WO2019013519A1 - 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단 - Google Patents

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WO2019013519A1
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cell culture
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구송희
장선호
서인용
이승훈
김찬
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    • D10B—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBLASSES OF SECTION D, RELATING TO TEXTILES
    • D10B2509/00—Medical; Hygiene

Definitions

  • the present invention relates to fabrics for cell culture supports, and more particularly to multilayer fabrics for cell culture supports.
  • Cell culture is a technique for extracting cells from a living body and culturing them out of the living body.
  • the cultured cells are differentiated into various tissues of the body such as skin, organs, nerves, etc. and transplanted into the human body before transplantation into the human body. And can be used for treating various diseases.
  • tissue culture is related to cell culture and it is a multidisciplinary study applying existing scientific fields such as cytology, life sciences, engineering, medicine, etc., and the correlation between the structure and function of living tissue And new fusion techniques are being studied to replace damaged tissues or organs with normal tissues and regenerate them.
  • the toxicity test of a specific substance using cultured cells is more similar to the actual case than when the cell is cultured / differentiated in a three-dimensional structure similar to the cell structure of the human body may be suitable as an in vitro cytotoxicity experimental model.
  • the transplanted cells or tissues can sufficiently function and function when the cultured / differentiated cell aggregate or tissue is transplanted into a three-dimensional structure similar to the actual tissue of the human body .
  • the cell culturing or tissue engineering scaffold developed to date has not been cultured in a similar structure to the body, and the survival rate of the cells is not high. Therefore, in vitro cultured cells can not be used as an experimental model or a cell for grafting there is a problem. That is, when the support for cell culturing or tissue engineering is made of nanofibers suitable for the size of cells, the mechanical properties are poor, which may cause problems in cell culture.
  • the raw material for cell culturing or tissue engineering support may contain a cell growth improving substance necessary for cell culture.
  • a cell growth improving substance necessary for cell culture.
  • the mechanical strength of the yarn is weakened due to the cell growth improving substance contained in the yarn, There is a problem in that the process passing property becomes remarkably deteriorated. Further, there may be a problem that the cells are easily separated as the yarn is cut in the external force during cell culture.
  • the present invention has been made in view of the above points, and it is an object of the present invention to provide a micro-environment suitable for attachment, migration, proliferation and differentiation of cells to improve the survival rate of cells, to proliferate cells three- It is an object of the present invention to provide a multilayer fabric for a cell culture support capable of easily recovering cells.
  • the present invention provides a support capable of stably growing cells and preventing the cells from being desorbed as the sufficient mechanical strength is developed so that collapse of supporters generated during the culturing of cells can be prevented There is another purpose.
  • the present invention provides a support capable of culturing the shape / structure of cells cultured to be more suitable for applying the cultured cells to an in vitro experimental model or an animal for transplantation in a similar manner to an actual animal body, There is a purpose.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a yarn manufacturing method, And a second fabric formed on at least one side of the first fabric and having a smaller average pore size than the first fabric, the fabric comprising a first yarn and a second yarn.
  • the average pore diameter of the first and second fabrics may satisfy the following condition (1).
  • a is the average pore diameter ( ⁇ ⁇ ) of the first raw fabric
  • b is the average pore diameter ( ⁇ ⁇ ) of the second raw fabric.
  • the first raw material may have an average pore size of 0.5 to 1 ⁇
  • the second raw material may have an average pore size of 0.1 to 0.5 ⁇ .
  • the first fabric may have a basis weight of 1 to 30 g / m 2 and an air permeability of 0.1 to 10 cfm.
  • the first yarn may have an average diameter of 100 to 500 ⁇ .
  • the second fabric may have a basis weight of 1 - 30 g / m < 2 > and an air permeability of 0.1 to 10 cfm, and the second yarn may have an average diameter of 100 to 500 mu m.
  • the first raw material may include a hydrophilic polymer
  • the second raw material may include a hydrophobic polymer
  • first and second fabrics may be provided, and the first and second fabrics may be alternately stacked or randomly stacked.
  • the first fabric and the second fabric may be independently any one of a knitted fabric, a woven fabric, and a nonwoven fabric.
  • any one or more of the first yarn and the second yarn may include a cell culture improving substance.
  • the cell culture enhancing substance may be a physiologically active ingredient that induces at least one of cell adhesion, migration, growth, proliferation, and differentiation.
  • physiologically active component may be selected from the group consisting of monoamines, amino acids, peptides, saccharides, lipids, proteins, glucoproteins, glucolipids, proteoglycans, mucopolysaccharides, ) And one or more kinds of cells.
  • the first raw material may be one or more selected from the group consisting of polycaprolactone, polydioxanone, polyglycolic acid, polylactide (PLLA), poly (DL-lactide-co- glycolide) (PS), polyethylene terephthalate (PET), polyethylene terephthalate (PET), polyethylene terephthalate (PET), polyvinyl alcohol, and the like.
  • PLLA polylactide
  • PS poly (DL-lactide-co- glycolide)
  • PET polyethylene terephthalate
  • PET polyethylene terephthalate
  • PET polyethylene terephthalate
  • PET polyvinyl alcohol
  • PES polyvinylidene fluoride
  • PVDF polyacrylonitrile
  • PAN polyacrylonitrile
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the present invention provides a multi-layer fabric for a cell culture support as described above; And a tissue engineered graft containing the cultured cells in the fabric.
  • the cell may be at least one stem cell selected from the group consisting of ovarian stem cells, pluripotent stem cells, pluripotent stem cells, oligopotent stem cells and single stem cells, Wherein the cell is selected from the group consisting of at least one differentiated cell selected from the group consisting of a cell, a stem cell, a stem cell, a stem cell, an epithelial cell, a mesothelial cell, an endothelial cell, a muscle cell, a neuron cell, an immune cell, And may include at least one selected.
  • amino acid sequences used in the present invention are abbreviated as IUPAC-IUB nomenclature as shown in Table 1 below.
  • IUPAC-IUB Nomenclature sign Abbreviation IUPAC-IUB Nomenclature sign Abbreviation IUPAC-IUB Nomenclature sign Abbreviation Alanine A Ala Glycine G Gly Proline P Pro Arginine R Arg Histidine H His Serine S Ser Asparagine N Asn Isoleucine I Ilt Threonine T Thr Cysteine C Cys Lysine K Lys Tryptophan W Trp Glutamic acid E Glu Methionine M Met Tyrosine Y Tyr Glutamine Q Gln Phenylalanine F Phe Balin V Val
  • a multilayer fabric for a cell culture support can realize a microenvironment suitable for attachment, migration, proliferation and differentiation of cells, thereby improving the survival rate of the cells and proliferating cells three-dimensionally , There is an effect that the cultured cells can be easily recovered.
  • the support according to the present invention can provide an efficient cell culture environment in which the yarn constituting the support can stably cultivate the cells even when containing the cell culture improving substance for cell culture, There is an effect that can be prevented.
  • FIG. 1 is a perspective view illustrating a multi-layer fabric for a cell culture support according to an exemplary embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a perspective view illustrating a difference in pore sizes of a first fabric and a second fabric constituting a multi-layer fabric for a cell culture support according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is a view for explaining a cell-seeding-improving substance included in a yarn constituting a multilayer fabric for a cell culture support according to another embodiment of the present invention.
  • FIGS. 4 and 5 are views showing cells attached through a mussel adhesive protein, which can be included in a multilayer fabric for cell culture support according to another embodiment of the present invention.
  • the multi-layer fabric for a cell culture support comprises a first fabric 100, 100 'formed by including a first yarn 110' as shown in FIGS. 1 and 2; Having a smaller average pore diameter than the first fabric 100, 100 ', is provided on at least one surface of the first fabric 100, 100' and the second fabric 210 ' And a fabric 200, 200 '.
  • the first fabric 100, 100 'and the second fabric 200, 200' may be independently any one of a fabric, a knitted fabric, and a nonwoven fabric.
  • the fibers included in the fabric have longitudinal and transverse directions, and the specific structure may be plain weave, twill weave, etc., and the density of warp and weft yarn is not particularly limited.
  • the knitted fabric may be a known knitted fabric.
  • the knitted fabric, the knitted fabric, and the like may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the nonwoven fabric when the nonwoven fabric is composed of a nonwoven fabric, the nonwoven fabric has no directionality in the longitudinal direction and the transverse direction.
  • the dry nonwoven fabric, the thermal bonding nonwoven fabric, the airless nonwoven fabric, the wet nonwoven fabric, the spunless nonwoven fabric, A known nonwoven fabric such as a nonwoven fabric or a meltblown can be used.
  • the nonwoven fabric may be a nanofiber web formed of electrospun nanofibers.
  • the average diameter of the second fabrics 200 and 200 ' is greater than the average diameter of the first fabrics 100 and 200' before the multi-fabric fabrics 10 and 10 'for a cell culture support according to the present invention are described. 100 "). ≪ / RTI >
  • the average pore diameter of the fabric When the average pore diameter of the fabric is small in the fabric for the cell culture support, the cells are not proliferated and cultured in both the inside and the outside of the fabric but are grown and cultured two-dimensionally only on the outer surface of the fabric, The microenvironment suitable for proliferation and differentiation is not realized, the cell survival rate is lowered, and the cells can not be proliferated three-dimensionally.
  • the average pore size of the fabric is large, the cells may proliferate both inside and outside of the fabric, but the cells to be cultured may desorb.
  • the multi-layer fabrics 10 and 10 'for the cell culture support according to the present invention are formed by the first fabrics 100 and 100' provided on the multi-layer fabrics 10 and 10 '
  • the average pore diameters of the first and second raw materials 200 and 200 ' are different from each other.
  • the average pore diameter of the second raw materials 200 and 200' is smaller than that of the first raw materials 100 and 100 '
  • the average pore diameter of the first raw fabric 100 and the second raw fabric 200 and 200 ' may satisfy the condition (1), 0.08? B / a? 1.2
  • the average pore diameter of the first fabric 100, 100 'and the second fabric 200, 200' is condition (1 ') and can satisfy 0.14? B / a? 0.9.
  • a is the average pore diameter ( ⁇ ⁇ ) of the first raw fabric
  • b is the average pore diameter ( ⁇ ⁇ ) of the second raw fabric.
  • the cells to be cultured are desorbed, or the cells are not proliferated and cultured both inside and outside of the fabric, but are grown and cultured two-dimensionally only on the outer surface of the fabric,
  • the microenvironment suitable for attachment, migration, proliferation, and differentiation of the cells is not realized, the cell viability is decreased, and the cells can not be grown three-dimensionally.
  • first fabrics 100 and 100 'and second fabrics 200 and 200' provided in the multi-layer fabrics 10 and 10 'for a cell culture support of the present invention will be described.
