KR20190068187A

KR20190068187A - 3d 프린팅으로 형성되며 장막-배양으로 보강된 인공 식도 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20190068187A
Application number: KR1020170168324A
Authority: KR
Inventors: 박찬흠; 주형우; 박현정; 연응규; 이지승
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2019-06-18
Also published as: KR102048418B1

Abstract

본 발명은 장막-배양으로 보강된 인공 식도 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성하여 치료효과를 향상시킨 인공 식도 및 그 제조방법에 관한 것이다. 이를 위해 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 식도는 링 형상의 바디부; 바디부의 표면에 형성된 다공성의 피막층; 및 바디부 및 피막층의 표면에 형성되고, 장막(omentum) 조직으로 이루어진 코팅층;을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

장막-배양으로 보강된 인공 식도 및 그 제조방법{ARTIFICIAL ESOPHAGUS REINFORCED WITH OMENTUM-CULTURED AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 장막-배양으로 보강된 인공 식도 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성하여 치료효과를 향상시킨 인공 식도 및 그 제조방법에 관한 것이다.

암, 선천적 기형 또는 외상과 같은 식도 질환에 대한 현재의 치료는 위, 창자 또는 결장을 통한 내시경적 개입과 식도 재건을 필요로 한다. 그러나 이러한 식도 대용품의 사용은 다양한 외과적 질환과 사망률을 유발할 수 있다. 생체 해부 부위의 해부학적 산소 소모 및 괴사는 약 처방전과 목의 컴파트먼트가 오염되어 있기 때문에 필연적으로 극도로 높은 사망률을 초래한다.

최근에는 천연 및 합성재료를 사용하여 자가 혹은 외부 다른 물질로 몇몇 유형으로 식도 대체물 주변을 둘러싸는 것이 식도 치환에 적용되었다. 세포막에서 추출된 세포막, 콜라겐, 키토산, 젤라틴 등을 포함한 천연 바이오 소재는 뛰어난 생체 적합성과 세포 외 기질에서의 생체 특이적 신호로 인해 연구되었다. 그러나 일부 시험관 또는 생체 내 실험 결과에도 불구하고, 재료의 부족, 낮은 기계적 강도 및 빠른 분해와 같은 문제들은 이러한 재료의 한계점으로 확인되었다.

인공 식도는 적절한 기계적 물성을 가져야 하며, 이는 다양한 힘에 대한 변형으로 음식을 통과시키는 데 필수적인 조건이고, 인공 식도의 이식 후 누출, 협착, 감염, 염증, 면역 거부, 불량한 상피화 및 인공 식도의 빈약한 근육 재생은 해결해야 할 주요 문제이다. 또한, 최상의 수술 결과를 얻기 위해, 인공 식도의 기계적 강도와 순응도가 정상 식도의 값과 유사해야 하며 수술 중 수술가장자리를 최적화 할 수 있어야 한다.

이에, 이러한 문제점을 극복할 수 있는 새로운 인공 식도에 대한 개발이 요구되고 있다.

대한민국 공개특허공보 특2000-0057130호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성하여 치료효과를 향상시킨 인공 식도 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.

상기 목적은, 링 형상의 바디부; 바디부의 표면에 형성된 다공성의 피막층; 및 바디부 및 피막층의 표면에 형성되고, 장막(omentum) 조직으로 이루어진 코팅층;을 포함하는 인공 식도에 의해 달성될 수 있다.

이때, 바디부는, 소정의 간격으로 이격된 복수 개로 이루어질 수 있고, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어질 수 있다.

또한, 피막층은, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 목적은, 원통형의 지지관에 링 형상의 바디부를 형성하는 제1단계; 바디부의 표면에 미세섬유 형태로 분사하여 다공성의 피막층을 형성하는 제2단계; 지지관을 제거하는 제3단계; 및 장막(omentum) 조직에서 배양하여 코팅층을 형성하는 제4단계;를 포함하는 인공 식도 제조방법에 의해 달성될 수 있다.

이때, 제1단계는, 소정의 간격으로 이격된 복수 개의 바디부를 형성할 수 있고, 바디부는 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어질 수 있다.

또한, 제2단계의 피막층은, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어질 수 있다.

