 전기방사를 위해 고분자는 유기용매에 균일하게 녹여야 한다. 본 발명에서는 전기방사에 이용되는 키토산 용액제조를 위해 방사성 (spinnability)이 높은 hexafluoroisopropanol(HFIP)와 methylene chloride(MC)를 용매로 사용하였으며, 균일한 용액상태에서 일정한 섬유형태가 얻어지기 때문에 용액은 불순물이 없도록 완전히 용해시키고 상온에서 24시간정도 교반시킨 후 전기방사에 이용하였다.

도 1에서 나타낸 바와 같이 본 발명에서 사용한 기본적인 전기방사장치의 구성은 0 - 40 kV의 전압공급이 가능한 직류 고전압 발생장치 (DC High Voltage Generator [40kV/3mA], Chungpa EMT Co.), 평판형태 (plate type support jack, 200 x 200 mm, stainless steel)와 회전드럼형태 (metal drum, 400(w) x 216(Ø) mm, stainless steel)의 집전판 (collector), 금속드럼의 회전속도 제어장치 (drum speed controller unit, 0?176 rpm) 및 고분자용액을 일정한 유량 (volume) 및 유체속도 (flow rate)로 제어하는 주사기펌프 (syringe pump, KDS220, KD Scientific Inc.), 주사기 (Hamilton81620 gastight syringe, 10.0 ml, USA), 금속 주사기바늘 (Hamilton91022 metal hub needle, 22 Guage [length: 50.8 mm, inner diameter: 0.41 mm], USA), 디지털 온/습도계 (JB913R, Oregon scientific Inc., USA) 등으로 구성하였다.

본 발명에서는 다양한 공정인자 중 섬유형태에 중요한 영향을 주는 용액의 농도, 인가전압, 방사거리, 유체속도, 집전판의 형태, 습도 등에 따른 각각의 섬유 시트를 제조 후 구조 및 형태를 분석하고 재현성이 가장 좋은 전기방사조건으로 대량방사하여 회수하였다.

아래 실시예는 다양한 하이브리드 섬유 시트의 제조방법을 보다 상세히 설명한 것이다. 그러나 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.

비교예 1: PLGA 나노섬유 시트의 제조

생분해성/생체적합성 공중합체로 널리 알려져 있고 의료용으로 FDA (Food and Drug Administration) 승인을 받은 PLGA를 이용한 나노섬유 시트를 제조하기 위하여 먼저 균일한 PLGA-HFIP 6 wt% 용액을 제조 후 재현성이 좋은 조건에서 전기방사 하였다. 공정인자로는 전압 15 kV, 방사거리 18 cm, 유체속도 0.017 ml/min으로 고정시키고 평판형 집전판에 5시간 동안 방사하였다. 그 후 시트에 포함된 잔존용매를 제거하기 위하여 35℃ 진공오븐에서 3시간동안 충분히 건조시켰다. 그리고 건조된 나노섬유 시트는 전자 현미경을 통해 관찰하였으며(도 2), 알루미늄 호일에서 떼어낸 순수한 나노섬유 시트는 밀봉하여 제습보관 하였다.

비교예 2: PCL 마이크로섬유 시트의 제조

생분해성/생체적합성 공중합체로 널리 알려져 있는 PCL을 이용한 나노섬유 시트를 제조하기 위하여 먼저 균일한 PCL-MC 12 wt% 용액을 제조 후 재현성이 좋은 조건에서 전기방사 하였다. 공정인자로는 전압 15 kV, 방사거리 30 cm, 유체속도 0.056 ml/mindm로 고정시키고 평판형 집전판에 3시간 동안 방사하였다. 그 후 시트에 포함된 잔존용매를 제거하기 위하여 35℃ 진공오븐에서 3시간동안 충분히 건조시켰다. 그리고 건조된 마이크로섬유 시트는 전자 현미경을 통해 관찰하였으며(도 3), 알루미늄 호일에서 떼어낸 순수한 마이크로섬유 시트는 밀봉하여 제습보관 하였다.

실시예 1: PLGA / PCL 나노/마이크로 하이브리드섬유 시트의 제조

본 발명에서는 기존의 하이브리드 섬유와는 다른 생체모방적인 섬유 시트를 제조하기 위해 나노섬유와 마이크로 섬유를 도 4와 같이 양방향에서 동시에 방사하여 나노섬유와 마이크로섬유가 구분되어있지 않은 네트워크를 이루는 형태의 하이브리드 섬유 시트를 제조하였다.

