KR20140144062A - 3차원 세포배양 키트 및 이를 이용한 3차원 세포배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당시럽을 이용한 디스크 상에 가열된 아가로즈를 도포하여 점성이 있는 세포배양 지지체를 형성하고, 이와 같은 세포배양 지지체에 세포를 부착시켜 접종하여 점성 아가로즈젤 사이에서 세포가 입체적으로 배양되도록 하는 방법에 관한 것으로서, 당시럽이 아가로즈 내부로 흘러퍼져서 형성된 헐거운 입체구조를 이용하여 효율적인 3차원 세포배양이 가능하며, 상기 세포배양 지지체를 멸균된 상태로 밀봉 제작하여 필요할 때 간편하고 신속하게 사용할 수 있는 3차원 세포배양 키트 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

3차원 세포배양 키트 및 이를 이용한 3차원 세포배양 방법 {Three dimensional cell culturing kit and the culturing method using the same}

본 발명은 3차원 세포배양 키트 및 이를 이용한 3차원 세포배양 방법에 관한 것이다.

인공적으로 배양된 세포들은 다양한 분야에서 응용된다. 특히 동물세포를 3차원적으로 배양하면 이를 이용하여 약물의 작용기작을 연구하거나, 암세포의 전이과정을 추적하는데 활용이 가능하다. 특히 생체조직을 키워 인체에 이식이 필요한 경우 또는 줄기세포를 이식할 경우 2차원 세포배양 기술의 단점을 보완하여 생체 내에 보다 안정적으로 시술하기 위해 3차원 세포배양 기술이 더욱 중요하다. 그리고 3차원적으로 배양된 세포는 생체조직과 유사한 형태와 구조를 갖게 되며, 이를 이용하면 장기의 재생도 가능하다.

최근, 신약을 개발한 경우 약리활성을 테스트하기 위하여 동물실험을 수행하고 있고 무수히 많은 희생 동물이 발생하여 윤리적인 문제가 대두 되고 있다. 이때 2차원으로 평면 배양된 세포를 이용한 실험의 경우는 약리활성을 정확하게 평가하기 어려운 문제가 있다. 따라서, 생체조직과 유사한 환경으로 세포를 배양하기 위한 3차원 입체 배양 기술이 더욱 요구되고 있는 실정이다.

종래의 3차원 세포 배양기술로는 정전기 및 전극을 이용한 입체배양 방법, 고분자 물질을 지지체 (scaffold)로 활용하는 방법, 매트릭스 겔에 다공 (multi-pore)을 형성하여 배양하는 방법, 세포의 배양축을 바꾸어 주는 방법, 배양용기의 밑면에 굴곡을 주어 세포를 다층으로 배양시키는 방법, 나노입자를 이용하여 세포를 입체 배양하는 방법, 페이퍼에 세포를 배양하여 여러 층으로 쌓아 세포의 입체구조를 형성시키는 방법 및 세포부착이 가능한 콜라겐을 이용하여 세포를 입체적으로 배양하는 방법 등이 활용되었다.

그러나, 상기 종래의 3차원 세포배양 방법들은 배양방법이 복잡하고 세포배양에 장시간이 요구되는 등의 문제가 있었고, 이에 따라 신속하게 세포를 배양하여 활용해야 하는 경우에는 적용하기 어려운 한계가 있었다.

이와 같이 응용분야가 다양한 세포의 3차원적 배양을 위하여 다양한 시도가 이루어지고 있으나, 간편한 방법으로 신속하게 세포를 효율적으로 입체 배양할 수 있는 새로운 방법 및 필요할 때 언제든지 신속하게 활용할 수 있는 편리한 세포 배양 키트의 제공이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명에서는 굳힌 당시럽이 아가로즈용액 내부에 확산되어 녹아들어가 미세 틈이 다수 형성된 점성을 갖는 아가로즈젤 세포배양 지지체를 만든 후 상기 지지체에 세포를 접종하고, 이와 같이 세포가 접종된 점성 아가로즈젤 세포배양 지지체를 액상 배지에 띄워 배양함으로써 상술한 문제점을 해결할 수 있었고, 특히 점성있는 아가로즈젤 세포배양 지지체를 밀봉하여 키트로 제작함으로써 편리한 3차원 세포배양 키트를 제공할 수 있었으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

즉, 본 발명은 굳힌 당시럽을 이용하여 아가로즈 용액 내부에 다수의 요홈부가 형성되도록 하여 점성 아가로즈젤 세포배양 지지체로, 밀봉용기에 포장된 3차원 세포배양 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명은 점성 아가로즈젤의 점성이 있는 표면의 요홈부에 세포를 부착시켜 세포배양 지지체 역할을 하도록 하여 뒤집어 액상배지에 띄워 배양하는 3차원 세포배양 방법을 제공하는 데 있다.