또한, 제4단계는, 장막(omentum) 조직에서 2주간 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 정상 식도와 유사한 기계적 강도 및 순응도(생체 친화적)를 가질 수 있는 효과를 가진다.

다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 식도의 제조과정 일부를 개략적으로 나타낸 도면이다. (A) 지지관에 바디부를 형성하는 단계, (B~D) 피막층을 형성하는 단계이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 식도의 제조과정 일부를 개략적으로 나타낸 도면이다. (A) 대망(greater omentum)에 스캐폴드를 이식하는 단계, (B) 대망(greater omentum)에서 2주간 배양하는 단계, (C) 자궁 경부 식도로 이식하는 단계이다.
도 3은 대망(greater omentum)으로의 이식 형태를 나타낸 도면이다.
도 4는 스캐폴드의 SEM 이미지(A~F) 및 직경 분포 히스토그램(G~H)을 나타낸 도면이다.
도 5는 스캐폴드의 응력-변형률 곡선을 나타낸 도면이다. (A)는 건조 상태 및 (B)는 젖은 상태를 나타낸다(식도는 정상 쥐의 식도이다).
도 6은 배양 1, 7, 14 일 후 스캐폴드에 대한 세포 생존 능력을 분석한 그래프이다.
도 7은 재건된 인공 식도의 구조의 거시적인 외관을 나타낸 도면이다.
도 8은 장막-배양된 스캐폴드의 hematoxylin-eosin 염색한 조직학적 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 장막-배양된 스캐폴드의 면역조직화학을 나타낸 도면이다.
도 10은 스캐폴드 이식 2주 후 hematoxylin-eosin 염색된 절편(A, B, C)에 대한 조직학적 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 이식된 스캐폴드의 면역조직화학을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.

도면에서 제안된 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다. 그리고, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에서 기술한 "부"란, 특정 기능을 수행하는 하나의 단위 또는 블록을 의미한다.

각 단계들에 있어 식별부호(제1, 제2, 등)는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.

도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 식도의 제조과정 일부를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1 및 도 2를 참조하여 설명하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 식도는 링 형상의 바디부; 바디부의 표면에 형성된 다공성의 피막층; 및 바디부 및 피막층의 표면에 형성되고, 장막(omentum) 조직으로 이루어진 코팅층;을 포함한다. 여기에서, 표면은 외부면, 내부면을 모두 포함한다. 본 발명은 바디부의 표면에 다공성의 피막층을 형성하여 스캐폴드(scaffold)를 제조한 후, 제조된 스캐폴드를 장막(omentum)에 배양하여 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성한 인공 식도(장막-배양된 스캐폴드)로서, 정상 식도와 유사한 기계적 강도 및 순응도(생체 친화적)를 가질 수 있는 효과를 가진다.

바디부는 링 형상으로 제조될 수 있고, 제조하는 인공 식도의 크기에 따라 복수 개로 이루어질 수 있으며, 복수 개의 바디부는 소정의 간격을 유지하여 이격될 수 있다. 바디부는 생체적합성 물질(Biocompatible material)로 제조되는 것이 바람직한데, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 제조될 수 있다.

피막층은 바디부의 표면에 미세섬유 형태로 분사되어 다공성의 형태로 형성된다. 바디부가 복수개 형성될 경우, 바디부 표면 및 각 바디부 사이에 미세섬유 형태로 분사(도 1의 B~D 참조)되어 최종적으로 식도로 기능할 수 있도록 관 형상(tubular)을 가지게 된다. 피막층은 바디부와 마찬가지로 생체적합성 물질로 제조되는 것이 바람직한데, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 제조될 수 있다.

코팅층은 스캐폴드(바디부 및 피막층)의 표면에 형성되고, 장막(omentum) 조직으로 이루어진다. 구체적으로, 스캐폴드를 장막(omentum) 조직에 이식하여 배양하면 장막 조직은 다공성의 피막층 및 바디부 내부, 외부를 포함하는 표면에 이식되어 코팅층을 형성하게 된다. 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성하여 식도에 이식하면 기존의 식도와 동일 유사한 수준의 순응도를 가질 수 있다.

