WO2017209521A1 - 세포배양용 또는 조직공학용 지지체 - Google Patents

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cells
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cell culture
tissue engineering
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구송희
장선호
서인용
김찬
이승훈
소윤미
이지현
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    • D10B—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBLASSES OF SECTION D, RELATING TO TEXTILES
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Definitions

  • the present invention relates to a support, and more particularly, to implement a microenvironment suitable for the movement, proliferation, and differentiation of cultured cells, thereby improving the survival rate of the cells, and support for cell culture or tissue engineering for easy separation of cultured cells. It is about.
  • Cell culture is a technique for harvesting cells from living organisms and culturing them in vitro, and cultured cells are differentiated into various tissues of the body such as skin, organs, and nerves, and then transplanted into the human body before transplantation or differentiation. At the same time can be used to treat a variety of diseases.
  • Tissue engineering is related to cell culture and is a multidisciplinary study that applies existing scientific fields such as cytology, life science, engineering, and medicine, and the correlation between structure and function of biological tissues. New fusion techniques have been studied to understand and to replace and regenerate damaged tissues or organs with normal tissues.
  • One of the tasks continuously received in the field of cell culture or tissue engineering using the same, and one of the research / development tasks is the material of a support that can be cultured / differentiated and implanted into human tissue with the cells, It is a study on the structure. That is, in order to examine the effect of a specific substance on the human body, the toxic reaction experiment of the specific substance using the cultured cells is more similar to the reality than when the cultured / differentiated cell population is made into a three-dimensional structure similar to the actual human cell structure. It may be suitable as an in vitro cytotoxicity test model.
  • transplanted cells or tissues may fully function and play a role when cultured / differentiated cell aggregates or tissues are transplanted into a three-dimensional structure similar to the actual tissues of the human body. .
  • the cell culture scaffolds developed to date are not suitable for in vitro experimental models or transplanted cells through the cultured cells because the cells are not cultured in a structure similar to the body and the cell survival rate is not high. .
  • the present invention has been made in view of the above, and an object of the present invention is to provide a support for cell culture or tissue engineering by improving a cell proliferation rate and survival rate by implementing a microenvironment suitable for movement, proliferation, and differentiation of cultured cells.
  • the present invention is another object to provide a support that is more suitable for the use of cell culture and tissue engineering as it can be transplanted in the body with the cultured cells.
  • the present invention has another object to implement the support according to the invention to various products used in the field of cell culture or tissue engineering, such as bioreactor, cell culture vessel, body transplant kit.
  • the present invention provides a support for cell culture or tissue engineering comprising a fibrous web of a three-dimensional network structure formed by including a support fiber.
  • the fiber web may have an average pore diameter of 0.05 to 10 ⁇ m and a porosity of 40 to 90%.
  • the support fiber may have an average diameter of 100nm ⁇ 3 ⁇ m.
  • the thickness of the fibrous web may be 1 ⁇ 20 ⁇ m
  • basis weight may be 1 ⁇ 30g / m2.
  • the fibrous web may include a plurality of supporting fibers, and may satisfy the following conditions (1) and (2).
  • the dispersion coefficient (E) of the diameter of the supporting fibers in the diameter distribution is 8 to 25%, and (2) the air permeability of the fiber web is 1 to 40 cfm.
  • a value according to the following equation (1) may be 1.5 ⁇ 6.8.
  • the value according to Equation 2 may be 1.0 ⁇ 5.5.
  • the support fibers are PCL (polycaprolactone), PDO (polydioxanone), PLLA (poly (L-lactide)), PLGA (poly (DL-lactide-co-glycolide)), PEO (polyethylene oxide), PLA (Polylactic acid) )
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the support fibers are polystyrene (polystyrene), polyethylene terephthalate (PET), polyethersulfone (PES), polyvinylidene fluoride (PVDF), polydimethylsiloxane (PDMS), polyamide, polyethylene and polyethylene oxide-polypropylene oxide block copolymer
  • At least one non-biodegradable component selected from the group consisting of may comprise as a fiber forming component.
  • the present invention also provides a bioreactor comprising a support according to the invention and a housing having the support therein.
  • the present invention also provides a cell culture vessel comprising a support according to the present invention.
  • the present invention provides a kit for transplantation comprising a support according to the invention and a cell aggregate cultured, including the outer and inner spaces of the fibrous web of the support.
  • Amino acid sequences used in the present invention are abbreviated as shown in Table 1 according to the IUPAC-IUB nomenclature.
  • Naming IUPAC-IUB sign Abbreviation Naming IUPAC-IUB sign Abbreviation Naming IUPAC-IUB sign Abbreviation Naming IUPAC-IUB sign Abbreviation Alanine A Ala Glycine G Gly Proline P Pro Arginine R Arg Histidine H His Serine S Ser Asparagine N Asn Isoleucine I Ile Threonine T Thr Cysteine C Cys Lysine K Lys Tryptophan W Trp Glutamic acid E Glu Methionine M Met Tyrosine Y Tyr Glutamine Q Gln Phenylalanine F Phe Valine V Val
  • ECM Extracellular matrix
  • the "motif” of the present invention may be included in proteins, glycoproteins, etc. in the extracellular matrix that play an important role in cell adhesion, migration, and differentiation, and may structurally and functionally interact with receptors provided to penetrate the surface or the membrane of the cell membrane.
  • Peptides containing amino acid sequences including those that have been isolated intracellularly or artificially produced using the gene cloning technique.
  • 3D cell cluster of the present invention refers to a shape in which cells are collected in three dimensions, and cell-cell interactions are caused by expression of gap junction proteins such as cadherin and connexin. Refers to an artificially formed cell population that is similar to living tissue. Compared with the two-dimensional cultured cells, the three-dimensional cell population includes multiple cells, and the two-dimensional cultured cells are monolayer cells, and the three-dimensional cell population has more cells per unit area than the two-dimensional cultured cells.
  • the support is provided with a microenvironment suitable for the movement, proliferation and differentiation of the cultured cells, the cell proliferation rate and survival rate can be improved.
  • the support can be easily removed without physical / chemical stimulation to the cells cultured in the support, so that the cultured cells can be easily recovered, and the body can be transplanted with the cultured cells.
  • the shape / structure of the cultured cells can be cultivated similarly to the actual animal body so that the cultured cells are more suitable for application to in vitro experimental models or for transplantation into animal bodies.
  • the support according to an embodiment of the present invention can be further improved cell proliferation and survival as it is modified with a material that helps cell culture / differentiation, the cells to be cultured can be easily implemented in three-dimensional shape. Accordingly, it is very suitable for use in the field of cell culture and tissue engineering, and can be widely applied to various products in the art.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view and a partially enlarged view of a fibrous web included in a support according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2 is a partially enlarged cross-sectional view of the long axis direction of the support fiber included in an embodiment of the present invention
  • Figure 2a to 2d is an adhesive bioactive component and / or non-adhesive provided on the inside / outside of the support fiber Drawings for various embodiments of the arrangement of the bioactive component
  • Figure 3 is a view showing the adhesive fibers and non-adhesive bioactive components provided on the support fiber and its surface included in an embodiment of the present invention
  • Figure 3a is an adhesive bioactive to a portion of the support fiber surface
  • Figure 3b is a partial perspective view showing the case where the non-adhesive bioactive component is fixed to the adhesive bioactive component after the component is disposed
  • Figure 3b is coated with the adhesive bioactive component on the support fiber surface
  • coated adhesive physiological Cross-sectional view showing a case where a non-adhesive bioactive component is coated on an active ingredient
  • Figure 4 is a graph showing the cumulative number of supporting fibers by diameter of the distribution of the support fibers included in an embodiment of the present invention
  • 5 to 7 is a SEM photograph of the fiber web included in an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 8 and 9 show SEM photographs of the primary cultures of cells cultured on a support for cell culture according to an embodiment of the present invention.
  • the shape of one configuration shown in the drawings is not limited to the shape shown in the drawings.
  • the shape of the adhesive physiologically active ingredients 111b 1 and 111b 2 is illustrated as a yarn, but this is the positional relationship between the adhesive physiologically active ingredients located inside / outside the fiber.
  • the shape may differ from the actual adhesive bioactive component.
  • the shape of the adhesive bioactive component is expressed as a yarn, as shown in FIG. 2A, the adhesive bioactive component 111b 1 is shown to be spaced apart from the outer surface of the support fiber 111, but is not limited thereto. It will be understood that the bioactive component 111b 1 includes a case of partially covering the outer surface without being spaced apart from the outer surface of the support fiber 111.
  • a support includes a fibrous web 100 including a support fiber 111.
  • the fibrous web 100 may form a three-dimensional network structure with at least one strand of support fiber.
  • the fibrous web formed by including one strand of support fibers may form a three-dimensional network structure through one strand of support fibers being folded / arranged a plurality of times without any direction.
  • the fibrous web 100 may include a plurality of supporting fibers to form a three-dimensional network structure by arranging and stacking each supporting fiber independently without defining folding and / or fiber length directions.
  • adhesion or fusion may occur between different surfaces in the single-stranded support fiber and / or surfaces of different support fibers, which makes the three-dimensional network structure structurally more complicated and the cells loaded on the support are three-dimensional network. It may migrate / proliferate into the pores formed into the structure and may be advantageous for culturing the cells into a cell population having a three-dimensional shape / structure.
  • the average pore size of the fibrous web 100 is preferably provided so as to secure a space enough for the cells to move and proliferate in the pores inside the fibrous web, and the diameter of the fibrous web may be determined according to the specific type of the cultured cell. Therefore, this invention does not specifically limit about this. However, preferably, the average pore size may be 0.05 to 50 ⁇ m, and more preferably 0.05 to 10 ⁇ m. If the mean pore size is less than 0.05 ⁇ m, when the cells to be cultured proliferate, they can migrate and proliferate in plan through the outer surface of the fibrous web, rather than moving to the pores inside the fibrous web. May not be cultured.
  • the cells moved into the inner space may be killed or proliferation may be reduced.
  • the average pore size exceeds 50 ⁇ m, the movement of cells into the internal space of the fibrous web and the passage of the culture solution may be good, but the cells to be cultured may be separated out of the fibrous web together with the culture solution passing through the fibrous web.
  • the increase of such detached cultured cells is difficult to culture into a cell population having a desired conformation.
  • the fibrous web 100 may have a porosity of 40 to 90%, thereby making it easier to form a three-dimensional cell population through the cells to be moved and proliferated into the fibrous web, and to the pores inside the fibrous web.
  • a porosity 40 to 90%
  • the fibrous web 100 may have a porosity of 40 to 90%, thereby making it easier to form a three-dimensional cell population through the cells to be moved and proliferated into the fibrous web, and to the pores inside the fibrous web.
  • the porosity is less than 40%, it is difficult to form a three-dimensional cell population, and may cause death of cells moving and proliferating into the fibrous web.
  • the porosity exceeds 90%, the support may collapse during cell culture due to the weakening of the mechanical strength of the support.
  • the fibrous web 100 may have an average thickness of 1 to 100 ⁇ m, preferably 1 to 50 ⁇ m, more preferably 1 to 20 ⁇ m.
  • the fiber web 100 may have a basis weight of 0.1 ⁇ 30g / m2. If the thickness of the fibrous web is less than 1 ⁇ m and / or the basis weight is more than 30 g / m 2, the cultivation of a three-dimensional cell population is difficult and / or the support as the space inside the fibrous web becomes narrow or the total volume is reduced. The amount of cell populations that can be obtained can be reduced.
  • the fiber web thickness is less than 1 ⁇ m and / or basis weight is less than 0.1 g / m 2, the mechanical strength of the support may be reduced.
  • the thickness of the fibrous web exceeds 100 ⁇ m the culture solution mobility in the thickness direction of the fibrous web is lowered, which may cause the growth of the cells cultured in the fibrous web, there is a fear of death.
  • the support fiber 111 forming the above-described fibrous web 100 may be used without limitation in the case of known polymer compounds that can be implemented in a fiber shape as a fiber forming component, for example, biodegradable components or non-biodegradable Contains ingredients.
  • the material of the support is provided as a biodegradable component
  • the cells cultured / proliferated / differentiated on the support can be transplanted into the body by separately including the support, and the implanted support can be cultured in the body immediately after transplantation.
  • the convenience of treatment can be greatly increased by not requiring a separate surgery / treatment to remove the scaffold after implantation.
  • the material of the biodegradable component is hydrophilic in nature, it is highly decomposable by water.
  • the water which can be used as a solution for dissolving the support in the process of dissolving and collecting the cultured cells by dissolving the support using this point is Since there is little irritation to the cells, there is an advantage that little to no physical / chemical damage to the cultured cells.
  • the mechanical strength is superior to that of the biodegradable support fiber, thereby stably culturing the cells.
  • the biodegradable component is very difficult compared to the non-biodegradable component to form a fibrous web having a desired structure through electrospinning or the like, the non-biodegradable component is more advantageous in terms of handling and stable radioactivity, and thus The pore diameter, porosity and the like can be easily manufactured fiber web implemented.
  • the support fiber 111 includes a biodegradable fiber forming component
  • a compound known as a biocompatible component may be used without limitation in order to minimize toxicity to cells while having biodegradable properties.
  • the support fiber according to an embodiment of the present invention should be implemented to have a diameter of the nano-sized, for this purpose the support fiber can be produced by electrospinning, in this case the biodegradable fiber forming component is electrospun It is preferable to use a compound which further has properties suitable for.