  • the first fabric 100 and 100 allow cells to proliferate and cultivate both inside and outside of the fabric and realize a microenvironment suitable for attachment, migration, proliferation, and differentiation of cells to improve the survival rate of the cells, To three-dimensionally perform a function of growing and culturing.
  • the cells of the second fabric 200 and 200 since the cells of the second fabric 200 and 200 'do not detach from the supporter during cell culturing and have defects such as bending or breaking during cell culture or cell proliferation and separation, stable cell cultivation is possible .
  • the first fabric 100 ' includes a first air support S1 and the second fabric 200' includes a second air support S2.
  • the average pore size of the first base air group S1 is larger than the average pore size of the second air base group S2.
  • the first preliminary air group S1 is capable of culturing and growing cells in the first fabric 100 ', thereby enabling a cell culture of a three-dimensional structure.
  • the cells can be cultured and proliferated on the surface of the second fabric 200 'by having a small average pore size as compared with the air force group S1, and the cells to be cultured can be prevented from desorbing.
  • the first air base S1 included in the first fabric 100 ' may have an average pore diameter of 0.5 to 1 ⁇ ⁇ so as to satisfy the condition (1), and preferably an average pore diameter of 0.55 to 0.95 ⁇ ⁇ Lt; / RTI > If the average pore diameter of the first fabric 100 'is less than 0.5 ⁇ , the cells are not proliferated and cultured in both the inside and the outside of the fabric but are grown and cultured two-dimensionally only on the outer surface of the fabric, , The microenvironment suitable for movement, proliferation, and differentiation is not realized, the cell viability is decreased, the cells can not be grown three-dimensionally, and the average pore size of the first fabric 100 ' The cells to be cultured can be desorbed.
  • the second pneumatic group S2 included in the second fabric 200 ' may have an average pore size of 0.1 to 0.5 ⁇ so as to satisfy the condition (1), and preferably an average pore size of 0.15 to 0.45 ⁇ Lt; / RTI > If the average pore diameter of the second fabric 200 'is less than 0.1 ⁇ , it is difficult to culture the cell culture liquid to an intended level and the average pore size of the second fabric 200' is 0.5 ⁇ If exceeded, the cells to be cultured may be desorbed.
  • the plurality of fabrics may have an average pore size different from each other, and at least two pores may have different average pore sizes .
  • the first fabric 100 or 100 ' may have a basis weight of 1 to 30 g / m 2, preferably a basis weight of 5 to 25 g / m 2, while satisfying the thickness range described later. If the basis weight satisfies the thickness range described below and the basis weight is less than 1 g / m 2, the cultured cells can be desorbed. If the basis weight exceeds 30 g / m 2, the cells are proliferated and cultured both inside and outside of the fabric , The micro-environment suitable for cell attachment, migration, proliferation, and differentiation is not realized, the cell survival rate is lowered, and the cells are proliferated three-dimensionally You can not.
  • the second fabric 200 or 200 ' may have a basis weight of 1 to 30 g / m 2, preferably a basis weight of 5 to 25 g / m 2, while satisfying the thickness range described later. If the basis weight satisfies the thickness range described later and the basis weight is less than 1 g / m 2, the cells to be cultured can be desorbed. If the basis weight exceeds 30 g / m 2, Cell culture can be difficult.
  • the first fabric 100, 100 ' may have a thickness of 5 to 50 ⁇ , and preferably a thickness of 10 to 45 ⁇ , while satisfying the basis weight range. If the first fabric satisfies the above-mentioned basis weight and the thickness is less than 5 ⁇ ⁇ , the cells are not proliferated and cultured in both inside and outside of the fabric but are grown and cultured two-dimensionally only on the outer surface of the fabric, The microenvironment suitable for attachment, migration, proliferation, and differentiation of cells is not realized, the cell viability is decreased, the cells can not be grown three-dimensionally, and when the thickness exceeds 50 ⁇ , the cultured cells are desorbed .
  • the second fabric 200, 200 ' may have a thickness of 5 to 50 ⁇ , and preferably a thickness of 10 to 45 ⁇ , while satisfying the basis weight range. If the thickness of the second fabric meets the above-mentioned basis weight and the thickness is less than 5 mu m, cell culture can not easily pass through the cell culture liquid. If the thickness exceeds 50 mu m, .
  • the first fabric 100 and 100 ' may have an air permeability of 0.1 to 10 cfm and an air permeability of 1 to 8 cfm. If the air permeability of the first fabric 100 or 100 'is less than 0.1 cfm, the cells do not proliferate and cultivate both inside and outside of the fabric, but are grown and cultured two-dimensionally only on the outer surface of the fabric, The microenvironment suitable for attachment, migration, proliferation, and differentiation of cells is not realized, the cell viability is decreased, the cells can not be three-dimensionally propagated, and when the air permeability exceeds 10 cfm, .
  • the second fabric 200 or 200 ' may have an air permeability of 0.1 to 10 cfm, and preferably an air permeability of 1 to 8 cfm. If the air permeability of the second fabric 200 or 200 'is less than 0.1 cfm, it is difficult to culture the cell culture liquid to an intended level, and if the air permeability exceeds 10 cfm, .
  • At least one of the first fabric 100, 100 'and the second fabric 200, 200' may be provided.
  • the first fabric 100 and the second fabric 200 are illustrated in the drawing, the first fabric 100 and the second fabric 200 may be formed of a plurality of the first fabric 100 and the second fabric 200.
  • the first fabric 100, 100 'and the second fabric 200, 200' may be alternately stacked or randomly stacked and the first fabric 100, 100 'and the second fabric 200, 200 'are randomly stacked, the first and second fabrics may be formed as a single layer or two layers, and may be randomly stacked, with a second fabric at one side of the first fabric.
  • the first fabric 100, 100 'and the second fabric 200, 200' of the multi-layer fabric 10, 10 'for a cell culture support according to the present invention can be used for the size and kind of the cultured cells, And the like.
  • the first fabric 100 or 100 'provided in the multi-layer fabric 10 or 10' for cell culture support according to the present invention is formed to include the first yarn 110 'and the second fabric 200 , 200 'are formed including the second yarn 210'.
  • the first yarn 110 ' may include a hydrophilic polymer
  • the second yarn 210' may include a hydrophobic polymer
  • the first yarn 110 ' may be composed of one or a plurality of monosaccharides, and the one or more monosaccharides may be a spun yarn, a filament yarn, a slitting yarn or an electrospun nanofiber.
  • the spinning solution of the mono yarns may be formed as a hydrophilic fiber forming component, or the surface of the yarn may be further subjected to plasma treatment or surface coating with components such as dopamine.
  • the monosaccharide may be formed by including a hydrophilic polymer as a hydrophilic fiber forming component.
  • the first yarn 110 'included in the first fabric 100 and 100' is formed to include the hydrophilic polymer, the degradability by water is increased, and in the process of separating and collecting the cultured cells, There is an advantage that there is little stimulation of the cells due to the water that can be used in the solution, so that there is little physical / chemical damage to the cultured cells.
  • the second yarn 210 ' may be composed of one or a plurality of mono yarns, and the one or more mono yarns may be yarns of yarn, filament yarn, slitting yarn or electrospun nanofiber .
  • the spinning solution of the mono yarns may be made into a hydrophobic fiber forming component, or the silane coupling agent may be treated on the surface of the yarn after spinning to improve the hydrophobic property.
  • the monosaccharide may be formed by including a hydrophobic polymer as a hydrophobic fiber forming component.
  • the hydrophobicity of the fabric surface is increased to increase the adhesion with the cells having the hydrophobic property on the outer surface. And the hydrogen bonding force between the yarns is weakened, so that the dispersibility can be improved.
  • the first fabric 100, 100 'and the second fabric 200, 200' each include a hydrophilic / hydrophobic yarn, the hydrophilic / hydrophobic yarns are passed through the multilayer fabric 10, 10 ' Simultaneous incubation of cells is possible.
  • the first yarn 110 ' may have an average diameter of 100 to 500 ⁇ m, and preferably an average diameter of 150 to 450 ⁇ m. If the average diameter of the first yarn 110 'is less than 100 mu m, the cells to be cultured can be desorbed. When the average diameter exceeds 100 mu m, the cells are not proliferated and cultured in both the inside and the outside of the fabric, , The microenvironment suitable for attachment, migration, proliferation, and differentiation of cells is not realized, the cell viability is decreased, and the cells can not be proliferated three-dimensionally have.
  • the second yarn 210 ' may have an average diameter of 100 to 500 ⁇ m, and preferably an average diameter of 150 to 450 ⁇ m. If the average diameter of the second yarn 210 'is less than 100 ⁇ , the cells to be cultured can be desorbed. If the average diameter exceeds 100 ⁇ , the pore size is decreased and the cell culture liquid is not easily passed. Cell culture may be difficult.
  • the first yarn 110 'provided on the first fabric 100 or 100' of the multi-layer fabric 10 or 10 'for a cell culture support according to an embodiment of the present invention includes a biodegradable fiber-
  • the second yarn 210 'included in the second fabric 200, 200' may include a non-biodegradable fiber forming component.
  • the first yarn 110 ' is formed of a fiber forming component such as polycaprolactone, polydioxanone, polyglycolic acid, polylactide (PLLA), PLGA
  • the second yarn 210 ' may include at least one material selected from the group consisting of poly (DL-lactide-co-glycolide), polylactic acid and polyvinyl alcohol.
  • PS polyethylene terephthalate
  • PET polyether sulfone
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PAN polyacrylonitrile
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • first yarn 110 'and / or the second yarn 210' constituting the multi-layer fabric 10 or 10 'for a cell culture support described above may have other components such as an adhesive component and a physiologically active component Cell culture enhancing substances.
  • the first fabric 100 '' includes a fiber-forming component 111, an adhesive component 112, and a physiological activity And a cell culture enhancing substance comprising the component (113).
  • the second fabric includes the cell culture improving material
  • the cell orientation improving material provided in the first yarn and the second yarn may be different from each other.
  • the first yarn 110 '' is not provided with the adhesive component 112 or the physiologically active component 113, and the physiologically active component 113 is bonded to the first yarn 110 ' Can be fixed to a part of the outer surface of the first yarn 110 ". Or a physiologically active component may be provided so as to completely cover the adhesive component provided on the entire outer surface of the yarn.
  • the adhesive component 112 and the physiologically active component 113 are fixed to the first yarn 110 " constituting the multi-layer fabric 10 " for the cell culture support according to the embodiment of the present invention Thereby stimulating cell proliferation and accelerating cell proliferation.
  • the adhesive component 112 is used to fix the cultured cells initially on the cell support to prevent the cells loaded on the culture solution from floating and / or to bind the physiologically active component 113 to the first yarn 110 " So that the physiologically active ingredient 113 can function to prevent the cells from being desorbed during the cell culture on the first yarn 110 ".