다음으로 인공 식도를 제조하는 방법에 대해 설명한다. 도 1 및 도 2를 참조하여 설명하되, 상술하여 중복되는 부분에 대해서는 생략한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 인공 식도 제조방법은 원통형의 지지관에 링 형상의 바디부를 형성하는 제1단계; 바디부의 표면에 미세섬유 형태로 분사하여 다공성의 피막층을 형성하는 제2단계; 지지관을 제거하는 제3단계; 및 장막(omentum) 조직에서 배양하여 코팅층을 형성하는 제4단계;를 포함한다. 본 발명은 원통형의 지지관에 바디부를 형성하고, 바디부의 표면에 피막층을 형성한 후, 원통형의 지지관을 제거하여 스캐폴드(scaffold)를 제조하고, 이를 장막(omentum)에 배양하여 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성함으로써 정상 식도와 유사한 기계적 강도 및 순응도(생체 친화적)를 가지는 인공 식도(장막-배양된 스캐폴드)를 제조할 수 있다.

제1단계는 원통형의 지지관에 바디부를 형성하는 단계로, 3D 프린팅 장치를 이용하여 링 형상의 바디부를 형성할 수 있다. 원통형의 지지관은 바디부를 형성할 수 있도록 지지할 수 있는 것이라면 무엇이든 사용할 수 있고, 일 예로, 스테인리스 로드(stainless rod)를 사용할 수 있다. 이 때, 제조되는 인공 식도의 길이(크기)에 따라서 복수 개의 바디부를 형성할 수 있고, 바디부는 서로 소정의 간격으로 이격된다. 바디부는 생체적합성 물질(Biocompatible material)로 제조되는 것이 바람직한데, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 제조될 수 있다.

제2단계는 바디부의 표면에 다공성의 피막층을 형성하는 단계로, 전기 방사법(electrospinning methods)을 이용하여 생체적합성 물질을 미세섬유 형태로 분사하여 바디부의 표면에 다공성의 피막층을 형성할 수 있다. 바디부가 복수개로 형성될 경우, 바디부 표면 및 각 바디부 사이에 미세섬유 형태로 분사(도 1의 B~D 참조)되어 최종적으로 바디부 및 지지관의 표면에 관 형상(tubular)을 가지게 된다. 피막층은 바디부와 마찬가지로 생체적합성 물질로 제조되는 것이 바람직한데, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 제조될 수 있다.

제3단계는 피막층이 생성된 후, 원형의 지지관을 제거하는 단계로, 지지관을 제거하여 스캐폴드를 형성하고, 피막층은 식도로 기능할 수 있도록 관 형상을 유지하게 된다.

제4단계는 제조된 스캐폴드를 장막(omentum) 조직에서 배양하여 스캐폴드 표면에 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성하는 단계로, 충분한 코팅층을 형성하기 위하여 약 2주간 배양하는 것이 바람직하다. 장막 조직으로 이루어진 코팅층을 형성하여 식도에 이식하면 기존의 식도와 동일 유사한 수준의 순응도를 가질 수 있다.

이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

스캐폴드(scaffolod)의 제조

스캐폴드(PCL 스캐폴드라고도 함)는 3D프린터(BT-3000(NBR-Tech Co., Ltd., 강원도 춘천시)와 전기 방사법을 조합하여 제조하였다. 첫 번째 단계로 스테인레스 막대(stainless rod)에 PCL링(바디부)을 3D 프린팅하였다. 생분해성 PCL(평균 분자량 45,000 Da, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 디스펜싱(dispensing) 형태의 시스템을 사용하여, 가열 가능한 베럴(barrel)로 옮겼다. 가열로 융해된 PCL을 300㎛의 바늘로 압출하여 200㎛ 두께의 링으로 프린팅하였다. 제작된 PCL링의 크기는 2.5 X 2.5 X 1 mm³이었다. 이후 10%(w/v) PCL(MW 80,000) 용액을 전기 방사해서 PCL피막층을 제조하였다. 전기 방사된 용액은 DMF와 THF(Sigma-Aldrich, USA, 50:50(v/v))의 용매 혼합물에 PCL 펠렛(pellets)를 밤새 연속 교반(60℃) 하여 제조했으며, 제조된 PCL 용액으로 전기 방사 과정을 시행하였다. PCL 용액을 바늘(22 게이지, 0.4 mm ID x 0.7 mm OD)이 장착된 10 mL 플라스틱 주사기에 용액을 준비한 후 시린지 펌프를 사용하여 0.4 mL/hr의 양으로 일정하게 2 시간 동안 토출하여 주었다. 이때 바늘에는 고전압 전류를 인가하여 주고 바늘과 수집기의 거리는 15cm를 유지하였다. 사용된 전압은 +30 kV와 -30 kV를 사용하였다(도 1 참조).