먼저 PLGA 나노섬유와 PCL 마이크로섬유는 비교예 1, 2와 같은 조건에서 유체속도만 달리하여 섬유 시트를 제조하였다. 최종적으로는 6 wt%의 PLGA용액을 제조하고 18 cm의 거리에서 15 kV의 전압을 가하여 나노섬유를 제조하였고 PCL 마이크로섬유 또한 12 wt%의 PCL용액을 제조한 후 30 cm의 거리에서 15 kV의 전압을 가하여 마이크로섬유를 제조하였다. 유체속도는 마이크로섬유를 0.056 ml/min으로 고정시키고 나노섬유는 유체속도 0.010 ml/min, 0.013 ml/min으로 두가지의 하이브리드 섬유시트를 제조하였다. 그 후 시트에 포함된 잔존용매를 제거하기 위하여 35℃ 진공오븐에서 3시간 동안 충분히 건조 시켰다. 그리고 건조된 하이브리드 섬유 시트는 전자 현미경을 통해 관찰하였으며(도 5), 알루미늄 오일에서 떼어낸 순수한 하이브리드 섬유 시트는 밀봉하여 제습 보관 하였다.

실험예 1: 나노섬유와 마이크로섬유의 직경분석

섬유의 직경 및 직경분포를 조사하기 위하여 영상분석기 (IMT I-solution ver 7.6, Image & microscope Technology Inc.)를 이용하였다. 먼저 SEM을 통해 얻어진 섬유의 이미지를 영상분석 프로그램으로 scale bar를 보정하여 평균직경을 분석하였다. 샘플은 영상분석기로 각각 다른 200개의 섬유직경을 측정하여 평균직경을 계산하였고, 전체적으로 섬유직경의 분포도를 도 6에서 막대그래프로 표현하였다. 도 6에서 나타낸 바와 같이 전자 현미경을 통해 확대하여 관찰한 결과, 나노섬유는 약 400 nm의 직경을 가지고 마이크로섬유는 약 9.6 μm의 직경을 가지는 것을 알 수 있었다.

실험예 2: In vitro 생분해 거동 실험

조직공학용 지지체를 설계할 때 생분해속도의 조사는 필수적이라고 할 수 있다. 키토산을 포함하는 다양한 생분해성 나노섬유의 생분해거동을 분석하기 위하여 제조된 나노섬유시트를 1 x 1 cm 크기로 제작한 다음 24well tissue culture plate 바닥에 고정시킨 후 1 mL phosphate buffered saline (PBS; pH 7.4) 용액을 넣고 incubator (MCO-15AC (164L), 37℃, 5% CO_2, SANYO, Japan)에서 시간경과에 따라 섬유의 형태변화, 수축 및 생분해 거동을 관찰하였다. 도 7에서와 같이 생분해성 평가는 나노섬유와 마이크로섬유 그리고 하이브리드섬유를 PBS에 넣고 약 7주간 관찰하여 평가하였다. 생분해성 합성고분자인 PLGA와 PCL의 경우 분해되는 기간이 다른 생분해성 천연고분자보다도 상대적으로 길다. 특히 PCL의 경우에는 PLGA보다도 분해기간이 더 길고 PLGA의 경우에는 합성된 PLA와 PGA의 비율에 따라 그 기간이 다양하게 결정된다. 본 실험에 사용한 PLGA는 그 비율이 50 대 50으로 PLGA 중에서도 분해기간이 가장 평균에 속한다. 도 7에 나타낸 바와 같이 PLGA 나노섬유는 표면적이 넓어 PCL보다 분해되는 기간이 더 짧았고 약 3주 정도 지나자 섬유의 끊어짐이 대량으로 발생하여 필름화가 가속화 되었다. 이러한 나노섬유의 분해결과는 하이브리드섬유에도 그대로 적용되어 약 3주가 지나가 나노섬유가 완전히 끊어지고 마이크로섬유에 부착되어있는 것을 관찰할 수가 있다. 또한 마이크로섬유의 경우에는 시간이 지날수록 섬유의 굵기가 점점 줄어들며 분해가 진행된다는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 생분해성 결과는 세포배양 시 초기에는 나노섬유로 인해 세포가 빠르게 증식하고 그 후 나노섬유의 분해로 인해 세포들이 더 자랄 수 있는 공간을 만들어 준다는 것을 보여주고 있고 또한 마이크로섬유도 분해로 인해 직경이 가늘어 지며 점점 더 세포들이 증식할 수 있는 공간이 넓어진다는 것을 보여주고 있다. 이러한 생분해성 평가 결과는 세포의 장기간 배양이 유리하다는 것을 보여주고 있으며 이는 조직배양 지지체로서 하이브리드섬유가 가지는 가능성을 잘 보여주고 있다.

