KR20160142613A - 탄성 및 신축성이 강화된 관형 지지체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관 및 비혈관계 재생용 관형 지지체 및 그의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 혈관 및 비혈관계 재생용 관형 지지체는 고분자 스프링이 첨가되어 우수한 기계적 강도를 가지며, 전기방사법을 이용하여 스프링에 고분자 섬유를 피복시켜 조직의 재생에 유리한 세포외 기질(ECM)을 모방할 수 있고 섬유의 배열의 조절이 가능하다. 또한, 생체모방성과 생분해성의 조절, 및 높은 물리적 강도를 가질 수 있다.

Description

탄성 및 신축성이 강화된 관형 지지체{Tubular saffolds}

본 발명은 혈관 또는 비혈관계 조직 재생을 위한 관형 지지체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

조직 재생은 인체 내 기관이나 조직이 기능을 잃거나 유실 시에 세포, 약물 지지체 등을 제공하여 효과적으로 조직을 재생하는 것으로, 이때, 조직 재생용 지지체는 임플란트 부위에서 물리적으로 안정하고, 재생 효능을 조절할 수 있는 생리활성을 가져야 하며, 또한 새로운 조직을 형성한 후에는 생체 내에서 분해되고, 분해산물이 독성을 갖지 않아야 한다.

이러한 조직 재생용 지지체로 종래에는 일정한 강도와 형태를 갖는 고분자를 이용한 다공성 지지체가 제조되었으며, 이러한 고분자를 이용한 스폰지 타입이나 섬유형 매트릭스 또는 젤타입의 세포배양 지지체가 제조 및 이용되고 있다.

이 중 섬유형 매트릭스 지지체는 열린 공극을 갖고 있으며 공극의 크기가 커서 세포가 잘 부착하여 증식하는 구조를 갖는다. 그러나 상기 섬유형 매트릭스 지지체는 현재 많이 사용되지 않는데, 이는 지지체가 천연고분자로 이루어진 경우 수상에서 강도가 매우 약하여 붕해되거나 수축되어 형태를 유지하지 못하고 합성 고분자를 사용하더라도 섬유형태만으로는 일정 공간을 확보하기 어려워서 주로 삼차원 구조보다는 막 형태의 2차원 구조로 형성되는 문제점이 있다. 참고로, 조직을 재생함에 있어 3차원 구조는 세포의 활성과 재생능에 매우 중요한 구조이다. 또한, 이러한 지지체만으로는 약물을 봉입하여 조절 방출하거나 생리 활성을 갖는 천연 고분자들을 모두 적용시키는 데는 한계가 있다.

일반적으로 나노섬유는 넓은 표면적과 높은 다공성을 갖는다. 이러한 이점을 조직공학용 나노섬유 지지체에 적용 시 지지체는 세포의 부착이 쉽고 세포의 영양소와 대사산물의 침투 및 배출이 용이한 세포외 기질과 유사한 구조를 갖는다. 때문에 상처 혹은 결손부의 빠른 재생을 목적으로하는 조직공학용 지지체로 많이 사용되고 있다. 이런 나노섬유를 제조하는 방법은 초연신법, 합성법, 상분리법, 전기방사법 등 다양한 방법이 있으나 그 중 조작이 간단하고 공정상의 비용이 저렴하며 넓은 재료의 선택폭이 있다는 장점 때문에 전기방사 공정은 조직 공학 분야를 포함하여 여러 분야에서도 주로 사용되고 있다.

전기방사 시작은 우연히 1930년대에 Formhals가 실험 중 발견한 것으로 초산셀룰로오스 섬유의 생산에 대한 장치 특허로부터 시작되었다. 그러나 처음에는 낮은 생산량, 정량화되지 않은 방법, 낮은 배향, 물성의 불규칙성 등 여러 문제 때문에 산업적인 중요성에서 주목받지 못했다. Reneker 이후로 좀 더 간편한 전기방사장치가 개발되었고 현재 그것은 전 세계적인 관심사인 나노섬유를 제조하는 간편한 방법으로 여러 분야에서 연구되고 있다.

