KR20210118339A - 3차원 바이오 프린팅 폐색기를 이용한 허혈성 심질환 동물 모델 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체 및 상기 중공 구조체를 포함하는 심근 경색 동물 모델에 관한 것이다.
Description
본 발명은 허혈성 심질환 동물 모델 제조를 위한 3차원 인쇄법으로 제조된 중공 구조체 및 이를 이용한 허혈성 심질한 동물모델, 더욱 자세하게는 3차원 바이오프린팅 기술로 제작된 심근 경색 모델 제조용 중공 구조체, 이를 이용한 심근 경색 동물 모델, 및 동물 모델의 제조방법에 관한 것으로, 비임상 실험에 필수적인 대동물 (大動物) 심근경색 모델에 관한 것이다.
심근 경색은 전 세계적으로 가장 높은 발병률과 사망률을 갖는 질환으로 이를 치료하기 위한 다양한 연구 개발이 요구되고 있다. 심근 경색이 발병하게 되면 심장 구조상의 관상 동맥이 좁아지게 되고, 이로 인해 심근은 충분한 산소와 영양분을 받지 못하게 된다. 결과적으로 관상 동맥 주변부의 심근은 괴사 상태에 도달하게 되고, 정상적인 기능을 수행하지 못하게 되는 결과를 초래한다.
심근 경색을 치료하기 위해 동물 실험에 대한 필요성이 지속적으로 요구되었고 설치류, 양, 돼지 등의 심근 경색 모델을 개발함으로써 심근 경색의 발병, 치료법들이 개발되었다. 특히, 돼지는 사람과 생리학, 해부학적 구조, 심혈관 구조가 매우 유사한 특성을 갖기 때문에, 임상을 진행하기 전 필수 단계인 대동물(大動物)의 비임상 실험에 많이 사용되는 동물이다. 일반적으로 돼지 심근 경색 모델은 관상 동맥의 재관류를 유도하거나, 외과적인 방법들을 이용하여 제작된다. 그러나, 이러한 방식들은 심근경색 유도 시 높은 사망률을 갖고 시간이 많이 소요되며, 수술 후 극심한 감염과 심막염을 유발하는 단점이 있다. 또한, 돼지 동물모델의 경우, 기술 및 환경적인 요인들로 인하여 빠른 회복력을 갖는 어린 개체들을 사용해야 하는 한계점이 있고, 이는 유효한 데이터 확보의 제약을 초래한다. 따라서, 심근경색 유도 후 낮은 사망률을 가지고, 오랜 기간 동안 심근 경색을 유발시킬 수 있는 동물모델의 새로운 제조방법에 대한 개발이 필요한 실정이고, 3D 바이오 프린팅을 이용한 심근 경색 모델의 제조방법은 이러한 요구를 충족시킬 수 있는 최적의 기술로 판단될 수 있다.
본 발명의 일 예는 3차원 프린팅 기술을 이용하여 관상 동맥의 부분적 혈류 압박을 유도할 수 있는 생체적합성 고분자 기반의 맞춤식 원통형 중공 구조체 (이식체) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 중공 구조체를 이식 대상 혈관에 이식하여 혈류를 부분 차단함으로써 심근 경색을 유발하는, 심근 경색 유발 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 중공 구조체를 최소한의 외과적 수술법에 적용한 대(大)동물 기반 심근 경색 모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 서로 다른 심장 구조를 갖는 동물 실험 모델을 제작하기 위한 맞춤형 이식체의 공정 조건을 확립하였고, 심혈관조영술, 심초음파, 조직병변 검사 등을 통해 대동물 심근 경색 모델에 대한 유효성의 검증을 수립하였다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체이며, 이식 대상 혈관에 이식되어 심근 경색을 유발하는, 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체 (폐색기; Occluder)에 관한 것이다. 상기 중공 구조체는 혈류가 통과할 수 있도록 소정 크기의 내경을 가지는 것일 수 있다.
상기 중공 구조체는 심근 경색을 유발하기 위한 목적으로 혈관에 이식될 수 있으며, 혈류가 차단될 경우 심근 경색이 유발될 수 있는 혈관이라면 상기 중공 구조체가 이식될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체는 좌전하행지동맥, 우관상동맥, 및 좌회선동맥으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에 이식되어 심근 경색을 유발하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체는, 이식 대상 혈관에 이식되어 혈류의 부분 차단에 의해 심근 경색을 유발하며, 이 때 혈류를 완전 차단하거나 한계치 이상으로 차단할 경우 혈류 차단에 의해 중공 구조체가 이식된 개체가 사망할 수 있으므로, 개체의 사망을 방지하고 심근 경색을 유도할 수 있도록 소정 크기의 내경을 가지도록 형성될 수 있다. 즉, 상기 중공 구조체의 내경은 소정 크기 이하로 형성되어 혈류를 부분 차단하도록 형성될 수 있으며, 예를 들어 상기 중공 구조체의 내경은 상기 중공 구조체 외경의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 28% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 또는 15% 이하로 형성될 수 있다. 또한, 상기 중공 구조체의 내경은 혈류를 과도하게 차단하여 개체가 사망에 이르지 않도록 소정 크기 이상으로 형성될 수 있으며, 통상의 기술자라면 상기 중공 구조체의 내경의 하한값이 특정되지 않더라도 개체가 사망에 이르지 않고 심근 경색을 유발할 수 있도록 상기 중공 구조체의 적절한 내경을 설정할 수 있을 것이며, 예를 들어 상기 중공 구조체의 내경은 상기 중공 구조체 외경의 1% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 또는 80% 이상으로 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 중공 구조체의 내경은 상기 중공 구조체의 외경을 기준으로 상기 상한값 및 상기 하한값의 조합으로 설정될 수 있다.