실험예 3: 각 나노섬유시트 지지체의 조직 적합성 조사

본 연구에서는 normal human epidermal fibroblasts를 계대 배양하여 실험하였다. 실험에 사용할 샘플들을 에탄올을 이용하여 멸균처리와 동시에 샘플의 중성화를 시키고 PBS로 담근 후 35mm 페트리접시 (petri dish)에 놓고 섬유아세포를 1 × 10⁴ cell/dish의 농도로 파종하였다. 세포 파종은 샘플 표면에만 파종을 유도하기 위해서 유리로 제작된 링을 샘플 위에 올리고 링 안쪽으로 파종한다. 사용한 배지로는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco)을 기본으로 10% fetal bovine (FBS)과 1% 항생제 penicillin G-streptomycin을 포함하였다. 37℃, 5% CO₂의 분위기의 인큐베이터 내에서 초기 접착과 증식 거동을 알 수 있도록 적당한 배양시간을 정한 후 배양하여 전자현미경을 통해 세포의 형태를 확인하였고 MTT assay를 통해 증식 거동을 살펴보았다.

먼저 나노섬유, 마이크로섬유, 하이브리드섬유에서의 섬유아세포의 접착과 증식거동을 비교하기 위해 전자현미경 사진을 통하여 관찰하였다. PLGA 나노섬유, PCL 마이크로섬유, 하이브리드섬유에 섬유아세포를 배양하여 1, 5, 9일에 걸쳐 세포의 거동을 확인한 것을 도 8-10에 나타내었다.

세포를 배양하여 1일차(도 8)에 관찰해 본 결과 나노섬유의 경우 세포의 접착이나 퍼짐 (spreading)이 우수한 것을 확인할 수 있었고 마이크로섬유의 경우에는 표면의 기공이 커 부직포의 안쪽으로 세포의 침투가 활발하여 표면에 세포가 거의 없고 부직포 내부에서 먼저 부착되어있음을 추측할 수 있었다. 반면 하이브리드섬유의 경우에는 섬유 내에 나노섬유와 마이크로섬유에 세포들이 잘 퍼져있는 것을 관찰할 수 있었고 5일, 9일(도 9, 도 10)이 지나자 굉장히 많은 양의 세포들이 다양한 면으로 잘 퍼져있고 일부 생분해가 진행되어 섬유 안쪽으로 세포들이 들어갈 수 있는 공간이 만들어지고 있음을 관찰할 수 있었다. 나노섬유의 경우에는 5일과 9일차에 세포의 증식이 활발하게 되고 있으나 2차원적으로 자라고 있음을 보였고 마이크로섬유는 마이크로섬유 표면에서 자란 세포가 5일과 9일차가 되자 섬유가 교차된 지점에 퍼져있음 (spreading)을 관찰할 수 있었다.