상기 하나의 관점을 달성하기 위한 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트 (이하 "제1 발명"이라 함)는 내측의 당; 상기 당의 외측에 코팅된 아가로즈; 및 상기 당과 상기 아가로즈가 접촉하는 경계면에 상기 당이 녹아 들어가 형성된 다수의 요홈부;를 포함하는 세포배양 지지체로 구성된다.

제1 발명에 있어서, 상기 세포배양 지지체는 당이 녹아 들어가 형성된 오목한 콘택트렌즈 형상 또는 반구 형상인 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 세포배양 지지체는 투명한 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 3차원 세포배양 키트는 상기 세포배양 지지체를 수납할 수 있는 밀봉용기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 관점을 달성하기 위한 3차원 세포배양 방법 (이하 "제2 발명"이라 함)은 당시럽을 제공하는 단계; 상기 당시럽을 기판상에 도포하는 단계; 상기 당시럽을 냉각시켜 굳힌 후, 그 상부를 가열된 아가로즈로 코팅하여 당-아가로즈 복합체를 형성시키는 단계; 상기 당이 아가로즈로 스며들어가 굳어 세포배양 지지체를 형성시키는 단계; 상기 세포배양 지지체를 상기 기판으로부터 분리시키는 단계; 상기 분리된 세포배양 지지체의 당이 존재하는 부분에 세포를 접종시키는 단계; 및 상기 세포가 접종된 세포배양 지지체의 당이 존재하는 부분을 액상배지의 표면과 접촉시켜 세포를 배양하는 단계;를 포함한다.

제2 발명에 있어서, 상기 당시럽을 제공하는 단계의 당시럽은: 알코올에 고상의 당을 침지하여 불순물을 제거하는 단계; 상기 침지된 고상의 당을 회수한 후, 56 내지 70℃의 온도에서 고상의 당에 잔류하는 알코올을 증발시켜 건조시키는 단계; 상기 증발에 의해 건조된 고상의 당을 멸균 증류수에 녹이는 단계; 및 상기 멸균 증류수에 녹인 당을 100℃ 이상의 온도로 끓이는 단계;에 의해 형성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트는 당시럽이 아가로즈의 표면에 스며들어가면서 확산에 의해 다수의 점성이 있는 요홈부가 형성된 세포의 부착 및 세포배양 지지체로 구성되므로, 접종된 세포가 용이하게 부착되고 세포배양시 지지체 역할을 수행할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포배양 지지체의 재료인 아가로즈는 내구성이 뛰어나 요홈부를 장기간 유지 및 보관 가능하며 필요할 때 간편하게 세포를 배양할 수 있는 수단을 제공하는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 3차원 세포 배양방법에 따르면 당시럽에 의하여 아가로즈 내부에 가교구조물이 형성됨과 동시에 당의 확산으로 점성에 의하여 세포의 부착이 용이하게 되며, 세포를 부착시킨 후 뒤집어 중력방향으로 자라게 함으로써 세포들이 중첩에 의해 눌려 사멸하는 것을 방지할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 세포배양 지지체를 액상 배지에 띄워 배양함으로써 세포에 원활한 배지의 공급과 순환이 가능하게 되며, 기존의 3차원 세포배양 방식보다 간단하게 적은 비용으로 세포를 쉽게 효율적으로 배양할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트의 세포배양 지지체를 나타내는 단면도이다.
도 2의 (a) 및 (b)는 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트를 나타내는 단면도이다.
도 2의 (c)는 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트의 또 다른 구현 예를 나타내는 그림이다.
도 3의 (a) 내지 (j)는 본 발명에 따른 3차원 세포배양 방법을 나타내는 개략적인 공정단면도이다.
도 4는 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트를 웰 플레이트에 넣은 상태를 나타내는 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트를 웰 플레이트에 넣고 액상 배지를 공급한 상태를 나타내는 그림이다.
도 6은 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트의 세포배양 지지체를 형성하는 다른 구현 예를 나타내는 공정단면도이다.
도 7은 12-웰 플레이트에 본 발명에 따른 3차원 세포배양 지지체를 넣고 세포를 접종한 상태를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 3차원 세포배양 방법에 의하여 세포를 배양한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 본 발명에 따라 3차원적으로 HEK293세포를 배양한 지 4일째 되는 사진이다.
도 10은 본 발명에 따라 3차원적으로 HEK293세포를 배양한 지 8일째 되는 사진이다.