상기 중공 구조체는 이식 대상 혈관에 이식 가능하도록 소정 크기의 외경을 가지는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 중공 구조체의 외경은 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130%, 70% 내지 125%, 70% 내지 120%, 70% 내지 115%, 70% 내지 110%, 70% 내지 105%, 75% 내지 130%, 75% 내지 125%, 75% 내지 120%, 75% 내지 115%, 75% 내지 110%, 75% 내지 105%, 80% 내지 130%, 80% 내지 125%, 80% 내지 120%, 80% 내지 115%, 80% 내지 110%, 80% 내지 105%, 85% 내지 130%, 85% 내지 125%, 85% 내지 120%, 85% 내지 115%, 85% 내지 110%, 85% 내지 105%, 90% 내지 130%, 90% 내지 125%, 90% 내지 120%, 90% 내지 115%, 90% 내지 110%, 90% 내지 105%, 95% 내지 130%, 95% 내지 125%, 95% 내지 120%, 95% 내지 115%, 95% 내지 110%, 95% 내지 105%, 100% 내지 130%, 100% 내지 125%, 100% 내지 120%, 100% 내지 115%, 100% 내지 110%, 100% 내지 105%, 105% 내지 130%, 105% 내지 125%, 105% 내지 120%, 105% 내지 115%, 105% 내지 110%, 110% 내지 130%, 110% 내지 125%, 110% 내지 120%, 110% 내지 115%, 115% 내지 130%, 115% 내지 125%, 115% 내지 120%, 120% 내지 130%, 120% 내지 125%, 또는 125% 내지 130% 의 범위를 갖는 것일 수 있으며, 일예로 상기 중공 구조체의 외경은 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130%의 범위를 갖는 것일 수 있다.
일예로, 상기 중공 구조체의 외경은 1 내지 4 mm, 1 내지 3.5 mm, 1 내지 3 mm, 1 내지 2.5 mm, 1 내지 2 mm, 1.5 내지 4 mm, 1.5 내지 3.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 1.5 내지 2.5 mm, 또는 1.5 내지 2 mm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 앞서 설시한 바와 같이 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체의 외경은 이식 대상 혈관에 이식되어 혈류를 부분 차단할 수 있도록 소정 크기를 갖도록 형성될 수 있다.
일예로, 상기 중공 구조체의 내경은 0.1 내지 2 mm, 0.1 내지 1.5 mm, 0.1 내지 1 mm, 0.1 내지 0.5 mm, 0.2 내지 2 mm, 0.2 내지 1.5 mm, 0.2 내지 1 mm, 또는 0.2 내지 0.5 mm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 앞서 설시한 바와 같이 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체의 내경은 개체의 사망을 방지하고 심근 경색을 유도할 수 있을 정도로 혈류를 차단하도록 소정 크기의 내경을 가지도록 형성될 수 있다.
일예로, 상기 중공 구조체는 1.5 내지 5 mm, 1.5 내지 4.5 mm, 1.5 내지 4 mm, 1.5 내지 3.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 2 내지 5 mm, 2 내지 4.5 mm, 2 내지 4 mm, 2 내지 3.5 mm, 2 내지 3 mm, 2.5 내지 5 mm, 2.5 내지 4.5 mm, 2.5 내지 4 mm, 2.5 내지 3.5 mm, 또는 2.5 내지 3 mm 의 길이로 형성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체는, 생분해성 고분자 재질인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 중공 구조체의 재질은 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL), 폴리락테이트-코-글라이콜레이트(poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리유산 (Poly Lactic Acid, PLA), 폴리우레탄 (polyurethane, PU), 폴리락테이트-코-카프로락톤 (poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), 폴리다이옥사논 (polydioxanone, PDO), 폴리스티렌 (polystyrene, PS), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethylene glycol), PEG), 폴리비닐아세테이트 (poly(vinyl acetate), PVA), 폴리프로필렌글라이콜 (polypropylene glycol, PPG), 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide, PAAm), 폴리글리콜릭에이스드 (polyglycolic acid, PGA), 폴리메틸메타클릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리하이드록시부틸레이트 (polyhydroxybutyrate, PHB), 및 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, PVP) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 이식 대상 혈관의 내경을 측정하는 단계; 고분자 용융물을 준비하는 단계; 및 소정 크기의 내경을 가지며 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체 형상으로 상기 고분자 용융물을 3차원 인쇄하는 단계를 포함하는, 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 이식 대상 혈관은 인간을 제외한 동물의 혈관인 것일 수 있다.
상기 이식 대상 혈관은 혈류가 차단될 경우 심근 경색이 유발될 수 있는 혈관으로 선택될 수 있으며, 예를 들어 좌전하행지동맥, 우관상동맥, 및 좌회선동맥으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 고분자 용융물을 3차원 인쇄하는 단계는, 상기 중공 구조체의 외경이 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130%, 70% 내지 125%, 70% 내지 120%, 70% 내지 115%, 70% 내지 110%, 70% 내지 105%, 75% 내지 130%, 75% 내지 125%, 75% 내지 120%, 75% 내지 115%, 75% 내지 110%, 75% 내지 105%, 80% 내지 130%, 80% 내지 125%, 80% 내지 120%, 80% 내지 115%, 80% 내지 110%, 80% 내지 105%, 85% 내지 130%, 85% 내지 125%, 85% 내지 120%, 85% 내지 115%, 85% 내지 110%, 85% 내지 105%, 90% 내지 130%, 90% 내지 125%, 90% 내지 120%, 90% 내지 115%, 90% 내지 110%, 90% 내지 105%, 95% 내지 130%, 95% 내지 125%, 95% 내지 120%, 95% 내지 115%, 95% 내지 110%, 95% 내지 105%, 100% 내지 130%, 100% 내지 125%, 100% 내지 120%, 100% 내지 115%, 100% 내지 110%, 100% 내지 105%, 105% 내지 130%, 105% 내지 125%, 105% 내지 120%, 105% 내지 115%, 105% 내지 110%, 110% 내지 130%, 110% 내지 125%, 110% 내지 120%, 110% 내지 115%, 115% 내지 130%, 115% 내지 125%, 115% 내지 120%, 120% 내지 130%, 120% 내지 125%, 또는 125% 내지 130% 의 범위가 되도록 인쇄하는 것일 수 있으며, 일예로 상기 중공 구조체의 외경이 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130% 의 범위가 되도록 인쇄하는 것일 수 있다.
상기 고분자 용융물을 3차원 인쇄하는 단계는, 상기 중공 구조체의 내경이 상기 중공 구조체의 외경의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 28% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 또는 15% 이하가 되도록 인쇄하는 것일 수 있다.
상기 고분자 용융물을 3차원 인쇄하는 단계는, 상기 중공 구조체의 외경이 1 내지 4 mm, 1 내지 3.5 mm, 1 내지 3 mm, 1 내지 2.5 mm, 1 내지 2 mm, 1.5 내지 4 mm, 1.5 내지 3.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 1.5 내지 2.5 mm, 또는 1.5 내지 2 mm 가 되도록 인쇄하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 앞서 설시한 바와 같이 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체가 이식 대상 혈관에 이식되어 혈류를 부분 차단할 수 있도록 소정 크기를 갖도록 인쇄할 수 있다.