  • the biodegradable fiber forming component is polycaprolactone (PCL), polydioxanone (PDO), poly (L-lactide) (PLLA), poly (DL-lactide-co-glycolide) (PLGA), polyethylene oxide (PEO) It may include, but is not limited to, any one or more selected from the group consisting of PLA (Polylactic acid) and PVA (polyvinyl alcohol).
  • PCL polycaprolactone
  • PDO polydioxanone
  • PLLA poly (L-lactide)
  • PLGA poly (DL-lactide-co-glycolide)
  • PEO polyethylene oxide
  • PLA Polylactic acid
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the support fiber 111 includes a non-biodegradable fiber-forming component
  • a compound known as a biocompatible component may be used without limitation, while having non-biodegradable properties and minimizing toxicity to cells.
  • the non-biodegradable support fiber should be implemented to have a diameter of nano-size, for this purpose, the support fiber can be produced by electrospinning, in this case the non-biodegradable fiber It is preferable to use the compound which has further a characteristic suitable for electrospinning for a formation component.
  • the non-biodegradable fiber forming component is polystyrene (polystyrene), polyethylene terephthalate (PET), polyethersulfone (PES), polyvinylidene fluoride (PVDF), polydimethylsiloxane (PDMS), polyamide, polyethylene and polyethylene oxide- Any one or more selected from the group consisting of polypropylene oxide block copolymers may be included as a fiber forming component, but is not limited thereto.
  • the support fiber is not particularly limited to the present invention as the diameter can be determined to implement the pore size, porosity, basis weight, etc. in consideration of the cell size according to the desired culture cell type.
  • the support fiber may have an average diameter of 10 nm to 100 ⁇ m, preferably 100 nm to 50 ⁇ m, more preferably 100 nm to 10 ⁇ m, and more preferably 100 nm to 3 ⁇ m. Can be. If the average diameter of the support fiber is less than 10nm, the mechanical strength of the fiber web can be significantly reduced, if the average diameter exceeds 100 ⁇ m to prepare a fiber web having the desired porosity, the surface area of the support fiber It can be difficult.
  • the cells in order to cultivate cells in three dimensions, the cells penetrate and culture not only the surface of the support but also the internal space of the support, and ultimately infiltrate into the internal space and contact between the cultured cells and the cells cultured on the surface.
  • Cell populations may be formed.
  • the three-dimensional culture of the cells can be induced by the surface morphology of the cell culture (or tissue engineering) support.
  • the surface roughness may be large so that the morphology of the surface of the cell culture support is not flat and is uneven.
  • the uneven surface shape of the cell support includes, for example, a plurality of recesses and / or convex portions.
  • the cells may be more easily and firmly seated in the spaces between the convex portions or the grooves of the recesses. There is an advantage that can significantly reduce the number of cells detached from the cell support.
  • the fibrous web is a plurality of biodegradable support fibers And the following condition (1) and condition (2) can be satisfied.
  • the diameter dispersion coefficient (E) of the support fibers may be 8 to 25%.
  • the diameter dispersion coefficient (E) is a parameter for estimating how close or wide the support fibers are to the average diameter when the average diameter is a predetermined diameter in a distribution chart based on the diameter of the support fibers. Equation 3 can be calculated.
  • the diameter dispersion coefficient (%) according to Equation 3 is 0% means that the standard deviation is 0, which means that the diameters of the plurality of support fibers included in the fibrous web are all identical to the average diameter.
  • an increase in the diameter dispersion coefficient means that the number of support fibers having a larger diameter and / or smaller diameter than the average diameter among the plurality of support fibers included in the fibrous web increases.
  • the support according to an embodiment of the present invention has a plurality of recesses and / or as described above, as the dispersion coefficient for the diameter of the biodegradable support fibers according to condition (1) at a predetermined average diameter satisfies 8 to 25%. It may be easier to implement a support for cell culture having a bumpy surface morphology such as a convex portion disposed. However, if the dispersion coefficient is excessively large, the increase in basis weight to thickness may be large, and thus, the average pore size and air permeability may be greatly reduced, and it is difficult to enter the cell culture medium into the support, or it may be difficult to exchange the cells in the support. Culture may be difficult and cell culture efficiency may be reduced.
  • the smooth surface morphology is advantageously expressed as the uniformity of the support diameter is increased, and the uniformity of pore size is also increased, but the seeded cells are located along the surface rather than three-dimensionally. If the dimensional culture or the average diameter of the support fiber is large, the pore structure with a large average pore size is generated, so that the seeded cells may be detached. In addition, if the dispersion coefficient for the diameter exceeds 25%, the average pore size of the support becomes very small as the nonuniformity with respect to the support diameter is increased in the support having a smaller average diameter, which causes inflow of the cell culture fluid into the support. The exchange may be difficult and there is a fear that the cells may be cultured along the surface rather than in three-dimensional culture.
  • the air permeability of the fibrous web may be 1 ⁇ 40cfm.
  • One of the important factors in growing cells in three-dimensionally on a cell culture support is whether it is possible to continuously supply the materials necessary for cell culture. Cells placed adjacent to the support when cells are grown in three dimensions on the surface of the cell culture support, or cells located in the exposed part of the cell population in the case of cells that penetrate and settle into the space of the cell culture support. B. It may be difficult to contact the cell culture fluid smoothly compared to cells located on the surface of the cell culture support.
  • the material of the above-mentioned support fiber is a biodegradable component
  • the biodegradable component may be decomposed by continuous contact such as moisture. However, when moisture and the like are difficult to move into the support, degradation of the biodegradable component may be delayed and it may be difficult to separate the cultured three-dimensional cell population from the support.
  • the air permeability of the fiber web may be 1 ⁇ 40cfm. If the air permeability is less than 1.0 cfm, it may be difficult for the cells to penetrate into the support, and the passage of a component capable of dissolving the cell culture fluid or the biodegradable component may not be smooth. In addition, if the air permeability exceeds 40cfm, a fibrous web of which the mechanical strength of the fibrous web is remarkably low or the diameter and thickness of the fineness of the supporting fibers is remarkably large can be realized, thereby increasing the weight of the support and limiting small It may be difficult to apply to a volume incubator, and it may be difficult to culture in the desired amount due to the detachment of the seeded cells.
  • the fibrous web 100 may further satisfy condition (3) and / or condition (4).
  • the value according to Equation 1 in the diameter distribution of the biodegradable support fibers may be 1.5 ⁇ 6.8, through which the cells seeded in the fibrous web 100 of the fibrous web It is possible to more easily penetrate into the inner space, and more easily implement a fibrous web implemented with a surface having a non-flat surface, the support surface morphology can be more suitable for the culture of three-dimensional cell population.
  • the quadrant number a is a / 4th obtained by arranging a plurality of biodegradable support fibers included in the fibrous web in diameter order and dividing the total number of biodegradable support fibers corresponding to the total frequency by four equal parts.
  • the first quartile means the diameter of the supporting fiber corresponding to the fourth quarter of the total number of supporting fibers in the diameter distribution diagram
  • the third quartile means the first quartile means the whole diameter in the diameter distribution diagram. It means the diameter of the support fiber corresponding to the third quarter of the number of support fibers. For example, when the number of supporting fibers is 15, the position of the first quartile means the supporting fiber having the fourth largest diameter, and the number of the first quartet means the diameter of the supporting fiber at that time.
  • the median (second quartile) position corresponds to the first quartile position between the fifth and sixth support fibers, and the first quartile is 5 It is calculated as the average of the first and sixth support fibers.
  • the cells according to Equation 1 for the first quartile, the third quartile and the maximum diameter value of the plurality of support fibers included in the fibrous web satisfy 1.5 to 6.8, so that the seeded cells are not only supported on the surface of the support but also into the support It may be easier to implement an infiltrated, uneven support surface morphology, which may be suitable for culturing a three-dimensional cell population. If the value according to Equation 1 is less than 1.5, it may be difficult to cultivate the desired three-dimensional cell population, such that the seeded cells may be two-dimensionally cultured on the surface of the cell culture support.
  • the diameter distribution of the support fiber becomes very wide and thus it may be difficult to implement the support with the desired predetermined pore diameter, and there may be large pores in the support so that the seeding Cultivation of the desired three-dimensional cell population may be difficult, for example, there is a possibility that the cells are easily detached from the support to the outside.
  • the macropores refer to pores having a diameter 10 times larger than the diameter of the seeded cells.
  • the value according to the following equation (2) in the diameter distribution of the supporting fibers may be 1.0 ⁇ 5.5, through which the cells seeded in the fibrous web 100 is the internal space of the fibrous web It is possible to more easily penetrate into, and to more easily implement the fibrous web implemented with a surface that is not flat surface support morphology described above, it can be more suitable for the culture of three-dimensional cell population.
  • the value according to Equation 2 is less than 1.0, a fibrous web having a flat surface morphology can be realized, so that the seeded cells can be cultured two-dimensionally on the surface of the cell culture support. This can be difficult.
  • the value according to Equation 2 exceeds 5.5, the diameter range of the support fiber having the smallest diameter among the support fibers and the support fiber corresponding to the first quartile is widened. This can be high, and thus the pore rate of small pore increases, so that the seeded cells can be difficult to penetrate and culture into the cell culture support.
  • the cell culture support is implemented to satisfy the above condition (3) and condition (4) simultaneously, the movement and proliferation of the cells are increased in the fibrous web, and the surface morphology is unplanarized to simultaneously increase the cell surface and the inside of the cell.
  • the three-dimensional culture at the same time increases the permeability of the culture solution has the advantage of promoting the culture of cells proliferating in the inside and prevent death.
  • the above-described fibrous web 100 may further include a bioactive component fixed to at least a portion of the support fiber surface.
  • the meaning of at least some of the biodegradable support fibers includes all of some of the support fibers of one strand and / or some of the plurality of support fibers.
  • the surface of the support fiber included in the fibrous web according to an embodiment of the present invention is provided on the support in a state in which the physiologically active component is fixed, and the physiologically active component in the cultured cells located on the support fiber or in the space surrounded by the support fiber.
  • the bioactive component may be a component that induces any one or more of cell adhesion, migration, growth, proliferation and differentiation.
  • the adhesive bioactive component which is a component that enhances the adhesion of cells among the biologically active components, is used to initially fix the cultured cells on the cell support and to prevent the cells loaded on the culture solution from floating.
  • the non-adhesive bioactive component involved in migration, growth, proliferation and differentiation can be fixed on the support fiber to prevent detachment from the support fiber during cell culture on the support fiber.
  • the adhesive bioactive component may be used without limitation in the case of a known adhesive bioactive component which does not generate cytotoxicity due to conventional biocompatibility, but preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 It may include one or more selected from the group consisting of a protein made by repeating 20 to 20 times and at least two of these proteins fused protein, through which the cytotoxicity is significantly lowered, adhesion to non-adhesive bioactive components At the same time, there is an advantage in that detachment of fixed non-adhesive bioactive components or isolation of cells generated as the adhesive bioactive components are dissolved in the culture solution during cell culture can be prevented.
  • the adhesive bioactive component as shown in Figure 2a one adhesive bioactive component (111b 1 ) is fixed to the surface of the first support fiber 111 implemented as the first fiber forming component (111a)
  • the one adhesive bioactive component 111b 1 may be fixed to the surface of the support fiber is provided so that a part of the component is located inside the support fiber, the other part is located outside the fiber.
  • the adhesive bioactive component 115 is not provided inside the fifth support fiber 115, and the adhesive bioactive component 115b may be fixed to one area of the outer surface.
  • Figure 3b may be provided to cover all the outer surface of the sixth support fiber 116.
  • bioactive component may be included without limitation in the case of a known substance known to express such a function.
  • the bioactive component is monoamine, amino acid, peptide, saccharide, lipid, protein, glycoprotein, glucolipid, proteoglycan, mucopolysaccharide and nucleic acid. acid)) and any one or more compounds selected from the group consisting of one or more of the cells.
  • the monoamine includes, for example, a compound including a primary amine such as catecholamine and indoleamine.
  • the peptide includes an oligopeptide
  • the protein comprises a polypeptide, for example, may be fibronectin and the like.
  • the saccharides may include monosaccharides, polysaccharides, oligosaccharides and carbohydrates.
  • the lipid may be, for example, a steroid hormone.
  • the bioactive component may comprise a motif.
  • the motif may be a natural peptide or a recombinant peptide including a predetermined amino acid sequence provided in any one or more selected from proteins, glycoproteins, and proteoglycans included in growth factors or extracellular matrix.
  • the motif is adrenomedullin (Adrenomedullin), angiopoietin (Angiopoietin), bone formation protein (BMP), brain-derived management quantum factor (BDNF), epidermal growth factor (EGF), erythropoietin (Erythropoietin), fibroblasts Fibroblast growth factor, glial cell line-derived quantum factor (GDNF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-) CSF), growth differentiation factor-9 (GDF9), hepatocyte growth factor (HGF), hepatoma-derived growth factor (HDGF), insulin-like growth factor (Insulin-like growth factor) , IGF), keratinocyte growth factor (KGF), migration-stimulating factor (MSF), myostatin (GDF-8), neuronal growth factor (NGF), Platelet-derived growth fact or, PDGF), Thro
  • the motif may include both a predetermined amino acid sequence included in the growth factor and a predetermined amino acid sequence included in the extracellular matrix.
  • the motif may include one or more selected from the group consisting of a protein comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 28 and a protein in which at least two of these proteins are fused, but is not limited thereto. no.
  • the motif may be implemented integrally by covalently bonded to the above-described adhesive bioactive component.
  • the adhesive bioactive component is a protein
  • the motif may be directly covalently attached to the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide, or covalently linked through a heterologous peptide or polypeptide.