전기장의 세기가 증가함에 따라 모세관 튜브 끝에 형성된 반구모양의 용액표면은 테일러 콘(Taylor cone)이라고 알려진 원뿔 모양으로 연신된다. 전기적 척력이 표면장력을 극복하는 임계값에 도달할 때, 하전 된 용액 젯(jet)이 공기 중에서 이동될 때, 용매는 증발되고 하전 된 고분자 섬유가 반대 전극 표면에 집적되며 연속적으로 집적된 섬유들은 부직포 형태를 갖게 된다.

전기방사의 변수로는 방사용액의 변수와 공정변수 및 환경적인 변수들로 나눌 수 있다. 방사용액의 변수로는 고분자 용액의 표면장력, 점도, 전도도 등이 포함된다. 공정변수로는 모세관 팁에서의 전위, 팁과 콜렉터 사이의 거리 등을 포함한다. 그리고 환경적인 변수에는 방사시의 온도, 습도 및 진공조건 등을 들 수 있다.

전기방사 공정을 통해 제조된 나노섬유 지지체는 주로 쉬트(sheet), 튜브(tube)형태, 혹은 그 이외의 형태의 섬유형 조직공학용 지지체를 제조하는데 사용되며 고분자 외의 재료로 원하는 부위에 맞는 지지체를 제조할 수 있다. 전기방사 공정을 이용한 쉬트형태의 지지체는 피부재생, 연골 및 기타 조직 재생용으로 사용할 수 있으며, 또한 튜브 형태의 조직공학용 지지체는 혈관조직, 골조직의 재생 기법에 사용된다.

그러나 전기방사 공정의 특성상 젯이 회전하면 집전판에 쌓이는 이유로 무작위한 배열을 갖는 나노섬유로 이루어진 지지체가 되며 무작위한 나노섬유 지지체는 정렬된 나노섬유 지지체보다 재생이 늦어지는 한계점을 갖고 있다.

1. 한국공개특허 10-2005-0014033

본 발명에서는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생을 위한 관형 지지체, 및 이의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 생체 적합성 고분자 스프링; 및

상기 생체 적합성 고분자 스프링 상에 피복된 고분자 섬유층을 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체를 제공한다.

본 발명은 또한, 생체 적합성 고분자 스프링에 고분자 용액을 전기방사하여 제 2 생체 적합성 고분자를 피복시키는 단계를 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 관형 지지체는 고분자 스프링을 포함하여, 지지체의 강도를 증가시켜 인체 내에서 혈압, 수압 또는 움직임과 같은 물리적인 조건에서 안정적으로 관형 지지체의 형태를 유지시켜 줄 수 있다.

또한, 본 발명에서는 전기방사를 이용하여 상기 고분자 스프링에 고분자 섬유층을 피복시켜 천연의 세포외 기질과 유사한 구조를 구현할 수 있다. 고분자 섬유는 비표면적이 커서 세포의 부착 면적이 크기 때문에, 상기 고분자 섬유로 이루어진 지지체에 세포를 배양할 경우 세포 부착능이 우수하며, 또한, 상기 고분자 섬유에 다양한 성장인자 및 항생제를 첨가하여 그 기능성을 높일 수 있다.

또한, 본 발명에서는 전기방사시 고분자 스프링에 피복되는 고분자 섬유의 배향을 조절할 수 있다. 혈관 또는 비혈관계 조직은 배향성을 가지고 있으므로, 섬유의 배향을 조절하여 인체 내 조직과 유사한 조직 재생이 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 관형 지지체의 개략적인 도면이다.
도 2는 실시예에 의해 제조된 관형 지지체에서 스프링을 제거한 후의 고분자 섬유층 및 스프링의 사진이다.
도 3 및 4는 실시예에 의해 제조된 관형 지지체의 주사현미경(SEM) 사진이다.
도 5는 실시예에 의해 제조된 관형 지지체의 유연성 및 기계적 강도를 측정한 사진이다.
도 6은 실시예에 의해 제조된 관형 지지체에서 세포 배양한 후의 형광 현미경 사진이다.
도 7은 실시예에 의해 제조된 관형 지지체에서의 세포 증식율을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 ‘조직공학’은 일반적으로 이식에 적합한 지지체 상 또는 내에 세포를 파종하여 조직 또는 기관의 등가물을 제조하는 것을 의미한다. 일반적으로, 대부분의 조직들은 계층적인 여러 가지 세포로 구성되어있으며, 분리시켰을 때 많은 세포들이 작은 규모에서 본래의 형태를 다시 형성할 수 있지만 상기 세포들은 큰 형태를 이루기 위해 보조 지지체를 필요로 한다. 이러한 보조 지지체는 생체 내 또는 외에서 세포를 모아 점착시킬 수 있고, 조직으로 발전시키기 위한 잠재적 장소가 되어야 하며, 점착된 세포들과 주변의 숙주 세포들이 새로운 조직을 형성할 수 있도록 해야 한다.

