CN202030741U - 含有微球面阵列的培养皿 - Google Patents

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Abstract

本实用新型涉及生物纳米领域，特别涉及含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体1和培养皿盖板2，所述培养皿本体1的基底3表面设有至少一个微球面阵列4，所述微球面阵列4的球面直径为微米或纳米级；本培养皿采用倾斜条件下的分步蚀刻方法制备而成，制备的微球面阵列面积达到培养皿应用的要求，其生产成本低，操作简单；运用本培养皿增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的方法为药物筛选提供了新方法和思路。

Description

含有微球面阵列的培养皿
技术领域
本实用新型涉及生物纳米领域，特别涉及含有微球面阵列的培养皿。
背景技术
以细胞为基础的生物检测是近二十年来药物筛选领域发展起来的药用效应或毒理效应的重要功能筛选手段。在这一筛选体系中，细胞作为一种生物传感器被整合到筛选平台中，既可以作为高通量筛选（high throughput screening, HTS）也可以作为高容量筛选（high content screening, HCS）的检测手段。较之于生物化学检测手段，细胞筛选方法具有从功能的角度获取待筛选分子药用效应或毒理效应的优势，然而其筛选成本却显著地低于动物实验。
在现有的细胞药物筛选体系中，细胞培养通常采用普通平面培养皿。尽管已有的培养基及化学添加剂已经能够满足人体内绝大多数细胞的培养要求，然而采用平面培养皿的培养技术却很明显地忽略了体内细胞生存的微观环境物理特性。在体情况下，细胞生存于三维的细胞基质中，而且这一支撑基质具有复杂的表面拓扑微结构。体外培养基底与体内生存条件的差异导致了培养细胞功能状态较之于体内不可避免的差异。对于药物筛选而言，这可能是筛选通量低下、筛选结果与后期动物实验结果不符的重要原因。另一方面，通过培养皿基底物理特性，如拓扑结构特征，的设计改变筛选细胞的功能响应性，将为提高细胞药物筛选效能提供新的技术途径。
近年来，组织工程与细胞工程的发展为药物筛选技术的革新提供了新的机遇。如，三维培养技术的建立为在体外模拟体内细胞生存环境提供了有效的工程化手段。这里最成功的例子可能是三维肿瘤微球被用于体外肿瘤细胞的多重抗药性研究。另一方面，培养基底拓扑微结构与培养细胞生长行为的关系已经有三十多年的研究历史。早期的研究大量集中在成纤维细胞与骨细胞的研究，其研究结果已经被用于组织工程植入体的构建。细胞培养基底拓扑结构由于影响细胞的形态及功能行为，因而是模拟体内细胞微环境的重要途径。对于神经细胞、肌细胞及腺体细胞等依赖于离子通道功能活动的可兴奋细胞而言，拓扑结构环境因为影响细胞的粘附、铺展及几何形态将对离子通道的功能响应性可能产生明显的影响，这在离子通道靶向药物的筛选中具有重要的应用前景。
电压依从式钙离子通道（voltage dependent calcium channel, VDCC）是细胞重要的离子通道。由于其参与细胞的众多生理过程以及在神经系统和心血管系统疾病中的重要作用，VDCC在制药业已经成为药物筛选的重要靶效应通道。以VDCC为靶效应通道的细胞药物筛选体系首先要求所采用目标细胞具有VDCC的表达及相应的VDCC功能响应性。VDCC功能响应性的强弱或大小直接影响到药物的筛选效能，如筛选通量以及有关药物效应和毒性的信息内含量。对于以神经细胞为基础的VDCC靶通道药物筛选，细胞的VDCC功能响应性低下是制约筛选效能提高的重要因素。引起神经细胞VDCC功能响应性低下的因素可能包括：（1）所使用神经细胞VDCC表达水平低下；（2）所采用分化条件不利于神经细胞VDCC的充分表达并成熟；（3）细胞的其他离子通道功能或膜电位水平异常。尽管采用基因工程的方法可以达到增强VDCC功能响应性从而构建筛选细胞的目的，但基因操作过程对于筛选结果的影响却值得进一步评价。
发明内容
有鉴于此，本实用新型的目的之一在于提供培养皿，该培养皿的基底含球面致密阵列型拓扑结构，该培养基底的拓扑微结构能支持所培养细胞的粘附及铺展，进而增强筛选细胞VDCC的功能响应性。
为实现上述目的，本实用新型的技术方案为：
含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体1和培养皿盖板2，所述培养皿本体1的基底3设有至少一个微球面阵列4，所述微球面阵列4中微球5的直径为微米或纳米级。