  • the non-adhesive bioactive component can be more firmly attached to the supporting fiber, and the detachment of the non-adhesive bioactive component can be minimized during cell culture.
  • a part of the bioactive component 112c is located inside the support fiber on the surface of the second support fiber 112 formed of the second fiber forming component 112b, A portion may be provided outside the fiber to be fixed to the support fiber surface.
  • the bioadhesive components 113c 1 , 113c 2 , and 114c 1 are fixed to the surface of the support fibers 113 and 114 embodied with the fiber forming components 113a and 114a. It may be fixed to the support fiber 113 via the active ingredient (113b, 114b 1 ).
  • the physiologically active component is not provided with an adhesive physiologically active component or physiologically active component inside the fifth support fiber 115, as shown in FIG.
  • the bioactive components 115c 1 and 115c 2 may be fixed to the outer surface portion of the support fiber 115 through the 115b.
  • the physiologically active component 116c may be provided to cover all of the adhesive physiologically active component 116b provided by completely covering the outer surface of the sixth support fiber 116.
  • adhesive bioactive components 111b 2 , 112b 2 , 114b 2 and / or non-adhesive bioactive components 112c 2 may be further included in the support fibers 111, 112, 113, and 114.
  • the support fiber comprising the adhesive component and / or non-adhesive bioactive component inside the fiber is adhesive bioactive together with the biodegradable fiber forming component in the spinning solution to be made of the support fiber as in the preparation of the support fiber described below. It may be the case that the components and / or non-adhesive bioactive components are spun in a mixed state to be made of support fibers.
  • Case be from radiation step includes the adhesive bioactive component adhesive bioactive components (111b 1, 112b 1, 113b 1, 114b 1) part of the support fabric (111 112 113 114) located in the interior, by adhesive bioactive components of (111b 1 , 112b 1 , 113b 1 , 114b 1 ) can minimize the release from the support fibers.
  • the non-adhesive bioactive component is included from the spinning step, as shown in FIG. 2B, the non-adhesive bioactive component 112c 1 may be fixed to the support fiber 112 without a separate adhesive bioactive component. There is an advantage.
  • Cell culture or tissue engineering support may include the above-described fibrous web 100 as a single layer or a plurality of laminates stacked.
  • a functional layer provided in a conventional cell culture / tissue engineering support such as an adhesive layer for attaching the support to a culture vessel or the like may be further provided on one surface.
  • the support including the above-described fibrous web can be prepared through the manufacturing method described below. However, it is not limited to the manufacturing method described later.
  • the support comprises the steps of (1) preparing a spinning solution comprising a fiber-forming component; And (2) producing a fibrous web formed by accumulating support fibers by electrospinning the spinning solution.
  • the spinning solution in step (1) may include a solvent in addition to the fiber forming component.
  • the solvent is used in the preparation of a conventional electrospinning liquid and may be used without limitation in the case of a solvent capable of dissolving the biodegradable or non-biodegradable fiber forming component described above. In addition, it is preferable to select a solvent that can be easily vaporized when step (2) described later is dry spinning.
  • the solvent is not specifically limited to the present invention as the solvent may be differently selected depending on the kind of the biodegradable compound to be specifically selected.
  • the solvent is diethyl carbonate (DEC), dimethyl carbonate (DMC), ethyl methyl carbonate (EMC), propylene carbonate (PC), water, acetic acid, formic acid, and dimethylformamide (DMF). ), Chloroform, dichloromethane, acetone, HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol) and isopropylalchol Any one or more may be used.
  • DEC diethyl carbonate
  • DMC dimethyl carbon
  • the spinning solution may be mixed with a fiber-forming component and a solvent such that the viscosity is 50 ⁇ 3000cps. If the viscosity of the spinning solution is less than 50 cps, the flowability of the spinning solution is high and it is difficult to manufacture the fibrous web by spraying the droplets from the nozzle of the spinning device. If the viscosity of the spinning solution is more than 2000 cps, the spinning property is low and the spinning property is lowered. Can be.
  • the spinning solution may further include an additive provided in a conventional cell culture support or a tissue engineering support.
  • the additive may be a hydrophilic enhancement component such as a nonionic surfactant.
  • the other additives can be selected according to the purpose of the known additives, so the present invention will be omitted.
  • the spinning solution described above is based on a solution in which the fiber-forming component is dissolved, including a solvent, but is not limited thereto, it is noted that the fiber-forming component may be a molten liquid.
  • step (2) the spinning solution is electrospun to perform a step of producing a fibrous web.
  • Step (2) may be performed through a conventional electrospinning apparatus, wherein the electrospinning apparatus comprises a solution tank in which a spinning solution is stored, and a spinning pack having a plurality of spinning nozzles connected to a high voltage generator arranged in a plurality of rows / multiple rows. It may include.
  • the lower part of the spin pack is provided with a collector can collect a fiber mat accumulated in the spinning support fiber, the collector may be located on the conveyor belt to collect a continuous fiber mat of a predetermined thickness formed sequentially. .
  • the collector is supported by the external coagulant solution and the spinning support fiber is solidified, or the support fiber spun without the external coagulation solution is solidified through air or a separate cooling wind may be collected on the collector.
  • the collected support fiber mat may then be subjected to a drying process for vaporizing the remaining solvent, external coagulating solution, etc., and thus may be made into a fibrous web.
  • the prepared fibrous web may further perform a surface coating of the support fiber with a component such as plasma treatment, dopamine on the surface in order to improve the hydrophilicity.
  • the prepared fibrous web may further perform a process of stretching in a specific direction for the pore size control, the orientation of the biodegradable components forming the support fibers.
  • the fibrous web may further perform a process of applying heat and / or pressure to satisfy the three-dimensional network structure, the desired thickness, basis weight, the process may be a conventional calendaring process.
  • one side of the manufactured fibrous web for example, may be further performed to form a separate adhesive layer so that the fibrous web can be fixed, attached to the culture vessel or the like on the edge of the fibrous web.
  • the fibrous web further comprising an adhesive bioactive component and / or non-adhesive bioactive component as an embodiment of the present invention is a spinning solution in the spinning solution manufacturing step of step (1) described above as a first method It can be prepared by a method of manufacturing the adhesive bioactive ingredient and / or non-adhesive bioactive ingredient to the supporting fiber from the beginning by mixing and spinning the adhesive bioactive ingredient and / or non-adhesive bioactive ingredient to have. Through the first method it is possible to produce a fibrous web comprising a modified support fiber as shown in Figures 2a to 2c.
  • the fibrous web after manufacturing the fibrous web so that the adhesive bioactive component is provided on the support fiber from the beginning by spinning the adhesive bioactive component to the spinning solution in the spinning solution manufacturing step of step (1) described above
  • the different types of bioactive components may be treated on the fibrous web to adhere the other types of bioactive components to the adhesive bioactive components fixed to the supporting fibers.
  • the method of treating the physiologically active component to the fibrous web may be a conventional method, for example, it may be by a method such as dipping, spraying, electrodeposition.
  • the support including the above-described fibrous web may be implemented as a bioreactor including a housing having the support therein.
  • the bioreactor may further include a culture solution containing various nutrients that affect cell proliferation or differentiation so as to proliferate and / or differentiate cells.
  • the culture solution may be a conventional solution provided in the bioreactor, the present invention is not particularly limited thereto.
  • the bioreactor may further include an inlet through which the culture solution is introduced into the housing and an outlet through which the culture solution is discharged to the outside.
  • the bioreactor may be a sealed housing that does not have an inlet / outlet that connects the outside and the inside of the housing.
  • the bioreactor may further include other members provided with a conventional bioreactor, the present invention is not particularly limited thereto.
  • the support according to an embodiment of the present invention may be provided in a conventional culture vessel may be implemented as a cell culture vessel.
  • the support may be attached to the inner surface of the culture vessel or may be provided to float on the culture solution provided in the culture vessel.
  • the support according to an embodiment of the present invention may be implemented as a body transplant kit including a cell aggregate cultured on a region including an outer surface and an inner space of the fibrous web included in the support.
  • the grafting kit is preferably implemented as a support formed of a biodegradable component, in this case there is an advantage to facilitate the transplantation as the support is naturally decomposed in the body without a separate support removal surgery after implantation.
  • the transplant kit may further include other drugs that minimize immune rejection or help engraftment of cells.
  • the cell aggregate is any one or more stem cells selected from the group consisting of pluripotent stem cells, pluripotent stem cells, pluripotent stem cells, oligopotent stem cells and single stem cells, and hematopoietic stem cells, hepatocytes, fibroblasts, It may include one or more of differentiation cells selected from the group consisting of epithelial cells, mesothelial cells, endothelial cells, muscle cells, neurons, immune cells, adipocytes, chondrocytes, bone cells, blood cells and skin cells.
  • Table 2 is a table of the sequence listing showing the amino acid sequence according to the SEQ ID NO described in the present invention.
  • a spinning solution 12 g of polyvinylidene fluoride (Arkema, Kynar761) as a fiber forming component was mixed with 88 g of a mixed solvent in which the weight ratio of dimethylacetamide and acetone was 70:30 at a temperature of 80 ° C. for 6 hours. While dissolving using a magnetic bar to prepare a mixed solution.
  • the spinning solution was electrospun using an electrospinning device in an environment of RH 65% 30 with an applied voltage of 25KV, a distance of 25cm between the current collector and the spinneret, and a discharge amount of 0.05ml / hole.
  • the supporting fiber forming the fibrous web had an average diameter of 693.9 nm, a standard deviation of the supporting fiber diameter of 86.0 nm, and the smallest diameter of the supporting fibers having a diameter of 350.0 nm and a first quartile (Q1) of 644.0 nm.
  • the third quartile (Q3) was 739.0 nm, and the diameter of the largest of the supporting fibers was 1294.0 nm.
  • the diameter distribution of the support fibers contained in the fiber web prepared as shown in Table 3 or Table 4 is the fiber as shown in Table 3 or Table 4 A support for cell culture with a web was obtained.
  • the average, standard deviation, first quartile (Q1), third quartile (Q3), and the above equations (1) and (2) are obtained by using the diameter distribution of the support fibers measured by the island distribution program (AMOGREENTECH). Calculated. In addition, the cumulative number of the support fibers for each diameter through the diameter distribution of the support fibers measured in Examples 1 to 3 is shown through a graph in FIG.
  • Air permeability was measured using a TEXTEST instruments to cut the fibrous web into a test area of 38cm2, grasp the equipment, and blow the air at a test pressure of 125 Pa to measure the amount of air passing through, and the unit of air permeability was cfm ( ft 3 / ft 2 / min).
  • the fibrous web prepared in Example was cut to the same size and then fixed in a well plate for cell culture. After loading mesenchymal stem cells (MSC) at 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on a well plate equipped with fibrous webs, KSB-3 supplyments (S2901) in 500 ml of KBS-3 Basal medium (B1001) FBS (Fetal Bovine Serum) was added to 2% of the mixed medium to 10% of the total medium weight, and Penicillin / Streptomycin was added to 1/100 of the total medium volume. Proliferation.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • B1001 KBS-3 Basal medium
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the cultured mesenchymal stem cells were stained using a cell counting kit 8 (CCK-8), and then absorbance was measured using a UV-vis spectrometer. At this time, the control was used to culture 2D in the same culture conditions in the cell culture dish.
  • Example 1 Based on the absorbance of Example 1 of the absorbance measured through the Example based on 100% the absorbance of the remaining examples are shown in Table 3 or Table 4 below.
  • the cultured fibroblasts were stained using cell counting kit 8 (CCK-8), and then absorbance was measured using a UV-vis spectrometer. At this time, the control was used to culture 2D in the same culture conditions in the cell culture dish. Based on the absorbance of Example 1 of the absorbance measured through the Example based on 100% the absorbance of the remaining examples are shown in Table 3 or Table 4 below.
  • Example 1 Example 2 Example 3 Example 4 Example 5 Example 6 Textile web Average diameter (nm) 693.9 214.4 1029.9 598.5 601.6 612.2 Diameter standard deviation (nm) 86.0 32.7 96.7 128.4 138.5 156.3 Minimum diameter (nm) 350.0 140.0 740.0 225.0 228.5 190.5 First Quartile (Q1, (nm) 644.0 192.0 964.3 546.0 532.4 502.7 Third Quartile (Q3, (nm) 739.0 234.0 1081.0 689.0 750.1 790.4 Diameter (nm) 1294.0 472.0 1385.0 1364.0 1465.4 1430.4 Dispersion coefficient (%) 12.39 15.25 9.39 21.45 23.02 25.53 Equation 1 5.84 5.67 2.60 4.72 3.29 2.22 Equation 2 3.09 1.24 1.92 2.24 1.40 1.09 Basis weight (g / m2) 5.0 3.8 4.7 5.2 5.4 5.6 Thickness ( ⁇ m) 5.5 5.2 5.5 5.5 5.5 5.5 Air permeability (cfm
  • Example 7 Example 8 Example 9 Example 10
  • Example 11 Textile web Average diameter (nm) 1018.9 1408.4 1227.0 1230.0 620.4 680.0 Diameter standard deviation (nm) 68.8 116.0 108.0 110.1 90.4 120.4 Minimum diameter (nm) 774.7 1117.5 870.4 808.0 330.0 333.0 First Quartile (Q1, (nm) 989.0 1334.0 1169.4 1153.3 560.4 628.0 Third Quartile (Q3, (nm) 1075.4 1621.0 1373.0 1310.0 659.0 740.0 Diameter (nm) 1355.0 1883.0 1662.0 1555.0 1305.0 1550.0 Dispersion coefficient (%) 6.75238 8.236297 8.801956 8.95122 14.57124 17.70588 Equation 1 3.236111 0.912892 1.41945 1.563497 6.551724 7.232143 Equation 2 2.480324 0.754355 1.468566 2.203574 2.336714 2.633929 Basis weight (
  • Example 2 it can be seen that the relative absorbance of fibroblasts is significantly increased than that of Example 1, which is realized by supporting fibers having a small average diameter, so that the flatness of the surface of the support is greater than that of Example 1, which is why It is expected that a culture environment suitable for fibroblasts is implemented.