각 섬유들의 세포증식거동을 좀 더 명확히 알기 위해 MTT assay를 실시하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. MTT assay 결과 시간이 경과할수록 모든 섬유에서 세포의 양이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고 특히 마이크로섬유와 나노섬유는 SEM 이미지 관찰 결과와는 다르게 마이크로섬유에서의 증식거동이 더 활발한 것을 확인할 수 있었다. 이는 나노섬유의 경우 2차원적인 세포증식으로 인하여 세포들이 자랄 수 있는 공간이 한정되어있는 반면 마이크로섬유는 3차원적인 배양이 가능해 세포들이 자랄 수 있는 공간이 충분하고 섬유표면의 SEM 이미지에서는 보지 못한 세포들이 내부에서 증식하고 있음을 추측할 수도 있다. 하지만 본 발명의 경우 나노섬유는 PLGA, 마이크로섬유는 PCL로 재료의 종류가 다르고 PCL의 경우 세포의 증식이 다른 물질들보다 매우 활발하다는 것을 문헌을 토대로 알 수가 있기에 나노섬유와 마이크로섬유에 대한 직접적인 비교는 사실상 불가능하다. 나노섬유와 마이크로섬유의 재료가 같을 경우 마이크로섬유의 큰 기공으로 인한 세포유출과 세포의 퍼짐(spreading)이 어려운 점 때문에 나노섬유보다 세포증식이 활발하지 못하다는 것이 보고되어 있다. 그리고 하이브리드섬유의 경우에는 나노섬유로 인해 세포의 유출이 적어 초기접착부터 많은 양의 세포가 자라고 있다는 것을 알 수가 있고 배양시간이 지날수록 나노섬유와 마이크로섬유보다도 월등한 증식거동을 보이고 있다. 이는 SEM 이미지에서 관찰한 결과와 일치하는 내용이다. 도 11에서 나노섬유의 경우와는 다르게 마이크로섬유의 경우 약 9일차가 지나자 증식이 더욱 빠르게 진행되어 18% 하이브리드섬유와 가까워지는 것을 볼 수가 있다. 이는 초기에는 마이크로섬유의 특성으로 인해 세포의 접착과 퍼짐 (spreading)이 어려웠으나 일정시간이 지나고 세포의 증식이 활발해지자 빠른 속도로 증식하는 것으로 추측된다. 나노섬유의 경우에는 세포가 증식할 충분한 공간이 없어 이런 현상은 나타나지 않으나 마이크로섬유의 경우에는 세포가 증식할 충분한 공간이 있기 때문에 시간이 지날수록 더욱더 활발한 증식거동을 보여준다고 생각된다. 이러한 거동을 하이브리드섬유와 비교해 보았을 때 하이브리드섬유는 다른 섬유에 비하여 세포배양효율이 좋다는 것을 의미한다. 이를 확인하기 위해 세포의 파종 수를 조절하여 그 거동을 확인하고 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12의 결과는 장기간 배양했을 시에 소수의 세포로도 충분한 배양을 할 수 있다는 것을 의미한다. 배양 초기에는 그 양이 적지만 하이브리드섬유 내의 나노섬유로 인해 세포의 유출을 막고 세포의 빠른 증식이 유도되어 약 3주가 지나자 굉장히 활발한 증식거동을 보여주고 있다.

최종적으로 나노/마이크로 하이브리드섬유의 세포부착성과 증식성, 세포배양 효율이 뛰어나다는 것이 상기실험으로 확인이 되었다. 세포는 ECM과 유사한 형태의 지지체에 배양할 경우 세포부착과 증식이 매우 뛰어나기 때문에 본 발명에서와 같이 양방향에서 동시에 방사한 경우 이전 기술과는 다르게 전체적으로 균일하게 상호연결(interconnection)된 형태의 섬유 시트를 제조할 수 있으며 삼차원적으로 배양할 수 있어 생체모방적이고 세포배양 효율이 월등하게 향상되었다. 본 발명에서는 나노섬유와 마이크로섬유의 단점을 극복하고 기존 기술에서의 문제점을 해결함과 동시에 생분해성 기간조절이 용이하고 나노섬유의 양 또한 용도에 맞게 조절할 수 있어 다양한 목표에 조직공학용 지지체나 세포배양용 기재로써 큰 효과를 발휘할 수 있을 것이라고 예상된다.

이상에서 기술한 바와 같이 마이크로섬유와 나노섬유는 각각의 단점과 장점을 가지고 있다. 이를 해결하기 위해 다양한 형태의 복합섬유가 연구되었으나 여전히 여러 문제점이 발생하였다. 이러한 문제점을 해소하고자 본 발명에서는 이상적인 조직공학용 지지체를 설계한 후, 공정이 간단한 전기방사기술을 이용하여 PLGA와 PCL을 사용하여 양방향에서 동시에 방사된 하이브리드 섬유시트의 제조방법을 고안하여 새로운 형태의 나노/마이크로 하이브리드 섬유시트를 제조하였다.