본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기 전에, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정되어서는 아니 되며, 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시 예의 구성은 본 발명의 바람직한 하나의 예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록, 본 발명의 바람직한 실시 예들을 상세히 설명한다. 아울러, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.

이하, 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트 및 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트의 세포배양 지지체를 나타내는 단면도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 3차원 세포배양 키트는 세포배양 지지체 그 자체 또는 이를 포함하여 구성되며, 세포배양 지지체는 아가로즈 및 당으로 구성된다. 한편 아가로즈 및 당으로 구성된 세포배양 지지체를 구체적으로 설명하면, 그 내측에 당이 존재하고, 외측은 상기 당에 아가로즈가 코팅되어 형성된다. 한편 상기 세포배양 지지체는 당과 아가로즈가 접촉하는 경계면에 다수의 요홈부가 형성되어 있으며, 이러한 요홈부는 고온의 아가로즈에 의해 용융된 당이 아가로즈 표면에 스며들어가 형성된 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 밀봉용기를 포함하는 3차원 세포배양 키트를 나타내는 단면도이다.

도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트는 곧바로 세포배양에 사용될 수도 있으나, 후술할 밀봉용기를 더욱 포함하도록 구성됨으로써 세포배양 지지체 (40)를 비교적 장기간 보관하기 위한 목적으로 사용될 수도 있다. 이러한 밀봉용기 내부에는 1xPBS를 채워 넣을 수 있으며, 이는 버퍼역할을 하게 된다. 이와 같이 밀봉용기에 수납된 세포배양 지지체는 내구성이 뛰어나고 비교적 장기간 보관하는 것이 가능하다.

즉, 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트는 세포배양 지지체 그 자체가 될 수도 있으나, 상기 밀봉용기에 수납된 형태로 제작될 수도 있다.

상기 밀봉용기는 본 발명에 따른 세포배양 지지체를 전체적으로 보호하는 역할을 수행하게 된다. 이러한 밀봉용기의 재질은 세포배양 지지체를 본래의 형상으로 유지할 수 있는 것을 선택한다. 바람직하게는 폴리메타아크릴레이트 (PMMA) 수지를 이용하여 성형 제작하는 것이 가능하다. 또한 상기 밀봉용기 안에는 세포배양 지지체의 형상이 유지될 수 있도록 소독된 증류수, 알코올 또는 1xPBS를 채울 수도 있다. 하나의 밀봉용기 안에는 통상 하나의 세포배양 지지체가 수납되는 것이 바람직하다. 한편 상기 밀봉용기는 덮개 (90)와 수납부 (100)로 구성되며, 상기 수납부 (100)는 세포배양 지지체의 형상에 맞게 제작되는 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다. 한편 본 발명에 따른 세포배양 키트는 도 2의 (c)와 같이 여러 개가 붙어있는 형태로 제작하는 것도 가능하다. 사용자는 필요한 경우 도 2의 (c)와 같이 하나의 세포배양 키트 (110)를 떼어낸 후 덮개 (90)를 제거하고 수납부 (100)에 들어있는 세포배양 지지체를 꺼내어 세포배양에 사용하는 것이 가능하다.

이러한 수납부 (100)와 덮개 (90)는 사용자가 필요한 경우 신속하게 개봉하여 사용할 수 있도록 제작하는 것이 바람직하며, 상기 세포배양 지지체를 상기 밀봉용기에서 용이하게 분리 가능하도록 제작한다. 상기 밀봉용기는 딱딱한 재질로 형성하거나, 또는 부드러운 재질로 형성하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명에 따른 3차원 세포배양 방법을 구체적으로 설명한다.

도 3은 본 발명에 따른 3차원 세포배양 방법을 나타내는 개략적인 공정단면도로서, 도 3을 참조하면, 알코올 등으로 소독된 기판 (10) 상에 소독된 당시럽을 도포하여 디스크형상의 당 (20)를 형성한다. 상기 당시럽은 상기 유리기판에 도포하기 전에 소독이 이루어져야 한다. 이러한 소독은 고형의 당을 100% 알코올에 약 10 내지 30분간 담그고 알코올에 침전된 고형의 당을 회수하여 고형의 당에 잔류하는 알코올을 증발시키는 단계를 포함한다. 한편, 상기 기판에 도포될 당시럽을 준비하는 단계는 상기 알코올 소독 단계를 마친 설탕을 증류수에 넣어 시럽을 만든 후, 이러한 시럽을 100℃ 이상의 온도로 끓이는 단계로 이루어진다. 상기 당시럽을 끓이는 온도는 100 내지 110℃가 바람직하다.