  • Example 3 it can be seen that the relative absorbance of the stem cells is significantly increased compared to that of Example 1, which is a flat degree of the surface of the support as Example 3 is implemented as a fiber having a larger average diameter than that of Example 1. It is expected to be smaller than 1, resulting in a culture environment more suitable for stem cells.
  • Example 1 examples 4 to 6, even in the case of a support made of a support fiber having a similar average diameter, the dispersion coefficient for the diameter of Example 6 outside the preferred range according to the present invention culture example after cell seeding Compared to 1, 4, 5, the relative absorbance was greatly reduced, in particular, it can be seen that significantly reduced for stem cells.
  • Example 9 the relative absorbance of the fibroblasts in Example 9 was reduced compared to Example 3, Example 10
  • Example 10 the relative absorbance of the stem cells is reduced.
  • Example 12 it can be seen that the relative absorbance of the fibroblasts and stem cells is reduced compared to Example 3, Example 11.

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Abstract

세포배양용 또는 조직공학용 지지체가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 의한 지지체는 생분해성 지지섬유를 포함하여 형성된 3차원 네트워크 구조의 섬유웹을 구비한다. 이에 의하면, 배양되는 세포의 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이지지체에 구비됨에 따라서 세포 증식율 및 생존율이 향상될 수 있다. 또한, 지지체에서 배양된 세포에 대한 물리/화학적 자극없이 지지체를 쉽게 제거시킬 수 있어서 배양된 세포의 회수가 용이하고, 배양된 세포를 구비한 채로 체내 이식 가능하다. 나아가, 배양된 세포를 in vitro 실험모델이나 동물 체내에 이식용으로 적용하기에 보다 적합하도록 배양되는 세포들의 형상/구조를 실제 동물 체내와 유사하게 배양시킬 수 있다. 더불어, 본 발명의 일실시예에 따른 지지체는 세포배양/분화에 도움을 주는 물질로 개질됨에 따라서 세포증식 및 생존이 더욱 향상될 수 있고, 배양되는 세포가 입체적형상으로 용이하게 구현될 수 있다.

Description

세포배양용 또는 조직공학용 지지체
본 발명은 지지체에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 배양되는 세포의 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경을 구현함으로써 세포의 생존율을 향상시키고, 배양된 세포의 분리가 용이한 세포배양용 또는 조직공학용 지지체에 관한 것이다.
최근, 질병 치료에 배양 세포의 이용이 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심 및 연구가 증가하고 있다. 세포 배양은 세포를 생체로부터 채취하고, 생체 밖에서 배양시키는 기술이며, 배양된 세포는 피부, 장기, 신경 등 신체의 다양한 조직으로 분화시켜 인체에 이식되거나 분화시키기 전 상태로 인체에 이식시켜 생착 및 분화를 동시에 이루어지게 하여 다양한 질병 치료에 활용될 수 있다.
이와 같은 세포배양이 연계된 분야가 조직공학(tissue engineering)이며, 세포학, 생명과학, 공학, 의학 등의 기존의 과학 영역을 응용하는 다학제간 학문으로써, 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체, 재생시키기 위한 새로운 융합기술이 연구되고 있다.
통상적인 세포배양 분야나 이를 이용한 조직공학 분야에서 지속적으로 많은 관심을 받고, 연구/개발되는 과제 중의 하나는 세포를 배양/분화시키고, 세포를 구비한 채로 인체 조직에 이식될 수 있는 지지체의 재료나 구조 등에 관한 연구이다. 즉, 인체에 특정물질이 미치는 영향을 살펴보기 위하여 배양된 세포를 이용한 특정 물질의 독성반응실험은 실제 인체의 세포구조와 유사한 3차원구조로 배양/분화된 세포군집체를 통해서 이루어질 때 보다 실제와 유사한 in vitro 세포 독성실험모델로 적합할 수 있다. 또한, 배양된 세포를 인체의 조직으로 이식하기 위해서는 인체의 실제 조직과 유사한 3차원구조로 배양/분화된 세포집합체나 조직이 이식될 때 이식된 세포나 조직이 충분히 제 기능과 역할을 할 수 있다.
그러나 현재까지 개발된 세포배양용 지지체는 체내와 유사한 구조로 세포가 배양되지 않고, 세포의 생존율도 높지 않음에 따라서 이를 통하여 배양된 세포를 통해서는 in vitro 실험모델이나 이식용 세포로써 부적합한 문제가 있다.
이에 따라 체내와 유사한 배양환경을 제공할 수 있고, 세포 배양에 요구되는 공간이 세포마다 적절히 확보되는 동시에 지지체 내에서 세포가 배양되는 도중 이탈되는 세포를 막아 세포의 생존율 및 세포를 입체적으로 성장시킬 수 있는 지지체에 대한 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 배양되는 세포의 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경을 구현시켜 세포 증식율 및 생존율이 향상된 세포배양용 또는 조직공학용 지지체를 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 지지체에서 배양된 세포에 대한 물리/화학적 자극 없이 지지체를 쉽게 제거시킬 수 있어 배양된 세포의 회수가 용이한 세포배양용 또는 조직공학용 지지체를 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 배양된 세포를 구비한 채로 체내 이식 가능함에 따라서 세포배양 및 조직공학의 용도에 보다 적합하게 구현된 지지체를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 배양된 세포를 in vitro 실험모델이나 동물 체내에 이식용으로 적용하기에 보다 적합하도록 배양되는 세포들의 형상/구조를 실제 동물 체내와 유사하게 배양시킬 수 있는 지지체를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 지지체를 생물반응기, 세포배양용기, 체내이식용 키트 등 세포배양분야 또는 조직공학분야에 사용되는 각종 제품으로 구현시키는데 또 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 지지섬유를 포함하여 형성된 3차원 네트워크 구조의 섬유웹;을 구비하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체를 제공한다.
본 발명의 실시예에 의하면 상기 섬유웹은 평균공경이 0.05 ~ 10㎛이고, 기공도가 40 ~ 90%일 수 있다.
또한, 상기 지지섬유는 평균직경이 100㎚~ 3㎛일 수 있다.
또한, 상기 섬유웹의 두께는 1 ~ 20㎛이고, 평량은 1 ~ 30g/㎡일 수 있다.
또한, 상기 섬유웹은 지지섬유를 다수개 포함하고, 하기의 조건 (1)과 조건 (2)를 만족할 수 있다. (1) 지지섬유들의 직경분포에서 직경에 대한 분산계수(E)가 8 ~ 25%이며, (2) 섬유웹의 공기투과도 1 ~ 40cfm이다.
또한, 상기 지지섬유들의 직경분포에서 하기의 조건 (3)으로써, 하기 수학식 1에 따른 값이 1.5 ~ 6.8일 수 있다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2017005705-appb-I000001
또한, 상기 지지섬유들의 직경분포에서 하기의 조건 (4)로써, 하기 수학식 2에 따른 값이 1.0 ~ 5.5일 수 있다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2017005705-appb-I000002
또한, 상기 지지섬유는 PCL(polycaprolactone), PDO(polydioxanone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide)), PEO(polyethylene oxide), PLA(Polylactic acid) 및 PVA(polyvinyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생분해성 성분을 섬유형성성분으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 지지섬유는 폴리스티렌(Poly styrene), PET (Polyethylene terephthalate), PES(Polyethersulfone), PVDF(Polyvinylidene fluoride), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리에틸렌 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록공중합체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 비생분해성 성분을 섬유형성성분으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 지지체 및 상기 지지체를 내부에 구비하는 하우징을 포함하는 생물반응기(bioreactor)를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 지지체를 포함하는 세포배양용기를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 지지체 및 상기 지지체의 섬유웹 외부 및 내부 공간을 포함하여 배양된 세포집합체를 포함하는 체내이식용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 하기 표 1과 같이 약어로 기재하였다.
IUPAC-IUB 명명 기호 약자 IUPAC-IUB 명명 기호 약자 IUPAC-IUB 명명 기호 약자
알라닌 A Ala 글라이신 G Gly 프롤린 P Pro
아르기닌 R Arg 히스티딘 H His 세린 S Ser
아스파라긴 N Asn 아이소루신 I Ile 트레오닌 T Thr
시스테인 C Cys 라이신 K Lys 트립토판 W Trp
글루탐산 E Glu 메티오닌 M Met 타이로신 Y Tyr
글루타민 Q Gln 페닐알라닌 F Phe 발린 V Val
이하, 본 발명에서 사용한 용어에 대하여 설명한다.
본 발명의 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 "모티프"는 세포의 부착, 이동, 분화 등에 중요한 역할을 하는 세포외 기질내 단백질, 당단백질 등에 포함되어 세포막의 표면 또는 막을 관통하도록 구비되는 수용체와 구조적/기능적으로 상호작용을 할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로써, 세포내에서 분리하거나 유전자 클로닝(Gene cloning) 기법을 이용하여 인공적으로 생산된 것을 모두 포함한다.
본 발명의 "3차원 세포군집체"(3dimension cell cluster)는 3차원으로 세포가 모여있는 형상을 의미하는 것으로, cadherin 및 connexin 등과 같은 간극연접(gap junction) 단백질의 발현으로 인해 세포-세포 상호작용이 발생하여 생체 조직과 유사한 인공적으로 조성된 세포군집체를 의미한다. 2차원 배양세포와 비교했을 때, 3차원 세포군집체는 다층의 세포를 포함하고, 2차원 배양세포는 단층 세포로 3차원 세포군집체가 2차원 배양세포보다 단위면적당 세포 수가 많다.
본 발명에 의하면, 배양되는 세포의 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이지지체에 구비됨에 따라서 세포 증식율 및 생존율이 향상될 수 있다. 또한, 지지체에서 배양된 세포에 대한 물리/화학적 자극없이 지지체를 쉽게 제거시킬 수 있어서 배양된 세포의 회수가 용이하고, 배양된 세포를 구비한 채로 체내 이식 가능하다.
나아가, 배양된 세포를 in vitro 실험모델이나 동물 체내에 이식용으로 적용하기에 보다 적합하도록 배양되는 세포들의 형상/구조를 실제 동물 체내와 유사하게 배양시킬 수 있다.
더불어, 본 발명의 일실시예에 따른 지지체는 세포배양/분화에 도움을 주는 물질로 개질됨에 따라서 세포증식 및 생존이 더욱 향상될 수 있고, 배양되는 세포가 입체적형상으로 용이하게 구현될 수 있다. 이에 따라 세포배양분야 및 조직공학분야의 용도로 매우 적합하여 당해 분야의 각종 제품으로 널리 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 지지체에 포함되는 섬유웹의 단면도 및 부분확대도,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 포함되는 지지섬유의 장축방향에 대한 부분확대단면도로써, 도 2a 내지 도 2d는 지지섬유의 내/외부에 구비되는 접착성 생리활성성분 및/또는 비접착성 생리활성성분의 배치에 대한 다양한 실시예에 대한 도면,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 포함되는 지지섬유 및 이의 표면에 구비되는 접착성 생리활성성분 및 비접착성 생리활성성분을 나타내는 도면으로써, 도 3a는 지지섬유 표면의 일부분에 접착성 생리활성성분이 배치된 후 상기 접착성 생리활성성분에 비접착성 생리활성성분이 고정된 경우를 나타내는 부분사시도이고, 도 3b는 지지섬유 표면상에 접착성 생리활성성분이 피복되고, 피복된 접착성 생리활성성분 상에 비접착성 생리활성성분이 피복된 경우를 나타내는 단면도,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 포함되는 지지섬유들의 섬경분포를 직경별 지지섬유 누적개수로 나타낸 그래프,
도 5 내지 7은 본 발명의 일 실시예에 포함되는 섬유웹의 SEM 사진, 그리고
도 8 및 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용 지지체 상에 1일차 배양된 섬유아세포 SEM 사진을 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 부가한다.
또한, 도면에 도시된 일구성의 형상은 도면에 도시된 형상에 제한되지 않는다. 일예로, 도 2a에 도시된 생리활성성분으로써, 접착성 생리활성성분(111b1,111b2)의 형상을 실과 같이 도시하였으나, 이는 섬유 외부/내부의 위치하는 접착성 생리활성성분의 위치관계 등에 대하여 쉽게 설명하기 위함이며, 실제 접착성 생리활성성분의 형상과 다를 수 있다. 또한, 접착성 생리활성성분의 형상을 실과 같이 표현함에 따라서 도 2a와 같이 접착성 생리활성성분(111b1)이 지지섬유(111)의 외부면에 이격된 것으로 나타내었으나 이에 제한되지 않으며, 접착성 생리활성성분(111b1)이 지지섬유(111)의 외부면에 이격되지 않고 외부면을 부분적으로 피복하는 경우를 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다.