进一步，所述微球面阵列4为球面直径0.51-1.98微米的微球5紧密排列而成，所述微球面阵列4中的两相邻微球5的间距小于0.5微米；
进一步，所述微球5为微全球5-A和/或微半球5-B；
进一步，所述微球面阵列4的面积至少大于单个靶细胞的面积；
进一步，所述微球面阵列4的面积为0.25cm2；
进一步，所述培养皿还包括进液管7和出液管8，培养皿盖板2上设有连接孔6，所述进液管7和出液管8从连接孔6伸入培养皿内；
进一步，所述出液管8伸入培养皿内的一端与基底3接触；
进一步，培养皿盖板2上的连接孔设有密封垫圈9。
微球面阵列培养皿中培养的细胞经钙离子荧光染料染色后，以普通荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、孔板读数器或其他钙离子荧光记录装置采集细胞钙离子荧光信号，在信号采集过程中用高钾溶液施以去极化刺激，得增强的电压依从式钙离子通道荧光响应性。
本实用新型的有益效果在于：本培养皿采用倾斜条件下的分步蚀刻方法制备而成，其微球面直径为微米或纳米级，制备的微球面阵列可以达到0.10到0.25 cm2的大面积范围，达到培养皿应用的要求，其生产成本低，操作简单；本培养皿能显著增加神经细胞VDCCs功能响应性：含有微球面阵列的培养皿在神经干细胞分化第0天、7天、14天时，较普通培养皿能显著提高靶细胞的VDCC荧光响应性；运用本培养皿增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的方法为药物筛选提供了新方法和思路。
附图说明
为了使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本实用新型作进一步的详细描述，其中：
图1为含有微球面阵列的培养皿本体的示意图；
图2为含有微球面阵列的培养皿盖板的示意图；
图3为含有微全球球面阵列的培养皿基底示意图；
图4为含有微半球球面阵列的培养皿基底示意图；
图5为 ENStem-ATM人神经干细胞在平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿和微全球球面阵列基底培养皿中的扫描电镜照片。图示在细胞接种后第2天（分化第0天）细胞于平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿（a）、1.98 μm微全球球面阵列基底培养皿（b）和0.51μm微全球球面阵列基底培养皿（c）的生长状况，标尺示25 μm。
具体实施方式
为了使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本实用新型的优选实施例进行详细的描述。
实施例 1 含有微球面阵列的培养皿的制备
一材料准备：
1．35 mm细胞培养皿（Corning，美国）；细胞培养六孔板（Nest Biotech Co., Ltd，中国）
2．直径为25 mm的圆形盖玻片（上海精轮工业上玻璃有限公司，中国。或Fisher Scientific,美国）
3．聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories, Inc., 美国。或aladdin, 中国)，直径分别为0.51 微米和 1.98±0.20 微米。
4．2.5%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯细胞培养皿一个，剪碎后称取聚苯乙烯2.5克，加入100mL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存备用。
5．10.16%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯细胞培养皿一个，剪碎后称取聚苯乙烯10.16克，加入100mL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存备用。
6．1.7%的聚苯乙烯微球工作悬液
10%的聚苯乙烯微球悬液（供货浓度） 40 μL
蒸馏水 200 μL
混匀后得浓度为1.7%的微球工作悬液。
7．倾斜平台，自制。
8．聚二甲基硅氧烷[poly(dimethylsiloxane),PDMS]（Sylgard 184, Dow Corning,美国）
二、含有微球面阵列的培养皿的设计及制备：