상기 기판은 본 발명에 따른 세포배양 지지체가 용이하게 분리되도록 유리기판인 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 한편 본 발명에 따른 세포배양 지지체는 아가로즈가 당시럽을 흡수하여 식으면서 수분이 빠져나오게 되어 유리 등의 기판으로부터 분리가 용이해진다.

상기 기판 (10) 상에 형성된 당시럽 디스크가 상온 (20 내지 25℃)으로 냉각될 때까지 기다린 후, 상기 디스크 상에 미리 준비된 아가로즈를 도포한다. 상기 아가로즈로는 0.5 내지 2 (w/v)% 아가로즈용액을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 도포 되는 아가로즈 용액은 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 끓인 후 5 내지 6℃ 이하로 식기 전에 아가로즈 용액을 상기 디스크 상에 도포하여 당-아가로즈 복합체를 형성시킨다. 이와 같은 당-아가로즈 복합체는 후술할 세포배양 지지체를 형성시키기 위한 중간단계를 의미하며, 액상의 아가로즈가 디스크형상의 당 위에 퍼져 흐르면서 후술할 콘택트렌즈 형상의 세포배양 지지체 (40)를 형성하게 된다.

이와 같이 당 위에 도포 된 아가로즈는 아가로즈의 고온에 의하여 당을 녹이게 되며, 이와 같이 용융된 당은 아가로즈의 내부로 용융되어 퍼지면서 아가로즈 내부에 다수의 틈 (요홈부)를 형성하게 된다. 이와 같이 형성된 요홈부는 후술할 세포가 지지하면서 자랄 수 있는 입체적인 지지체 역할을 하게 된다. 한편 틈이 형성된 아가로즈를 서서히 상온으로 냉각시키면 아가로즈가 굳어 젤 형상을 띄게 되며 세포배양 지지체 (40)가 형성된다.

이와 같이 냉각된 아가로즈는 당시럽에 의하여 내부에 다수의 요홈부가 형성되어 있는 구조이다. 상기 세포배양 지지체 (40)는 콘택트렌즈 형상 또는 반구 형상이며 한 쪽 면에 오목한 부분이 형성된다. 당이 아가로즈에 녹아 들어가 틈이 형성되어 있는 구조이나, 이러한 틈 구조는 육안으로는 확인되지 않으며 전체적으로 투명한 콘택트렌즈처럼 보인다. 미세한 틈은 상기 세포배양 지지체의 상기 오목부에 형성되어 있으며, 상기 오목부는 당시럽이 아가로즈와 접촉하는 부분에 형성된다. 세포배양 지지체에서 당 (20)과 아가로즈 (30)는 도 1에는 개념적으로 구분하여 도시하였으나, 실제 제조되는 세포배양 지지체에서는 이들의 경계가 육안으로 확인되지 않으며, 하나의 (투명한)구조체로 관찰된다.

상기 세포배양 지지체 (40)는 필요에 따라 다양한 크기 및 형상으로 제조될 수 있다. 즉, 상기 기판 (10) 상에 도포 되는 당시럽의 양에 따라 상기 디스크의 직경이 결정되며, 이와 같이 결정된 디스크의 직경 보다 상기 아가로즈를 더 넓게 도포하게 된다. 본 발명에 따른 상기 세포배양 지지체의 직경은 아가로즈 농도에 따라 0.5 내지 2cm인 것이 바람직하나, 필요에 따라 이러한 크기를 변경하는 것도 가능하다. 세포배양 지지체 하나를 만들기 위하여 아가로즈 용액 20 내지 40㎕를 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 세포배양 지지체는 액상의 당시럽 및 아가로즈를 이용하게 되므로 통상적으로 원형이며, 마치 콘택트렌즈와 유사한 형상을 갖게 된다. 그러나, 이러한 형상은 원형, 삼각형, 사각형 또는 무정형 등 다양하게 형성되는 것이 가능하며, 본 발명의 범주가 이러한 형상에 한정되는 것은 아니다.