  • the adhesive component 112 may be used without limitation in the case of a known adhesive component 112 that is conventional biocompatibility-free and does not cause cytotoxicity, but preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: To 20 times, and a protein in which at least two of these proteins are fused.
  • the physiologically active ingredient 113 may be a substance that directly or indirectly induces at least one of cell adhesion, migration, growth, proliferation, and differentiation so as to promote cell culture. May be included without limitation if it is a known substance known to express function.
  • the physiologically active ingredient 113 may be a monoamine, an amino acid, a peptide, a saccharide, a lipid, a protein, a glucoprotein, a glucolipid, a proteoglycan, a mucopolysaccharide, And one or more compounds selected from the group consisting of nucleic acids and cells.
  • the monoamines include, for example, compounds containing primary amines such as catecholamines and indole amines.
  • the peptide includes an oligopeptide
  • the protein includes a polypeptide, such as, for example, fibronectin.
  • the saccharides include monosaccharides, polysaccharides, oligosaccharides, and carbohydrates, and the lipids may be, for example, steroid hormones.
  • the physiologically active ingredient 113 may include a motif.
  • the motif may be a natural peptide or a recombinant peptide comprising a predetermined amino acid sequence contained in at least one selected from the group consisting of a growth factor or an extracellular matrix protein, a glycoprotein, and a proteoglycan.
  • the motif is selected from the group consisting of adrenomedullin, angiopoietin, bone morphogenetic protein (BMP), brain derived neurotrophic factor (BDNF), epidermal growth factor (EGF), erythropoietin, (GDNF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), fibroblast growth factor, glial cell line derived neurotrophic factor Growth differentiation factor-9 (GDF9), hepatocyte growth factor (HGF), hepatoma-derived growth factor (HDGF), insulin-like growth factor (IGF), keratinocyte growth factor (KGF), migration-stimulating factor (MSF), myostatin (GDF-8), nerve growth factor Platelet-derived growth factor cell growth factor (TCGF), neurofilin, transforming growth factor-alpha (TGF-a), transforming growth factor- (TGF-beta), tumor necrosis factor-alpha (BMP
  • the motif may include a predetermined amino acid sequence included in the growth factor and a predetermined amino acid sequence included in the extracellular matrix. More preferably, the motif may include at least one selected from the group consisting of proteins comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 28 and proteins fused with at least two of these proteins, no.
  • the motif may be integrally formed by covalently bonding to the adhesive component 112 described above.
  • the adhesive component 112 is a protein
  • the motif may be directly covalently bonded to the N-terminal and / or C-terminal of the polypeptide, or may be covalently bonded through a heterogeneous peptide or polypeptide.
  • the physiologically active ingredient 113 can be attached more firmly to the first yarn 110 ", and the elimination of the physiologically active ingredient 113 during cell culture can be minimized.
  • the motif may further include specific domains or motifs of a mussel protein or a mussel protein to enhance cell adhesion.
  • marine life mussel produces and secretes adhesive proteins, which can firmly attach the mussel itself to wet solid surfaces such as rocks in the sea, thereby affecting the impact of waves and the buoyancy effect of seawater. I do not accept.
  • the mussel adhesive protein (110) is known as a strong natural adhesive. It has flexibility that can be flexed while exhibiting a tensile strength about twice that of epoxy resin, compared with a chemical synthetic adhesive.
  • mussel adhesive proteins have the ability to adhere to a variety of surfaces, such as plastics, glass, metals, teflon and biomaterials. Adhesion on wet surfaces, which remain an incomplete challenge in chemical adhesive development, It is possible within.
  • a mussel protein is used as a physiologically active ingredient in a multi-layer fabric for a cell culture support according to the present invention
  • the cells are stably cultured on a supporter to increase the engraftment rate of the cells and to perform physicochemical mechanisms harmful to the cells It is possible to realize a more suitable environment for cell culture.
  • the physicochemical mechanism is not required in the process of recovering the cells, the cells can be more easily recovered without damaging the cells.
  • FIG. 3 the structure in which the cells 300a and 300b bind to the first raw material 101 through the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b will be described in detail with reference to FIGS. 4 and 5.
  • FIG. 4 the structure in which the cells 300a and 300b bind to the first raw material 101 through the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b will be described in detail with reference to FIGS. 4 and 5.
  • the cells 300a cultured in the pores formed by the first yarns arranged in the first fabric 101 are adhered to the first yarn through the mussel adhesive protein 114 .
  • the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b are used to immobilize the cultured cells on the cell support in the initial stage to prevent floating of the cells loaded on the culture solution and / or the function of the non-adhesive physiologically active ingredient 113 It is possible to perform the function of preventing desorption of the physiologically active ingredient 113 in the process of cell culture by fixing on a yarn.
  • Mussel-derived adhesive protein preferably a mussel adhesive protein derived from Mytilus ulis (Mytilus gallus), Mytilus galloprovincialis or Mytilus coruscus 114, 114a, 114b) or variants thereof.
  • the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b of the present invention include fp (foot protein) -1 to fp-5 proteins or mutants thereof derived from the mussel species, respectively, and preferably Mefp 1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 and Mgfp-5 or mutants thereof, But is not limited thereto.
  • the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b of the present invention can be used for the production of Myfus (mytilus edulis foot protein) -1, Mgfp (Mytilus galloprovincialis foot protein) -1, Mcfp (Mytilus coruscus foot (SEQ ID NO: 1), fp-2 (sequence (SEQ ID NO: 1)), or a variant thereof, 6, fp-3 (SEQ ID NO: 7), fp-4 (SEQ ID NO: 8), fp-5 (SEQ ID NO: 9), and fp- A fusion protein to which the above protein is linked, or a variant of the protein.
  • the mussel adhesive proteins 114, 114a, 114b of the present invention may include all the mussel adhesive proteins described in WO2006 / 107183 or WO2005 / 092920.
  • the mussel adhesive protein is selected from the group consisting of fp-151, fp-131, fp-353, fp-153, fp-351, 16). ≪ / RTI >
  • mutants of the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b preferably include additional sequences at the carboxyl terminal or amino terminal of the mussel adhesive protein under the premise that the adhesive force is maintained, or some amino acids are substituted with other amino acids . More preferably, a polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids including RGD (Arg Gly Asp) is linked to the carboxyl terminal or amino terminal of the mussel adhesive protein, or a polypeptide consisting of 1 to 100 of the total number of tyrosine residues constituting the mussel adhesive protein %, Preferably 5 to 100% of which is substituted by 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine (DOPA).
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine
  • the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b may be adhered to the first yarn provided on the first fabric 101. However, in the present invention, the mussel adhesive proteins 114, 114a and 114b are attached to the surface of the first yarn. However, the present invention is not limited thereto, and the fiber forming component and the mussel adhesive protein may be mixed together to prepare a synthetic polymer solution A first yarn in which a part of the mussel adhesive protein is located inside and another part is provided on the outer surface may be produced through irradiation.
  • the mussel adhesive proteins 114a and 114b can be adhered to a desired cell through the adhesive component 112 and the physiologically active ingredient 113.
  • the adhesive component 112 and the physiologically active component 113 provided on the surface of the mussel adhesive protein 114a can be bonded to the cell membrane receptor 310 that performs signal transmission through peptide bonding.
  • the present invention is not limited thereto, and the mussel binding protein can be directly adhered to the outer membrane of the cell 300b using its own adhesive ability.
  • the mussel adhesive proteins 114, 114a, and 114b replace conventional adhesives that have only a physical adhesive function and deteriorate cell specific functions such as cell growth and differentiation, It is safe and has the advantage of improving the adhesive strength while maintaining the characteristics of cells through peptide bonds that activate cell growth and differentiation functions.
  • the second yarn may contain an adhesive component, a physiologically active component, and a mussel adhesive protein.
  • the description of the adhesive component, the physiologically active component, and the mussel adhesive protein included in the first yarn 110 ' The detailed description thereof will be omitted.
  • a well plate is exemplified.
  • the fabric is fixed to contact the lower surface of a well plate, necrosis of cells cultured on the lower surface of the fabric
  • the cells can be cultured by fixing the fabric at a predetermined distance from the lower surface.
  • the present invention also relates to a multi-layer fabric 10, 10 'for the cell culture support according to the present invention; And a tissue engineered graft containing the cultured cells in the fabric.
  • the cell may be one or more stem cells selected from the group consisting of ovarian stem cells, pluripotent stem cells, pluripotent stem cells, oligopotent stem cells, and single stem cells, and hematopoietic stem cells, hepatocytes, And may include at least one selected from at least one differentiated cell selected from the group consisting of a cell, a mesenchymal cell, an endothelial cell, a muscle cell, a nerve cell, an immune cell, an adipocyte, a cartilage cell, a bone cell, have.
  • the cell may be a cell having a shape elongated in one direction rather than a sphere, or a cell having strong mobility.
  • the materials of the first yarn and the second yarn are embodied as a fiber-forming component harmless to the human body, the support on which the cultured cells are attached can be directly implanted into the human body, , There is an advantage that it can be stably attached.
  • a first fabric 0.3 mg / ml of fibronectin (RGD based) and 0.3 mg / ml of laminin as a physiologically active substance were used as an adhesive material, and PLGA 13% by weight, and THF and DMF as a solvent at a weight ratio of 3: 7 in a total of 87% by weight was applied with an electrospinning device at an applied voltage of 25 KV, a distance of 25 cm from the collector to the spinneret, ml / hole under an environment of RH 60% 30 to obtain a nanofiber web formed of nanofibers having an average diameter of 600 nm.
  • the resulting nanofiber web was calendared twice at a temperature of 130 ⁇ and a pressure of 4 kPa to obtain a first web having a basis weight of 15.1 g / m 2, a thickness of 25 ⁇ , an average pore diameter of 0.8 ⁇ , and an air permeability of 5 cfm Fabrics were prepared.
  • fibronectin RGD based
  • laminin a physiologically active substance
  • PVDF Polyvinylidene fluoride as a solvent and acetone and dimethylacetamide (DMAc) as a solvent at a weight ratio of 3: 7 in a total of 84 wt% was applied to an electrospinning device at an applied voltage of 25 KV, The distance to the spinneret was 25 cm and the discharge amount was 0.05 ml / hole.
  • Electrospinning was carried out in an environment of RH 65% and 30%, and the average diameter was 550 nm A nanofiber web formed of nanofibers was obtained.
  • the resulting nanofiber web was calcined twice at 130 ⁇ and at a pressure of 4 kPa to obtain a second fabric having a basis weight of 15 g / m 2, a thickness of 25 ⁇ , an average pore size of 0.3 ⁇ , and an air permeability of 5 cfm .