장막 배양된 스캐폴드(인공 식도)의 제조

스캐폴드 배양 및 이식의 과정은 도 2에 나타내었다. 체중 250-270 g의 10 마리의 수컷 Sprague-Dawley 종 랫트(rat)을 사용하였다. 랫트(rat)의 흡입 마취 유도는 아산화 질소와 산소 혼합물(75:25)(Air Liquid America, Houston, TX)에서 3% 이소플루란(isoflurane)으로 채워진 유도 챔버에 의해 마취되었다. 마취 후 랫트(rat) 외과 수술 부위의 털을 제거 및 소독하고 랫트의 복부를 절개하였다.

복부를 절개하여 장막(omentum)을 꺼냈다. 스캐폴드(인공식도)를 장막(omentum)으로 감싸고 4-0 Vicryl suture(Ethicon, Inc., Somerville, NJ)로 봉합하였다. 장막(omentum) 배양 2 주 후, 이식편을 포함한 장막(omentum)일부를 적출하였다. 페니실린 G(200 units per mL)가 함유된 생리 식염수로 세척하여 장막 배양된 스캐폴드(인공 식도)를 준비하였다.

장막 배양된 스캐폴드(인공 식도)의 이식

2 주간의 장막(omentum) 배양 된 스캐폴드를 식도결손 부위에 인공식도를 대체 이식하였다. 이 스캐폴드(인공식도)를 랫트(rat)의 목 중앙을 종으로 절개하여 기도와 식도를 노출시켜 식도의 경부를 부분 절개하였다. 이때 띠근육(strap muscle) 한면을 남겨 스캐폴드(인공식도)와 같이 봉합시켜 움직임을 도왔다(도 3 참조, 도 3은 장막(omentum)에 이식하는 방법을 나타낸 도면으로, (A) 장막(omentum)이 복강으로부터 나옴, (B) 스캐폴드는 장막(omentum)의 하단 부분에 삽입하고 4-0 Vicryl로 봉합, (C) 이식 2 주 후, 장막 조직이 배양, (D) 식도의 경부에 이식).

[실험예]

스캐폴드의 특성(Characterization)

스캐폴드의 단면 형태는 춘천 한국 기초 과학 연구소에서 저 진공 모드에서 환경 주사 전자 현미경(E-SEM, S-3500N, Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 조사되었다. 이전에 카본 테이프에 PCL 스캐폴드 붙여서 준비하고 음이온 스퍼터(Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하여 15 mA에서 30 초간 두 번 연속하여 은/팔라듐(10 nm)으로 코팅하여 주었다. 코팅된 각 샘플은 가속 전압 10KV 및 1K의 배율하에서 촬영하였다.

프린트 된 PCL 링의 평균 외경 및 내경은 각각 2119㎛ 및 1577㎛이고, 평균 두께는 261㎛ 이었다. 전기 방사법으로 제조된 나노 섬유는 평균 섬유 직경이 2.69 ± 2.41㎛이고 평균 기공 크기가 5.13 ± 3.31㎛ 이었다. 평균 전기 방사(피막층) 두께는 281㎛이었다(하기 표 1 참조). 주사 전자 현미경(SEM)을 이용하여 PCL 스캐폴드의 단면 및 표면 형태를 조사하였다. 도 4는 나노 섬유의 표면 형태 및 단면 이미지를 나타낸 것이다. PCL 링이 있는 스캐폴드(인공식도)로 구성되었다. 스캐폴드(도 4)의 단면 이미지에서 나노 섬유 구조와 다공성 구조를 명확하게 관찰할 수 있었다. 이 높은 다공성은 세포가 스캐폴드 위에 이동할 때 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.