상기 세포배양 지지체는 보통 투명한 상태로 형성된다. 즉, 당시럽을 제조할 때 백색의 일반적인 알갱이 상태 설탕을 사용하게 되며, 용융된 당이 아가로즈로 녹아 들어가면서 아가로즈의 투명성이 더해져 전체적인 세포배양 지지체는 투명에 가까운 색을 띤다. 이러한 투명성은 후술할 세포의 배양상태를 지지체에서 배양한 상태 그대로 현미경으로 관찰가능하도록 하며, 오염 등에 의하여 정상적인 세포배양이 이루어지지 않는 경우 이러한 비정상상태를 손쉽게 확인할 수 있는 장점을 갖게 된다. 그러나, 본 발명에 따른 상기 세포배양 지지체의 색상은 반드시 투명한 상태에만 한정되는 것은 아니다. 즉, 필요에 따라 각 세포배양 지지체마다 서로 다른 색상을 띠게 하여 다양한 세포의 배양 상태를 한눈에 구별하여 확인할 수도 있다. 이와 같은 색상은 당시럽을 만드는 재료가 되는 알갱이 상태의 설탕에 세포의 성장에 영향을 주지 않는 색소를 첨가하거나 또는 아가로즈에 이러한 색소를 첨가하여 형성하는 것이 가능하다.

당은 높은 점성을 가지며, 이러한 당의 점성에 의하여 접종된 세포가 세포배양 지지체의 아가로즈에 용이하게 부착된다.

한편, 상기 세포배양 지지체에 존재하는 당은 접종된 세포에 영양분으로 사용될 수도 있다. 그러나, 이러한 영양분은 후술할 액상 배지에 의해 주로 공급되므로 세포배양 지지체에 존재하는 당이 쉽게 고갈되지는 않으며, 세포가 충분히 배양될 때까지 세포를 상기 세포배양 지지체에 부착시켜 두는 역할을 수행할 수 있다.

상기 세포배양 지지체는 하나의 기판상에 동시에 여러 개 형성시키는 것이 가능하다.

세포배양 지지체가 형성된 후, 상기 세포배양 지지체를 상기 기판으로부터 분리한다. 세포배양 지지체를 기판으로부터 분리할 때 소독된 핀셋 등을 이용할 수 있으며, 기타 당업자에게 알려진 일반적인 방법으로 수행하는 것이 가능하다.

상기 분리된 세포배양 지지체를 상기 기판에 또는 미리 준비된 별도의 유리기판에 뒤집어 세포배양 지지체의 오목한 부분이 위로 향하도록 위치시킨다. 이러한 유리기판은 알코올 등을 이용하여 미리 소독해 둔다. 이와 같이 뒤집어 위치된 세포배양 지지체의 오목한 부분에 3차원으로 배양할 세포를 접종한다. 세포접종은 세포의 종류에 따라 당업자에게 알려진 일반적인 방법에 의하여 수행될 수 있다. 세포접종시 상기 세포배양 지지체에서 당이 존재하며 요홈부가 형성된 부위에 넓게 접종하는 것이 바람직하며, 당이 있는 부분은 육안으로 식별되지 않으므로 당시럽으로 도포된 디스크형상의 크기가 어느 정도인지에 대한 정보를 미리 알아 두는 것이 필요하다. 그러나, 이와 같은 세포접종시 액상배지에 있는 세포를 이용하여 접종하는 경우에는 접종할 세포가 포함된 액상 배지를 상기 세포배양 지지체 전반에 걸쳐 도포하면 되므로 별도로 디스크의 크기를 고려할 필요가 없다.

이와 같이 접종된 세포는 상기 세포배양 지지체에 존재하는 당의 점착성에 의하여 상기 세포배양 지지체에 용이하게 부착되며, 특히 아가로즈에 존재하는 미세 틈 (요홈부)은 이러한 점착력을 강화하는 효과를 나타내게 된다.

이와 같이 세포가 접종된 세포배양 지지체를 미리 준비된 액상 배지에 띄워서 위치시키되 다시 오목한 부분이 아래를 향하도록 하여 세포가 액상 배지와 직접 접촉되도록 한다. 본 발명에 따라 3차원으로 배양되는 세포는 주로 동물세포이므로 당업자에게 알려진 동물세포 배양에 사용되는 액상 배지라면 어느 것이라도 본 발명의 배양방법에 사용될 수 있다.

액상 배지 상에 본 발명에 따른 세포배양 지지체를 띄워서 배양시키는 경우 세포는 중력방향으로 자라게 되어 세포 간의 눌림에 의한 간섭을 덜 받게 되며, 가장 자연스러운 형태로 세포가 자랄 수 있는 환경이 제공된다.