1．含有微球面阵列的培养皿设计
本实用新型的含有微球面阵列的培养皿本体1，详见图1；培养皿盖板2详见图2。应当指出，本设计按照普通35mm培养皿进行设计描述。如改变培养皿及孔板尺寸或具有多个重复单元结构的培养皿孔板（如6孔板、12孔板等）而具备本实用新型的权利保护特征的培养皿及孔板设计依然属于本专利的权利保护范围。
1）含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体1和培养皿盖板2，所述培养皿本体1的基底3设有至少一个微球面阵列4，所述微球面阵列4中微球的直径为微米或纳米级。
2）所述微球面阵列4为球面直径0.51-1.98微米的微球5紧密排列而成，所述微球面阵列4中的两相邻微球5的间距小于0.5微米；
3）所述的含有微球面阵列的培养皿，所述微球面5为微全球5-A和/或微半球5-B；其中，微全球是指微型的球体，微半球是指微型的半球体；
4）所述的含有微球面阵列的培养皿，所述微球面阵列4的面积至少大于单个靶细胞的面积；
5）所述的含有微球面阵列的培养皿，所述微球面阵列4的面积为0.25cm2；
6）所述的含有微球面阵列的培养皿，所述培养皿还包括进液管7和出液管8，所述进液管7和出液管8从培养皿板盖2上的连接孔6伸入培养皿内。在不开启培养皿盖板的静置的条件下，采用负压作用下可以借助出液管8引流出培养皿本体1的全部液体；在非检测的培养条件下，培养皿也可以不使用进液管和出液管，直接通过揭开培养皿盖板进行换液；
7）所述的含有微球面阵列的培养皿，所述出液管8 伸入培养皿内的一端与基底3接触；
8）所述的含有微球面阵列的培养皿，培养皿盖板2 上的连接孔设有密封垫圈9 。密封垫圈9固定出液管8及进液管7与软质硅胶管的连接。液体引流管及进样管使得在荧光检测过程中可以在静置条件下完成液体更换、清洗及加样，避免了移动培养皿引起被检测视野变化对荧光检测的影响。
含有微球面阵列的培养皿本体详见图1；
含有微球面阵列的培养皿盖板详见图2；
含有微全球球面阵列的培养皿基底详见图3；
含有微半球球面阵列的培养皿基底详见图4；
上述微球面直径可以为微米级或亚微米级。
上述培养皿也可直接设计为基底3表面有微球面阵列4的构造。
2、含有微球面阵列的培养皿的制备步骤
应当指出，作为优先实施示例，这里以35mm培养皿及六孔板为例描述具有微球面阵列基底的培养皿及孔板的制备过程。以其它尺寸或其他途经实现的微全球球面或微半球球面致密阵列基底培养皿或孔板也在本专利权限保护之内。现就本部分实施步骤描述如下。
Figure 77796DEST_PATH_IMAGE001
取35mm培养皿一个，在培养小室底部中央开出一直径10mm的圆形小孔。除培养皿外，其他六孔板、十二或其他孔板均可以实现。
Figure 90751DEST_PATH_IMAGE002
取25mm圆形盖玻片，以2.5%的聚苯乙烯溶液在约6000转/分的条件下旋转涂层40秒，对盖玻片进行薄型聚苯乙烯裱衬，涂层厚度约0.1微米。
取25mm圆形盖玻片，以10.16%的聚苯乙烯溶液在约2000转/分的条件下旋转涂层30秒，对盖玻片进行厚型聚苯乙烯裱衬，涂层厚度约5微米。
Figure 201107DEST_PATH_IMAGE004
取步骤
Figure 455239DEST_PATH_IMAGE002
所获得的经薄型聚苯乙烯裱衬的盖玻片，以分步等离子蚀刻在倾斜角度的条件下制备微球阵列。具体步骤为：（a）薄型聚苯乙烯裱衬的盖玻片以等离子氧蚀刻60-80秒；（b）将30-50微升浓度为1.7%的聚苯乙烯微球工作悬液分布于经聚苯乙烯涂层的盖玻片表面；（c）分布有聚苯乙烯微球工作悬液的盖玻片放置于倾斜平台，倾斜约10°，静置30分钟显微镜下检查微全球球面阵列形成情况；（d）重复步骤（b）和（c），直至形成大片的微全球球面阵列为止；（e）为稳定聚苯乙烯微球与涂层表面的粘结，将上述微全球球面阵列于104℃烘箱中焙干35分钟。
将上述步骤
Figure 376108DEST_PATH_IMAGE004
制备的含微全球球面阵列的盖玻片嵌入并粘结于上述步骤所制备的开孔培养皿或孔板底部，获得含微全球球面致密阵列基底的培养皿或孔板。
为获得含微全球球面致密阵列基底培养皿或孔板，步骤
Figure 837493DEST_PATH_IMAGE004
和
Figure 74308DEST_PATH_IMAGE005
可以先后交换，即可以先粘结薄型聚苯乙烯裱衬的盖玻片于开孔的培养皿或孔板底部，构成平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿，再在底表面进行微全球球面阵列的制备，得含微全球球面致密阵列基底的培养皿。