  • the average pore size, basis weight, air permeability, average pore size, basis weight, air permeability, whether or not the first and second fabrics were included in the first fabric, 3 and Table 4 were prepared.
  • the multi-layer fabric for each cell culture support prepared in Examples and Comparative Examples was fixed on the bottom of the well plate, And a vertical distance of 3 mm.
  • Fibroblasts (HS27) were loaded into the prepared well plates and then proliferated in 10% complete medium for 4 days.
  • the 10% complete medium was prepared by mixing Ham's F12 medium in a modified eugles medium (DMEM) of Duvé course at a volume ratio of 1: 1.5, adding 7 vol% of fetal bovine serum, U / mL and streptomycin 65 mu g / mL.
  • DMEM modified eugles medium
  • DAPI staining was performed on the proliferated fibroblasts.
  • the cells were incubated with Confocal microscope.
  • the cells were incubated in the Z-axis direction from the lower part of the multilayered fabric to the upper part.
  • the number of cells cultured on the surface of the slitting furnish (the number of cells on the upper surface of the first fabric, the number of cells on the upper surface of the second fabric, and the average value of the cells on the lower surface of the second fabric)
  • the number of cells (the average number of cells measured at 1/3 and 2/3 of the first fabric thickness) was measured and calculated.
  • the number of cells in the other examples and the comparative examples was relatively shown based on the number of the surface and inner cells measured in Example 1 as 100%. Table 3 and Table 4 show the results.
  • Example 1 Example 2 Example 3
  • Example 4 Example 5
  • Example 6 Example 7 First fabric Average pore diameter ( ⁇ ⁇ ), a 0.8 1.2 0.95 0.55 0.4 0.91 0.57 Basis weight (g / m2) 15.1 13 14.2 15.9 17.3 0.5 35 Air permeability (cfm) 5 6.2 5.5 4.6 4.1 5.8 4.3 2nd fabric Average pore diameter ( ⁇ ⁇ ), b 0.3 0.05 0.15 0.45 0.6 0.3 0.3 Basis weight (g / m2) 15 19.1 17.9 14.4 13.8 15 15 Air permeability (cfm) 5 4 4.4 5.6 6.3 5 5 Condition (1) b / a 0.375 0.042 0.16 0.82 1.5 0.33 0.53 Number of surface cells (%) 100 63 88 90 72 65 81 Number of internal cells (%) 100 79 93 91 77 62 51
  • Example 10 Example 11
  • Example 12 Example 13 Comparative Example 1 Comparative Example 2
  • the average pore size, basis weight, air permeability, average pore size, basis weight, air permeability, whether or not the first fabric and the second fabric are included in the first fabric according to the present invention Compared with Examples 2, 5 to 13, and Comparative Examples 1 and 2 in which none of the above Examples 1, 3, and 4 were satisfactory, the cells to be cultured were not desorbed, Since the microenvironment suitable for attachment, migration, proliferation and differentiation of cells is realized and the cells can be proliferated three-dimensionally, the number of surface cells and the number of internal cells are increased, which is more suitable as a cell culture support Able to know.

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Abstract

세포배양 지지체용 멀티레이어 원단이 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단은 제1원사를 포함하여 형성되는 제1원단; 및 제2원사를 포함하여 형성되고, 상기 제1원단의 적어도 일면에 구비되며, 상기 제1원단에 비하여 작은 평균 공경을 가지는 제2원단;을 포함하여 구현된다. 이에 의하면, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되어 세포의 생존율이 향상되고, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 있으며, 배양된 세포를 용이하게 회수할 수 있는 효과가 있다. 또한, 지지체를 구성하는 원사가 세포배양을 위한 세포배양 향상물질을 함유하여도 안정적으로 세포를 배양할 수 있는 효율적인 세포 배양환경을 제공할 수 있고, 배양되는 세포의 탈리를 방지할 수 있는 효과가 있다.

Description

세포배양 지지체용 멀티레이어 원단
본 발명은 세포배양 지지체용 원단에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단에 관한 것이다.
최근, 질병 치료에 배양 세포의 이용이 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심 및 연구가 증가하고 있다. 세포 배양은 세포를 생체로부터 채취하고, 생체 밖에서 배양시키는 기술이며, 배양된 세포는 피부, 장기, 신경 등 신체의 다양한 조직으로 분화시켜 인체에 이식되거나 분화시키기 전 상태로 인체에 이식시켜 생착 및 분화를 동시에 이루어지게 하여 다양한 질병 치료에 활용될 수 있다.
이와 같은 세포배양이 연계된 분야가 조직공학(tissue engineering)이며, 세포학, 생명과학, 공학, 의학 등의 기존의 과학 영역을 응용하는 다학제간 학문으로써, 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체, 재생시키기 위한 새로운 융합기술이 연구되고 있다.
통상적인 세포배양 분야나 이를 이용한 조직공학 분야에서 지속적으로 많은 관심을 받고, 연구/개발되는 과제 중의 하나는 세포를 배양/분화시킬 수 있는 지지체의 재료, 구조 등에 연구이다. 즉, 인체에 특정물질이 미치는 영향을 살펴보기 위하여 배양된 세포를 이용한 특정 물질의 독성반응실험은 실제 인체의 세포구조와 유사한 3차원구조로 배양/분화된 세포군집체를 통해서 이루어질 때 보다 실제와 유사한 in vitro 세포 독성실험모델로 적합할 수 있다. 또한, 배양된 세포를 인체의 조직으로 이식하기 위해서는 인체의 실제 조직과 유사한 3차원구조로 배양/분화된 세포집합체나 조직이 이식될 때 이식된 세포나 조직이 충분히 제 기능과 역할을 할 수 있다.
그러나 현재까지 개발된 세포배양용 또는 조직공학용 지지체는 체내와 유사한 구조로 세포가 배양되지 않고, 세포의 생존율도 높지 않음에 따라서 이를 통하여 배양된 세포를 통해서는 in vitro 실험모델이나 이식용 세포로써 부적합한 문제가 있다. 즉 세포 배양용 또는 조직공학용 지지체를 세포의 크기에 적합한 나노섬유로 제조할 경우 기계적 물성이 약하여 세포 배양에 문제점이 있을 수 있다.
또한 세포배양용 또는 조직공학용 지지체용 원사는 세포배양에 필요한 세포배양성 향상물질을 포함할 수 있는데 이 경우, 원사에 함유된 세포배양성 향상물질로 인해 원사의 기계적 강도가 약화됨에 따라서 원단으로 제조되는 공정통과성이 현저히 저하되는 문제가 있다. 나아가, 세포배양 중 외력에 원사가 절단됨에 따라서 세포가 쉽게 이탈되는 문제점이 있을 수 있다.
이에 따라 체내와 유사한 배양환경을 제공할 수 있고, 세포 배양에 요구되는 공간이 세포마다 적절히 확보되는 동시에 목적하는 구조로 제조가 용이하며, 지지체 내에서 세포가 배양되는 도중 이탈되는 세포를 막아 세포의 생존율 및 세포를 입체적으로 성장시킬 수 있는 세포배양 지지체용 원단에 대한 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되어 세포의 생존율이 향상되고, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 있으며, 배양된 세포를 용이하게 회수할 수 있는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 세포의 배양과정에서 발생하는 지지체의 붕괴 등이 방지될 수 있도록 충분한 기계적 강도가 발현됨에 따라서 세포가 안정적으로 증식될 수 있고, 배양되는 세포의 탈리를 방지할 수 있는 지지체를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 배양된 세포를 in vitro 실험모델이나 동물 체내에 이식용으로 적용하기에 보다 적합하도록 배양되는 세포들의 형상/구조를 실제 동물 체내와 유사하게 배양시킬 수 있는 지지체를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 지지체를 생물반응기, 세포배양용기 등 세포배양분야 또는 조직공학분야에 사용되는 각종 제품으로 구현시키는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 제1원사를 포함하여 형성되는 제1원단; 및 제2원사를 포함하여 형성되고, 상기 제1원단의 적어도 일면에 구비되며, 상기 제1원단에 비하여 작은 평균 공경을 가지는 제2원단;을 포함하는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1원단과 제2원단의 평균 공경은 하기 조건 (1)을 만족할 수 있다.
(1) 0.08 ≤ b/a ≤ 1.2
이때, 상기 a는 제1원단의 평균 공경(㎛)이고, 상기 b는 제2원단의 평균 공경(㎛)이다.
또한, 상기 제1원단은 평균 공경이 0.5 ~ 1㎛일 수 있고, 상기 제2원단은 평균 공경이 0.1 ~ 0.5㎛일 수 있다.
또한, 상기 제1원단은 평량이 1 ~ 30g/㎡ 및 공기투과도가 0.1 ~ 10cfm일 수 있고, 상기 제1원사는 평균직경이 100 ~ 500㎛일 수 있으며, 상기 제2원단은 평량이 1 ~ 30g/㎡ 및 공기투과도가 0.1 ~ 10cfm일 수 있고, 상기 제2원사는 평균직경이 100 ~ 500㎛ 일 수 있다.
또한, 상기 제1원사는 친수성 고분자를 포함하여 형성될 수 있고, 상기 제2원사는 소수성 고분자를 포함하여 형성될 수 있다.
또한, 상기 제1원단 및 제2원단 중 어느 하나 이상은 복수 개 이상 구비될 수 있고, 상기 제1원단 및 제2원단은 교호적층되거나 무작위로 적층될 수 있다.
또한, 상기 제1원단 및 제2원단은 각각 독립적으로 편물, 직물 및 부직포 중 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 제1원사 및 제2원사 중 어느 하나 이상의 원사는 세포배양 향상물질을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포배양 향상 물질은 세포의 부착, 이동, 성장, 증식(proliferation) 및 분화(differentiation) 중 어느 하나 이상을 유도하는 생리활성성분일 수 있다.
또한, 상기 생리활성성분은 모노아민, 아미노산, 펩타이드, 당류(saccharide), 지질(lipid), 단백질, 당단백질(glucoprotein), 당지질(glucolipid), 프로테오글리칸, 뮤코다당(mucopolysaccharide) 및 핵산(nucleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 및 세포 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1원사는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리다이옥사논(polydioxanone), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid), PLLA(poly(Llactide)), PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리락틱산(Polylactic acid) 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함할 수 있고, 상기 제2원사는 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌옥사이드(poly(alkylene oxide)), 폴리아미노산(poly(amino acids)), 폴리알릴아민(poly(allylamines), 폴리포스파젠(polyphosphazene) 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단; 및 상기 원단 내 배양된 세포들을 포함하는 조직공학용 이식체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포는, 전능줄기세포, 만능줄기세포, 다능줄기세포, 올리고포텐트(oligopotent) 줄기세포 및 단일줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 줄기세포 및, 조혈모세포, 간세포, 섬유세포, 상피세포, 중피세포, 내피세포, 근육세포, 신경세포, 면역세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혈액세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분화세포 중에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 하기 표 1과 같이 약어로 기재하였다.