또한 세포가 자라는 동안 세포는 필연적으로 대사과정을 거치므로 암모니아 또는 이산화 탄소 등을 생산하게 된다. 이러한 암모니아 또는 이산화탄소 등은 액상 배지의 수소이온농도 (pH)변화를 야기하게 되나, 본 발명에 따른 3차원 세포배양 방법에 따르면, 아가로즈가 배양액을 머금은 형태로 배양액의 순환이 자유로워 암모니아 또는 이산화탄소 등을 잘 순환시켜 pH변화를 완화시키는 작용을 하므로 세포의 효율적인 배양이 가능해진다. 또한 아가로즈는 그 자체로 수분을 어느 정도 머금고 있으므로, 배지가 마르더라도 세포가 쉽게 건조되지 않는 장점 또한 갖게 된다.

도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 세포배양 지지체를 48-웰 플레이트 (well plate) 또는 24-웰 플레이트 등의 웰 플레이트 (130)에 넣어 세포를 3차원적으로 배양하는 방법을 나타내는 도면이다. 즉, 도 4와 같이 세포배양 지지체를 각각 웰 플레이트의 웰에 넣은 후 세포를 접종하고 도 5와 같이 액상 배지 (71)를 공급하는 것이 가능하다. 한편 세포 접종은 웰 플레이트에 세포배양 지지체를 넣기 전에 미리 이루어져도 무방하다. 한편 세포배양 지지체를 웰 플레이트에 수납한 후 세포를 접종하고자 한다면 세포배양 지지체의 당시럽이 존재하는 부분을 위로 향하도록 해야 한다. 이 경우는 웰 플레이트에 세포배양 지지체를 미리 넣고 세포를 접종하게 되므로 세포접종이 용이한 장점이 있다. 그러나, 이와 같이 웰 플레이트를 이용하여 세포를 3차원적으로 배양하는 경우에 세포를 중력방향으로 배양하는 것도 가능하다. 즉, 중력방향으로 배양하고자 하는 경우 (도시되지 않음)에는 세포배양 지지체에 배양하고자 하는 세포를 접종하고, 세포가 접종된 세포배양 지지체를 각각의 웰에 액상배지가 담겨져 있는 웰 플레이트에 뒤집어 (즉, 세포배양 지지체의 당시럽이 존재하는 부분이 아래로 향하도록) 넣어 세포를 3차원적으로 배양시키는 것이 가능하다. 이와 같이 세포배양 지지체를 뒤집어서 웰 플레이트에서 배양하는 경우에는 중력방향으로 세포가 자라게 되므로 효율적인 3차원 세포배양이 가능해진다.

도 6은 본 발명에 따른 3차원 세포배양 방법의 다른 구현 예를 나타내는 공정단면도이다. 즉, 도 6에 나타낸 과정은 도 3에 도시된 과정과 거의 유사하나, 도 3에서 사용된 유리기판 대신에 직접 웰 플레이트의 웰의 저부 (bottom)에서 본 발명에 따른 세포배양 지지체를 형성시키는 방법을 나타낸다. 이는 점성 아가로즈젤을 규격화하여 세포배양 지지체를 형성시키기 위한 방법이다. 즉, 48-웰 플레이트 또는 24-웰 플레이트 (웰의 개수는 무방함) 등의 웰 플레이트의 저부에 당시럽 (160)을 100 내지 200㎕ 정도 도포하고 (a), 그 위에 1xPBS에 녹인 1%아가로즈 용액 (150)이 50 내지 85℃의 온도 일 때, 각각 400 내지 800㎕정도 분주하여 당이 아가로즈 내로 확산되어 퍼져 녹아들어간 점성의 아가로즈젤을 만든다. 이 때, 도 1 및 도 3에서 설명한 것과 같이 당 (161)이 아가로즈로 녹아 들어가 다수의 요홈부가 형성된다 (b). 이와 같이 다수의 요홈부가 형성된 상태에서 핀셋 등으로 각각의 웰 플레이트에서 당-아가로즈 복합체를 꺼내어 도 6의 (c)와 같이 위아래를 뒤집어 다시 웰 플레이트의 웰에 넣는다. 그 후, 도 6의 (d)와 같이 아가로즈로 녹아들어간 당 (161) 부위에 배양하고자 하는 세포를 접종하고 (d) 그 위에 액상배지는 넣어 (도시되지 않음) 세포를 3차원적으로 배양하는 것이 가능하다. 이와 같이, 세포배양 지지체를 웰 플레이트 상에서 직접 형성시키는 경우에는 각각의 웰 크기에 맞게 세포배양 지지체를 형성할 수 있다는 장점이 있다. 한편 이와 같이 웰 플레이트에서 직접 세포배양 지지체를 형성하는 경우에 세포를 중력방향으로 배양하는 것도 가능하다. 즉, 도 6에는 도시되지 않았으나, 도 6의 (b)와 같이, 당 위에 아가로즈를 도포하여 세포배양 지지체를 형성시킨 후에, 이들을 각각 꺼내어 외부에서 당이 있는 부위에 세포를 접종하고 각각의 웰 플레이트의 웰에 액상배지를 넣은 후, 상기 세포배양 지지체의 세포가 접종된 부분을 아래 방향으로 하여 (즉, 위아래를 뒤집지 않음) 액상 배지가 들어 있는 각각의 웰에 넣은 후 세포를 3차원적으로 배양한다. 이와 같이 세포를 배양하는 경우에는 세포배양 지지체를 각각의 웰 크기에 맞추어 제작할 수 있을 뿐만 아니라, 세포를 중력 방향으로 배양하여 효율적인 세포 배양이 가능해진다.