상기 고분자 용융물을 3차원 인쇄하는 단계는, 상기 중공 구조체의 내경이 0.1 내지 2 mm, 0.1 내지 1.5 mm, 0.1 내지 1 mm, 0.1 내지 0.5 mm, 0.2 내지 2 mm, 0.2 내지 1.5 mm, 0.2 내지 1 mm, 또는 0.2 내지 0.5 mm 가 되도록 인쇄하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 앞서 기재한 바와 같이 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체가 개체의 사망을 방지하고 심근 경색을 유도할 수 있을 정도로 혈류를 차단하도록 소정 크기의 내경을 가지도록 인쇄할 수 있다.
상기 고분자 용융물을 3차원 인쇄하는 단계는, 상기 중공 구조체의 길이가 1.5 내지 5 mm, 1.5 내지 4.5 mm, 1.5 내지 4 mm, 1.5 내지 3.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 2 내지 5 mm, 2 내지 4.5 mm, 2 내지 4 mm, 2 내지 3.5 mm, 2 내지 3 mm, 2.5 내지 5 mm, 2.5 내지 4.5 mm, 2.5 내지 4 mm, 2.5 내지 3.5 mm, 또는 2.5 내지 3 mm 의 길이를 가지도록 인쇄하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 이식 대상 혈관의 내경을 측정하는 단계; 고분자 용융물을 3차원 인쇄하여, 혈류가 통과할 수 있도록 소정 크기의 내경을 가지며, 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계; 및 상기 중공 구조체를 상기 이식 대상 혈관에 이식하는 단계를 포함하는, 심근 경색 유발 방법에 관한 것이다. 상기 이식 대상 혈관은 인간을 제외한 동물의 혈관인 것일 수 있다. 상기 중공 구조체의 외경은 이식 대상 혈관에 이식 가능하도록 소정 크기의 외경을 가지는 것일 수 있으며, 상기 이식 대상 혈관의 내경을 기준으로 한 상기 중공 구조체의 외경은 앞서 설시한 바와 같으며, 예를 들어 상기 중공 구조체는 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130% 범위의 외경을 가지는 것일 수 있다.
상기 동물은 인간을 제외한 포유류인 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 동물은 돼지, 원숭이, 침팬지, 양, 염소, 소, 말, 낙타, 개, 및 고양이로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 이식 대상 혈관은 혈류가 차단될 경우 심근 경색이 유발될 수 있는 혈관으로 선택될 수 있으며, 예를 들어 좌전하행지동맥, 우관상동맥, 및 좌회선동맥으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 원통형 중공 구조체의 내경이 상기 원통형 중공 구조체의 외경의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 28% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 또는 15% 이하가 되도록 제조하는 것일 수 있다. 또한, 상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 원통형 중공 구조체가 혈류를 과도하게 차단하여 개체가 사망에 이르지 않도록 소정 크기 이상의 내경을 가지도록 제조하는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 중공 구조체의 내경이 상기 중공 구조체 외경의 1% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 또는 80% 이상이 되도록 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 중공 구조체의 내경이 상기 중공 구조체의 외경을 기준으로 상기 상한값 및 상기 하한값의 조합으로 설정되도록 제조하는 것일 수 있다.
상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 중공 구조체의 외경을 1 내지 4 mm, 1 내지 3.5 mm, 1 내지 3 mm, 1 내지 2.5 mm, 1 내지 2 mm, 1.5 내지 4 mm, 1.5 내지 3.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 1.5 내지 2.5 mm, 또는 1.5 내지 2 mm 의 크기로 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 앞서 설시한 바와 같이 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체가 이식 대상 혈관에 이식되어 혈류를 부분 차단할 수 있도록 소정 크기를 갖도록 제조하는 것일 수 있다.
상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 중공 구조체의 내경을 0.1 내지 2 mm, 0.1 내지 1.5 mm, 0.1 내지 1 mm, 0.1 내지 0.5 mm, 0.2 내지 2 mm, 0.2 내지 1.5 mm, 0.2 내지 1 mm, 또는 0.2 내지 0.5 mm 가 되도록 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 앞서 설시한 바와 같이 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체가 개체의 사망을 방지하고 심근 경색을 유도할 수 있을 정도로 혈류를 차단하도록 소정 크기의 내경을 가지도록 제조하는 것일 수 있다.
상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 원통형 중공 구조체의 길이를 1.5 내지 5 mm, 1.5 내지 4.5 mm, 1.5 내지 4 mm, 1.5 내지 3.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 2 내지 5 mm, 2 내지 4.5 mm, 2 내지 4 mm, 2 내지 3.5 mm, 2 내지 3 mm, 2.5 내지 5 mm, 2.5 내지 4.5 mm, 2.5 내지 4 mm, 2.5 내지 3.5 mm, 또는 2.5 내지 3 mm 의 길이로 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 이식하는 단계는, 상기 원통형 중공 구조체를 경동맥으로 주입하여 좌전하행지동맥에 이식하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은, 상기 이식 대상 혈관에 이식된 상기 원통형 중공 구조체를 제거하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다. 구체적으로, 풍선 카테터를 이용한 종래의 심근 경색 유발 방법은 동맥 내부의 혈류를 임시적으로 차단한 뒤 다시 풍선 카테터를 제거하는 과정에서 의도치 않은 혈관 또는 조직의 물리적 손상이 발생할 수 있고 낮은 생존률을 보이나, 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은 상기 원통형 중공 구조체를 이식 후 제거하는 단계를 포함하지 않아, 높은 안정성으로 심근 경색을 유도할 수 있고 높은 생존률을 달성할 수 있다 (실시예 4).