将PDMS预聚体与固化剂按10：1的比例混合均匀浇注于步骤
Figure 235480DEST_PATH_IMAGE004
所制备的含微全球球面致密阵列的盖玻片上，真空抽气30 min，于60℃的加热板条件下固化2小时，将固化的PDMS剥离即得到PDMS球面阵列负模。
Figure 582147DEST_PATH_IMAGE007
取步骤
Figure 312118DEST_PATH_IMAGE003
所制备的厚型聚苯乙烯裱衬的盖玻片，置于103℃的加热板上，以步骤
Figure 402434DEST_PATH_IMAGE006
所制备的PDMS球面阵列负模在亚玻璃态温度条件下进行进行加压。20分钟后，取出厚型聚苯乙烯裱衬的盖玻片及PDMS球面阵列负模，室温冷却，剥离PDMS球面阵列负模即得含微半球球面阵列的基底。
Figure 397066DEST_PATH_IMAGE008
将步骤
Figure 586738DEST_PATH_IMAGE007
制备的含微半球球面阵列的基底嵌入并粘结于上述步骤所制备的开孔培养皿或孔板底部，获得含微半球球面阵列基底的培养皿或孔板。
微全球球面阵列基底培养皿和微半球球面阵列基底培养皿均为增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的培养皿。从普通细胞尺寸（10-20微米）及本实用新型的球面直径尺度（0.51-1.98微米）看，只要细胞培养过程中细胞不能深入到球面之间间隙的尺寸及球面直径均可，且微全球球面阵列和微半球球面阵列应为相同功能的细胞培养表面。
按图2以及“含有微球面阵列的培养皿设计”部分所描述的结构和尺寸制备培养皿盖板。
Figure 790559DEST_PATH_IMAGE010
步骤
Figure 964182DEST_PATH_IMAGE005
和步骤
Figure 413618DEST_PATH_IMAGE008
所制备的含微球面阵列的培养皿本体经等离子氧蚀刻150秒以增加表面粗糙度后即可用于细胞培养及细胞药物筛选的检测。该等离子蚀刻步骤也可在步骤
Figure 95004DEST_PATH_IMAGE004
和步骤
Figure 985599DEST_PATH_IMAGE007
制备的球面阵列嵌入并粘结于开孔培养皿及孔板之前进行。
将制备好的培养皿进行消毒杀菌处理后，可用于细胞培养及检测。
实施例2 含有微球面阵列的培养皿的增强细胞电压依从式钙离子通道功能响应性的方法
将以上含有微全球球面阵列的培养皿进行细胞培养及电压依从式钙通道功能响应性的评价，证实本方法的实施效果。应当指出，对于微半球球面阵列的培养皿而言，神经细胞感知的拓扑微环境与微全球球面阵列完全一样，因为细胞的尺度及生长行为决定了细胞不可能贴附于微球与微半球的底部从而感知这一部分几何形态的差异。发明者完全有理由推测半球球面致密阵列与微全球球面致密阵列拓扑结构有相同的细胞生物学效应。
一、 材料准备：
1．ENStem-ATM人神经干细胞（Millipore公司，美国）
2．多聚鸟氨酸（poly-L-ornithine hydrobromide）（Sigma产品, 美国）
3．浓度为40μg/mL的多聚鸟氨酸裱衬液
取多聚鸟氨酸供货安培瓶（含多聚鸟氨酸冻干制剂50mg），加入5mL灭菌蒸馏水，涡旋混匀制成浓度为10mg/mL的储备液。上述储备液分装为16μL/eppendorf管。取上述含16μL多聚鸟氨酸储备液的eppendorf管，加入4mL的灭菌蒸馏水，涡旋混匀制成浓度为40μg/mL的多聚鸟氨酸裱衬液。
4．鼠基底膜层粘连蛋白[来自EHS鼠肉瘤（Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma）]（Sigma产品，美国）
5．浓度为5 μg/mL的鼠基底膜层粘连蛋白裱衬液
将浓度为1mg/mL（供货浓度）的鼠基底膜层粘连蛋白储备液分装为10μL/eppendorf管。取上述含10μL鼠基底膜层粘连蛋白储备液的eppendorf管，加入2mL的灭菌蒸馏水，涡旋混匀制成浓度为5μg/mL的鼠基底膜层粘连蛋白裱衬液。
6．浓度为200mM的L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich产品，美国）
7．B27添加剂（Invitrogen产品，美国）