도 7의 a는 12-웰 플레이트에 본 발명에 따른 세포배양 지지체를 넣은 것 (맨 아래)과 그 위에 액상 배지를 넣은 것 (맨 위)을 나타낸다. 한편, 도 7의 b는 세포배양 지지체에 세포를 접종한 후 액상배지를 넣고 세포를 3차원적으로 배양하는 것 (가운데 줄)을 나타낸다.

이하, 본 발명에 따른 3차원 세포배양 결과를 보여주는 사진들에 대하여 설명한다.

도 8은 본 발명에 따라 멜라노마 세포주 (melanoma cell line)를 배양한 결과를 나타낸다. 도 8을 참조하면, 세포가 덩어리를 이루어 3차원적으로 배양된 것을 확인할 수 있다.

도 9 및 도 10은 암세포의 일종인 HEK293 세포를 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 방법에 따라 배양한 결과를 나타내는 사진이다. 도 9는 HEK293 세포를 배양한 지 4일째의 세포 사진이다 (왼쪽 사진은 100배 확대, 오른쪽 사진 2개는 40배 확대). 도 10은 본 발명에 따란 HEK293 세포를 배양한 지 8일째 되는 사진이다 (위쪽 사진은 100배 확대, 아래쪽 사진은 40배 확대). 도 9에서는 HEK293세포가 3차원적으로 배양되기 시작하는 상태를 확인할 수 있으며, 도 10에서는 세포가 3차원적으로 배양된 것을 확인할 수 있다.

세포의 배양이 완료된 후에는 투명한 아가로즈 지지체를 메틸알콜, 알콜, 또는 포름알데하이드 등에 고정하여 세포관찰을 용이하게 할 수 있다. 세포배양지지체에 3차원 입체 배양한 후 약물 등을 처리하여 세포에서 세포로 약물이 전달되는 과정이나 투과 및 확산 되는 과정 등을 관찰할 수 있으며, 또한 아가로즈 지지체의 아가로즈는 내구성은 뛰어나지만 탄성력이 적어 세포배양지지체를 쪼개어 쉽게 부수어 세포덩어리를 분리할 수 있다. 이렇게 분리한 세포 덩어리는 생체 이식에 활용할 수 있다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

하기 실시 예 1은 본 발명에 따른 3차원 세포배양 방법의 일 구체 예를 나타낸 것이며, 실시 예 2는 본 발명에 따른 3차원 세포배양 키트의 제조방법을 나타내는 일 구체 예를 나타낸다.