상기와 같은 하이브리드 섬유시트는 PLGA와 PCL이라는 생분해성 고분자를 사용하였기 때문에 인체에 안전하고 섬유시트 형태의 특성상 유연하고 비표면적이 큰 다공성 소재로써 조직공학용 지지체로서의 응용이 용이하고 생분해속도의 조절이 쉽다. 특히 양방향에서 동시에 방사하여 나노섬유와 마이크로섬유가 층을 이루지 않는 상호연결(interconnection)된 형태의 섬유시트를 제조하여 기존의 섬유시트들의 문제점들을 해결하였고 세포증식성과 세포배양 효율이 대폭 향상되었다. 결과적으로 본 발명에서 제공된 하이브리드 섬유시트는 위 요소들의 효과로 인하여 조직공학용 세포배양 기재로서의 역할을 극대화 할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

1 : 부도체 소재의 피스톤 2 : 전기방사용 주사기
3 : 주사기 고정대 4 : 회전드럼형태의 집전판
5 : 주사기 펌프 6 : 에어콘 (제습기능)
7 : 환풍구 8 : 전열기 (용매 휘발 촉진)

Claims (14)

1. a) 서로 다른 두 종류의 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 각각의 용액을 제조하는 단계;
   b) 상기 제조된 각 용액을 전기방사법을 이용하여 양 방향에서, 각 생분해성 고분자의 나노섬유와 마이크로섬유를 동시에 방사하여 나노/마이크로 하이브리드섬유 시트를 제조하는 단계;
   c) 상기 제조된 하이브리드섬유 시트의 잔류용매를 제거하여 수득하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용되는 생분해성 고분자는 PHB(poly-hydroxy butyrate), PHBV(3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate), PGA[(poly)glycolic acid], PLA[(poly)lactic acid], PLGA(polylactic-co-glycolic acid), PCL[poly(e-caprolactone)], 폴리다이옥사논(polydioxanone), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 폴리아하이드라이드(polyanhydride), γ-PGA, 젤라틴(gelatin), 실크(silk), 콜라겐(collagen), 셀룰로오스(cellulose), 알긴산(alginic acid) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용되는 생분해성 고분자는 PLGA(polylactic-co-glycolic acid)와 PCL[poly(e-caprolactone)]인 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 PLGA와 PCL은 그 분자량이 각각 1000~500,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법.
   
5. 제 3항에 있어서, 상기 제1항의 b) 단계에 따른 전기방사는 PLGA 용액, PCL 용액의 농도가 각각 0.1~50중량%, 전압 5~100kV, 유체속도 0.1~5ml/h, 방사거리 3~50cm 및 습도 1~50%의 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용되는 유기용매는 트리플루오로아세트산(TFA, trifluoro acetic acid), 디메틸포름아마이드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide), TFE(trifluoro ethylene), 아세톤(acetone), HFIP(hexa fluoro isopropanol), MC(methylene chloride), THF(tetrahydrofuran), 아세트산(acetic acid) 및 포름산(formic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 나노섬유와 마이크로섬유의 조성비가 각각 1:99 ~ 99:1 인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포의 제조방법.
   
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되고, 그 단면의 평균 직경이 각각 10~1000 nm인 나노섬유, 1~100 μm인 마이크로섬유인 것을 특징으로 하는 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포.
   
9. 도 4와 같이, 양방향에서 동시 방사가 가능한 전기방사 시스템.
   
10. 제 9항에 있어서, 상기 시스템의 양방향에서 동시 방사된 나노섬유와 마이크로섬유를 이용하여 나노/마이크로 하이브리드섬유 부직포를 제조하는 것을 특징으로 하는 전기 방사 시스템.
    
11. 제 9항에 있어서, 상기 시스템에 의해 제조된 부직포는 양방향에서 동시에 방사함으로써 층 분리없이 상호연결(interconnection)되는 것을 특징으로 하는 전기 방사 시스템.
    
12. 도 1과 같이, 주사기펌프와 용액 토출 장치는 피스톤 막대로 연결하여 챔버 외부에서 밀어주는 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방사장치 시스템.
    
13. 도 1과 같이, 챔버내의 환경을 전기방사에 최적조건으로 유지하기 위해 습도조절용 에어콘, 용매 휘발 및 섬유화 촉진용 온열기, 휘발성 용매 제거용 배기시스템을 갖춘 것을 특징으로 하는 전기방사용 챔버 시스템.
    
14. 피부, 근육, 연골, 간, 혈관, 신경, 각막세포, 줄기세포 등의 세포배양이 가능한 조직공학용 지지체.

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