8．浓度为10μg/mL的重组人白血病抑制因子（recombinant human leukemia inhibitory factor, LIF）（Chemicon产品，美国）
9．Neurobasal基础培养基（Invitrogen产品，美国）
10．碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）（Sigma-Aldrich产品，美国）
11．牛血清白蛋白（bovine serum albumine, BSA）（盐城赛宝生物科技有限公司，中国）
12．bFGF储备液
称取牛血清白蛋白1g，加入100mL Neurobasal基础培养基，以0.2微米孔径滤膜无菌过滤后制得含1%BSA的Neurobasal培养基。
取bFGF供货安培瓶（内含25μg bFGF冻干制剂），加入0.5 mL含1%BSA的Neurobasal培养基，制得浓度为50μg/mL的bFGF储备液。
13．神经干细胞扩增培养液
浓度为200mM的L-谷氨酰胺 0.5 mL
B27添加剂 1.0 mL
浓度为10μg/mL的LIF 50 μL
浓度为50μg/mL的bFGF储备液 20 μL
以Neurobasal基础培养基定容至 50 mL
上述扩增培养液含添加剂的终浓度为：L-谷氨酰胺2 mM；bFGF 20 ng/mL； LIF 10 ng/mL；B-27 添加剂2%。
14．神经干细胞分化培养液
浓度为200mM的L-谷氨酰胺 0.5 mL
B27添加剂 1.0 mL
浓度为10μg/mL的LIF 50 μL
以Neurobasal基础培养基定容至 50 mL
上述扩增培养液含添加剂的终浓度为：L-谷氨酰胺2 mM；LIF 10 ng/mL；B-27 添加剂2%。
15．0.2M的二甲胂酸盐缓冲液（pH7.2）
甲液：二甲胂酸钠 4.28g，加蒸馏水至 100ml
乙液：0.2N盐酸
取甲液50mL、乙液4.2mL，以蒸馏水定容至200mL，即得pH为7.2的0.2M二甲胂酸盐缓冲液。
16．0.1M的二甲胂酸盐缓冲液（pH7.2）
取上述0.2M的二甲胂酸盐缓冲液50mL，以蒸馏水定容至100mL即可。
17．8%的戊二醛储备液（Electron Microscopy Sciences产品，美国）
18．含2%戊二醛的0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）
采用如下配方：
8%的戊二醛储备液 5 mL
蒸馏水 5 mL
0.2M的二甲胂酸盐缓冲液 10 mL
19．4%的四氧化锇储备液
取四氧化锇1g，以蒸馏水定容至25mL。
20．含1%四氧化锇的0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）
采用如下配方：
4%的四氧化锇储备液 5 mL
蒸馏水 5 mL
0.2M的二甲胂酸盐缓冲液 10 mL
21．梯度脱水用不同浓度的乙醇
采用如下配方：
Figure 844971DEST_PATH_IMAGE011
22．无酚红Neurobasal基础培养基（Invitrogen产品，美国）
23．二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）（济南奥泰化工有限公司，中国）
24．Pluronic F-127 （Molecular Probes产品，美国）
25．胎牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司，中国）
26．Calcium Green-1 AM（Molecular Probes产品，美国）
27．Calcium Green-1 AM储备液
取Calcium Green-1 AM供货安培瓶（含50μg Calcium Green-1 AM），加入39 μL DMSO涡旋溶解制得浓度为1mM的Calcium Green-1 AM储备液。
28．Pluronic F-127储备液
称取Pluronic F-127 0.2g 于1.5 mL的eppendorf离心管中，加入1mL的DMSO，涡旋溶解制得浓度为20%的Pluronic F-127储备液。
29．高钾Neurobasal储备液
称取0.738g氯化钾，溶解于20mL的无酚红Neurobasal基础培养基中，制得K+浓度约为500mM的高钾Neurobasal储备液。
30．Calcium Green-1 AM染色液