IUPAC-IUB 명명 기호 약자 IUPAC-IUB 명명 기호 약자 IUPAC-IUB 명명 기호 약자
알라닌 A Ala 글라이신 G Gly 프롤린 P Pro
아르기닌 R Arg 히스티딘 H His 세린 S Ser
아스파라긴 N Asn 아이소루신 I Ilt 트레오닌 T Thr
시스테인 C Cys 라이신 K Lys 트립토판 W Trp
글루탐산 E Glu 메티오닌 M Met 타이로신 Y Tyr
글루타민 Q Gln 페닐알라닌 F Phe 발린 V Val
본 발명에 의하면, 본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단은 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되어 세포의 생존율이 향상되고, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 있으며, 배양된 세포를 용이하게 회수할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 지지체는 지지체를 구성하는 원사가 세포배양을 위한 세포배양 향상물질을 함유하여도 안정적으로 세포를 배양할 수 있는 효율적인 세포 배양환경을 제공할 수 있고, 배양되는 세포의 탈리를 방지할 수 있는 효과가 있다.
도 1는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 나타내는 사시도,
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 구성하는 제 1 원단 및 제 2 원단의 기공크기의 차이를 나타내는 사시도,
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 구성하는 원사에 포함되는 세포배양성 향상물질을 설명하기 위한 도면, 그리고,
도 4 및 도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단에 포함될 수 있는 홍합 접착 단백질을 통해 세포가 접착된 모습을 나타내는 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 부가한다.
본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단은, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 제1원사(110')를 포함하여 형성되는 제1원단(100, 100'); 및 제2원사(210')를 포함하여 형성되고, 상기 제1원단(100, 100')의 적어도 일면에 구비되며, 상기 제1원단(100, 100')에 비하여 작은 평균 공경을 가지는 제2원단(200, 200');을 포함하여 구현된다.
이때, 상기 제1원단(100, 100') 및 제2원단(200, 200')은 각각 독립적으로 직물, 편물 및 부직포 중 어느 하나일 수 있다.
예를 들어 직물로 구성된 경우, 직물에 포함되는 섬유가 종횡의 방향성이 있으며, 구체적인 조직은 평직, 능직 등일 수 있으며, 경사와 위사의 밀도는 특별히 한정하지 않는다.
또한, 예를 들어 편물로 구성된 경우, 편물을 이루는 조직은 공지의 니트조직으로 이루어질 수 있다. 일예로, 위편물, 경편물 등일 수 있으나 이에 대해서는 특별히 한정하지 않는다.
그리고, 예를 들어 부직포로 구성된 경우, 부직포는 포함되는 섬유에 종횡의 방향성이 없는 것을 의미하고, 케미컬본딩 부직포, 써멀본딩 부직포, 에어레이 부직포 등의 건식부직포나 습식부직포, 스판레스 부직포, 니들펀칭 부직포 또는 멜트블로운와 같은 공지된 부직포를 사용할 수 있으며, 일 예로 상기 부직포는 전기방사된 나노섬유로 형성된 나노섬유웹일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')에 구비되는 각 구성에 대해 설명하기에 앞서, 제2원단(200, 200')의 평균 공경이 제1원단(100, 100')의 평균 공경 보다 작아야 하는 이유를 설명한다.
세포배양 지지체용 원단에서 원단의 평균 공경이 작을 경우, 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되지 않고, 원단의 외부표면에서만 2차원적으로 증식 및 배양됨에 따라, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되지 않고, 세포의 생존율이 저하되며, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 없다. 또한, 원단의 평균 공경이 클 경우, 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식될 수 있으나, 배양되는 세포가 탈리될 수 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')은 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')에 구비되는 제1원단(100, 100') 및 제2원단(200, 200')의 평균 공경이 상이하도록 구현하였으며, 바람직하게는 상기 제2원단(200, 200')의 평균 공경은 제1원단(100, 100')의 평균 공경에 비하여 작고, 보다 바람직하게는 상기 제1원단(100, 100') 및 제2원단(200, 200')의 평균 공경은 조건 (1)로써, 0.08 ≤ b/a ≤ 1.2를 만족할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 제1원단(100, 100') 및 제2원단(200, 200')의 평균 공경은 조건 (1')으로써, 0.14 ≤ b/a ≤ 0.9를 만족할 수 있다.
이때, 상기 a는 제1원단의 평균 공경(㎛)이고, 상기 b는 제2원단의 평균 공경(㎛)이다.
만일 상기 b/a가 상기 범위를 만족하지 못하면 배양되는 세포가 탈리되거나, 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되지 않고, 원단의 외부표면에서만 2차원적으로 증식 및 배양됨에 따라, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되지 않고, 세포의 생존율이 저하되며, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 없을 수 있다.
이하, 본 발명의 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')에 구비되는 제1원단(100, 100') 및 제2원단(200, 200')에 대하여 설명한다.
상기 제1원단(100, 100')은 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되도록 하고, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경을 구현시켜서 세포의 생존율을 향상시키며, 세포를 3차원적으로 증식 및 배양시키는 기능을 수행한다.
또한, 상기 제2원단(200, 200')은 세포배양 중 세포가 지지체로부터 탈리되지 않고, 세포배양 중 또는 세포증식 및 분리과정에서 휘거나 부러지는 등의 단점이 개선됨에 따라 안정적인 세포 배양이 가능하도록 하는 기능을 수행한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 상기 제1원단(100')은 제1기공군(S1)을 포함하고, 상기 제2원단(200')은 제2기공군(S2)을 포함한다. 이때, 상술한 바와 같이 제1기공군(S1)의 평균 공경은, 제2기공군(S2)의 평균 공경 보다 크다.
구체적으로 상기 제1기공군(S1)은 제1원단(100') 내부에서 세포의 배양 및 증식이 가능함에 따라 3차원 구조의 세포배양을 가능하게 하고, 상기 제2기공군(S2) 제1기공군(S1)에 비하여 작은 평균 공경을 가짐에 따라 제2원단(200')의 표면에서 세포를 배양 및 증식시킬 수 있고, 배양되는 세포의 탈리를 방지할 수 있다.
또한, 상기 제1원단(100')에 포함되는 제1기공군(S1)은 상기 조건 (1)을 만족하도록 평균 공경이 0.5 ~ 1㎛일 수 있고, 바람직하게는 평균 공경이 0.55 ~ 0.95㎛일 수 있다. 만일 상기 제1원단(100')의 평균 공경이 0.5㎛ 미만이면 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되지 않고, 원단의 외부표면에서만 2차원적으로 증식 및 배양됨에 따라, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되지 않고, 세포의 생존율이 저하되며, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 없을 수 있고, 제1원단(100')의 평균 공경이 1㎛를 초과하면 배양되는 세포가 탈리될 수 있다.
그리고, 상기 제2원단(200')에 포함되는 제2기공군(S2)은 상기 조건 (1)을 만족하도록 평균 공경이 0.1 ~ 0.5㎛일 수 있고, 바람직하게는 평균 공경이 0.15 ~ 0.45㎛일 수 있다. 만일 상기 제2원단(200')의 평균 공경이 0.1㎛ 미만이면 세포배양액의 통과가 용이하지 않아 목적하는 수준으로 세포 배양이 어려울 수 있고, 제2원단(200')의 평균 공경이 0.5㎛를 초과하면 배양되는 세포가 탈리될 수 있다.
또한, 상기 제 1 원단(100) 및 제 2 원단(200)이 복수 개로 구비되는 경우 복수 개의 원단은 각각 서로 다른 크기의 평균 공경을 나타낼 수 있으며, 적어도 둘 이상의 원단은 크기가 다른 평균 공경을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 제1원단(100, 100')은 후술하는 두께 범위를 만족하는 동시에 평량이 1 ~ 30g/㎡일 수 있고, 바람직하게는 평량이 5 ~ 25g/㎡일 수 있다. 만일 상기 제1원단이 후술하는 두께 범위를 만족하는 동시에 평량이 1g/㎡미만이면 배양되는 세포가 탈리될 수 있고, 평량이 30g/㎡를 초과하면 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되지 않고, 원단의 외부표면에서만 2차원적으로 증식 및 배양됨에 따라, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되지 않고, 세포의 생존율이 저하되며, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 없을 수 있다. 그리고, 상기 제2원단(200, 200')은 후술하는 두께 범위를 만족하는 동시에 평량이 1 ~ 30g/㎡일 수 있고, 바람직하게는 평량이 5 ~ 25 g/㎡일 수 있다. 만일 상기 제2원단이 후술하는 두께 범위를 만족하는 동시에 평량이 1g/㎡ 미만이면 배양되는 세포가 탈리될 수 있고, 평량이 30g/㎡를 초과하면 세포배양액의 통과가 용이하지 않아 목적하는 수준으로 세포 배양이 어려울 수 있다.
한편, 상기 제1원단(100, 100')은 상기 평량 범위를 만족하는 동시에 두께가 5 ~ 50㎛일 수 있고, 바람직하게는 두께가 10 ~ 45㎛일 수 있다. 만일 상기 제1원단이 상기 평량 범위를 만족하는 동시에 두께가 5㎛ 미만이면 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되지 않고, 원단의 외부표면에서만 2차원적으로 증식 및 배양됨에 따라, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되지 않고, 세포의 생존율이 저하되며, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 없을 수 있고, 두께가 50㎛를 초과하면 배양되는 세포가 탈리될 수 있다. 또한, 상기 제2원단(200, 200')은 상기 평량 범위를 만족하는 동시에 두께가 5 ~ 50㎛일 수 있고, 바람직하게는 두께가 10 ~ 45㎛일 수 있다. 만일 상기 제2원단이 상기 평량범위를 만족하는 동시에 두께가 5㎛ 미만이면 세포배양액의 통과가 용이하지 않아 목적하는 수준으로 세포 배양이 어려울 수 있고, 두께가 50㎛를 초과하면 배양되는 세포가 탈리될 수 있다.