[표 1]

스캐폴드의 기계적 성질

기계적 성질은 Universal Testing Machine(QM100S, Qmesys, Korea)을 사용하여 측정하였다. 측정 환경은 지그 헤드 속도 5 mm/min에서 최대 하중 10 kgf로 고정하였으며, 측정 샘플은 외경이 2614㎛이고 두께가 500㎛인 원통형 스캐폴드로 수행되었다. 각 측정 샘플은 3개의 건조표본과 3개의 습한 표본으로 인장강도가 측정되었으며, 샘플 측정시에 온도와 습도는 25℃, 65% RH로 설정하였다.

PCL 스캐폴드의 최대 신장률은 각각 축 방향, 축의 수직 방향을 측정하였다. (축 방향)최대 인장 강도는 359 gf이고 연신율은 1032 ± 60.7 % 로 측정되었다. (축 방향에 수직)최대 인장 강도는 982gf이고 연신율은 1543 ± 94.2 %로 측정되었다. 또한, 정상적인 랫트(rat) 식도 최대 신장률도 같은 방법으로 측정하였다. (축 방향)최대 인장 강도는 678gf이고 연신율은 764 ± 41.01이고, (축 방향에 수직)최대 인장 강도는 229gf이고 연신율은 764 ± 97.58 %로 측정되었다(하기 표 2 및 도 5 참조). 이 값에 기초하여 스캐폴드(인공식도)는 높은 연신율이 나타나는 것으로 보아 자연 식도의 특성이 잘 모방 되었음을 나타낸다.

[표 2]

스캐폴드의 세포 독성 분석(Cytotoxicity assay)

세포의 독성 분석은 랫트의 섬유 아세포(NIH 3T3)를 스캐폴드 위에 배양하고 CCK-8(Enzo Life Sciences, USA) 분석법을 사용하여 평가하였다. 샘플을 96-웰 플레이트의 바닥에 부착하기에 적합한 크기로 생검-펀처(Kasco, Keys Cutaneous Punch, Sialkot, Pakistan)로 외경 6mm의 원형 디스크로 균일하게 절단하였다. 샘플을 70 % 에탄올에서 30 분 동안 멸균하고, PBS로 2 회 세척하고 10 % 태아 소 혈청(Welgene Fresh mediaTM) 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle Medium)에 침지하였다. 마지막으로 스캐폴드의 세공에 DMEM이 잘 스며들도록 진공 혼합(vaccum mixing)하였다. 스캐폴드 위에 세포(20,000 cells / well)가 함유된 DMEM 100㎕를 파종하였다. 세포를 1 일, 7 일 및 14 일 동안 배양하였다. 세포 배양시 배지는 매 48 시간마다 교체하였다. 필요한 시간만큼 배양 후, 세포-결합 스캐폴드(인공식도)를 1.5ml 튜브로 옮기고, CCK-8 용액(1:10의 비율로 오리지날 CCK-8 용액과 혼합된 DMEM) 200㎕로 처리하였다. 이 튜브를 37℃에서 2시간 동안 배양하여 살아있는 세포와 반응하게 하였다. 적색 CCK-8 용액을 각각의 샘플로부터 수득하고, 이를 96-웰 플레이트에 넣어 분광 분석(spectrophotometric analysis)을 450 nm에서 판독할 수 있는 ELISA 마이크로 플레이트 리더(분자 장치, SpectraMax^® 플러스 384)로 실시하였다. 대조군은 아무것도 없는 1:10의 비율로 DMEM과 혼합 한 CCK-8 용액으로 설정하였다.

도 6은 1 일, 7 일 및 14 일 배양 후 CCK-8 분석으로 얻은 데이터를 나타낸 것이다. 렛트 섬유 아세포(NIH 3T3)는 점차적으로 세포가 증식됐고, 이는 다공성 스캐폴드(인공식도)가 세포 증식에 유리한 환경임을 의미한다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 렛트 섬유 아세포(NIH 3T3)의 성장은 1 일에서 14 일까지 기하 급수적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이 결과는 제조된 스캐폴드에 세포 독성이 관찰되지 않았음을 의미한다.

장막 배양된 스캐폴드(인공 식도) 관찰, 이식 후 절차 및 조직 검사

장막(omentum) 배양 2 주 후, 이식편을 포함한 장막(omentum)일부를 적출하였다. 이식편은 감염이나 협착이 없었고, 관 모양의 구조를 유지하였다. 장막-배양된 인공 식도는 스캐폴드의 안쪽과 바깥쪽에서 장막(omentum)에서의 조직 재생이 관찰되었다. 재생된 스캐폴드의 표면 정렬은 대칭적이고 외과적 문합술에 최적이었다(도 7 참조).