取1.5 mL的eppendorf离心管一支，依次加入Calcium Green-1 AM储备液5 μL、Pluronic F-127储备液1 μL、B27添加剂20 μL和无酚红Neurobasal基础培养基974 μL，涡旋混匀，制得1mL Calcium Green-1 AM染色液。Calcium Green-1 AM染色液含5 μM Calcium Green-1 AM、2% B-27添加剂和0.02% Pluronic F-127。
31．Calcium Green-1 AM去酯化孵育液
取1.5 mL的eppendorf离心管一支，依次加入Pluronic F-127储备液1 μL、B27添加剂20 μL、胎牛血清30 μL和无酚红Neurobasal基础培养基949 μL，涡旋混匀，制得1mL Calcium Green-1 AM去酯化孵育液。Calcium Green-1 AM去酯化孵育液含2% B-27添加剂、3%胎牛血清和0.02% Pluronic F-127。
二、 神经细胞在培养皿中的培养
ENStem-ATM人神经干细胞购自美国Millipore公司。根据细胞供货商的建议，用于细胞扩增培养的普通细胞培养皿以及用于细胞分化实验的微全球球面阵列基底培养皿和平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿先后经浓度为40 μg/ml的多聚鸟氨酸裱衬液及浓度为5 μg/mL的鼠基底膜层粘连蛋白裱衬液分别裱衬至少2小时。神经干细胞于35 mm普通培养皿中以神经干细胞扩增培养液进行扩增，细胞隔日换液。在细胞融合度达到90-100%时，以机械法制成细胞悬液。将约1.2×106细胞接种于新的培养皿。对于分化实验，细胞被接种于经多聚鸟氨酸和鼠基底膜层粘连蛋白分别裱衬的含微全球球面阵列基底培养皿和平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿。在细胞接种后2天（分化后第0天），培养液被换成神经干细胞分化培养液。在分化后第0、6、7、11 和 13进行全换液，在分化后第2、4 和 9天进行半换液。在细胞培养过程中，平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿和微全球球面阵列基底培养皿均可以采用普通培养皿盖，而勿须采用含有进液管和出液管及密封垫圈的特制培养皿盖板2。细胞形态及生长行为以Nikon ECLIPSE TE300倒置显微镜进行观察并以Nikon D100数码相机进行显微摄像。
图5显示ENStem-ATM人神经干细胞于接种后第2天（分化第0天）在平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿（a）、1.98 μm微全球球面阵列基底培养皿（b）和0.51μm微全球球面阵列基底培养皿（c）的生长状况。图中显示本实用新型的球面阵列型培养皿的阵列区域与平面基底一样，能够支持细胞的粘附与铺展。
三、含微全球球面阵列的培养皿对神经干细胞 VDCCs 功能响应性的影响
VDCCs功能响应性的评价采用在50 mM高钾溶液刺激下细胞钙离子内流的动态反应来评价。值得指出的是，作为一种优先实施方案以及为更准确地评价本实用新型含微全球球面阵列基底培养皿的实施效果，以下实施方案采用激光共聚焦显微镜进行。鉴于普通荧光读数仪器与激光共聚焦显微镜相同的检测原理，有理由相信采用这类仪器可以取得相同的实施效果。
在神经干细胞分化的第0、7和14天，取出培养细胞的平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿和含有微全球球面阵列的培养皿，将普通培养皿盖更换为含有进液管和出液管及密封垫圈的特制培养皿盖板2进行以下操作及检测。平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿与含有微全球球面阵列的培养皿中培养的细胞经无酚红Neurobasal基础培养基清洗2次，以Calcium Green-1 AM染色液于37℃二氧化碳孵箱中染色1小时。细胞以无酚红Neurobasal基础培养基清洗后于1mL Calcium Green-1 AM去酯化孵育液中在37℃二氧化碳孵箱再孵育45分钟进行染料去酯化。以488 nm氩激光扫描，以515 nm长通滤片采集激光共聚焦图像。图像采集速率为每3秒1幅。在图像采集过程中从培养皿盖板2的进液管于细胞孵育液（即Calcium Green-1 AM去酯化孵育液）中加入100μL高钾Neurobasal储备液使孵育液K+终浓度为50 mM。VDCCs功能响应性表现为在高钾去极化作用下细胞内钙离子浓度增高以及由此导致的细胞内Calcium Green-1荧光强度增加。以Calcium Green-1荧光强度对时间作图，求得高钾刺激后Calcium Green-1荧光强度相对于刺激前荧光强度的相对增加幅度为VDCCs的相对响应幅度。