그리고, 상기 제1원단(100, 100')은 공기투과도가 0.1 ~ 10cfm일 수 있고, 바람직하게는 공기투과도가 1 ~ 8cfm일 수 있다. 만일 상기 제1원단(100, 100')의 공기투과도가 0.1cfm 미만이면 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되지 않고, 원단의 외부표면에서만 2차원적으로 증식 및 배양됨에 따라, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되지 않고, 세포의 생존율이 저하되며, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 없을 수 있고, 공기투과도가 10cfm을 초과하면 배양되는 세포가 탈리될 수 있다. 또한, 상기 제2원단(200, 200')은 공기투과도가 0.1 ~ 10cfm일 수 있고, 바람직하게는 공기투과도가 1 ~ 8cfm일 수 있다. 만일 상기 제2원단(200, 200')의 공기투과도가 0.1cfm 미만이면 세포배양액의 통과가 용이하지 않아 목적하는 수준으로 세포 배양이 어려울 수 있고, 공기투과도가 10cfm을 초과하면 배양되는 세포가 탈리될 수 있다.
한편, 상기 제1원단(100, 100') 및 제2원단(200, 200') 중 어느 하나 이상은 복수 개 이상 구비될 수 있다. 즉 도면에는 하나의 상기 제 1 원단(100) 및 제 2 원단(200)으로 도시하였으나, 이에 한정되지 않고 복수 개의 상기 제 1 원단(100) 및 제 2 원단(200)으로 구성될 수 있다.
예를 들어, 제1원단(100, 100')과 제2원단(200, 200')이 교호적층되거나 무작위로 적층될 수 있으며, 제1원단(100, 100')과 제2원단(200, 200')이 무작위로 적층되는 경우, 제1원단의 일면에 제2원단을 구비하되, 제1원단 및 제2원단 각각이 단층 또는 두 층으로 구비되어 무작위로 적층될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')의 제 1 원단(100, 100') 및 제 2 원단(200, 200')은 배양되는 세포의 크기와 종류 및 배양의 목적 등을 고려하여 적절히 배열할 수 있다.
다음, 본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')에 구비되는 제1원단(100, 100')은 제1원사(110')를 포함하여 형성되고, 제2원단(200, 200')은 제2원사(210')를 포함하여 형성된다.
이때, 상기 제1원사(110')는 친수성 고분자를 포함하여 형성될 수 있고, 상기 제2원사(210')는 소수성 고분자를 포함하여 형성될 수 있다.
상기 제1원사(110')는 한 개 또는 복수 개의 모노사로 이루어질 수 있고, 상기 한 개 또는 복수 개의 모노사는 방적사, 필라멘트사, 슬리팅사(slitting yarn) 또는 전기방사된 나노섬유일 수 있다. 이러한 모노사의 친수성을 특성을 부여하기 위해서 상기 모노사들의 방사용액을 친수성 섬유형성성분으로 하거나 방사 후 원사 표면에 플라즈마 처리, 도파민 등의 성분으로 표면코팅 등을 더 수행할 수 있다. 일예로, 상기 모노사는 친수성 섬유형성성분인 친수성 고분자를 포함하여 형성될 수 있다.
이와 같이 상기 제 1 원단(100, 100')에 구비되는 제1원사(110')가 친수성 고분자를 포함하여 형성됨으로써 물에 의한 분해성이 높아지고, 배양된 세포를 분리, 수거하는 공정에서 지지체를 용해시키는 용액으로 사용될 수 있는 물로 인한 세포에 자극이 거의 없어서 배양된 세포에 물리/화학적 손상을 거의 주지 않는 이점이 있다.
또한, 상기 제2원사(210')는 한 개 또는 복수 개의 모노사로 이루어질 수 있꼬, 상기 한 개 또는 복수 개의 모노사는 방적사, 필라멘트사, 슬리팅사(slitting yarn) 또는 전기방사된 나노섬유일 수 있다. 이러한 모노사의 소수성을 특성을 부여하기 위해서 상기 모노사들의 방사용액을 소수성 섬유형성성분으로 하거나 방사 후 원사 표면에 실란계 커플링제를 처리하여 소수성 특성을 향상시킬 수 있다. 일예로, 상기 모노사는 소수성 섬유형성성분인 소수성 고분자를 포함하여 형성될 수 있다.
이와 같이 상기 제 2 원단(200, 200')에 구비되는 제2원사(210')가 소수성 고분자를 포함하여 형성됨으로써 원단 표면의 소수성이 증가하여 외부면이 소수 특성을 갖는 세포와 접착성이 증가하고, 원사들 사이의 수소결합력이 약해져서 분산성이 좋아질 수 있다. 또한 상기 제 1 원단(100, 100')과 제 2 원단(200, 200')이 각각 친수성/소수성 원사를 포함함으로써 하나의 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')을 통하여 친수성/소수성 세포의 동시 배양이 가능한 이점이 있다.
한편, 상기 제1원사(110')는 평균직경이 100 ~ 500㎛일 수 있고, 바람직하게는 평균직경이 150 ~ 450㎛일 수 있다. 만일 상기 제1원사(110')의 평균직경이 100㎛ 미만이면 배양되는 세포가 탈리될 수 있고, 평균직경이 100㎛를 초과하면 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되지 않고, 원단의 외부표면에서만 2차원적으로 증식 및 배양됨에 따라, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되지 않고, 세포의 생존율이 저하되며, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 없을 수 있다.
또한, 상기 제2원사(210')는 평균직경이 100 ~ 500㎛일 수 있고, 바람직하게는 평균직경이 150 ~ 450㎛일 수 있다. 만일 상기 제2원사(210')의 평균직경이 100㎛ 미만이면 배양되는 세포가 탈리될 수 있고, 평균직경이 100㎛를 초과하면 공경이 감소됨에 따라 세포배양액의 통과가 용이하지 않아 목적하는 수준으로 세포 배양이 어려울 수 있다.
다음, 본 발명의 일실시예에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')의 제1원단(100, 100')에 구비되는 제1원사(110')는 생분해성 섬유형성성분을 포함할 수 있고, 제2원단(200, 200')에 구비되는 제2원사(210')는 비생분해성 섬유형성성분을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1원사(110')는 섬유형성성분으로 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리다이옥사논(polydioxanone), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리락틱산(Polylactic acid) 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함할 수 있고, 상기 제2원사(210')는 섬유형성성분으로 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리아크릴로나이트릴(PAN), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌옥사이드(poly(alkylene oxide)), 폴리아미노산(poly(amino acids)), 폴리알릴아민(poly(allylamines), 폴리포스파젠(polyphosphazene) 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다.
한편, 상술한 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10')을 구성하는 제1원사(110') 및/또는 제2원사(210')는 섬유형성성분 이외에 접착성분 및 생리활성성분 등과 같은 세포배양 향상물질을 포함할 수 있다.
이를 제1원단을 예를 들어 설명하면, 도 3에 도시된 바와 같이 제1원단(100")은 제1원사(110")에 섬유형성성분(111) 외에, 접착성분(112) 및 생리활성성분(113)을 포함하는 세포배양 향상물질을 포함할 수 있다. 이때, 제2원단이 세포배양 향상물질을 포함할 경우, 제1원사 및 제2원사에 구비되는 세포배향 향상물질을 서로 다를 수 있다.
한편, 상기 제1원사(110")의 내부에는 접착성분(112)이나 생리활성성분(113)이 구비되지 않고, 외부면 일 영역에 고정된 접착성분(112)을 통해 생리활성성분(113)이 제1원사(110")의 외부면 일부분에 고정될 수 있다. 또는 원사의 외부면을 전부 피복하여 구비되는 접착성분을 전부 피복하도록 생리활성성분이 구비될 수도 있다.
최근 연구되고 있는 세포배양기술은 실제 체내의 세포간 환경을 in vitro에서 구현시키는 방향으로 연구되고 있으며, 세포배양 환경을 체내의 세포환경과 유사하게 조성시키기 위하여 체내 세포외 기질(ECM)에 구비되는 각종 성분을 in vitro 배양시 배양용액에 포함시켜 적용하는 추세에 있다. 그러나 배양용액에 세포배양을 증진시킬 수 있는 물질을 포함시킬 경우 배양되는 세포에 지속적으로 상기 물질을 노출시키는데 한계가 있으며, 지속적 노출을 위해서는 배양용액에 상기 물질의 함량을 증가시켜야 하나, 이는 비용의 증가, 증식효율에 있어서 문제가 있다.
이에 따라 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10")을 구성하는 제1원사(110")에 접착성분(112) 및 생리활성성분(113)이 고정된 상태로 구비시켜 세포자극 및 이를 통한 세포 내 신호전달을 지속, 증폭시켜 세포증식을 더욱 가속화 시킬 수 있는 이점이 있다.
상기 접착성분(112)은 배양세포를 초기에 세포 지지체 상에 고정시켜 배양용액상에 로딩된 세포가 부유하는 것을 방지하는 기능 및/또는 생리활성성분(113)을 제1원사(110")에 고정시켜 생리활성성분(113)이 제1원사(110") 상에 세포배양 되는 과정에서 배양되는 세포의 탈리를 방지하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 접착성분(112)은 통상의 생체적합성이 있어서 세포독성을 발생시키지 않는 공지된 접착성분(112)의 경우 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 아미노산 서열이 1회 내지 20회 반복하여 이루어진 단백질 및 이들 단백질 중 적어도 2개가 융합된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있고, 이를 통해 세포독성이 현저히 저하되고, 생리활성성분(113)의 접착력이 우수한 동시에 세포배양 중 접착성분(112)이 배양용액에 용해됨에 따라서 발생하는 생리활성성분의 탈리나 세포의 단리가 방지될 수 있는 이점이 있다.
다음으로, 생리활성성분(113)에 대해 보다 구체적으로 설명한다. 상기 생리활성성분(113)은 세포배양을 증진시킬 수 있도록 세포의 부착, 이동, 성장, 증식(proliferation) 및 분화(differentiation) 중 어느 하나 이상을 직/간접적으로 유도하는 물질일 수 있으며, 이와 같은 기능을 발현하는 것으로 알려진 공지의 물질인 경우 제한 없이 포함될 수 있다. 일예로, 상기 생리활성성분(113)은 모노아민, 아미노산, 펩타이드, 당류(saccharide), 지질(lipid), 단백질, 당단백질(glucoprotein), 당지질(glucolipid), 프로테오글리칸, 뮤코다당(mucopolysaccharide) 및 핵산(nucleic acid) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 및 세포 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 이때, 모노아민은 일예로, 카테콜아민, 인돌아민 등 1차 아민을 포함하는 화합물을 포함한다. 또한, 상기 펩타이드는 올리고펩타이드를 포함하며, 상기 단백질은 폴리펩티드를 포함하고 일예로, 피브로넥틴 등일 수 있다. 상기 당류는 단당류, 다당류, 올리고당 및 탄수화물을 포함하고, 상기 지질은 일예로 스테로이드 호르몬일 수 있다.