2 주간의 장막(omentum) 배양된 스캐폴드를 랫트(rat)의 식도결손 부위에 대체 이식 후 3 일째부터 동물에게 액체 음식을 주었다. 이식 1주 및 2주 후에 적출했다. 이식 1주와 2주 후 적출한 대부분의 랫트(rat)에서 천공, 누공, 혈종 축적, 농양 형성 또는 주변 연조직 괴사에 대한 증상은 없었다(도 7 참조, 도 7은 재건된 스캐폴드(인공식도)의 외관(A, B)과 인공 식도 이식 후의 형태(C), 이식 2주 후 재건된 식도 구조물의 형태(D)를 나타낸 것이다).

인접한 식도 조직과의 스캐폴드(인공식도)를 4% 파라포름 알데히드에 고정시키고 증가하는 비율의 에탄올(70, 80, 90 및 100%(v/v))을 함유하는 용액에서 점진적으로 탈수시키며, 자일렌(Xylene)으로 세척하고, 조직학적 분석을 위해 파라핀에 포매하였다. 이후 파라핀 블록을 7㎛ 두께로 절단하고, 슬라이드(slide)에 올려 탈 파라핀화하고, hematoxylin-eosin(H&E) 및 Verhoeff's van Gieson Stain 및 Masson Trichrome(MT)으로 염색하였다. 이렇게 염색한 장막-배양(omentum-cultured)된 스캐폴드(인공식도)를 축 방향 및 길이 방향 단면에 대한 조직학적 결과를 확인하였다. 염증 세포와 섬유 아세포의 혼합물은 스캐폴드의 내부와 외부에 침투하였다. 숙주 세포는 스캐폴드(인공식도)의 안쪽과 바깥쪽에서 스캐폴드(인공식도)를 따라 자랐다. 스캐폴드(인공식도)의 바깥쪽 조직에서 몇 개의 새로 혈관이 형성되는 것을 관찰할 수 있었는데, 이를 통해 조직 재생 과정을 확인 할 수 있었다(도 8 참조 : 도 8은 장막-배양된 스캐폴드(인공식도)의 hematoxylin-eosin 염색한 조직학적 결과를 나타낸 도면으로, (A) 축 방향, (B) 종 방향을 나타낸다. 숙주 세포는 스캐폴드의 내부(C)와 외부(D)에서 스캐폴드(인공식도)를 따라 자랐다. (E) 스캐폴드의 바깥쪽에 새로 발달된 혈관은 조직 재생 과정을 나타내었다.). 이식 2주 후에 적출한 스캐폴드(인공식도)를 hematoxylin-eosin(H&E)으로 염색한 부분의 조직학적 결과는 스캐폴드(인공식도)와 재생 조직의 수술부위가 완전히 치유 되었음을 볼 수 있었다.

슬라이드에 올린 조직을 혈소판 내피 세포 접착 분자(CD31 / PECAM-1) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현 확인을 위해 조직 절편을 탈 파라핀화 했다. 사용한 1 차 항체(Abs)는 1 : 100으로 희석 한 CD31/PECAM-1(Novus)과 1 : 100으로 희석한 VEGF(Santa Cruz)였다. 2 차 항체(Abs)로는 IgG-Alexa Fluor 488(1 : 200 희석, Invitrogen)을 사용하고 DAPI를 대조 염색에 사용하였다.

DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) / F-Actin의 병합된 이미지는 세포가 스캐폴드(인공식도)의 내벽 / 외벽을 따라 자라 들어간 것을 나타낸다(도 9 참조 : 도 9는 장막-배양된 스캐폴드(인공식도)의 면역조직화학을 나타낸 도면이다. DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)염색, F-Actin에 대한 Rhodamine phalloidin 염색, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)/F-Actin 병합된 이미지.).

이렇게 구조적 완전성은 자라 들어간 숙주 세포가 스캐폴드(인공식도)에 부착되어 유지되었다. 경미한 염증 반응만이 있었다. 결손된 식도의 주변부에서 편평상피와 연조직의 재생이 있었는데, 이 상피 재생은 PCL 링을 따라 양쪽의 두 식도에서 시작되었지만, 인공식도의 중심부분은 상피화되지 않았다.