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은, 상기 중공 구조체가 이식된 동물을 사육하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은, 상기 중공 구조체가 동물에 이식되어 하기 (1) 내지 (6) 중 하나 이상을 유발하는 것일 수 있다:
(1) 좌전하행지동맥 직경의 감소
(2) 박출율 (Ejection fraction)의 감소
(3) 심장 조직의 괴사
(4) 심근 세포의 비정상적인 형상학적 변화
(5) 심근 조직 내부의 콜라겐 축적
(6) 심근 조직의 저산소증 유발.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은, 상기 중공 구조체 이식 5주 후 상기 동물의 생존률(%)이 50% 초과, 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 이 때, 상기 생존률(%)의 상한값이 특정되지 않더라도, 상기 원통형 중공 구조체에 의해 개체가 사망하지 않을 정도의 심근 경색이 유발되는 본 발명의 기술적 효과를 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 생존률(%)의 상한값은 100% 이하, 99% 이하, 95% 이하, 또는 90% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 심장 조직 (예를 들어, 좌심실 조직)의 괴사율(%)이 15% 이상, 20% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상일 수 있다. 이 때, 상기 심장 조직의 괴사율(%)의 상한값이 특정되지 않더라도, 상기 원통형 중공 구조체에 의해 심근 경색이 유발되는 본 발명의 효과를 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 심장 조직의 괴사율(%)의 상한값은 100% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 또는 50% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 박출율 (예를 들어, 좌심실의 박출율) 감소율(%)이 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 또는 40% 이상일 수 있다. 상기 이식 6주 후 박출율 감소율(%)은, 상기 중공 구조체 이식 전 평균 박출율과, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 평균 박출율의 차이를, 상기 중공 구조체 이식 전 평균 박출율로 나누어 도출된 값이다. 이 때, 상기 박출율 감소율의 상한값이 특정되지 않더라도, 상기 원통형 중공 구조체에 의해 심근 경색이 유발되는 본 발명의 효과를 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 박출율 감소율(%)의 상한값은 100% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 또는 50% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발 방법은, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 좌전하행지동맥 내경의 감소율(%)이 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 45% 이상일 수 있다. 상기 이식 6주 후 좌전하행지동맥 내경의 감소율(%)은, 상기 중공 구조체 이식 전 평균 좌전하행지동맥 내경과, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 평균 좌전하행지동맥 내경의 차이를, 상기 중공 구조체 이식 전 평균 좌전하행지동맥 내경으로 나누어 도출된 값이다. 이 때, 상기 좌전하행지동맥 내경의 감소율의 상한값이 특정되지 않더라도, 상기 원통형 중공 구조체에 의해 심근 경색이 유발되는 본 발명의 효과를 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 좌전하행지동맥 내경의 감소율(%)의 상한값은 100% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 또는 50% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 이식 대상 혈관에 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체를 포함하며, 상기 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체는 소정 크기의 내경을 가지며 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체인, 인간을 제외한 심근 경색 동물 모델에 관한 것이다. 상기 중공 구조체의 외경은 이식 대상 혈관에 이식 가능하도록 소정 크기의 외경을 가지는 것일 수 있으며, 상기 이식 대상 혈관의 내경을 기준으로 한 상기 중공 구조체의 외경은 앞서 설시한 바와 같으며, 예를 들어 상기 중공 구조체는 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130% 범위의 외경을 가지는 것일 수 있다.
상기 동물은 인간을 제외한 포유류인 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 동물은 돼지, 원숭이, 침팬지, 양, 염소, 소, 말, 낙타, 개, 및 고양이로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 이식 대상 혈관은 혈류가 차단될 경우 심근 경색이 유발될 수 있는 혈관으로 선택될 수 있으며, 예를 들어 좌전하행지동맥, 우관상동맥, 및 좌회선동맥으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 동물 모델은 하기 (1) 내지 (6) 중 하나 이상이 유발되는 것일 수 있다:
(1) 좌전하행지동맥 직경의 감소
(2) 박출분율 (Ejection fraction)의 감소
(3) 심장 조직의 괴사
(4) 심근 세포의 비정상적인 형상학적 변화
(5) 심근 조직 내부의 콜라겐 축적
(6) 심근 조직의 저산소증 유발.
본 발명의 일 예에 따른 동물 모델은, 상기 중공 구조체가 이식된 5주 후의 생존률이 50% 초과, 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상인 것일 수 있다. 이 때, 상기 생존률(%)의 상한값이 특정되지 않더라도, 상기 원통형 중공 구조체가 이식된 동물 모델이 사망하지 않을 정도의 심근 경색이 유발되는 본 발명의 기술적 효과를 통상의 기술자가 명확하게 이해할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 생존률(%)의 상한값은 100% 이하, 99% 이하, 95% 이하, 또는 90% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 동물 모델은, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 심장 조직 (예를 들어, 좌심실 조직)의 괴사율(%)이 15% 이상, 20% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상일 수 있다. 이 때, 상기 심장 조직의 괴사율(%)의 상한값은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 예에 따른 동물 모델은, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 박출율 (예를 들어, 좌심실의 박출율) 감소율(%)이 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 또는 40% 이상일 수 있다. 상기 이식 6주 후 박출율 감소율(%) 및 상기 박출율 감소율의 상한값은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 예에 따른 동물 모델은, 상기 중공 구조체 이식 6주 후 좌전하행지동맥 내경의 감소율(%)이 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 45% 이상일 수 있다. 상기 이식 6주 후 좌전하행지동맥 내경의 감소율(%) 및 상기 좌전하행지동맥 내경의 감소율의 상한값은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 이식 대상 혈관에 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체를 이식하는 단계를 포함하며, 상기 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체는 소정 크기의 내경을 가지며 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체인, 인간을 제외한 심근 경색 동물 모델의 제조방법에 관한 것이다. 상기 중공 구조체의 외경은 이식 대상 혈관에 이식 가능하도록 소정 크기의 외경을 가지는 것일 수 있으며, 상기 이식 대상 혈관의 내경을 기준으로 한 상기 중공 구조체의 외경은 앞서 설시한 바와 같으며, 예를 들어 상기 중공 구조체는 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130% 범위의 외경을 가지는 것일 수 있다.
상기 이식하는 단계는, 상기 중공 구조체를 경동맥으로 주입하여 좌전하행지동맥에 이식하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 동물 모델의 제조방법은, 상기 이식 대상 혈관에 이식된 상기 원통형 중공 구조체를 제거하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 동물 모델의 제조방법은, 상기 중공 구조체 이식 5주 후 상기 동물의 생존률이 50% 초과, 55% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 동물 모델의 제조방법은, 상기 중공 구조체가 이식된 동물을 사육하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 중공 구조체는 동물에 이식되어 하기 (1) 내지 (6) 중 하나 이상을 유발하는 것일 수 있다:
(1) 좌전하행지동맥 직경의 감소
(2) 박출분율 (Ejection fraction)의 감소
(3) 심장 조직의 괴사
(4) 심근 세포의 비정상적인 형상학적 변화
(5) 심근 조직 내부의 콜라겐 축적
(6) 심근 조직의 저산소증 유발.