한편, 상기 생리활성성분(113)은 모티프를 포함할 수 있다. 상기 모티프는 생장인자(growth factor) 또는 세포외기질(extracellular matrix)에 포함되는 단백질, 당단백질 및 프로테오글리칸 중에서 선택된 어느 하나 이상에 구비된 소정의 아미노산 서열을 포함하는 천연 펩타이드 또는 재조합 펩타이드일 수 있다. 구체적으로 상기 모티프는 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 앙기오포이에틴(Angiopoietin), 뼈형성단백질(BMP), 뇌유래신경영양인자(BDNF), 표피생장인자(EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin), 섬유아세포 증식인자(Fibroblast growth factor), 신경교의세포주유래신경영양인자(GDNF), 과립구집락자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 성장분화인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포생장인자(HGF), 간세포선종 유래 생장인자(Hepatoma-derived growth factor, HDGF), 인슐린유사생장인자(Insulin-like growth factor, IGF), 각질세포 증식인자(Keratinocyte growth factor , KGF), 이동자극인자(Migration-stimulating factor, MSF), 마이오스타틴(Myostatin , GDF-8), 신경생장인자(Nerve growth factor, NGF), 혈소판유래생장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), T-세포생장인자(T-cell growth factor, TCGF), 뉴로필린, 형질전환생장인자-알파(TGF-α), 형질전환생장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 혈관내피생장인자(VEGF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생장인자(GF)에 포함된 소정의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는, 히알루론산, 헤파린황산염, 콘드로이틴황산염, 테르마틴황산염, 케라탄황산염, 알진염, 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포외기질(extracellular matrix)에 포함되는 소정의 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 모티프는 생장인자에 포함되는 소정의 아미노산 서열 및 상기 세포외기질에 포함되는 소정의 아미노산 서열을 모두 포함할 수도 있다. 보다 바람직하게는 상기 모티프는 서열번호 8 내지 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 단백질 및 이들 단백질 중 적어도 2개가 융합된 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 모티프는 상술한 접착성분(112)에 공유결합시켜 일체로 구현될 수도 있다. 일예로, 상기 접착성분(112)이 단백질인 경우 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 상기 모티프를 직접 공유결합 시키거나 이종의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 개재시켜 공유결합 시킬 수 있으며, 이 경우 제1원사(110")에 더욱 견고히 생리활성성분(113)을 부착시킬 수 있고, 생리활성성분(113)의 세포배양 중 탈리를 최소화시킬 수 있다.
또한, 상기 생리활성성분(113)이 모티프일 경우 상기 모티프는 세포의 부착성을 증진시키기 위하여 홍합단백질 또는 홍합단백질 중 특정한 도메인이나 모티프를 더 포함하여 구현될 수 있다.
한편, 해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질(adhesive proteins)을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체 표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다. 홍합 접착 단백질(110)은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 지니고 있다. 또한, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 아직까지 화학접착제 개발에서 미완의 과제로 남아 있는 젖은 표면에서의 접착도 몇 분 안에 가능하다.
만일, 본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단에 구비되는 생리활성성분으로 홍합단백질을 사용할 경우, 세포를 지지체에 안정적으로 배양시켜 세포의 생착율을 높임과 동시에 세포에 유해한 물리화학적 기작을 수행하지 않음으로써 세포 배양에 보다 적합한 환경을 구현할 수 있다. 또한, 세포를 회수하는 과정에서도 별도의 물리화학적 기작을 요하지 않기 때문에 세포에 손상을 가하지 않고 세포를 보다 용이하게 회수할 수 있다.
한편, 이하에서는 도 4 및 도 5를 통해 세포(300a, 300b)가 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)를 통해 제1원단(101)에 결합하는 구조에 대해 상세히 설명하도록 한다.
도 4를 참조하면, 제1원단(101)에 구비되는 경위사로 배열된 제1원사로 인해 형성된 기공에서 배양되는 세포(300a)는 홍합 접착 단백질(114)을 통해 제1원사와 접착할 수 있다.
상기 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)은 배양세포를 초기에 세포지지체 상에 고정시켜 배양용액상에 로딩된 세포가 부유하는 것을 방지하는 기능 및/또는 비접착성 생리활성성분(113)을 원사에 고정시켜 세포배양 되는 과정에서 생리활성성분(113)의 탈리를 방지하는 기능을 수행할 수 있다. 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilusedulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytiluscoruscus)에서 유래한 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b) 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 fp(foot protein)-1 내지 fp-5단백질 또는 이의 변이체를 포함하며, 바람직하게는 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis footprotein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 6), fp-3 (서열번호 7), fp-4 (서열번호 8), fp-5 (서열번호 9), 및 fp-6 (서열번호 10)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)은 국제공개번호 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/[0013] 092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-151(서열번호 11), fp-131(서열번호 13), fp-353(서열번호 14), fp-153(서열번호 15), fp-351(서열번호 16) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)의 변이체는, 바람직하게는 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.
이와 같은 본 발명의 일 구현예에 따른 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)은 제1원단(101)에 구비되는 제1원사에 접착될 수 있다. 다만 본 발명에서는 상기 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)이 제1원사 표면에 접착된 것으로 서술하였지만, 이에 제한되지 않고 제1원사 제조 시 섬유형성성분과 홍합 접착 단백질을 함께 혼합하여 합성고분자 용액을 제조한 후 방사를 통해 홍합 접착 단백질의 일부가 내부에 위치하고, 다른 일부가 외부 표면에 구비된 제1원사를 제조할 수도 있다.
또한, 도 5와 같이 상기 홍합 접착 단백질(114a, 114b)은 접착성분(112) 및 생리활성성분(113)을 통하여 목적하는 세포와 접착할 수 있다. 즉 홍합 접착 단백질(114a) 표면에 구비된 접착성분(112) 및 생리활성성분(113)은 신호전달 기능을 하는 세포막 수용체(310)와 펩타이드 결합을 통해 접착될 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않고 상기 홍합 접합 단백질은 자체의 접착능력을 이용하여 세포(300b) 외막과 직접적으로 접착될 수 있다.
이와 같이 본원 발명의 일 실시예에 따른 홍합 접착 단백질(114, 114a, 114b)은, 물리적 접착 기능만을 가지고 있어 세포의 성장과 분화 등의 세포 고유 기능을 저하시키는 기존의 접착제를 대체하고, 인체에 안전하고 세포의 성장과 분화 기능을 활성화하는 펩타이드 결합을 통해 세포의 특성을 그대로 유지하면서도 접착력을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
한편, 상술한 바와 같이 제2원사에도 접착성분, 생리활성성분, 홍합 접착 단백질이 포함될 수 있으나, 상술한 제1원사(110")에 구비되는 접착성분, 생리활성성분 및 홍합 접착 단백질에 대한 설명과 동일할 수 있음에 따라, 이에 대한 자세한 설명은 생략하도록 한다.
한편, 본 발명에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 통해 세포 배양 시, well plate를 예로 설명하면, well plate의 하부면에 접하도록 원단을 고정 시, 원단의 하부면에서 배양되는 세포들의 괴사가 발생할 수 있음에 따라, 하부면으로부터 소정의 이격거리를 두고 원단을 고정시켜서 세포를 배양시킬 수 있다.
한편 본 발명은, 본 발명에 따른 상술한 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단(10, 10'); 및 상기 원단 내 배양된 세포들을 포함하는 조직공학용 이식체를 제공한다.
이때, 상기 세포는 전능줄기세포, 만능줄기세포, 다능줄기세포, 올리고포텐트(oligopotent) 줄기세포 및 단일줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 줄기세포 및, 조혈모세포, 간세포, 섬유세포, 상피세포, 중피세포, 내피세포, 근육세포, 신경세포, 면역세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혈액세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분화세포 중에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다. 일예로, 상기 세포는 형상이 구형보다는 일방향으로 길쭉한 형상을 갖는 세포이거나 이동성이 강한 세포일 수 있다.
또한, 상기 제1원사 및 제2원사의 재질을 인체에 무해한 섬유형성성분으로 구현할 경우 배양된 세포가 부착된 지지체를 직접 인체 내부로 이식이 가능하며, 이를 통해 배양된 세포를 조직 내 더욱 용이하고, 안정적으로 생착시킬 수 있는 이점이 있다.
서열번호 아미노산 서열
1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser GluGlu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His SerGly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly LysTyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser GlyLys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly TyrLys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro ThrTyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro SerTyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr LysAla Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys
2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser GluGlu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His SerGly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly LysTyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser GlyLys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly TyrLys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro ThrTyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro SerTyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr LysAla Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro
3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp AlaAsp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly GlyAsn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp AsnAsn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser AlaLys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys ProSer Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr TyrLys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu
4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly GlyGly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly TrpAsn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr HisTyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly TyrLys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr LysAsn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His ArgLys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala LysPro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro ThrTyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
8 Arg Gly Asp
9 Arg Gly Asp Ser
10 Arg Gly Asp Cys
11 Arg Gly Asp Val
12 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro
13 Gly Arg Gly Asp Ser
14 Gly Arg Gly Asp Thr Pro
15 Gly Arg Gly Asp Ser Pro
16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys
17 Tyr Arg Gly Asp Ser
18 Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr
19 Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
20 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
21 Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr
22 Lys Ala Phe Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe
23 Ile Lys Val Ala Asn
24 Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln
25 Val Ala Glu Ile Asp Gly Ile Gly Leu
26 Pro His Ser Arg Asn Arg Gly Asp Ser Pro
27 Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
28 Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예 1>
먼저, 제1원단을 제조하기 위하여 접착물질로 피프로넥틴(fibronectin, RGD based)을 0.3mg/ml 및 생리활성물질로 라미닌(laminin)을 0.3mg/ml로 포함하고, 섬유형성성분으로 PLGA을 13중량% 및 용매로 THF과 DMF를 3 : 7의 중량비로 총 87중량%로 포함하는 제1방사용액을 전기방사 장치를 사용하여 인가전압 25KV, 집전체와 방사구까지의 거리 25cm, 토출량 0.05ml/hole의 조건으로 RH 60% 30의 환경에서 전기방사를 실시하여 평균직경이 600nm인 나노섬유로 형성된 나노섬유웹을 수득하였다. 수득된 나노섬유웹을 온도 130℃, 압력 4 kPa로 캘린더링 2회 실시한 방법으로 평량이 15.1 g/㎡이고, 두께가 25 ㎛이며, 평균 공경이 0.8 ㎛이고, 공기투과도가 5 cfm인 제1원단을 제조하였다.