또한, 본 발명에서 ‘지지체’는 스캐폴드(Scaffold)라고도 하며, 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 의미한다. 상기 지지체는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 중요하다. 이는, 줄기세포 또는 생검으로부터 얻은 세포들이 환자들에게 보다 효과적으로 사용되기 위해서는 체외에서 가능한 많은 수의 세포가 얻어지고 새로운 자기유래의 조직으로 분화가 이루어져야 하는데, 지지체의 사용은 이들을 가능하게 할 수 있는 방법이기 때문이다.

인체 조직의 재생을 위해 사용되는 지지체 재료의 주된 요건으로는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 수행해야 하고, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 벽으로서의 역할을 담당해야 하는데, 이는 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체 적합성이 있어야 함을 의미한다. 또한, 이식된 세포가 충분히 조직으로서 본연의 기능과 역할을 수행하게 되면, 원하는 시간에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 사라지는 생분해성을 지녀야 한다.

이상적인 생체 적합성 지지체는 시험관내 또는 생체 내에서 세포 성장을 지지하는 능력, 다양한 범위의 세포 유형 또는 계통의 성장을 지지하는 능력, 요구되는 유연성 또는 경직성의 다양한 수준을 갖는 능력, 다양한 수준의 생분해성을 갖는 능력, 2차 손상을 유발하지 않고 생체 내에서 목적하는 부위로 도입되는 능력, 및 원하는 작용 부위로 약물, 세포 및/또는 생활성 물질의 운반을 위한 저장소 또는 담체로서 제공되는 능력을 가져야 한다.

이러한 요구를 가장 잘 충족하는 것으로 생체 적합성 고분자를 들 수 있다. 생체 적합성 고분자는 정해진 크기나 모양으로 조직을 재생할 수 있고, 생체 내ㆍ외에서 세포의 점착과 확장을 위한 임시적인 장소를 제공하므로, 세포증식 및 세포분화를 위한 합성 세포 외 기질로 사용하기에 적합하다.

이에, 상기 생체 적합성 고분자를 사용하여 조직의 재생을 위한 지지체를 제작하였으나, 상기 제조된 지지체는 인체 내에서 혈압 또는 수압 등의 조건, 또는 기계적 운동 등을 견디기에는 물리적 강도가 약하다는 단점을 지녔다.

따라서, 본 발명에서는 생체 적합성 고분자 스프링; 및

상기 생체 적합성 고분자 스프링 상에 피복된 고분자 섬유층을 포함하는 관형 지지체를 제공한다.

상기 관형 지지체는 혈관 또는 비혈관계 조직의 재생에 이용될 수 있다.

상기 생체 적합성 고분자 스프링은 관 형태의 지지체 내부에서 지지체의 기계적 강도를 증가시켜, 인체 내에서 혈압과 수압 또는 움직임과 같은 물리적인 조건에서 안정적으로 지지체의 형태를 유지시켜 줄 수 있다.

일 구체예에서, 생체 적합성 고분자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniy alcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(poly acrylicacid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 생체 적합성 고분자는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 혈액적합성을 가진다. 또한, 상기 생체 적합성 고분자는 일정 기간 후 체내에서 자발적으로 분해되어, 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않는다.

일 구체예에서, 생체 적합성 고분자 스프링은 필라멘트의 코일 스프링(coiled spring) 형태를 가질 수 있다. 본 발명에서 ‘코일 스프링(coiled spring)’은 단면이 둥글거나 각진 봉재(필레멘트)를 코일형으로 감은 스프링을 의미한다. 용도에 따라 코일 스프링은 인장, 압축, 비틀림, 원뿔형, 장구형으로 분류할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 압축형의 코일 스프링을 사용할 수 있다.