심근 경색이 발병하게 되면 동맥 내부에 플라크(Plaque)가 형성되고 이로 인해 심근으로 정상적인 혈류 전달이 불가능해지며, 심근은 산소와 영양분을 공급받지 못하게 되어 괴사가 유발된다. 기존의 방식들은 이를 모사하고자 정상적인 동맥 내부의 혈류를 임시적으로 차단하여 심근 손상을 유도한 뒤, 혈류 차단을 다시 해제하는 방식으로 심근 경색을 유도하였다. 예를 들어, 종래의 심근 경색 모델을 제조하는 대표적인 방법은 풍선 카테터를 이용하여 동맥 내부에 혈류를 임시적으로 차단하는 방법이다.
그러나, 이러한 종래의 방식은 실제 형성되는 심근 경색 환경을 모사했다고 말하기 어려울 뿐만 아니라, 낮은 생존율, 낮은 심근 괴사율, 불안정한 박출율 등을 초래하여 심근경색 모델을 제작하는데 많은 비용과 시간이 소모되는 문제가 있었다. 이러한 종래의 문제를 해결하기 위하여, 본 발명에서 제시한 방식은 영구적인 혈류의 부분적 차단을 구현함으로써 실제 심근경색과 비슷한 환경을 재현할 수 있고, 이에 따른 향상된 심기능 저하를 보여줌으로써 효과적인 심근 경색 유도 모델의 제작이 가능하였다.
본 발명은 생체 적합한 고분자를 이용하여 영구적으로 혈류를 부분 차단하여 심근경색을 성공적으로 모사할 수 있으며, 3D 바이오프린팅 기술을 이용하여 통공을 가지는 원기둥 형태의 복잡한 구조체를 제조할 수 있어, 시간, 재현성, 맞춤화, 제작 효율성 등의 측면에서 종래의 동물 모델 제조방법 대비 우수한 효과를 가진다.
도 1a는 본 발명의 일 예에 따른 3차원 바이오 프린팅 시스템의 전경을 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 예에 따라 제조된 다양한 크기의 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체의 형태 및 외경과 내경을 나타낸 도면이다.
도 1c는 본 발명의 일 예에 따라 관상동맥에 배치되는 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체의 주입 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1d는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체의 정면 및 측면부의 모습을 나타낸 도면이다.
도 2의 a는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체가 이식된 동물 모델의 초기 심혈관조영술 결과를 나타낸 도면이고, 도 2의 b는 중공 구조체 배치 후 심혈관 조영술 결과를 나타낸 도면으로 중공 구조체의 위치를 하얀색 화살표로 표시하였으며, 도 2의 c는 중공 구조체로 인한 부분적 혈류 차단을 확인한 심혈관조영술 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체에 의한 관상 동맥 내경 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체에 의한 좌심실의 박출율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 다양한 조직 검사법을 통해 본 발명의 일 예에 따라 심근 경색 유도 6주 후의 좌심실 벽의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면으로 (Bar: 100 μm), 도 4의 a는 TTC 염색 결과를 나타낸 도면이고, 도 4의 b 및 e는 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이며, 도 4의 c 및 f는 picrosirius red 염색 결과를 나타낸 도면이고, 도 4의 d 및 g는 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 예에 따라 제조된 다양한 크기의 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체의 형태 및 외경과 내경을 나타낸 도면이다.
도 1c는 본 발명의 일 예에 따라 관상동맥에 배치되는 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체의 주입 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1d는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체의 정면 및 측면부의 모습을 나타낸 도면이다.
도 2의 a는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체가 이식된 동물 모델의 초기 심혈관조영술 결과를 나타낸 도면이고, 도 2의 b는 중공 구조체 배치 후 심혈관 조영술 결과를 나타낸 도면으로 중공 구조체의 위치를 하얀색 화살표로 표시하였으며, 도 2의 c는 중공 구조체로 인한 부분적 혈류 차단을 확인한 심혈관조영술 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체에 의한 관상 동맥 내경 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체에 의한 좌심실의 박출율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 다양한 조직 검사법을 통해 본 발명의 일 예에 따라 심근 경색 유도 6주 후의 좌심실 벽의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면으로 (Bar: 100 μm), 도 4의 a는 TTC 염색 결과를 나타낸 도면이고, 도 4의 b 및 e는 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이며, 도 4의 c 및 f는 picrosirius red 염색 결과를 나타낸 도면이고, 도 4의 d 및 g는 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체 제조
(1) 다양한 외경 및 내경을 가지는 중공 구조체 제조
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유발용 중공 구조체는 목적하는 바에 따라 다양한 재질로 제조될 수 있으며, 본 실시예에서는 예시적으로 생체적합성이 뛰어난 PCL(Polycaprolactone) 고분자를 재료로 사용하였다.
PCL 고분자 용융물을 온도와 압력 제어가 가능한 3D 바이오 프린팅 시스템 상단부의 고분자 압출 헤드에서 70 ℃의 시린지 내부 온도, 550 kPa의 공압 조건으로 주입하였고, 150 μm 직경을 갖는 노즐을 통해 PCL 용융물을 마이크로 사이즈로 압출하여 중심부에 통공을 가지는 원기둥 형태의 중공 구조체를 다양한 크기로 제조하였다. G-code 생성 프로그램을 이용하여 원통형 중공 구조체에 대한 노즐 이송 경로를 생성하였고, 고분자 압출 시 60 mm/min 의 스테이지 이송 속도를 부여하여 지속적이고 안정적인 중공 구조체 생산 공정을 확립하였다 (도 1a). 도 1a는 본 발명의 일 예에 따른 3차원 바이오 프린팅 시스템의 전경을 나타낸 도면이다.