表一为ENStem-ATM人神经干细胞在平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿和含有1.98 μm微全球球面阵列的培养皿基底上的VDCCs功能响应性。表中VDCCs反应性以50mM高钾溶液刺激下的荧光强度相对增加值为指标。细胞具有反应性的判断依据是在高钾溶液刺激下细胞荧光强度增加15%或以上。按此标准，无论分化前或分化后第7天及第14天，在平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿或1.98 μm微全球球面阵列培养皿基底上的细胞反应比率均接近100%。表中所示为细胞荧光强度相对增加值的平均值。从表中可见，在分化前平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上细胞荧光强度相对增加值（0.81±0.53）与含1.98 μm微全球球面阵列的培养皿基底上的相应值（0.83±0.79）无显著性差异（P>0.2）。在分化的第7天，平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上细胞的VDCCs功能响应性（0.95±0.46）较之分化前无明显增高（P>0.20），但含1.98 μm微全球球面阵列的培养皿基底上细胞VDCCs功能响应性（1.20 ± 0.48）较之分化前明显增高（P<0.01）。在分化第14天，平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上细胞的VDCCs功能响应性（2.68±1.21）增加至分化前的两倍以上（P<0.01），而含1.98 μm微全球球面阵列的培养皿基底上细胞VDCCs功能响应性（5.12±2.42）增加至分化前的5倍以上（P<0.01）。在分化的第7天和第14天，含1.98 μm微全球球面阵列的培养皿基底上细胞VDCCs功能响应性较之平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上的相应值明显增高（P<0.01）。
表一ENStem-ATM 人神经干细胞在含1.98 μm微全球球面阵列基底和平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上的VDCCs功能响应性（50mM高钾刺激下Calcium Green-1荧光强度增加值）的比较
Figure 266856DEST_PATH_IMAGE012
表二示ENStem-ATM人神经干细胞在平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底和含0.51 μm微全球球面阵列的培养皿基底上的VDCCs功能响应性。按前述标准，分化前或分化后第7天及第14天，在平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底或含0.51 μm微全球球面阵列的培养皿基底上的细胞反应比率同样接近100%。从表中可见，在分化前含0.51 μm微全球球面阵列的培养皿基底上细胞荧光强度相对增加值（1.03±0.78）较之平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上的相应值（0.76±0.60）明显增高（P<0.01）。在分化的第7天，平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上细胞的VDCCs功能响应性（0.82 ± 0.31）较之分化前无明显增高（P>0.20），但含0.51 μm微全球球面阵列的培养皿基底上细胞VDCCs功能响应性（1.30 ±0.29）较之分化前明显增高（P<0.01）。与此同时，含0.51μm微全球球面阵列的培养皿基底上细胞VDCCs功能响应性较之平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上的相应值明显增高（P<0.01）。在分化第14天，平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上细胞的VDCCs功能响应性（1.40±0.95）及含0.51μm微全球球面阵列的培养皿基底上的相应值较分化前及分化第7天进一步增高（P<0.01），但含0.51μm微全球球面阵列的培养皿基底上细胞VDCCs功能响应性较之平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上的相应值无显著统计学差异（P>0.20）。