상기 필라멘트의 직경, 스프링의 지름 및 길이는 사용하는 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 필라멘트의 직경은 0.1 내지 10 mm일 수 있고, 스프링의 지름은 1 내지 30 mm일 수 있으며, 길이는 10 내지 100 mm일 수 있다. 상기 스프링의 길이는 도 1의 지지체에서 x축(가로) 방향을 의미하며, 지름은 y축(세로) 방향을 의미한다.

본 발명에서 관형 지지체는 전술한 생체 적합성 고분자 스프링 외에 고분자 섬유층을 포함하며, 상기 고분자 섬유층은 고분자 스프링 상에 피복된 형태를 가진다. 상기 고분자 섬유층은 천연의 세포외 기질과 유사한 구조를 가지며 비표면적이 커서 세포의 부착 면적이 크기 때문에, 상기 고분자 섬유층에 세포를 배양할 경우 세포 부착능이 우수하고, 상기 고분자 섬유층에 다양한 성장인자 및 항생제를 첨가할 경우 그 기능성을 높일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 고분자 섬유층은 제 2 생체 적합성 고분자를 포함할 수 있다.

상기 제 2 생체 적합성 고분자의 종류를 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhyd rides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 고분자 섬유층은 혈관 또는 비혈관계 조직의 재생을 돕는 성분이나 약물, 항균성 부여를 위한 항생제를 더 함유할 수 있다.

상기 혈관 또는 비혈관계 조직의 재생을 돕는 성분이나 약물은 예를 들어, 라미닌, 도파민, 피브로넥틴, FGF, BMP-2, IGF, TGFβ 및 알렌드로네이트(Alendronate)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 항생제는 당업계에서 세균의 생육과 활성을 저지 또는 억제할 수 있다고 알려진 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 예를 들어, 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamicin), 메틸파라벤(methyl paraben), 에틸파라벤(ethyl paraben), 페니실린(penicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 모노박탐(monobactam), 카바페넴(carbapenem), 아미노글리 코사이드(aminoglycoside), 마크롤라이드(macrolide), 테트라사이클린(tetracycline), 클로르암페니콜(chloramphnicol), 퀴놀론(quinolone), 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 린코사미드(lincosamide), 메트로니다졸(metronidazole), 설폰아미드(sulfonamide), 트리메소프림(trimethoprim) 및 이들의 염을 포함하고, 이들은 단독 또는 2종 이상의 혼합물 형태로 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 고분자 섬유층의 두께는 특별히 제한되지 않으며, 0.1 내지 5 mm 또는 1 내지 3 mm일 수 있다. 상기 범위에서 유연성 및 강도가 우수한 관형 지지체를 제공할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 생체 적합성 고분자 스프링에 고분자 용액을 전기방사하여 제 2 생체 적합성 고분자를 피복시키는 단계를 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 ‘전기방사’는 고분자 용액이나 용융된 고분자를 일정 전압으로 하전 시킬 때 발생하는 전기적 인력 및 척력을 이용하여 섬유를 형성하는 것을 의미한다.

본 발명에서는 천연의 세포외 기질과 유사한 구조를 구현하기 위해 생체 적합성 고분자 상에 전기방사를 이용하여 고분자 섬유층을 제조할 수 있다.

본 발명에서 생체 적합성 고분자 스프링은 전술한 바와 같이 코일 스프링 구조를 가질 수 있으며, 전술한 생체 적합성 고분자를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 생체 적합성 고분자 스프링은 상기 생체 적합성 고분자를 사용하여 제조할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 생체 적합성 고분자 필라멘트를 코일 형태로 감은 뒤 열처리하여 제조할 수 있다. 또는 시중에서 시판되는 제품을 이용할 수 있다.

본 발명에서 고분자 용액은 제 2 생체 적합성 고분자 및 용매를 포함할 수 있다.

일 구체예에서 제 2 생체 적합성 고분자는 전술한 제 2 생체 적합성 고분자를 사용할 수 있으며, 용매는 클로로포름, 톨루엔, 디클로로메테인, 테트라히드로푸란(THF), 트리플로로에탄올(TFE) 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다.