도 1에 도시된 것과 같이 본 발명의 일 실시예에 의한 지지체는 지지섬유(111)를 포함하여 형성된 섬유웹(100)을 구비한다. 상기 섬유웹(100)은 적어도 1가닥의 지지섬유로 3차원 네트워크 구조를 형성할 수 있다. 구체적으로 1가닥의 지지섬유를 포함하여 형성된 섬유웹은 1가닥의 지지섬유가 방향의 정함 없이 복수회 폴딩되어 배열/적층됨을 통해 3차원 네트워크 구조를 형성할 수 있다.
또는 상기 섬유웹(100)은 복수개의 지지섬유를 포함하여 각각의 지지섬유가 독립적으로 폴딩 및/또는 섬유길이방향의 정함이 없이 각각이 배열/적층됨을 통해 3차원 네트워크 구조를 형성할 수 있다. 이때, 1가닥 지지섬유내의 서로 다른 표면간 및/또는 서로 다른 지지섬유의 표면간에는 접착 또는 융착이 발생할 수 있고, 이를 통해 3차원네트워크 구조가 구조적으로 더 복잡해지며 지지체에 로딩된 세포가 3차원 네트워크 구조로 형성된 기공 내부로 이동/증식할 수 있고, 입체적 형상/구조를 갖는 세포군집체로 세포를 배양시키기에 유리할 수 있다.
또한, 지지체 내부/외부에서 배양되는 세포의 증식률 및 생존률을 증가시키기 위해서는 세포의 증식에 필요한 영양분 등의 공급이 중요한데, 3차원 네트워크 구조의 섬유웹은 영양분을 포함하는 배양용액의 유로가 매우 복잡, 다양하게 형성됨으로써 지지체 내부에 위치한 세포까지 용이하게 영양분이 공급되어 세포사멸을 방지하고 세포증식을 향상시킬 수 있다.
상기 섬유웹(100)의 평균공경은 섬유웹 내부의 기공에 세포가 이동, 증식할 수 있을 정도의 공간이 확보되도록 구비됨이 바람직하며, 배양되는 세포의 구체적 종류에 따라서 직경이 결정될 수 있음에 따라서 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다. 다만, 바람직하게는 상기 평균공경은 0.05 ~ 50㎛일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.05 ~ 10㎛일 수 있다. 만일 평균공경이 0.05㎛ 미만일 경우 배양되는 세포가 증식될 때 섬유웹 내부의 기공으로 이동하기 보다는 섬유웹의 외부면을 통해 평면적으로 이동 및 증식할 수 있어서 목적하는 수준으로 입체적 형상을 갖는 세포군집체를 배양하지 못할 수 있다. 또한, 섬유웹의 내부 공간으로 세포가 이동한다고 하더라도 배양용액이 섬유웹을 원활하게 통과하지 못할 수 있음에 따라서 내부공간으로 이동한 세포가 사멸되거나 증식이 저하될 수 있다. 또한, 만일 평균공경이 50㎛를 초과하는 경우 섬유웹의 내부공간으로 세포의 이동 및 배양용액의 통과성이 좋을 수 있으나, 배양되는 세포가 섬유웹을 통과하는 배양용액과 함께 섬유웹 밖으로 이탈될 수 있으며, 이와 같은 탈리되는 배양세포의 증가는 목적하는 입체형상을 갖는 세포군집체로 배양되기 어렵다.
또한, 상기 섬유웹(100)은 기공도가 40 ~ 90%일 수 있으며, 이를 통해 섬유웹 내부로 이동 및 증식되는 세포를 통한 입체형상의 세포군집체를 형성하기에 보다 용이하며, 섬유웹 내부 기공에 배양용액을 담지하거나 배양용액의 통과성을 향상시킬 수 있는 이점이 있다. 만일 기공도가 40% 미만일 경우 입체형상의 세포군집체의 형성이 어렵고, 섬유웹 내부로 이동 및 증식하는 세포의 사멸을 초래할 수 있다. 또한, 만일 기공도가 90%를 초과할 경우 지지체의 기계적강도 약화로 세포배양 중에 지지체가 붕괴할 수 있다.
또한, 상기 섬유웹(100)은 평균두께가 1 ~ 100㎛일 수 있고, 바람직하게는 1 ~ 50㎛, 보다 바람직하게는 1 ~ 20㎛일 수 있다. 또한, 상기 섬유웹(100)은 평량이 0.1 ~ 30g/㎡일 수 있다. 만일 섬유웹의 두께가 1㎛ 미만 및/또는 평량이 30g/㎡를 초과하는 경우 섬유웹 내부공간이 협소해지거나 전체 부피가 감소함에 따라서 입체형상을 갖는 세포군집체의 배양이 어렵거나 및/또는 지지체를 통해 수득할 수 있는 세포군집체의 양이 적어질 수 있다. 또한, 만일 섬유웹 두께가 1㎛ 미만 및/또는 평량이 0.1g/㎡ 미만일 경우 지지체의 기계적 강도가 저하될 수 있다. 또한, 만일 섬유웹의 두께가 100㎛를 초과하는 경우 배양용액이 섬유웹 두께방향의 이동성이 저하되고, 이로 인해 섬유웹 내부에서 배양되는 세포의 증식저하, 사멸의 우려가 있을 수 있다.
또한, 상술한 섬유웹(100)을 형성하는 지지섬유(111)는 섬유형성성분으로 섬유형상으로 구현이 가능한 공지된 고분자 화합물의 경우 제한없이 사용될 수 있으며, 일예로, 생분해성 성분 또는 비생분해성 성분을 포함한다. 지지체의 재질을 생분해성 성분으로 구비시킬 경우 지지체상에서 배양/증식/분화되는 세포를 별도로 분리시키지 않고, 지지체까지 포함시켜 체내로 이식시킬 수 있으며, 이식된 지지체는 이식직후 배양세포가 체내에 보다 잘 생착될 수 있도록 도움을 줄 수 있고, 일정시간 경과 후 체내에서 자연분해될 수 있음에 따라서 지지체를 이식 후 제거하는 별도의 수술/치료를 요구하지 않아 치료의 편의성이 매우 증가할 수 있다. 또한, 생분해성 성분의 재질은 재질적으로 친수성이 높아서 물에 의한 분해성이 높은데, 이러한 점을 이용하여 지지체를 녹여 배양된 세포를 분리, 수거하는 공정에서 지지체를 용해시키는 용액으로 사용될 수 있는 물은 세포에 자극이 거의 없어서, 배양된 세포에 물리/화학적 손상을 거의 주지 않는 이점이 있다.
또한, 지지체의 재질을 비생분해성 성분으로 구비시킬 경우 생분해성 지지섬유보다 기계적 강도가 우수해 안정적으로 세포를 배양시킬 수 있다. 또한, 세포배양 과정에서 가해지는 지지체와 접촉되는 배양용액 등에 의해 지지지체의 기계적 강도 약화를 방지할 수 있음에 따라서 더욱 안정적으로 세포를 배양할 수 있다. 더불어, 생분해성 성분은 전기방사 등을 통해 목적하는 구조를 갖는 섬유웹을 형성시키기가 비생분해성 성분에 비해 매우 어렵기 때문에 취급 및 안정적인 방사성 측면에서 비생분해성 성분이 더 유리하고, 이에 따라 목적하는 공경, 기공도 등이 구현된 섬유웹을 용이하게 제조할 수 있다.
상기 지지섬유(111)가 생분해성 섬유형성성분을 포함하는 경우 통상적으로 생분해성인 특성을 갖는 동시에 세포에 독성이 최소화될 수 있도록 생체적합한 성분으로 알려진 화합물의 경우 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 지지섬유는 본 발명의 일 실시예에 의하면, 나노 사이즈의 직경을 갖도록 구현되어야 하며, 이를 위해서 상기 지지섬유는 전기방사를 통해 제조될 수 있는데, 이 경우 생분해성 섬유형성성분은 전기방사에 적합한 특성까지 더 구비하는 화합물을 사용함이 바람직하다. 이에 대한 일예로, 생분해성 섬유형성성분은 PCL(polycaprolactone), PDO(polydioxanone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide)), PEO(polyethylene oxide), PLA(Polylactic acid) 및 PVA(polyvinyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 지지섬유(111)가 비생분해성 섬유형성성분을 포함하는 경우 통상적으로 비생분해성인 특성을 갖는 동시에 세포에 독성이 최소화될 수 있도록 생체적합한 성분으로 알려진 화합물의 경우 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 비생분해성 지지섬유는 본 발명의 일 실시예에 의하면, 나노사이즈의 직경을 갖도록 구현되어야 하며, 이를 위해서 상기 지지섬유는 전기방사를 통해 제조될 수 있는데, 이 경우 상기 비생분해성 섬유형성성분은 전기방사에 적합한 특성까지 더 구비하는 화합물을 사용함이 바람직하다. 이에 대한 일예로, 비생분해성 섬유형성성분은 폴리스티렌(Poly styrene), PET (Polyethylene terephthalate), PES(Polyethersulfone), PVDF(Polyvinylidene fluoride), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리에틸렌 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록공중합체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 섬유형성성분으로 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 지지섬유는 목적하는 배양세포 종류에 따른 세포크기를 고려한 공경, 기공도, 평량 등을 구현하도록 직경이 결정될 수 있음에 따라서 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다. 일예로, 상기 지지섬유는 평균직경이 10㎚ ~ 100㎛일 수 있고, 바람직하게는 100㎚ ~ 50㎛일 수 있으며, 보다 바람직하게는 100㎚ ~ 10㎛, 더 바람직하게는 100㎚ ~ 3㎛일 수 있다. 만일 지지섬유의 평균직경이 10㎚ 미만일 경우 섬유웹의 기계적 강도가 현저히 저하될 수 있고, 평균직경이 100㎛를 초과하는 경우 목적하는 수준의 기공도, 지지섬유의 표면적을 갖는 섬유웹을 제조하기 어려울 수 있다.
한편, 세포를 입체적으로 배양시키기 위해서는 세포가 지지체의 표면 뿐만 아니라 지지체의 내부공간에도 침투 및 배양되어, 종국적으로 내부공간에 침투 및 배양된 세포와 표면상에서 배양되는 세포 간에 접촉하여 하나의 3차원적인 세포군집체를 형성할 수 있다. 다만, 표면상에서 배양되는 세포의 경우에도 세포배양용(또는 조직공학용) 지지체의 표면 모폴로지에 의해 세포의 입체적 배양을 유도할 수 있다. 이러한 일예로써, 세포배양용 지지체 표면의 모폴로지가 평평하지 않고, 울통불퉁하도록 표면 거칠기가 클 수 있다. 세포지지체의 표면 형상이 울퉁불퉁하다는 것은 예시적으로 다수개의 오목부 및/또는 볼록부를 포함한 것으로써, 세포의 입체적 성장효과 이외에 세포가 볼록부 간 사이 공간 또는 오목부의 홈에 보다 용이하고 견고하게 안착될 수 있어서 세포지지체에서 탈리되는 세포의 수를 현저히 감소시킬 수 있는 이점이 있다.
위와 같은 세포의 입체적 성장 및 파종된 세포의 안착성 향상을 위한 모폴로지의 표면을 갖는 세포 배양용지지체를 구현하기 위하여 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 섬유웹은 생분해성 지지섬유를 다수개 포함하고, 하기의 조건 (1)과 조건 (2)를 만족할 수 있다.
먼저, 조건 (1)로써, 지지섬유들의 직경 분산계수(E) 8 ~ 25%일 수 있다. 상기 직경 분산계수(E)는 지지섬유들의 직경을 기준으로 한 분포도에서 소정의 평균직경일 때, 상기 평균직경에 대비하여 지지섬유들이 얼마나 가까이 또는 넓게 분포하고 있는지를 가늠할 수 있는 파라미터로써, 하기 수학식 3으로 계산될 수 있다.
[수학식 3]
Figure PCTKR2017005705-appb-I000003
상기 수학식 3에 따른 직경 분산계수(%)가 0%라는 의미는 표준편차가 0이라는 것으로써, 섬유웹에 포함된 다수개의 지지섬유들의 직경이 모두 평균직경과 일치함을 의미한다. 따라서, 이와 반대로 직경 분산계수가 점점 커진다는 것은 섬유웹에 포함된 다수개의 지지섬유 중 평균직경보다 큰 직경 및/또는 작은 직경을 갖는 지지섬유의 수가 증가한다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 의한 지지체는 소정의 평균직경에서 조건 (1)에 따른 생분해성 지지섬유들의 직경에 대한 분산계수가 8 ~ 25%를 만족함에 따라서 상술한 것과 같이 다수개의 오목부 및/또는 볼록부가 배치된 것과 같은 울퉁불퉁한 표면 모폴로지를 갖는 세포배양용 지지체를 구현하기 보다 용이할 수 있다. 다만, 분산계수가 과도하게 커질 경우 두께 대비 평량의 증가가 클 수 있고, 이로 인해 평균공경과 공기투과도가 크게 감소할 수 있고, 세포배양액의 지지체 내부로 유입이 어렵거나 교환이 어려워져 지지체 내부에서 세포배양이 어려울 수 있어서 세포배양 효율이 감소할 수 있다. 만일 직경에 대한 분산계수가 8% 미만일 경우 지지체 직경의 균일성이 증가함에 따라서 매끄러운 표면 모폴로지가 발현되기에 유리하고, 공경의 균일성도 증가하나, 파종된 세포가 입체적으로 증식하기 보다는 표면상을 따라 2차원적으로 배양되거나 또는 지지섬유의 평균직경이 클 경우 평균공경이 큰 기공구조가 생성되어 파종된 세포가 탈리될 우려가 있는 등 목적하는 수준의 입체적인 세포군집체를 배양시킬 수 없을 수 있다. 또한, 만일 직경에 대한 분산계수가 25%를 초과할 경우 평균직경이 다소 작은 지지체에서는 지지체 직경에 대한 불균일성이 증가함에 따라서 지지체의 평균공경이 매우 작아지고, 이로 인해 세포배양액의 지지체 내부로의 유입이나 교환이 어려워질 수 있고, 세포가 3차원 배양되기 보다는 표면을 따라 배양될 우려가 있다.