表二 ENStem-ATM 人神经干细胞在含0.51 μm微全球球面阵列的培养皿基底和平面聚苯乙烯裱衬基底的培养皿基底上的VDCCs功能响应性（50mM高钾刺激下Calcium Green-1荧光强度增加值）的比较
Figure 502666DEST_PATH_IMAGE013
在神经细胞为基础的细胞药物筛选中，电压依从式钙通道功能响应性的提高将极大地提高有关的荧光筛选效率。神经干细胞具有很好的代表性，本实用新型仅以神经细胞为例，但不仅限于神经细胞，其分化过程代表了细胞的不同发育阶段。本实用新型通过分步等离子蚀刻在此基础上设计了含有微球阵列的培养皿，所制备的微球面阵列面积达到了培养皿应用药求，使得以微球面阵列结构增强电压依从式钙通道功能响应性的应用成为可能。实施示例显示，微米级（1.98 μm）和亚微米级（0.51 μm）的球面致密阵列型培养皿基底具有增强电压依从式钙通道功能响应性效果，达到了预期的目的。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管通过参照本实用新型的优选实施例已经对本实用新型进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本实用新型的精神和范围。

Claims (8)

1.含有微球面阵列的培养皿，包括培养皿本体（1）和培养皿盖板（2），其特征在于：所述培养皿本体（1）的基底（3）设有至少一个微球面阵列（4），所述微球面阵列（4）中微球（5）的直径为微米或纳米级。
2.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于：所述微球面阵列（4）为直径为0.51-1.98微米的微球（5）紧密排列而成，所述微球面阵列（4）中的两相邻微球（5）的间距小于0.5微米。
3.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于：所述微球（5）为微全球（5-A）和/或微半球（5-B）。
4.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于：所述微球面阵列（4）的面积至少大于单个靶细胞的面积。
5.根据权利要求4所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于：所述微球面阵列（4）的面积为0.25cm2。
6.根据权利要求1所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于：所述培养皿还包括进液管（7）和出液管（8），皿盖板（2）上设有连接孔（6），所述进液管（7）和出液管（8）从连接孔（6）伸入培养皿内。
7.根据权利要求6所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于：所述出液管(8)伸入培养皿内的一端与基底(3)接触。
8.根据权利要求6所述的含有微球面阵列的培养皿，其特征在于：培养皿盖板(2)上的连接孔设有密封垫圈(9)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103224883A (zh) * 2012-03-21 2013-07-31 杨生元 用于细胞和组织培养的具有微纳米尺度刚度图形和曲率图形的基底以及制作这种基底的方法
CN104651221A (zh) * 2013-11-21 2015-05-27 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种显微授精培养皿
CN110951613A (zh) * 2019-12-30 2020-04-03 北京大学 单细胞阵列芯片及离子通道药物的筛选方法

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