층 구조를 가진 인공 식도의 모든 부위에서 엘라스틴과 콜라겐 섬유 침착이 관찰되었다. 조직의 재생은 기존 식도에서 시작하여 인공 식도의 양쪽 끝에 연결되었다(도 10 참조 : 도 10은 스캐폴드 이식 2주 후 hematoxylin-eosin(H&E) 염색된 절편(A, B, C)에 대한 조직학적 결과를 나타낸 도면이다. (A) 2주차에 PCL 링이 확인되었고, 인공식도 구조물에서 2 주까지 결합부위의 치유를 보였다. 경미한 염증 반응 및 최소의 과립(granulation) 조직 형성이 관찰되었다. (B) 스캐폴드의 바깥쪽에 새로 형성된 혈관은 조직 재생을 나타낸다. 점선은 장막-배양된 스캐폴드(PCL)와 스캐폴드를 덮는 재생 조직 사이의 경계를 나타낸다. (C) 편평상피와 연조직 재생이 식도 결손부위 주변에서 일어났다. Verhoeff 's van Gieson Stain(D, E, F, G)과 Masson trichrome(H, I, J, K)절편에 대한 조직학적 분석을 나타낸다. PCL 링이 존재하는 인공 식도의 모든 부분에서 엘라스틴(적색 화살표)과 콜라겐(검은색 화살표) 섬유 침착이 관찰되었다. 조직 재생은 자연 식도에서 시작하여 인공 식도의 양쪽 끝에 연결되고, 점선은 PCL 링을 나타낸다.).

여기서 콜라겐과 엘라스틴은 세포 외 기질의 두 가지 중요한 구조 단백질로 최적의 기계적 특성에 기여한다. DAPI / CD31과 DAPI / VEGF의 병합 이미지는 이식 된 스캐폴드(인공식도)에 새로운 혈관 형성을 나타낸다(도 11 참조 : 도 11은 이식된 스캐폴드의 면역조직화학을 나타낸 도면이다. DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 염색(A, D), 혈소판 내피 세포 부착 분자(CD31 / PECAM-1)(B), 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 염색(E), 병합이미지 DAPI/CD31(C), DAPI/VEGF(F)는 이식된 스캐폴드(인공식도)에 신생 혈관이 형성되었음을 나타낸다(흰색 화살표).).

본 명세서에서는 본 발명자들이 수행한 다양한 실시예 가운데 몇 개의 예만을 들어 설명하는 것이나 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고, 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

Claims

링 형상의 바디부;
바디부의 표면에 형성된 다공성의 피막층; 및
바디부 및 피막층의 표면에 형성되고, 장막(omentum) 조직으로 이루어진 코팅층;을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공 식도.
제1항에 있어서, 바디부는,
소정의 간격으로 이격된 복수 개로 이루어진 것을 특징으로 하는, 인공 식도.
제1항에 있어서, 바디부는,
폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는, 인공 식도.
제1항에 있어서, 피막층은,
폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는, 인공 식도.
원통형의 지지관에 링 형상의 바디부를 형성하는 제1단계;
바디부의 표면에 미세섬유 형태로 분사하여 다공성의 피막층을 형성하는 제2단계;
지지관을 제거하는 제3단계; 및
장막(omentum) 조직에서 배양하여 코팅층을 형성하는 제4단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공 식도 제조방법.
제5항에 있어서, 제1단계는,
소정의 간격으로 이격된 복수 개의 바디부를 형성하는 것을 특징으로 하는, 인공 식도 제조방법.
제5항에 있어서, 제1단계의 바디부는,
폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는, 인공 식도 제조방법.
제5항에 있어서, 제2단계의 피막층은,
폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone), PCL), 폴리(L-락티드 산)(poly(L-lactic acid), PLLA), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide), PLGA), 폴리(글리코릭 산)(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(poly(L-lactide-co-caprolactone, PLLC)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는, 인공 식도 제조방법.
제5항에 있어서, 제4단계는,
장막(omentum) 조직에서 2주간 배양하는 것을 특징으로 하는, 인공 식도 제조방법.