심근 경색은 일반적으로 좌전하행지동맥 (LAD, Left Anterior Descending artery) 내부의 변형으로 인해 혈류가 차단되고 이로 인해 충분한 산소와 영양분을 공급받지 못하게 되어 발생하는 질환이기 때문에, 심근 경색이 발생하는 환경을 모사하고자 이식체 중심부에 구멍을 형성하여 관상 동맥의 내부 형태 및 혈압으로부터의 받는 손상을 최소화하는 중공 구조체 형태를 고려하였고, 다양한 크기의 외경 및 내경으로 맞춤 제작이 가능하여 동물 실험에서 발생할 수 있는 예상치 못한 변수를 차단할 수 있었다 (도 1b). 도 1b는 본 발명의 일 예에 따라 제조된 다양한 크기의 중공 구조체의 형태 및 외경과 내경을 나타낸 도면이다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 중공 구조체의 길이는 3 mm로 제조하였으며, 중공 구조체의 외경과 내경을 0.1mm 단위까지 조절할 수 있었다. 종래의 심근경색 모델 제작 방법은 카테터를 동맥 내부에 삽입하여 혈류를 일시적으로 차단하여 심근 손상을 유도한 뒤 다시 카테터를 제거하는 방식으로 심근경색을 유도하였으나, 카테터를 제거하는 과정에서 의도치 않은 혈관 또는 조직의 물리적 손상이 발생할 수 있고 이는 생존률 하락을 초래할 수 있으며, 매우 가느다란 혈관에 삽입 되어야하는 이식체의 특성상 이식체의 미세한 크기 변화도 심근경색 유발에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 제조방법은 심근경색 유발용 이식체의 크기를 미세하게 조절 가능하고 개체 특이적으로 맞춤 제조가 가능하여, 높은 안정성으로 심근 경색을 유도할 수 있었다.
(2) 이식 대상 혈관 맞춤형 중공 구조체 제조
생후 3 개월된 Yorkshire × Landrace F1 crossbred castrated male 종 돼지 7마리를 준비하여, 정량적관상동맥조영술 검사를 통해 좌전하행지동맥의 내경을 측정하였다. 측정된 돼지 7마리의 좌전하행지동맥 내경을 표 1에 나타내었다.
| 샘플 NO. | 좌전하행지동맥 내경(mm) | 이식체 외경 (mm) | 이식체 내경 (mm) |
| 1 | 1.94 | 2.10 | 0.30 |
| 2 | 2.1 | 2.40 | 0.30 |
| 3 | 2.13 | 2.10 | 0.30 |
| 4 | 1.71 | 1.80 | 0.50 |
| 5 | 2.05 | 1.80 | 0.50 |
| 6 | 2.35 | 2.40 | 0.30 |
| 7 | 1.98 | 2.10 | 0.30 |
| 표준편차 | 0.20 | - | - |
표 1에 나타난 바와 같이, 각 개체의 좌전하행지동맥 내경의 표준편차가 약 0.20 mm로 나타났으며, 좌전하행지동맥의 평균 내경이 약 2 mm 로 매우 얇은 굵기임을 고려해보았을 때 편차가 매우 크게 나타나, 심근경색 유발용 이식체를 각 개체에 특이적으로 제조하는 것이 필요함을 알 수 있었다. 이에 따라 이식체의 외경 및 내경을 표 1에 나타난 각 개체의 좌전하행지동맥 내경에 적합하게 제조하였으며, 각 개체 특이적인 중공 구조체의 외경 및 내경을 표 1에 나타내었다. 중공 구조체의 외경은 각 개체의 좌전하행지동맥의 내경을 기준으로 상기 값의 70% 내지 130% 가 되도록 설정하였고, 중공 구조체의 내경은 부분적 혈류 차단으로 인해 발생할 수 있는 각 개체의 사망 가능성 및 심근 유도의 적절성을 고려하여 이식체 외경의 10% 내지 40% 가 되도록 설정하였다.
실시예 2: 심근 경색 유발을 위한 중공 구조체 이식 및 동물 모델 제조
실시예 1에서 제조된 개체 특이적 심근 경색 유도용 중공 구조체를 풍선 확장 카테터 상단부 가이드 와이어에 중심부에 고정하여 각 개체의 경동맥에서 좌전하행지동맥 (LAD)까지 배치되도록 이식하였다 (도 1c 및 도 1d). 이러한 이식 방법은 외과적 수술 프로세스를 최소화하고 발생하는 혈류를 부분적으로 차단하여, 심근 경색 유도 후 높은 생존율을 도모할 수 있었다. 도 1c는 관상동맥에 배치되는 중공 구조체의 주입 과정을 나타낸 모식도이며, 도 1d는 중공 구조체의 정면 및 측면부의 모습을 나타낸 도면이다.
실시예 3: 심근 경색 동물 모델의 심근 경색 유발 확인
(1) 관상 동맥 내부 혈류 흐름 관찰
실시예 1에서 제조된 중공 구조체가 심근 경색 동물 모델에서 실질적인 혈류 차단을 수행하는지를 확인하기 위해, 중공 구조체 이식 전 (도 2의 a), 중공 구조체 이식 직후 (도 2의 b), 및 중공 구조체 이식 5주 후 (도 2의 c) 각각 심혈관조형술 검사를 수행하여 관상 동맥 내부의 혈류 흐름을 관찰하여 도 2에 나타내었다. 도 2의 b에서 하얀색 화살표로 가리킨 바와 같이, 실험에 사용된 중공 구조체는 부작용 없이 모든 돼지들의 좌전하행지동맥 위치에 정확히 배치되었다. 도 2의 c에 나타난 바와 같이, 이식 후 5주까지 부분적인 혈류를 유도하여 안정적인 심근 경색이 성공적으로 유도되었다.
(2) 심장 기능 변화 관찰
심초음파 검사와 정량적 관상동맥조영 검사를 통해 중공 구조체에 의한 심장 기능의 변화를 관찰하였다. 표 2는 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체 이식 후 관상 동맥 내경 변화를 나타낸 것이고, 이를 그래프화하여 도 3a에 나타내었다. 표 2 및 도 3a에 나타난 바와 같이, 좌전하행지동맥 내경의 경우 중공 구조체 적용 후 시간이 지남에 따라 확연하게 감소하였다. 또한, 표 3은 본 발명의 일 예에 따른 중공 구조체 이식 후 좌심실의 박출율 변화를 나타낸 것이고, 이를 그래프화하여 도 3b에 나타내었다. 표 3 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 심장 기능을 평가하는데 가장 중요한 지수인 박출율 역시(EF, Ejection fraction) 중공 구조체 이식 6 주 후 약 30%까지 감소하여 중증 심근 경색의 수치를 보였으며, 본 발명의 일 예에 따른 3차원 바이오프린팅 기술로 제작된 대동물 기반 심근 경색 모델의 정량적 적합성이 검증되었다. 도 3a 및 도 3b에서 baseline은 이식 전의 혈관 내경을 의미한다.