실시 예 1

75T-플라스크에 설탕 50g 및 100%알코올 100ml를 넣고 3회 헹궈 불순물을 제거한다. 56℃ 드라이오븐에서 설탕을 완전히 건조시켜 알코올을 제거한다. 이렇게 불순물을 제거한 설탕 5g을 증류수 5ml에 넣고 완전히 녹여 시럽을 만든다. 이와 같은 과정을 거쳐 만들어진 당시럽을 뚜껑이 있는 유리병에 넣고 약 100℃ 이상의 온도에서 끓인다. 끓인 당시럽을 상기 유리기판에 피펫을 이용하여 한 방울 (약 20㎕)씩 도포하고 식혀 고체 당시럽이 형성되도록 한다. 이와 같이 끓인 당시럽은 식으면서 고체화되고, 미리 85℃로 가열된 1% 아가로즈 용액을 피펫을 이용하여 고체당시럽이 덮히도록 약 20㎕씩 도포한다. 이와 같이 형성된 당-아가로즈 복합체를 다시 상온으로 냉각시켜 당시럽이 아가로즈 용액에 녹아 스며들어가 오목부를 구비하는 세포배양 지지체를 형성시킨다. 이와 같은 과정으로 점성 있는 아가로즈젤 세포배양 지지체를 만든다. 상기 세포배양 지지체를 소독된 핀셋을 이용하여 유리기판에서 뒤집는다. 세포배양 지지체의 오목부에 자궁경부암 세포 (SiHa Cell line) 및 위암세포 (AGS Cell line)를 접종하고, 2 내지 4시간 동안 세포를 세포배양 지지체에 뿌려 붙이고 세포배양 지지체를 액상 배지에 띄워 배양한다. 이와 같이 준비된 세포를 37℃, 5% 이산화탄소로 유지된 인큐베이터에 넣어 4일간 배양한다. 세포배양이 완료된 후 이를 배양 접시에 올려놓고 4%포르말린 또는 알코올로 고정하여 세포의 단면을 잘라 관찰하였다.

실시 예 2

실시 예 1의 방법에 따라 제조된 세포배양 지지체 10개를 준비한다. 폴리메틸아크릴수지 (PMMA)를 이용하여 밀봉용기의 수납부와 덮개를 제작하였으며, 상기 밀봉용기는 반구형으로 제작하였다. 상기 밀봉용기 하나의 크기는 직경 5cm, 높이 1.5cm로 제작하였다. 이와 같은 키트는 가로x세로 25cm x 3cm로 하여 총 10개의 밀봉용기가 하나의 키트를 구성하도록 제작하였으며, 상기 밀봉용기에 하나씩 총 10개의 세포배양 지지체를 수납하여 3차원 세포배양 키트를 제작하였다.

이상 본 발명을 구체적인 실시 예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

10: 기판 20: 당
21: 당 30: 아가로즈
31: 당-아가로즈 복합체 32: 아가로즈
40, 41: 세포배양 지지체 50: 세포
60: 세포가 접종된 세포배양 지지체
70, 71: 액상 배지 80: 세포 덩어리
90: 덮개 100: 수납부
110: 세포배양 키트 120: 세포배양 키트.
130: 웰 플레이트 140: 세포배양 지지체
150: 아가로즈 160, 161: 당
170: 세포

Claims (6)

1. 당;
   상기 당의 외측에 코팅된 아가로즈; 및
   상기 당과 상기 아가로즈가 접촉하는 경계면에 상기 당이 녹아 들어가 형성된 다수의 요홈부;를 포함하는 세포배양 지지체로 구성된 3차원 세포배양 키트.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 세포배양 지지체는 당이 녹아 들어가 형성된 오목한 콘택트렌즈 형상 또는 반구 형상인 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양 키트.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 세포배양 지지체는 투명한 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양 키트.
   
4. 청구항 1 내지 3의 어느 한 항에 있어서,
   상기 세포배양 지지체를 수납할 수 있는 밀봉용기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양 키트.
   
5. 당시럽을 제공하는 단계;
   상기 당시럽을 기판상에 도포하는 단계;
   상기 당시럽을 냉각시켜 굳힌 후, 그 상부를 가열된 아가로즈로 코팅하여 당-아가로즈 복합체를 형성시키는 단계;
   상기 당이 아가로즈로 스며들어가 굳어 세포배양 지지체를 형성시키는 단계;
   상기 세포배양 지지체를 상기 기판으로부터 분리시키는 단계;
   상기 분리된 세포배양 지지체의 당이 존재하는 부분에 세포를 접종시키는 단계; 및
   상기 세포가 접종된 세포배양 지지체의 당이 존재하는 부분을 액상배지의 표면과 접촉시켜 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 3차원 세포배양 방법.
   
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 당시럽을 제공하는 단계의 당시럽은:
   알코올에 고상의 당을 침지하여 불순물을 제거하는 단계;
   상기 침지된 고상의 당을 회수한 후, 56 내지 70℃의 온도에서 고상의 당에 잔류하는 알코올을 증발시켜 건조시키는 단계;
   상기 증발에 의해 건조된 고상의 당을 멸균 증류수에 녹이는 단계; 및
   상기 멸균 증류수에 녹인 당을 100℃ 이상의 온도로 끓이는 단계;
   에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양 방법.
   
   
   

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