상기 고분자 용액에서, 제 2 생체 적합성 고분자는 용매 100 중량부 대비 1 내지 50 중량부로 포함될 수 있다. 상기 범위에서 전기방사를 용이하게 수행할 수 있다.

본 발명에서는 관형 지지체는 생체 적합성 고분자 스프링에 고분자 용액을 전기방사하여 제 2 생체 적합성 고분자를 피복시켜 제조하며, 이에 의해 고분자 스프링 상에 고분자 섬유층이 형성된다.

일 구체예에서, 전기방사는 전압 발생장치에서 일정전류를 흘려서 주사바늘기와 적층부 간에 전기장을 형성시키고, 방사액 저장소에 충전된 고분자 용액을 전기장의 힘과 실린지 펌프에서 건 압력에 의하여 적층부에 방사할 수 있다. 이때, 방사에 영향을 미치는 요인으로는 전압, 흐름속도, 방사부(주사바늘기)와 적층부 사이의 거리, 온도 또는 습도 등이 있다.

상기 전기방사는 7.5 내지 30 kV의 적용전압에서 주사바늘기를 이용하여 방사부와 적층부 간의 거리를 7 내지 15 cm로 이격하고, 고분자 용액의 유속을 분당 0.0001 내지 1 ㎖로 하며, 주사바늘기의 직경은 0.45 내지 0.55 mm로 하여 수행할 수 있다.

또한 일 구체예에서, 전기방사는 전도성 와이어를 생체 적합성 고분자 스프링 주위에 배열한 상태에서 수행할 수 있다. 일반적으로 전기방사 공정을 통한 고분자 섬유층의 제조시 전기방사 공정 상의 특성으로 고분자 섬유가 무작위한 배열로 형성된다. 본 발명에서는 전도성 와이어를 사용하여 고분자 스프링에 피복되는 섬유의 배열을 조절할 수 있으며, 혈관 및 비혈관게 조직은 배향성을 가지고 있으므로 섬유의 배향을 조절하여 인체 내 조직과 유사한 조직 재생을 가능하게 할 수 있다

상기 전도성 와이어의 종류는 전기를 통할 수 있는 물질이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 금속성의 막대(굵은 철사)를 와이어로 사용할 수 있다.

상기 전도성 와이어의 위치는 고분자 스프링의 길이 방향을 기준으로 직렬 방향 또는 직교 방향으로 위치할 수 있다.

예를 들어, 전도성 와이어가 고분자 스프링의 길이 방향을 기준으로 직렬 방향에 위치할 경우, 제조되는 고분자 섬유층은 상기 고분자 스프링의 길이 방향을 기준으로 직교 형태로 정렬된 배향성을 가지게 된다.

반면, 전도성 와이어가 고분자 스프링의 길이 방향을 기준으로 직교 방향에 위치할 경우, 제조되는 고분자 섬유층은 상기 고분자 스프링의 길이 방향을 기준으로 직렬 형태로 정렬된 배향성을 가지게 된다.

상기 직렬 또는 직교된 배향성은 조직의 재생에 있어 정렬된 섬유 배열이 세포의 분화 방향을 유도하여 무작위한 배열의 섬유와 대비하여 상대적으로 상처, 손실된 부위의 재생을 빠르게 할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 전기방사시 전도성 와이어의 위치를 반복적으로 조절하여 다양한 배향성을 가지는 고분자 섬유층을 제조할 수 있다.

일 구체예에서, 전기방사시 고분자 스프링의 회전속도를 조절하여 고분자 섬유층의 직경을 조절할 수 있다. 이는 전기 방사공정으로 방사되는 고분자가 회전하는 고분자 스프링에 감기면서 관형태의 고분자 섬유층이 형성되는데, 고분자 스프링의 회전속도를 빠르게 하여 더 얇은 고분자 섬유층을 제조할 수 있으며, 반대로 회전속도를 느리게하여 상대적으로 두꺼운 고분자 섬유층을 제조할 수 있다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.

실시예

실시예 1. 관형 지지체의 제조 및 배양

본 발명에서 도 1은 본 발명에 따른 관형 지지체의 개략적인 도면이다. 상기 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 관형 지지체(Tubular scaffold)는 고분자 스프링(polymer spring) 및 고분자 섬유층(fibrous tube)가 복합된 구조를 지니며, 본 실시예에서는 고분자 스프링에 전기방사를 이용하여 고분자 섬유층을 피복시켜 상기 관형 지지체를 제조할 수 있다.