다음으로 조건 (2)로써, 섬유웹의 공기투과도가 1 ~ 40cfm일 수 있다. 세포배양용 지지체에 세포를 입체적으로 성장시킬 때 중요요인 중 하나는 세포배양에 필요한 물질을 지속적으로 원활히 공급시켜줄 수 있는지 여부이다. 만일 세포가 세포배양용 지지체 표면 상에 입체적으로 성장될 때 지지체에 인접해서 배치되는 세포들이나, 세포배양용 지지체 내부 공간에 침투, 안착하여 배양되는 세포의 경우 세포군집체의 노출된 부분에 위치하는 세포나 세포배양용 지지체의 표면상에 위치한 세포에 비해 세포배양액에 원활히 접촉하기 어려울 수 있다. 또한, 상술한 지지섬유의 재질이 생분해성 성분일 경우 생분해성 성분은 수분 등의 지속적 접촉에 의해 분해될 수 있다. 그러나 수분 등이 지지체 내부로 이동이 어려울 경우 생분해성 성분의 분해가 지연되고 이를 통해 배양된 3차원 형상의 세포군집체를 지지체에서 분리하기 어려울 수 있다.
따라서 이를 방지하기 위해 상기 섬유웹의 공기투과도는 1 ~ 40cfm일 수 있다. 만일 공기투과도가 1.0cfm 미만일 경우 세포가 지지체 내부에 침투하기 어려울 수 있고, 세포배양액이나 생분해성 성분을 용해시킬 수 있는 성분의 통과도 원활하지 않을 수 있다. 또한, 만일 공기투과도가 40cfm을 초과할 경우 섬유웹의 기계적 강도가 현저히 낮거나 또는 지지섬유의 섬도의 직경과 두께가 현저히 큰 섬유웹이 구현될 수 있고, 이에 따라서 지지체의 중량이 커지고, 한정된 작은 부피의 배양기에 적용하기 어려울 수 있으며, 파종된 세포의 탈리로 인해 목적하는 양으로 배양이 어려울 수 있다.
또한, 보다 바람직하게는 상기 섬유웹(100)이 조건 (3) 및/또는 조건 (4)를 더 만족할 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 조건 (3)으로써, 생분해성 지지섬유들의 직경분포에서 하기 수학식 1에 따른 값이 1.5 ~ 6.8일 수 있고, 이를 통해 섬유웹(100)에 파종된 세포가 섬유웹의 내부 공간에 보다 용이하게 침투할 수 있고, 상술한 지지체 표면 모폴로지가 평탄하지 않는 표면으로 구현된 섬유웹을 더욱 용이하게 구현할 수 있음으로써, 입체적인 세포군집체의 배양에 더욱 적합할 수 있다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2017005705-appb-I000004
상기 수학식 1에서 a사부위수란, 섬유웹에 포함된 다수개의 생분해성 지지섬유를 직경순으로 배열한 후, 총도수에 해당하는 전체 생분해성 지지섬유 개수를 4등분한 a/4번째에 해당하는 지지섬유의 직경을 의미하며, 1사분위수란 직경분포도에 전체 지지섬유 개수의 1/4번째에 해당하는 지지섬유의 직경을 의미하고, 3사분위수란 1사분위수란 직경분포도에 전체 지지섬유 개수의 3/4번째에 해당하는 지지섬유의 직경을 의미한다. 일예로, 지지섬유 개수가 15개일 때, 1사분위수의 위치는 직경이 4번째로 큰 지지섬유를 의미하고, 1사분의수는 그때 지지섬유의 직경을 의미한다. 한편, 지지섬유의 총 개수가 짝수로써, 일예로 20개일 때, 중위수(2사분위수) 위치는 1사분위수 위치는 5번쨰 지지섬유와 6번째 지지섬유의 사이에 해당하며, 1사분위수는 5번째 지지섬유와 6번쨰 지지섬유의 평균으로 계산된다.
섬유웹에 포함된 복수개의 지지섬유들에 대한 1사분위수, 3사분위수 및 최대직경값에 대한 수학식 1에 따른 값이 1.5 ~ 6.8을 만족함을 통하여 파종된 세포가 지지체 표면뿐만 아니라 지지체 내부로 침투되고, 평탄하지 않은 지지체 표면 모폴로지를 구현하기에 보다 용이할 수 있고, 이를 통해 입체적 세포군집체의 배양에 적합할 수 있다. 만일 수학식 1에 따른 값이 1.5 미만일 경우 파종된 세포가 세포배양용 지지체 표면에서 2차원적 배양될 우려가 있는 등 목적하는 3차원적 세포군집체의 배양이 어려울 수 있다. 또한, 만일 만일 수학식 1에 따른 값이 6.8을 초과할 경우 지지섬유의 직경 분포가 매우 넓어지고 이에 따라서 목적하는 소정의 공경으로 지지체를 구현하기 어려울 수 있고, 지지체 내 거대기공이 존재할 수 있어서 파종된 세포가 지지체에서 쉽게 외부로 탈리될 우려가 있는 등 목적하는 3차원적 세포군집체의 배양이 어려울 수 있다. 여기서 상기 거대기공이란 파종된 세포의 직경보다 10배 큰 직경을 갖는 기공을 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 조건 (4)로써, 지지섬유들의 직경분포에서 하기 수학식 2에 따른 값이 1.0 ~ 5.5일 수 있고, 이를 통해 섬유웹(100)에 파종된 세포가 섬유웹의 내부 공간에 보다 용이하게 침투할 수 있고, 상술한 지지체 표면 모폴로지가 평탄하지 않는 표면으로 구현된 섬유웹을 더욱 용이하게 구현할 수 있음으로써, 입체적인 세포군집체의 배양에 더욱 적합할 수 있다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2017005705-appb-I000005
만일 수학식 2에 따른 값이 1.0 미만일 경우 표면 모폴로지가 평탄한 섬유웹이 구현될 수 있어서 파종된 세포가 세포배양용 지지체 표면에서 2차원적 배양될 우려가 있는 등 목적하는 3차원적 세포군집체의 배양이 어려울 수 있다. 또한, 만일 만일 수학식 2에 따른 값이 5.5를 초과할 경우 지지섬유 중에서 직경이 최소인 지지섬유와 1사분위 위치에 해당하는 지지섬유간 직경 범위가 넓어지게 됨에 따라서 직경이 작은 지지섬유의 비율이 높아질 수 있고, 이로 인하여 작은 공경의 기공비율이 높아져 파종된 세포가 세포배양용 지지체 내부로 침투, 배양되기 어려워 지는 등 목적하는 3차원적 세포군집체의 배양이 어려울 수 있다.
또한, 상술한 조건(3)과 조건(4)를 동시에 만족하도록 세포배양용 지지체가구현될 경우 세포의 섬유웹 내부 이동, 증식이 증가하고, 표면 모폴로지의 비평탄화로 세포 표면과 내부에서 동시에 세포가 입체적으로 배양되는 동시에서 배양용액의 투과성 증가하여 내부에서 증식하는 세포들의 배양을 증진시키고 사멸을 방지할 수 있는 이점이 있다.
한편, 상술한 섬유웹(100)은 적어도 일부의 지지섬유 표면에 고정된 생리활성성분을 더 포함할 수 있다. 이때, 적어도 일부의 생분해성 지지섬유의 의미는 1가닥의 지지섬유 중 일부 및/또는 복수 가닥의 지지섬유 중 일부가닥을 모두 포함한다.
최근 연구되고 있는 세포배양기술은 실제 체내의 세포간 환경을 in vitro에서 구현시키는 방향으로 연구되고 있으며, 세포배양 환경을 체내의 세포환경과 유사하게 조성시키기 위하여 체내 세포외 기질(ECM)에 구비되는 각종 성분을 in vitro 배양시 배양용액에 포함시켜 적용하는 추세에 있다. 그러나 배양용액에 세포배양을 증진시킬 수 있는 물질을 포함시킬 경우 배양되는 세포에 지속적으로 상기 물질을 노출시키는데 한계가 있으며, 지속적 노출을 위해서는 배양용액에 상기 물질의 함량을 증가시켜야 하나, 이는 비용의 증가, 증식효율에 있어서 문제가 있다. 이에 따라 본 발명의 일실시예에 따른 섬유웹에 포함되는 지지섬유의 표면에는 생리활성성분이 고정된 상태로 지지체에 구비시켜 지지섬유 상 또는 지지섬유로 둘러싸인 공간내에 위치하는 배양세포에 생리활성성분을 통한 부착 안정화, 세포자극 및 이를 통한 세포 내 신호전달을 지속, 증폭시켜 세포증식을 더욱 가속화 시킬 수 있는 이점이 있다.
상기 생리활성성분은 세포의 부착, 이동, 성장, 증식(proliferation) 및 분화(differentiation) 중 어느 하나 이상을 유도하는 성분일 수 있다.
먼저, 생리활성 성분 중 세포의 부착을 향상시키는 성분인 접착성 생리활성성분은 배양세포를 초기에 세포지지체 상에 고정시켜 배양용액상에 로딩된 세포가 부유하는 것을 방지하는 기능 및/또는 세포의 이동, 성장, 증식 및 분화 등에 관여하는 비접착성 생리활성성분을 지지섬유상에 고정시켜 비접착성 생리활성성분이 지지섬유 상에 세포배양 되는 과정에서 지지섬유에서 탈리를 방지하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 접착성 생리활성성분은 통상의 생체적합성이 있어서 세포독성을 발생시키지 않는 공지된 접착성 생리활성성분의 경우 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 아미노산 서열이 1회 내지 20회 반복하여 이루어진 단백질 및 이들 단백질 중 적어도 2개가 융합된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있고, 이를 통해 세포독성이 현저히 저하되고, 비접착성 생리활성성분에 대한 접착력이 우수한 동시에 세포배양 중 접착성 생리활성성분이 배양용액에 용해됨에 따라서 발생하는 고정된 비접착성 생리활성성분의 탈리나 세포의 단리가 방지될 수 있는 이점이 있다.
한편, 상기 접착성 생리활성성분은 도 2a에 도시된 것과 같이, 제1섬유형성성분(111a)으로 구현된 제1지지섬유(111)의 표면에는 일 접착성 생리활성성분(111b1)이 고정될 수 있으며, 이때, 상기 일 접착성 생리활성성분(111b1)은 성분의 일부가 지지섬유 내부에 위치하고, 나머지 일부가 섬유 외부에 위치하도록 구비되어 지지섬유 표면에 고정될 수 있다. 또는 도 3a에 도시된 것과 같이 제5지지섬유(115)의 내부에는 접착성 생리활성성분이 구비되지 않고, 외부면 일 영역에 접착성 생리활성성분(115b)이 고정될 수 있다. 또는, 도 3b에 도시된 것과 같이 제6지지섬유(116)의 외부면을 전부 피복하여 구비될 수도 있다.
다음으로, 섬유웹에 구비될 수 있는 생리활성성분 중 세포배양을 증진시킬 수 있도록 세포의 이동, 성장, 증식(proliferation) 및 분화(differentiation) 중 어느 하나 이상을 직/간접적으로 유도하는 비접착성 생리활성성분은 이와 같은 기능을 발현하는 것으로 알려진 공지의 물질인 경우 제한 없이 포함될 수 있다. 일예로, 상기 생리활성성분은 모노아민, 아미노산, 펩타이드, 당류(saccharide), 지질(lipid), 단백질, 당단백질(glucoprotein), 당지질(glucolipid), 프로테오글리칸, 뮤코다당(mucopolysaccharide) 및 핵산(nucleic acid) 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물 및 세포 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이때, 모노아민은 일예로, 카테콜아민, 인돌아민 등 1차 아민을 포함하는 화합물을 포함한다. 또한, 상기 펩타이드는 올리고펩타이드를 포함하며, 상기 단백질은 폴리펩티드를 포함하고, 일예로, 피브로넥틴 등일 수 있다. 상기 당류는 단당류, 다당류, 올리고당 및 탄수화물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 지질은 일예로 스테로이드 호르몬일 수 있다.
한편, 상기 생리활성성분은 모티프를 포함할 수 있다. 상기 모티프는 생장인자(growth factor) 또는 세포외기질(extracellular matrix)에 포함되는 단백질, 당단백질 및 프로테오글리칸 중에서 선택된 어느 하나 이상에 구비된 소정의 아미노산 서열을 포함하는 천연 펩타이드 또는 재조합 펩타이드일 수 있다. 구체적으로 상기 모티프는 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 앙기오포이에틴(Angiopoietin), 뼈형성단백질(BMP), 뇌유래신경영양인자(BDNF), 표피생장인자(EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin), 섬유아세포 증식인자(Fibroblast growth factor), 신경교의세포주유래신경영양인자(GDNF), 과립구집락자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 성장분화인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포생장인자(HGF), 간세포선종 유래 생장인자(Hepatoma-derived growth factor, HDGF), 인슐린유사생장인자(Insulin-like growth factor, IGF), 각질세포 증식인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 이동자극인자(Migration-stimulating factor, MSF), 마이오스타틴(Myostatin, GDF-8), 신경생장인자(Nerve growth factor, NGF), 혈소판유래생장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), T-세포생장인자(T-cell growth factor, TCGF), 뉴로필린, 형질전환생장인자-알파(TGF-α), 형질전환생장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 혈관내피생장인자(VEGF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생장인자(GF)에 포함된 소정의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는, 히알루론산, 헤파린황산염, 콘드로이틴황산염, 테르마틴황산염, 케라탄황산염, 알진염, 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세포외기질(extracellular matrix)에 포함되는 소정의 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 모티프는 생장인자에 포함되는 소정의 아미노산 서열 및 상기 세포외기질에 포함되는 소정의 아미노산 서열을 모두 포함할 수도 있다. 보다 바람직하게는 상기 모티프는 서열번호 8 내지 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 단백질 및 이들 단백질 중 적어도 2개가 융합된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 모티프는 상술한 접착성 생리활성성분에 공유결합시켜 일체로 구현될 수도 있다. 일예로, 상기 접착성 생리활성성분이 단백질인 경우 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 상기 모티프를 직접 공유결합시키거나 이종의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 개재시켜 공유결합시킬 수 있으며, 이 경우 지지섬유에 더욱 견고히 비접착성 생리활성성분을 부착시킬 수 있고, 비접착성 생리활성성분의 세포배양 중 탈리를 최소화시킬 수 있다.