그리고, 제2원단을 제조하기 위하여 접착물질로 피프로넥틴(fibronectin, RGD based)을 0.3mg/ml 및 생리활성물질로 라미닌(laminin)을 0.3mg/ml로 포함하고, 섬유형성성분으로 PVDF(Polyvinylidene fluoride)를 16중량% 및 용매로 아세톤과 디메틸아세트아미드(DMAc)를 3 : 7의 중량비로 총 84중량%로 포함하는 제2방사용액을 전기방사 장치를 사용하여 인가전압 25KV, 집전체와 방사구까지의 거리 25cm, 토출량 0.05ml/hole의 조건으로 RH 65% 30의 환경에서 전기방사를 실시하여 평균직경이 550nm인 나노섬유로 형성된 나노섬유웹을 수득하였다. 수득된 나노섬유웹을 온도 130℃, 압력 4 kPa로 캘린더링 2회 실시하여 평량이 15 g/㎡이고, 두께가 25 ㎛이며, 평균 공경이 0.3 ㎛이고, 공기투과도가 5 cfm인 제2원단을 제조하였다.
<실시예 2 ~ 13 및 비교예 1 ~ 2>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 제1원단의 평균 공경, 평량, 공기투과도, 제2원단의 평균 공경, 평량, 공기투과도, 제1원단 및 제2원단의 포함여부 등을 변경하여 표 3 및 표 4와 같은 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 제조하였다.
<실험예: 표면 세포수(%) 및 내부 세포수(%) 측정>
실시예 및 비교예에서 제조된 각각의 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 well plate에 고정시키되, 원단 하부면에 배양되는 세포의 괴사를 방지하기 위하여 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단을 well plate 하부면에서 수직방향으로 3mm의 이격거리를 두어 고정시켰다. 준비된 well plate에 섬유아세포(HS27)를 로딩시킨 후 10% 완전배지에서 4일동안 증식시켰다. 이때, 10 % 완전배지는 듀베코스의 변형된 이글즈 배지(DMEM)에 함의(Ham's) F12 배지를 1 : 1.5의 부피비로 혼합한 후, 소태아혈청(fetal bovine serum) 7 vol%, 페니실린 65 U/mL 및 스트렙토마이신 65㎍/mL을 첨가하여 제조하였다.
이후, 증식된 섬유아세포에 대하여 DAPI 염색을 실시한 후 Confocal microscope를 통해 배양된 세포가 부착된 상태로 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단 하부에서 상부까지 Z-축 방향으로 높이를 달리하면서 표면 및 내부사진을 촬영하였고, 슬리팅사 표면에서 배양된 세포의 수(제1원단 상부면의 세포수, 제2원단 상부면의 세포수 및 제2원단 하부면의 세포수의 평균값)와 제1원단 내부에서 배양된 세포의 수(제1원단 두께의 1/3지점과 2/3 지점에서 측정된 세포수의 평균값)을 측정 및 계산하였다. 이때, 실시예 1에서 측정된 표면 및 내부 세포수를 100%로 기준하여 다른 실시예 및 비교예의 세포수를 상대적으로 나타내었다. 표 3 및 표 4에 나타내었다.
구분 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7
제1원단 평균공경(㎛), a 0.8 1.2 0.95 0.55 0.4 0.91 0.57
평량(g/㎡) 15.1 13 14.2 15.9 17.3 0.5 35
공기투과도(cfm) 5 6.2 5.5 4.6 4.1 5.8 4.3
제2원단 평균공경(㎛), b 0.3 0.05 0.15 0.45 0.6 0.3 0.3
평량(g/㎡) 15 19.1 17.9 14.4 13.8 15 15
공기투과도(cfm) 5 4 4.4 5.6 6.3 5 5
조건(1) b/a 0.375 0.042 0.16 0.82 1.5 0.33 0.53
표면 세포수(%) 100 63 88 90 72 65 81
내부 세포수(%) 100 79 93 91 77 62 51
구분 실시예8 실시예9 실시예10 실시예11 실시예12 실시예13 비교예1 비교예2
제1원단 평균공경(㎛), a 0.8 0.8 0.57 0.93 0.8 0.8 - 0.8
평량(g/㎡) 15.1 15.1 18.6 12.2 15.1 15.1 - 15.1
공기투과도(cfm) 5 5 0.05 12 5 5 - 5
제2원단 평균공경(㎛), b 0.42 0.18 0.3 0.3 0.17 0.43 0.3 -
평량(g/㎡) 0.5 35 15 15 18.4 12.1 15 -
공기투과도(cfm) 5.7 4.4 5 5 0.05 12 5 -
조건(1) b/a 0.53 0.23 0.53 0.32 0.21 0.54 - -
표면 세포수(%) 64 75 80 70 71 66 80 61
내부 세포수(%) 70 73 52 68 69 68 17 53
상기 표 3 및 표 4에서 알 수 있듯이,본 발명에 따른 제1원단의 평균 공경, 평량, 공기투과도, 제2원단의 평균 공경, 평량, 공기투과도, 제1원단 및 제2원단 포함여부 등을 모두 만족하는 실시예 1, 3 및 4가, 이 중에서 하나라도 누락된 실시예 2, 5 ~ 13 및 비교예 1 ~ 2에 비하여 배양되는 세포가 탈리되지 않고, 세포가 원단의 내부와 외부 모두에서 증식 및 배양되며, 세포의 부착, 이동, 증식, 분화에 적합한 미세환경이 구현되어, 세포를 3차원적으로 증식시킬 수 있음에 따라, 표면 세포수 및 내부 세포수가 많아 세포배양 지지체로 더욱 적합한 것을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 제1원사를 포함하여 형성되는 제1원단; 및
    제2원사를 포함하여 형성되고, 상기 제1원단의 적어도 일면에 구비되며, 상기 제1원단에 비하여 작은 평균 공경을 가지는 제2원단;을 포함하는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1원단과 제2원단의 평균 공경은 하기 조건 (1)을 만족하는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단:
    (1) 0.08 ≤ b/a ≤ 1.2
    이때, 상기 a는 제1원단의 평균 공경(㎛)이고, 상기 b는 제2원단의 평균 공경(㎛)이다.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1원단은 평균 공경이 0.5 ~ 1㎛이고,
    상기 제2원단은 평균 공경이 0.1 ~ 0.5㎛인 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1원단은 평량이 1 ~ 30g/㎡ 및 공기투과도가 0.1 ~ 10cfm이고, 상기 제1원사는 평균직경이 100 ~ 500㎛이며,
    상기 제2원단은 평량이 1 ~ 30g/㎡ 및 공기투과도가 0.1 ~ 10cfm이고, 상기 제2원사는 평균직경이 100 ~ 500㎛인 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1원사는 친수성 고분자를 포함하여 형성되고,
    상기 제2원사는 소수성 고분자를 포함하여 형성된 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1원단 및 제2원단 중 어느 하나 이상은 복수 개 이상 구비되고,
    상기 제1원단 및 제2원단은 교호적층되거나 무작위로 적층되는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1원단 및 제2원단은 각각 독립적으로 편물, 직물 및 부직포 중 어느하나인 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1원사 및 제2원사 중 어느 하나 이상의 원사는 세포배양 향상물질을 포함하는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포배양 향상 물질은 세포의 부착, 이동, 성장, 증식(proliferation) 및 분화(differentiation) 중 어느 하나 이상을 유도하는 생리활성성분인 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생리활성성분은 모노아민, 아미노산, 펩타이드, 당류(saccharide), 지질(lipid), 단백질, 당단백질(glucoprotein), 당지질(glucolipid), 프로테오글리칸, 뮤코다당(mucopolysaccharide) 및 핵산(nucleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 및 세포 중 1종 이상을 포함하는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제1원사는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리다이옥사논(polydioxanone), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid), PLLA(poly(Llactide)), PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리락틱산(Polylactic acid) 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함하고,
    상기 제2원사는 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리이더술폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리아미드, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌옥사이드(poly(alkylene oxide)), 폴리아미노산(poly(amino acids)), 폴리알릴아민(poly(allylamines), 폴리포스파젠(polyphosphazene) 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함하는 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 세포배양 지지체용 멀티레이어 원단; 및
    상기 원단 내 배양된 세포들을 포함하는 조직공학용 이식체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는,
    전능줄기세포, 만능줄기세포, 다능줄기세포, 올리고포텐트(oligopotent) 줄기세포 및 단일줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 줄기세포 및,
    조혈모세포, 간세포, 섬유세포, 상피세포, 중피세포, 내피세포, 근육세포, 신경세포, 면역세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혈액세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분화세포 중에서 선택된 1 종 이상을 포함하는 조직공학용 이식체.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007510820A (ja) * 2003-11-05 2007-04-26 ミシガン ステイト ユニバーシティー ナノフィブリル構造体ならびに細胞および組織培養を含めた応用例
JP5566348B2 (ja) * 2003-08-07 2014-08-06 旭化成メディカル株式会社 複合多孔膜とその製造方法
KR101458425B1 (ko) * 2014-04-03 2014-11-07 동아대학교 산학협력단 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체, 이를 포함하는 에세이칩 및 에세이칩을 이용한 세포 분석방법
KR20140144062A (ko) * 2013-06-10 2014-12-18 주승연 3차원 세포배양 키트 및 이를 이용한 3차원 세포배양 방법
KR101479205B1 (ko) * 2014-06-30 2015-01-05 경북대학교 산학협력단 나노섬유 및 마이크로섬유가 직교된 나노-마이크로 섬유 매트의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 나노-마이크로 섬유 매트

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009093023A2 (en) * 2008-01-25 2009-07-30 Smith & Nephew Plc Multilayer scaffold
KR101104305B1 (ko) 2009-09-04 2012-01-11 충남대학교산학협력단 다공성 표면을 갖는 야누스 형태의 조직공학용 고분자 마이크로 섬유의 제조방법
JP6295182B2 (ja) * 2014-11-05 2018-03-14 グンゼ株式会社 組織再生基材
KR101828382B1 (ko) * 2016-04-28 2018-03-30 주식회사 아모그린텍 골유도재생술용 나노섬유 복합 멤브레인 및 그 제조방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5566348B2 (ja) * 2003-08-07 2014-08-06 旭化成メディカル株式会社 複合多孔膜とその製造方法
JP2007510820A (ja) * 2003-11-05 2007-04-26 ミシガン ステイト ユニバーシティー ナノフィブリル構造体ならびに細胞および組織培養を含めた応用例
KR20140144062A (ko) * 2013-06-10 2014-12-18 주승연 3차원 세포배양 키트 및 이를 이용한 3차원 세포배양 방법
KR101458425B1 (ko) * 2014-04-03 2014-11-07 동아대학교 산학협력단 3차원 구조의 다단 세포배양 구조체, 이를 포함하는 에세이칩 및 에세이칩을 이용한 세포 분석방법
KR101479205B1 (ko) * 2014-06-30 2015-01-05 경북대학교 산학협력단 나노섬유 및 마이크로섬유가 직교된 나노-마이크로 섬유 매트의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 나노-마이크로 섬유 매트

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