(1) 고분자 스프링의 제조

폴리디옥사논(polydioxanone, 직경: 1 mm) 필라멘트를 코일형태로 감은 뒤 열처리하여 고분자 스프링을 제조하였다.

(2) 고분자 용액의 제조

폴리카프로락톤(Poly(e-caprolactone, PCL, Mw: 70,000~90,000) (St.Louis, MO, USA) 1 g을 클로로포름(St.Louis, MO, USA) 및 2,2,2-트리플루오르에탄올(2,2,2-trifluoroethanol)(St.Louis, MO, USA)의 비율이 8:2인 혼합물 10 g에 용해시켜 폴리카프로락톤 고분자 용액을 제조하였다.

(3) 고분자 스프링에 고분자 섬유를 피복시킨 세포 지지체의 제조

단계 (1)에서 얻은 고분자 스프링에 단계 (2)에서 얻은 고분자 용액을 회전드럼을 이용하여 전기방사하였다. 상기 전기방사는 10 kV의 적용전압, 1.2 mm의 직경을 갖는 주사기바늘을 이용하여 방사부와 적층부 간의 거리를 10 cm로 이격하고, 고분자 용액의 유속을 분당 0.01 mL로 하였다. 피복되는 섬유의 배향성은 10 cm의 철사(wire)를 섬유가 집전되는 스프링 근처에 직렬 또는 직교로 배열해서 조절하여 관형 지지체를 제조하였다.

이때, 제조되는 섬유층의 내부는 직렬 형태의 배향성을 가지고, 외부는 직교 형태의 배향성을 가지도록, 고분자 섬유를 피복시켰다.

(4) 세포 배양

단계 (3)에서 제조된 관형 지지체를 내부 직경이 1 cm, 길이가 0.5 cm가 되도록 잘랐다. NIH-3T3 섬유아세포(Korean Cell Line Bank, Korea)를 세포주로 사용하였다.

세포 씨딩(seeding) 전에, 상기 관형 지지체를 70% 에탄올에 하룻밤 동안 침지하여 살균하고, phosphate buffered saline(PBS; Invitrogen Corp., Grand Island, NY, USA)으로 5회 워싱하였다.

세포 씨딩을 위해서, 5×10⁶ 개수의 세포를 부유시킨 배지 150 mL이 들어있는 교반용 컬쳐 플라스크에 관형 지지체를 침지시키고 이를 2 시간 동안 60 rpm의 속도로 교반을 시킴으로써 관형 지지체에 세포가 고르게 씨딩될 수 있도록 하였다.

세포-씨딩된 관형 지지체를 PBS로 3회 워싱한 후, 24-well plate에 옮겼다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Invitrogen)로 이루어진 배지에 10% fetal bovine serum(Invitrogen) 및 1% antibiotics(containing penicillin and streptomycin, Invitrogen)를 첨가하였다.

배양은 37℃ 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 이루어졌으며, 배지는 하루 걸러 교체하였다.

공초점 현미경(Confocal microscopy)(Zeiss LSM710, Jena, ermany)은 관형 지지체에서의 세포 행동을 관찰하기 위해 사용되었다.

nucleus(blue) 및 F-actin(red)는 4',6-diamidino-2-phenylindole (Sigma-Aldrich) 및 Alexa Fluor 546 phalloidin(Invitrogen)에 의해 각각 착색되었다. 세포 증식(Cell proliferation)은 배양 2 주 후 마이크로플레이트리더(microplate reader)(SpectraMax Plus 384, Molecular Devices, Co. Ltd., USA)에 의해 450 nm에서 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo, Co. Ltd., Kumamoto, Japan)를 사용하여 평가하였다.

비교예 1.

(1) 고분자 스프링의 제조 공정을 수행하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 관형 지지체를 제조하였다.

실험예 1. 관형 지지체 확인

본 발명의 실시예 1에 의해 제조된 관형 지지체는 고분자 스프링에 고분자 섬유층이 피복되며, 고분자 섬유층 내에 고분자 스프링을 포함하는 구성을 가진다.