상술한 생리활성성분은 도 2b에 도시된 것과 같이 제2섬유형성성분(112b)으로 구현된 제2지지섬유(112)의 표면에 생리활성성분(112c)의 일부가 지지섬유 내부에 위치하고, 나머지 일부가 섬유 외부에 위치하도록 구비되어 지지섬유 표면에 고정될 수 있다. 또한, 도 2c 및 2d에 도시된 것과 같이 생리활성성분(113c1, 113c2, 114c1)이 섬유형성성분(113a,114a)으로 구현된 지지섬유(113,114)의 표면에 고정된 일 접착성 생리활성성분(113b,114b1)을 개재하여 지지섬유(113)에 고정될 수 있다.
또한, 상기 생리활성성분은 도 3a에 도시된 것과 같이 제5지지섬유(115)의 내부에는 접착성 생리활성성분이나 생리활성성분이 구비되지 않고, 외부면 일 영역에 고정된 접착성 생리활성성분(115b)을 통해 생리활성성분(115c1,115c2)이 지지섬유(115) 외부면 일부분에 고정될 수 있다. 또는, 도 3b에 도시된 것과 같이 제6지지섬유(116)의 외부면을 전부 피복하여 구비되는 접착성 생리활성성분(116b)을 전부 피복하도록 생리활성성분(116c)이 구비될 수도 있다.
한편, 도 2a 내지 도 2d와 같이, 지지섬유(111,112,113,114) 내부에 접착성 생리활성성분(111b2, 112b2,114b2) 및/또는 비접착성 생리활성성분(112c2)이 더 포함될 수 있다. 섬유내부에 접착성성분 및/또는 비접착성 생리활성성분을 포함하는 지지섬유는 후술되는 지지섬유의 일제조예와 같이 지지섬유로 제조되기 위한 방사용액에 생분해성 섬유형성성분과 함께 접착성 생리활성성분 및/또는 비접착성 생리활성성분이 혼합된 상태로 방사되어 지지섬유로 제조된 경우 일 수 있다. 방사단계에서부터 접착성 생리활성성분을 포함시킬 경우 접착성 생리활성성분(111b1, 112b1, 113b1, 114b1)의 일부분을 지지섬유(111,112,113,114) 내부에 위치시킴으로써 접착성 생리활성성분(111b1, 112b1, 113b1, 114b1)이 지지섬유에서 이탈되는 것을 최소화시킬 수 있다. 또한, 방사단계에서부터 비접착성 생리활성성분을 포함시킬 경우 도 2b에서 확인할 수 있듯이 별도의 접착성 생리활성성분 없이도 비접착성 생리활성성분(112c1)을 지지섬유(112)에 고정시킬 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일실시예에 의한 세포배양용 또는 조직공학용 지지체는 상술한 섬유웹(100)을 단층으로 포함하거나 또는 복수개가 적층된 적층체일 수 있다. 또한, 지지체를 배양용기 등에 부착시키기 위한 접착층 등의 통상의 세포배양용/조직공학용 지지체에서 구비되는 기능층을 어느 일면에 더 구비할 수 있다.
상술한 섬유웹을 포함하는 지지체는 후술하는 제조방법을 통해 제조될 수 있다. 그러나 후술되는 제조방법에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 지지체는 (1) 섬유형성성분을 포함하는 방사용액을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 방사용액을 전기방사하여 지지섬유가 축적되어 형성된 섬유웹을 제조하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.
먼저, 상기 (1) 단계에서의 방사용액은 섬유형성성분 이외에 용매를 포함할 수 있다.
상기 용매는 통상의 전기방사용액의 제조에 사용되며 상술한 생분해성 또는 비생분해성 섬유형성성분을 용해할 수 있는 용매의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 후술하는 (2) 단계가 건식방사일 경우 쉽게 기화될 수 있는 용매를 선택함이 바람직하다. 상기 용매는 구체적으로 선택되는 생분해성 화합물의 종류에 따라 용매의 종류를 달리 선택할 수 있음에 따라 구체적인 종류를 본 발명은 특별히 한정하지 않는다. 일예로, 상기 용매는 DEC(diethyl carbonate), DMC(dimethyl carbonate), EMC(ethyl methyl carbonate), PC(propylene carbonate), 물, 초산(acetic acid), 개미산(formic acid), 디메틸포름아미드(DMF), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 아세톤(acetone), HFIP(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol) 및 이소프로필알콜(isopropylalchol)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 방사용액은 점도가 50 ~ 3000cps이 되도록 섬유형성성분 및 용매가 혼합될 수 있다. 만일 방사용액의 점도가 50cps 미만이면 방사용액의 흐름성이 높아 방사장치의 노즐에서 액적이 분사되어 섬유웹을 제조하기 어렵고, 방사용액의 점도가 2000cps를 초과하면 방사용액 흐름성이 낮아 방사성이 저하될 수 있다.
또한, 상기 방사용액에는 통상적인 세포배양용 지지체나 조직공학용 지지체에 구비되는 첨가제를 더 포함할 수 있고, 일예로, 상기 첨가제는 비이온계면활성제 등의 친수성 향상성분일 수 있다. 그 이외의 상기 첨가제는 목적에 따라 공지의 첨가제를 선택할 수 있음에 따라서 본 발명은 이에 대한 설명을 생략한다.
한편, 상술한 방사용액은 용매를 포함하여 섬유형성성분이 용해된 용액을 기준으로 설명하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 섬유형성성분이 용융된 용융액일 수 있음을 밝혀둔다.
다음으로 (2) 단계로써, 상기 방사용액을 전기방사하여 섬유웹을 제조하는 단계를 수행한다.
상기 (2) 단계는 통상의 전기방사장치를 통해 수행될 수 있으며, 상기 전기방사장치는 방사용액이 저장된 용액탱크, 고전압 발생기가 연결된 복수개의 방사노즐이 다수 열/다수 행으로 배열된 방사팩을 포함할 수 있다. 한편, 방사팩의 하부에는 콜렉터가 구비되어 방사되는 지지섬유가 축적된 섬유매트를 수집할 수 있으며, 상기 콜렉터는 컨베이어벨트 상에 위치되어 순차적으로 형성된 일정두께의 연속된 섬유매트를 수집할 수도 있다. 이때, 상기 콜렉터에는 외부응고액이 담지되어 방사된 지지섬유가 고화되거나 또는 외부응고액 없이 방사된 지지섬유가 공기 또는 별도의 냉각풍을 통하여 고화되어 콜렉터상에 수집될 수 있다.
수집된 지지섬유 매트는 이후 잔존 용매, 외부응고액 등을 기화시키기 위한 건조공정을 거칠 수 있고 이를 통해 섬유웹으로 제조될 수 있다.
상기 제조된 섬유웹은 친수성을 향상시키기 위하여 표면에 플라즈마 처리, 도파민 등의 성분으로 지지섬유의 표면코팅 등을 더 수행할 수 있다.
또한, 제조된 섬유웹은 공경크기 조절, 지지섬유를 형성하는 생분해성 성분의 배향을 위하여 특정방향으로 연신하는 공정을 더 수행할 수 있다. 또한, 상기 섬유웹은 3차원 네트워크 구조의 심화, 목적하는 두께, 평량을 만족하기 위하여 열 및/또는 압력을 가하는 공정을 더 수행할 수 있고, 상기 공정은 통상의 캘린더링 공정일 수 있다. 또한, 제조된 섬유웹의 일면, 일예로, 섬유웹의 테두리에 배양용기 등에 섬유웹이 고정, 부착될 수 있도록 별도의 접착층을 형성시키는 단계를 더 수행할 수도 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예와 같이 접착성 생리활성성분 및/또는 비접착성 생리활성성분을 더 포함하는 섬유웹은 제1방법으로써, 상술한 (1) 단계의 방사용액 제조단계에서 방사용액에 접착성 생리활성성분 및/또는 비접착성 생리활성성분을 혼합하여 방사시켜 처음부터 접착성 생리활성성분 및/또는 비접착성 생리활성성분이 지지섬유에 구비하도록 제조하는 방법을 통해 제조될 수 있다. 상기 제1방법을 통해서 도 2a 내지 2c와 같은 개질된 지지섬유를 포함하는 섬유웹을 제조할 수 있다.
또한, 제2방법으로써, 상술한 (1) 단계의 방사용액 제조단계에서 방사용액에 접착성 생리활성성분을 혼합하여 방사시켜 처음부터 접착성 생리활성성분이 지지섬유에 구비하도록 섬유웹을 제조 후 다른 종류의 생리활성성분을 섬유웹에 처리하여 상기 다른 종류의 생리활성성분을 지지섬유에 고정된 접착성 생리활성성분에 접착시킬 수 있다. 상기 제2방법을 통해서 도 2d와 같은 개질된 지지섬유를 포함하는 섬유웹을 제조할 수 있다. 이때, 상기 생리활성성분을 섬유웹에 처리하는 방법은 통상의 방법일 수 있으며, 일예로, 침지, 분무, 전착 등의 방법에 의할 수 있다.
또한, 제3방법으로써, 상술한 (1) 단계 및 (2) 단계를 통해 제조된 섬유웹의 표면에 접착성 생리활성성분을 처리하여 도 3a 또는 도 3b와 같이 지지섬유(115,116) 외부면의 적어도 일부분 또는 외부면 전부에 접착성 생리활성성분(115b,116b)을 피복시킨 후 피복된 접착성 생리활성성분 상에 비접착성 생리활성성분(115c1,115c2,116c)을 피복시켜 개질된 지지섬유를 포함하는 섬유웹을 제조할 수 있다.
이상으로 상술한 섬유웹을 포함하는 지지체는 상기 지지체를 내부에 구비하는 하우징을 포함하여 생물반응기로 구현될 수 있다. 상기 생물반응기는 세포를 증식 및/또는 분화시킬 수 있도록 세포증식이나 분화에 영향을 미치는 각종 영양인자가 포함되는 배양용액을 더 포함할 수 있다. 상기 배양용액은 생물반응기에 구비되는 통상의 용액일 수 있음에 따라서 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
또한, 상기 생물반응기는 상기 배양용액이 하우징 내부로 유입되는 유입구 및 외부로 배출되는 배출구를 더 구비할 수 있다. 또는 상기 생물반응기는 하우징 외부와 내부를 연결하는 유입구/배출구를 구비하지 않는 밀폐형의 하우징일 수 있다. 또한, 상기 생물반응기는 통상의 생물반응기가 구비하는 기타 부재를 더 포함할 수 있고, 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 의한 지지체는 통상적인 배양 용기에 구비되어 세포배양용기로 구현될 수 있다. 상기 지지체는 배양용기 내표면에 부착되거나 또는 배양용기 내 구비되는 배양용액 상에 부유하도록 구비될 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 의한 지지체는 상기 지지체에 포함된 섬유웹의 외부면 및 내부공간을 포함한 영역상에 배양된 세포집합체를 포함하여 체내이식용 키트로 구현될 수 있다. 상기 체내이식용 키트는 생분해성 성분으로 형성된 지지체로 구현됨이 바람직하고 이 경우 체내 이식 후 별도의 지지체 제거 수술 없이도 지지체가 체내에서 자연분해됨에 따라서 체내이식을 보다 용이하게 하는 이점이 있다. 상기 체내이식용 키트는 면역거부반응을 최소화시키거나 세포의 생착에 도움을 주는 기타 약물을 더 포함할 수 있다. 이떄, 상기 세포집합체는 전능줄기세포, 만능줄기세포, 다능줄기세포, 올리고포텐트(oligopotent) 줄기세포 및 단일줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 줄기세포, 및 조혈모세포, 간세포, 섬유세포, 상피세포, 중피세포, 내피세포, 근육세포, 신경세포, 면역세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혈액세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 분화세포 중 1 종 이상을 포함할 수 있다.
하기 표 2는 본 발명에서 설명된 서열번호에 따른 아미노선 서열을 나타낸 서열목록에 대한 표이다.