| 구분 | 좌전하행지동맥 내경 (mm) | 좌전하행지동맥 내경 감소율 (%) |
| Baseline (이식 전) | 2.04±0.18 | - |
| 이식 직후 | 1.61±0.20 | 21.08 |
| 이식 6주 후 | 1.08±0.05 | 47.06 |
| 구분 | 박출율 (%) | 박츌율 감소율 (%) |
| Baseline (이식 전) | 67.98±3.81 | - |
| 이식 1주 후 | 52.40±4.35 | 22.92 |
| 이식 2주 후 | 45.41±4.45 | 33.20 |
| 이식 6주 후 | 39.09±3.31 | 42.50 |
(3) 조직 병리학 검사
조직 병리학 검사를 통해 본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 유도 방법이 심근 경색을 성공적으로 유도하였는지 확인하였다. 조직 병리학 검사는 TTC (Triphenyltetrazolium chloride), H&E (Haemotoxylin and Eosin), picosirius red 의 조직학 검사와 HIF-1 Alpha 의 면역조직화학 검사 등 총 4가지의 염색법으로 분류된다.
첫 번째로 TTC 염색을 통해 일반 조직 대비 심근 경색이 유도된 부분의 차이를 관찰할 수 있었는데, 도 4의 a에 나타난 바와 같이 전반적으로 좌심실 벽 주위가 다르게 염색되는 것으로 보아 해당 부위에 거시적인 괴사가 발생했음을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 실시예 1에서 제조된 심근 경색 모델 5 마리의 전체 좌심실 부피 대비 TTC 염색된 심근경색 부위의 부피를 계산하여 괴사율 (%)을 측정하여 평균한 결과, 괴사율 약 33(%) 이상의 거시적인 괴사가 발생함을 확인할 수 있었다 (표 4).
| 샘플 NO. | 괴사율(%) |
| 1 | 26.54 |
| 2 | 24.03 |
| 3 | 27.14 |
| 4 | 54.91 |
| 5 | 31.60 |
| 평균 | 32.84±11.30 |
또한, H&E 염색을 중공 구조체 이식 초기 및 이식 6주 후 각각 수행한 결과를 도 4의 b (이식 초기) 및 도 4의 e (이식 6주 후)에 나타내었다. 도 4의 e에 나타난 바와 같이, 일반 조직 대비 심근 세포의 비정상적인 형상학적 변화를 미시적으로 관찰할 수 있었다.
또한, picrosirius red 염색을 중공 구조체 이식 초기 및 이식 6주 후 각각 수행한 결과를 도 4의 c (이식 초기) 및 도 4의 f (이식 6주 후)에 나타내었다. 도 4의 f에 나타난 바와 같이, 괴사된 심근 조직 내부에 콜라겐이 축적되는 것을 picrosirius red 염색을 통해 관찰할 수 있었으며, 심근 경색 유도로 인한 일반 심근 조직의 기능 상실을 확인할 수 있었다.
마지막으로 면역조직화학 염색을 중공 구조체 이식 초기 및 이식 6주 후 각각 수행한 결과를 도 4의 d (이식 초기) 및 도 4의 g (이식 6주 후)에 나타내었다. 도 4의 g에 나타난 바와 같이, 중공 구조체 이식 후 HIF-1 alpha 의 발현이 뚜렷하게 관찰되는 것으로 보아 심근 경색으로 인해 저산소증이 발생했음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 생존률 측정
본 발명의 일 예에 따른 심근 경색 동물 모델 제조방법이 얼마나 성공적으로 심근 경색 동물 모델을 제조할 수 있는지 확인하기 위해, 비교예로서 종래의 심근 경색 동물 모델 제조방법과, 본 발명의 일 예에 다른 심근 경색 동물 모델 제조방법으로 각각 7 개체의 동물 모델을 제조하고, 5주 후의 생존률을 측정하여 표 5에 나타내었다. 종래의 방법으로 제조된 심근 경색 모델은 일반적으로 사용되는 풍선 카테터를 이용하여 경상 동맥 내부에 흐르는 혈류를 임시적으로 차단하는 방법으로 제조되었다 (비교예 1).
| 구분 | 5주 후 생존률 |
| 실시예 2 | 90% |
| 비교예 1 | 50% |
표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 예에 따른 제조방법이 현저히 높은 생존률을 보였으며, 실험용 쥐와 달리 돼지는 심근 구조와 기능의 편차가 높은 특성을 가지며, 각각의 돼지 개체가 가지는 관상 동맥의 혈류 및 내경에 대한 수치의 추이가 다양하여 안정적인 동물 실험을 수행하기 어려운 문제점이 있었으나, 본 발명은 심근경색 유발용 중공 구조체의 직경과 통공을 수십 마이크로 단위로 맞춤 제작하여 심근경색을 연구하기 위한 모델로서 다양한 데이터를 안정적으로 확보할 수 있고, 데이터의 정량적 수치를 조절 가능하며, 좌전하행지동맥뿐만 아니라 다른 혈관 내부에도 배치할 수 있어 심근 경색을 성공적으로 모사할 수 있었다.
실시예 5: 중공 구조체의 통공 크기에 따른 괴사율 및 박출율 변화
다양한 통공 크기를 가지는 중공 구조체를 제조하여 이식한 뒤 괴사율 및 박출율 값을 비교하여 통공 크기가 심근경색 유발에 미치는 영향을 알아보았다. 구체적으로, 중공 구조체 직경의 24% 크기의 통공을 가지는 중공 구조체 (실시예 5-1) 및 중공 구조체 직경의 14% 크기의 통공을 가지는 중공 구조체 (실시예 5-2)를 제조한 뒤, 생후 3 개월된 Yorkshire × Landrace F1 crossbred castrated male 종 돼지에 각각 이식하였다. 이식 28 일 후 실시예 3의 (3)과 실질적으로 동일한 방법으로 괴사율 및 박출율을 측정하여 표 6에 나타내었다.
| 구분 | 괴사율(%) | 박출율 (%) |
| 실시예 5-1 | 20 | 51 |
| 실시예 5-2 | 30 | 39 |
표 6에 나타난 바와 같이, 통공의 크기가 상대적으로 작을수록 좌전하행지 관상 동맥 내부에서 받는 심근의 혈압 상승으로 인해 더 심한 박출율이 측정이 되었고, 이로 인한 심근 괴사의 증가를 관찰할 수 있었다.