본 발명의 도 2는 실시예 1에 의해 제조된 관형 지지체에서 스프링을 제거한 후, 고분자 섬유층 및 스프링을 나타내는 사진이다.

또한, 본 발명에서 도 3 및 4는 실시예 1에 의해 제조된 관형 지지체의 주사현미경(SEM) 사진이다. 절단면을 보았을 때, 섬유 피복층의 배향성은 내부와 외부가 다른 것을 확인할 수 있는데, 구체적으로 내부층은 직렬로, 외부층은 직교 방향으로 섬유층을 구성할 수 있다. 이는 혈관 및 비혈관을 이루는 세포들의 배향성을 고려하여 내피 및 평활근 세포를 세포지지체에 이식시 실제 혈관 및 비혈관과 유사하게 재생되도록 유도할 수 있다.

실험예 2. 유연성 및 기계적 강도 측정

기계적 강도는 Slide glass를 수직으로 올려놓고 직접적으로 외부의 무게를 견디는 실험을 수행하였다.

먼저, 도 5(a)는 실시예(B) 및 비교예(A)에 의해 제조된 관형 지지체의 유연성 및 안정성을 실험한 사진으로, 실시예에서 제조된 관형 지지체가 구부려도 구조의 변형없이 안정한 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 5(b)는 실시예(B) 및 비교예(A)에 의해 제조된 관형 지지체의 강도를 측정한 사진으로, 내부에 스프링이 없는 비교예의 경우 20 g부터 구조적 변형이 일어났으나, 실시예의 경우 80 g까지 변형 없이 구조를 유지하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2. 관형 지지체에서의 세포 증식율 측정

본 발명에서 도 6은 실시예에 의해 제조된 관형 지지체에서 세포 배양한 후의 형광 현미경(Fluorescent microscopic) 사진이다.

구체적으로, 도 6에서 (a), (c), (e)는 섬유 피복층의 내부층, (b), (d), (f)는 외부 표면에서의 사진을 나타내며, (a), (b)는 배양 1일 후, (c), (d)는 3일 후, (e), (f)는 5일 후의 사진을 나타낸다.

배양 1일 후, 대부분의 섬유아세포는 둥근 모양이었고, 어떠한 방향성 없이 관형 지지체 상에 씨딩되었다. 배양 3일 후, 세포는 섬유층의 배향성에 따라 증식하기 시작하였는데, 이는 세포 증식이 섬유의 배향성에 따라 조절 할 수 있음을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에서 도 7은 실시예에 의해 제조된 관형 지지체에서의 세포 증식율(Proliferation)을 나타내는 그래프로, 배양 시간이 증가할수록 세포의 증식율이 높아지는 것을 확인할 수 있다.

Claims (10)

1. 생체 적합성 고분자 스프링; 및
   상기 생체 적합성 고분자 스프링 상에 피복된 고분자 섬유층을 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   생체 접합성 고분자 스프링에서 생체 적합성 고분자는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniy alcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(poly acrylicacid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   생체 적합성 고분자 스프링은 직경이 0.1 내지 10 mm인 필라멘트의 코일 스프링(coiled spring)인 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   고분자 섬유층은 제 2 생체 적합성 고분자를 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   제 2 생체 적합성 고분자는 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhyd rides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체.
   
6. 생체 적합성 고분자 스프링에 고분자 용액을 전기방사하여 제 2 생체 적합성 고분자를 피복시키는 단계를 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체의 제조 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   고분자 용액은 제 2 생체 적합성 고분자 및 용매를 포함하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체의 제조 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서,
   용매는 클로로포름, 톨루엔, 디클로로메테인, 테트라히드로푸란(THF), 트리플로로에탄올(TFE) 또는 이들의 혼합 용액인 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체의 제조 방법.
   
9. 제 6 항에 있어서,
   전기방사는 7.5 내지 30 kV의 적용전압에서 주사바늘기를 이용하여 방사부와 적층부 간의 거리를 7 내지 15 cm로 이격하고, 고분자 용액의 유속을 분당 0.0001 내지 1 ㎖로 하여 수행하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체의 제조 방법.
   
10. 제 6 항에 있어서,
    전기방사 시 전도성 와이어를 스프링 주위에 배열하는 혈관 또는 비혈관계 조직 재생용 관형 지지체의 제조 방법.

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