서열번호 아미노산 서열
1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser GluGlu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His SerGly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly LysTyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser GlyLys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly TyrLys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro ThrTyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro SerTyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr LysAla Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys
2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser GluGlu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His SerGly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly LysTyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser GlyLys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly TyrLys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro ThrTyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro SerTyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr LysAla Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro
3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp AlaAsp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly GlyAsn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp AsnAsn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys ProSer Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr TyrLys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu
4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly GlyGly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly TrpAsn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr HisTyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly TyrLys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr LysAsn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His ArgLys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala LysPro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro ThrTyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
8 Arg Gly Asp
9 Arg Gly Asp Ser
10 Arg Gly Asp Cys
11 Arg Gly Asp Val
12 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro
13 Gly Arg Gly Asp Ser
14 Gly Arg Gly Asp Thr Pro
15 Gly Arg Gly Asp Ser Pro
16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys
17 Tyr Arg Gly Asp Ser
18 Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr
19 Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
20 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
21 Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr
22 Lys Ala Phe Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe
23 Ile Lys Val Ala Asn
24 Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln
25 Val Ala Glu Ile Asp Gly Ile Gly Leu
26 Pro His Ser Arg Asn Arg Gly Asp Ser Pro
27 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
28 Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
먼저, 방사용액을 제조하기 위하여 섬유형성성분으로 폴리비닐리덴플루오라이드(Arkema사, Kynar761) 12g을 디메틸아세트아마이드와 아세톤의 중량비를 70:30으로 혼합한 혼합용매 88g에 80℃의 온도로 6시간 동안 마그네틱바를 사용하여 용해시켜 혼합용액을 제조했다. 상기 제조된 방사용액을 전기방사 장치를 사용하여 인가전압 25KV, 집전체와 방사구까지의 거리 25cm, 토출량 0.05ml/hole의 조건으로 RH 65% 30의 환경에서 전기방사를 실시하여, 두께 5.5㎛, 중량 5g/㎡의 섬유웹인 하기 표 3과 같은 세포배양용 지지체를 수득하였다. 상기 섬유웹을 형성하는 지지섬유는 평균직경이 693.9㎚이었고, 지지섬유 직경에 대한 표준편차가 86.0㎚이며, 지지섬유 중 직경이 가장 작은 것의 직경이 350.0㎚, 1사분위수(Q1)가 644.0㎚, 3사분위수(Q3)가 739.0㎚, 지지섬유 중 직경이 가장 큰 것의 직경이 1294.0㎚이었다.
<실시예 2 ~ 12>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 방사용액에서 PVDF성분의 농도를 조절하여 하기 표 3 또는 표 4와 같이 제조된 섬유웹에 포함된 지지섬유의 직경분포가 표 3 또는 표 4와 같은 섬유웹을 갖는 세포배양용 지지체를 수득하였다.
<실험예1>
실시예에서 제조된 섬유웹에 대하여 하기의 물성을 평가하여 하기 표 3에 나타내었다.
1. 섬유웹 내 지지섬유의 직경분포
섬경분포 프로그램(AMOGREENTECH 개발)을 통한 방법으로 측정된 지지섬유의 직경분포를 이용하여 평균, 표준편차, 1사분위수(Q1), 3사분위수(Q3) 및 상술한 수학식 1, 수학식 2를 계산하였다. 또한, 실시예 1 내지 3에서 측정된 지지섬유의 직경분포를 통해 직경별 지지섬유의 누적개수를 도 4에 그래프를 통해 나타내었다.
2. 섬유웹의 공기투과도
공기 투과도는 TEXTEST instruments 장비를 이용하여 섬유웹을 시험 면적 38㎠ 크기로 절단한 후 장비에 파지시키고, 시험 압력 125Pa로 공기를 불어 주어 통과하는 공기의 양을 측정했고, 공기투과도의 단위는 cfm(ft3/ft2/min)으로 하였다.
3. 섬유웹의 주사전자현미경사진(SEM) 촬영
실시예 1 내지 3에 따른 섬유웹에 대한 SEM 사진을 촬영하여 도 5 내지 7에 나타내었다.
<실험예2>
실시예에서 제조된 섬유웹을 같은 크기로 잘른 후 세포배양용 well plate에 고정시켰다. 섬유웹이 구비된 well plate에 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)를 5×104cell/cm2로 로딩시킨 후 KBS-3 Basal medium(B1001) 500㎖에 KSB-3 supplyments(S2901) 2㎖를 혼합시킨 배지에 FBS(Fetal Bovine Serum)를 전체 배지 중량의 10%가 되도록 투입하고, Penicillin/Streptomycin을 전체 배지 부피의 1/100이 되도록 포함시켜 제조한 배지에서 37℃로 4일동안 증식시켰다.
이후, 배양된 중간엽 줄기세포(MSC)에 대하여 셀 카운팅 키트 8 (CCK -8)을 이용하여 염색시킨 뒤, UV-vis spectrometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 이때 control은 cell culture dish에서 동일한 배양조건으로 2D culture된 것을 사용했다.
실시예를 통해 측정된 흡광도 중 실시예1의 흡광도를 100%로 기준하여 나머지 실시예의 흡광도를 상대적으로 하기 표 3 또는 표 4에 나타내었다.
흡광도가 높을수록 세포배양용 지지체에 세포의 안착 후 배양이 잘 된 것으로 평가할 수 있다.
<실험예3>
실험예1과 동일하게 실시하여 섬유웹이 구비된 well plate를 준비하였다. 준비된 well plate에 섬유아세포(HS27)를 로딩시킨 후 10% 완전배지에서 37℃에서 4일동안 증식시켰다. 이때, 10 % 완전배지는 듀베코스의 변형된 이글즈 배지(DMEM)에 함의(Ham's) F12 배지를 1 : 1.5의 부피비로 혼합한 후, 소태아혈청(fetal bovine serum) 7vol%, 페니실린 65 U/mL 및 스트렙토마이신 65㎍/mL을 첨가하여 제조하였다.
이후, 배양된 섬유아세포(HS27)에 대하여 셀 카운팅 키트 8(CCK -8)을 이용하여 염색시킨 뒤, UV-vis spectrometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 이때 control은 cell culture dish에서 동일한 배양조건으로 2D culture된 것을 사용했다. 실시예를 통해 측정된 흡광도 중 실시예1의 흡광도를 100%로 기준하여 나머지 실시예의 흡광도를 상대적으로 하기 표 3 또는 표 4에 나타내었다.
또한, 실시예 2에 따른 세포배양용 지지체에 섬유아세포를 파종 후 1일차에 증식된 섬유아세포에 대하여 SEM 사진을 촬영하여 도 8(×500배)과 도 9(×8000배)에 나타내었다.
실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6
섬유웹 평균직경(㎚) 693.9 214.4 1029.9 598.5 601.6 612.2
직경 표준편차(㎚) 86.0 32.7 96.7 128.4 138.5 156.3
최소직경(㎚) 350.0 140.0 740.0 225.0 228.5 190.5
1사분위수(Q1, (㎚) 644.0 192.0 964.3 546.0 532.4 502.7
3사분위수(Q3, (㎚) 739.0 234.0 1081.0 689.0 750.1 790.4
최대직경(㎚) 1294.0 472.0 1385.0 1364.0 1465.4 1430.4
분산계수(%) 12.39 15.25 9.39 21.45 23.02 25.53
수학식1 5.84 5.67 2.60 4.72 3.29 2.22
수학식2 3.09 1.24 1.92 2.24 1.40 1.09
평량(g/㎡) 5.0 3.8 4.7 5.2 5.4 5.6
두께(㎛) 5.5 5.2 5.5 5.5 5.5 5.5
공기투과도(cfm) 6.22 2.84 23.00 6.80 3.65 2.44
배양결과 줄기세포 상대흡광도(%) 100 97.6 109.1 103.1 97.3 89.6.
섬유아세포 상대흡광도(%) 100 111.4 99.3 100 96.7 94.2
실시예7 실시예8 실시예9 실시예10 실시예11 실시예12
섬유웹 평균직경(㎚) 1018.9 1408.4 1227.0 1230.0 620.4 680.0
직경 표준편차(㎚) 68.8 116.0 108.0 110.1 90.4 120.4
최소직경(㎚) 774.7 1117.5 870.4 808.0 330.0 333.0
1사분위수(Q1, (㎚) 989.0 1334.0 1169.4 1153.3 560.4 628.0
3사분위수(Q3, (㎚) 1075.4 1621.0 1373.0 1310.0 659.0 740.0
최대직경(㎚) 1355.0 1883.0 1662.0 1555.0 1305.0 1550.0
분산계수(%) 6.75238 8.236297 8.801956 8.95122 14.57124 17.70588
수학식1 3.236111 0.912892 1.41945 1.563497 6.551724 7.232143
수학식2 2.480324 0.754355 1.468566 2.203574 2.336714 2.633929
평량(g/㎡) 4.5 4.3 4.5 4.5 5.0 5.2
두께(㎛) 5.5 5.6 5.5 5.5 5.4 5.6
공기투과도(cfm) 32.64 42.61 30.55 37.13 5.65 6.32
배양결과 줄기세포 상대흡광도(%) 90.0 89.6 97.1 106.9 104.3 97.5
섬유아세포 상대흡광도(%) 91.5 90.1 95.5 98.2 98.3 96.5
상기 표 3 및 표 4에서 확인할 수 있듯이,
실시예 2는 실시예1보다 섬유아세포에 대한 상대흡광도가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있는데, 이는 평균직경이 작은 지지섬유로 구현됨에 따라서 지지체 표면의 평탄한 정도가 실시예1보다 크고, 이로 인해 줄기세포보다 섬유아세포에 적합한 배양환경이 구현된 결과로 예상된다.
또한, 실시예3은 실시예1보다 줄기세포에 대한 상대흡광도가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있는데, 이는 실시예3이 실시예1보다 평균직경이 큰 섬유로 구현됨에 따라서 지지체 표면의 평탄한 정도가 실시예1보다 작아지고, 이로 인해 줄기세포에 더 적합한 배양환경이 구현된 결과로 예상된다.
한편, 실시예 1, 실시예 4 내지 6에서 평균직경이 유사한 지지섬유로 구현된 지지체인 경우에도 직경에 대한 분산계수가 본 발명에 따른 바람직한 범위를 벗어나는 실시예 6의 경우 세포 파종 후 배양결과 실시예 1, 4, 5에 대비하여 상대흡광도가 크게 저하되었고, 특히 줄기세포에 대해 크게 저하된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 수학식 1과 관련하여, 실시예3, 실시예9 내지 실시예12를 살펴보면, 실시예 9의 경우 실시예3, 실시예10에 대비하여 섬유아세포의 상대흡광도가 감소했고, 특히 줄기세포에 대한 상대흡광도가 감소한 것을 확인할 수 있다. 또한, 실시예12 역시, 실시예3, 실시예11에 대비하여 섬유아세포 및 줄기세포에 대한 상대흡광도가 감소한 것을 확인할 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 지지섬유를 포함하여 형성된 3차원 네트워크 구조의 섬유웹;을 구비하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 섬유웹은 평균공경이 0.05 ~ 10㎛이고, 기공도가 40 ~ 90 %인 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 지지섬유는 평균직경이 100㎚~ 1㎛인 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 섬유웹의 두께는 1 ~ 20㎛이고, 평량은 1 ~ 30g/㎡인 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 섬유웹은 지지섬유를 다수개 포함하고, 하기의 조건 (1)과 조건 (2)를 만족하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
    (1) 지지섬유들의 직경분포에서 지지섬유들의 직경 분산계수(E) 8 ~ 25%
    (2) 섬유웹의 공기투과도 1 ~ 40cfm
  6. 제1항에 있어서,
    상기 지지섬유는 세포의 부착, 이동, 성장, 증식(proliferation) 및 분화(differentiation) 중 어느 하나 이상을 유도하는 생리활성성분을 외부면에 더 구비하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 생리활성성분은 모노아민, 아미노산, 펩타이드, 당류(saccharide), 지질(lipid), 단백질, 당단백질(glucoprotein), 당지질(glucolipid), 프로테오글리칸, 뮤코다당(mucopolysaccharide) 및 핵산(nucleic acid) 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물 및 세포 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 지지섬유는 방사용액에 상기 생리활성성분을 포함하여 방사된 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 지지섬유들의 직경분포에서 하기의 조건 (3)을 더 만족하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
    (3) 수학식 1에 따른 값이 1.5 ~ 6.8
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2017005705-appb-I000006
  10. 제5항에 있어서,
    지지섬유들의 직경분포에서 하기의 조건 (4)를 더 만족하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
    (4) 수학식 2에 따른 값이 1.0 ~ 5.5
    [수학식 2]
    Figure PCTKR2017005705-appb-I000007
  11. 제1항에 있어서,
    상기 지지섬유는 PCL(polycaprolactone), PDO(polydioxanone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide)), PEO(polyethylene oxide), PLA(Polylactic acid) 및 PVA(polyvinyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생분해성 성분을 섬유형성성분으로 포함하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 지지섬유은 폴리스티렌(Poly styrene), PET (Polyethylene terephthalate), PES(Polyethersulfone), PVDF(Polyvinylidene fluoride), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리에틸렌 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록공중합체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 비생분해성 성분을 섬유형성성분으로 포함하는 세포배양용 또는 조직공학용 지지체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 지지체; 및
    상기 지지체를 내부에 구비하는 하우징;을 포함하는 생물반응기(bioreactor).
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 지지체; 및
    상기 지지체의 섬유웹 외부 및 내부 공간을 포함하여 배양된 세포집합체;를 포함하는 체내이식용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포집합체는 전능줄기세포, 만능줄기세포, 다능줄기세포, 올리고포텐트(oligopotent) 줄기세포 및 단일줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 줄기세포, 및
    조혈모세포, 간세포, 섬유세포, 상피세포, 중피세포, 내피세포, 근육세포, 신경세포, 면역세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혈액세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 분화세포 중 1 종 이상을 포함하는 체내이식용 키트.
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