Claims (26)
- 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체로서,
상기 중공 구조체의 내경은 혈류가 통과할 수 있도록 소정 크기를 가지고 외경의 50% 이하의 크기를 가지며,
혈관에 이식되어 심근 경색을 유발하는, 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체. - 제1항에 있어서, 상기 중공 구조체는 좌전하행지동맥, 우관상동맥, 및 좌회선동맥으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에 이식되어 심근 경색을 유발하는 것인, 중공 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 중공 구조체의 외경은 상기 혈관의 내경의 70% 내지 130%의 범위를 갖는 것인, 중공 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 중공 구조체의 외경은 1 내지 4 mm이고, 상기 중공 구조체의 내경은 0.1 내지 2 mm인, 중공 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 중공 구조체는 1.5 내지 5 mm의 길이를 갖는 것인, 중공 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 중공 구조체의 재질은 생분해성 고분자인, 중공 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 중공 구조체의 재질은 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL), 폴리락테이트-코-글라이콜레이트(poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리유산 (Poly Lactic Acid, PLA), 폴리우레탄 (polyurethane, PU), 폴리락테이트-코-카프로락톤 (poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), 폴리다이옥사논 (polydioxanone, PDO), 폴리스티렌 (polystyrene, PS), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethylene glycol), PEG), 폴리비닐아세테이트 (poly(vinyl acetate), PVA), 폴리프로필렌글라이콜 (polypropylene glycol, PPG), 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide, PAAm), 폴리글리콜릭에이스드 (polyglycolic acid, PGA), 폴리메틸메타클릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리하이드록시부틸레이트 (polyhydroxybutyrate, PHB), 및 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, PVP) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 중공 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 혈관은 돼지, 원숭이, 침팬지, 양, 염소, 소, 말, 낙타, 개, 및 고양이로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 동물의 혈관인, 중공 구조체.
- 고분자 용융물을 3차원 인쇄하여, 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130% 범위의 외경을 가지고, 혈류가 통과할 수 있도록 소정 크기의 내경을 가지며, 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계; 및
상기 중공 구조체를 상기 이식 대상 혈관에 이식하는 단계를 포함하며,
상기 이식 대상 혈관은 인간을 제외한 동물의 혈관인, 동물의 심근 경색 유발 방법. - 제9항에 있어서, 상기 이식 대상 혈관은 좌전하행지동맥, 우관상동맥, 및 좌회선동맥으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 원통형 중공 구조체의 내경이 상기 원통형 중공 구조체의 외경의 50% 이하가 되도록 제조하는 것인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 원통형 중공 구조체를 제조하는 단계는, 상기 원통형 중공 구조체의 길이를 1.5 내지 5 mm의 길이로 제조하는 것인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 고분자는 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL), 폴리락테이트-코-글라이콜레이트(poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리유산 (Poly Lactic Acid, PLA), 폴리우레탄 (polyurethane, PU), 폴리락테이트-코-카프로락톤 (poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), 폴리다이옥사논 (polydioxanone, PDO), 폴리스티렌 (polystyrene, PS), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethylene glycol), PEG), 폴리비닐아세테이트 (poly(vinyl acetate), PVA), 폴리프로필렌글라이콜 (polypropylene glycol, PPG), 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide, PAAm), 폴리글리콜릭에이스드 (polyglycolic acid, PGA), 폴리메틸메타클릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리하이드록시부틸레이트 (polyhydroxybutyrate, PHB), 및 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, PVP) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 이식하는 단계는, 상기 원통형 중공 구조체를 경동맥으로 주입하여 좌전하행지동맥에 이식하는 것인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 심근 경색 유발 방법은 상기 원통형 중공 구조체를 제거하는 단계를 포함하지 않는 것인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 심근 경색 유발 방법은 상기 원통형 중공 구조체를 제거하지 않고 유지한 상태에서 심근 경색을 유발하는 것인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 원통형 중공 구조체가 이식된 동물을 사육하는 단계를 추가로 포함하는, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 원통형 중공 구조체 이식 5주 후 상기 동물의 생존률이 70% 이상인, 심근 경색 유발 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 원통형 중공 구조체는 동물에 이식되어 하기 (1) 내지 (6) 중 하나 이상을 유발하는 것인, 심근 경색 유발 방법:
(1) 좌전하행지동맥 직경의 감소
(2) 박출율 (Ejection fraction)의 감소
(3) 심장 조직의 괴사
(4) 심근 세포의 비정상적인 형상학적 변화
(5) 심근 조직 내부의 콜라겐 축적
(6) 심근 조직의 저산소증 유발 - 제9항에 있어서, 상기 동물은 돼지, 원숭이, 침팬지, 양, 염소, 소, 말, 낙타, 개, 및 고양이로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 심근 경색 유발 방법.
- 이식 대상 혈관에 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체를 포함하며,
상기 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체는 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130%의 범위를 가지는 외경을 가지고, 소정 크기의 내경을 가지며 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체인, 인간을 제외한 심근 경색 동물 모델. - 제21항에 있어서, 상기 동물은 돼지, 원숭이, 침팬지, 양, 염소, 소, 말, 낙타, 개, 및 고양이로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 동물 모델.
- 제21항에 있어서, 상기 이식 대상 혈관은 좌전하행지동맥, 우관상동맥, 및 좌회선동맥으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 동물 모델.
- 제21항에 있어서, 상기 동물 모델은 상기 중공 구조체가 이식된 5주 후의 생존률이 70% 이상인, 동물 모델.
- 제21항에 있어서, 상기 동물 모델은 하기 (1) 내지 (6) 중 하나 이상이 유발되는 것인, 동물 모델:
(1) 좌전하행지동맥 직경의 감소
(2) 박출분율 (Ejection fraction)의 감소
(3) 심장 조직의 괴사
(4) 심근 세포의 비정상적인 형상학적 변화
(5) 심근 조직 내부의 콜라겐 축적
(6) 심근 조직의 저산소증 유발 - 이식 대상 혈관에 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체를 이식하는 단계를 포함하며,
상기 심근 경색 유발을 위한 이식용 중공 구조체는 상기 이식 대상 혈관의 내경의 70% 내지 130%의 범위를 가지는 외경을 가지고, 소정 크기의 내경을 가지며 길이방향으로 연장된 관통공이 형성된 원통형 중공 구조체인, 인간을 제외한 심근 경색 동물 모델의 제조방법.
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