TW202128977A - 細胞層片製造裝置及細胞層片 - Google Patents

細胞層片製造裝置及細胞層片 Download PDF

Info

Publication number
TW202128977A
TW202128977A TW109135703A TW109135703A TW202128977A TW 202128977 A TW202128977 A TW 202128977A TW 109135703 A TW109135703 A TW 109135703A TW 109135703 A TW109135703 A TW 109135703A TW 202128977 A TW202128977 A TW 202128977A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
mesh
cell
sheet
cells
support unit
Prior art date
Application number
TW109135703A
Other languages
English (en)
Inventor
堀武志
岩田博夫
黒澤修
谷敍孝
水田太郎
石原甲平
Original Assignee
日本國立研究開發法人理化學研究所
日商水田製作所股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本國立研究開發法人理化學研究所, 日商水田製作所股份有限公司 filed Critical 日本國立研究開發法人理化學研究所
Publication of TW202128977A publication Critical patent/TW202128977A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/48—Holding appliances; Racks; Supports
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A61L27/3891—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types as distinct cell layers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/46—Means for fastening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明可在培養基中的細胞層片處於穩定的狀態下，容易地觀察細胞層片的兩面。細胞層片製造裝置(100)具有：容器(20)；支撐體單元(10)，其具有網片(2)及基座(3)，且以可分離方式容置於容器(20)中，且基座(3)將網片(2)保持為懸浮於容器(20)之底面，支撐體單元(10)係以在培養基中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於容器(20)中。

Description

細胞層片製造裝置及細胞層片
本發明係關於細胞層片製造裝置及細胞層片。
細胞層片係作為在治療燒傷部位時的皮膚片等實際地被運用。將來，細胞層片有望使用於移殖到心力衰竭患者的心肌細胞層片或是移殖到糖尿病患者的胰島細胞層片，應用至許多的患者。
另一方面，已有藉著由複數個細胞層所形成的細胞層片，來重建類似生物體內的組織結構的嘗試。因此，製作三維配置細胞的細胞層片方法的重要性已受到認識。當以現有的，使用溫度反應性的培養皿的細胞層片製作法來進行製作時，常有所製作的細胞層片脆弱因而難以處理的情況(參考非專利文獻1、2)。此外，也擔心當想要於皿盤上製作由複數個細胞層(真皮層、表皮層)所形成的細胞層片時，可能會使得成熟的表皮層形成一種稱為緊密連接的屏障，進而阻礙對細胞層片之內部供給營養。
此外，已有提案一種於非細胞性的片狀支撐體上製作細胞層片的方法。然而，當支撐體與患部之細胞不相容時，在該方法下無法使支撐體暴露的表面貼附至患部上。也就是說，細胞層片中貼到患部的貼附表面係限制於單邊表面。當將其中角質細胞層(表皮層)配置於纖維芽細胞層(真皮層)之上的細胞層片貼附至患部時，如上所述般的限制貼附表面是相當地不理想。這是因為當要移殖細胞層片時，必須使真皮層側的表面黏附至患部。
此外，作為其他方法，已知一種於多孔膜(例如聚碳酸酯製的多孔膜)上製作由複數個細胞層所形成的細胞層片的方法(參照非專利文獻3)。由於藉此方法所製作的細胞層片可望經由多孔膜之孔而對細胞供給營養，因此與在皿盤上製作複數層細胞層片時相比，對細胞供給營養的表現優異。
然而，即使是在多孔膜上製作細胞層片的情況下也一樣，所製作的細胞層片，其貼到患部的貼附表面係單邊的表面，因此難以使用於移殖。是以，藉由上述方法所製作的細胞層片主要用於化合物的穿透性測試等。
已有提案一種細胞層片製作方法，其中係使用如明膠、聚乳酸(PLA)、乙醇酸乳酸共聚物(PLGA)等的奈米纖維片(參照非專利文獻4)。於此方法當中，藉由電紡法來製作由奈米纖維所形成的層片，並於該層片上培養細胞。關於上述方法，存在著難以透過電紡法來正確地控制各個奈米纖維的配置之問題。而且，由於此奈米纖維存在不規則性的問題，因此對於所製作的細胞層片，難以獲得具有高度再現性的結果。
此外，為了要製作細胞層片，已有提案使用微網片(micro mesh sheet)的作法。作為使用微網片的方法，已有報告(i)於微網片上培養細胞，以製作二維細胞層片之方法；(ii)於微網片上培養iPS細胞以製作球狀的類滋胚層(trophoblast-like)細胞之方法(參照專利文獻1、2，以及非專利文獻5)。作為使用此微網片的細胞培養法之應用，已開發了一種於微網片上培養確立(established)肝細胞HepG2細胞以製作三維細胞層片之技術。其中也顯示出此三維細胞層片相較於三維球體，其一部分的細胞功能得到提升，且在細胞觀察及供給營養上相當優異，對流體設備具有優異的相容性(參照非專利文獻6)。
[先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1] 國際公開WO2015/005349號手冊(2015年1月15日公開) [專利文獻2] 日本特開2019-50773號公報(2019年4月4日公開) [非專利文獻] [非專利文獻1] Green H, Kehinde O, Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(11):5665-8. [非專利文獻2] Yamada N, Okano T, Sakai H, Karikusa F, Sawasaki Y, Sakurai Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromolekulare Chemie, Rapid Communications. 1990;11(11):571-6. [非專利文獻3] Kojima H, Ishii I, Nakata S, Konishi H. Dose-response Evaluation Using an Epidermal Model, an Alternative to Skin Irritation Testing. Alternatives to Animal Testing and Experimentation. 2006;11(3):177-84. [非專利文獻4] Li J, Minami I, Shiozaki M, Yu L, Yajima S, Miyagawa S, et al. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Tissue-like Constructs for Repairing the Infarcted Myocardium. Stem Cell Reports. 2017;9(5):1546-59. [非專利文獻5] Okeyo KO, Kurosawa O, Yamazaki S, Oana H, Kotera H, Nakauchi H, et al. Cell Adhesion Minimization by a Novel Mesh Culture Method Mechanically Directs Trophoblast Differentiation and Self-Assembly Organization of Human Pluripotent Stem Cells. Tissue Eng Part C Methods. 2015;21(10):1105-15. [非專利文獻6] Hori T, Kurosawa O. A Three-dimensional Cell Culture Method with a Micromesh Sheet and Its Application to Hepatic Cells. Tissue Eng Part C Methods. 2018.
[發明所欲解決問題] 於使用微網片(micro mesh sheet)來製造細胞層片的方法當中，首先，將網片設置於容器內，並使其處於懸浮於用於培養細胞的培養基中之狀態。接著，將細胞播種至微網片上。然後，於培養基中培養被播種至微網片上的細胞。於上述細胞層片製造方法當中，為了要確認構成細胞層片的細胞的生長狀態，必須用顯微鏡來確認細胞層片之兩面。
例如，於專利文獻1所揭示的技術當中，用來播種細胞的微網片係設置於懸掛組件中，而懸掛組件係設置於容器中。於上述構成當中，難以達到：(i)翻轉細胞層片再進行培養(ii)翻轉細胞層片，進行顯微鏡觀察(即兩面觀察)。
此外，於專利文獻2所揭示的裝置當中，微網片係被保持於用來容置培養基的容器之內壁上所設置的溝槽中。於上述構成當中，不易將微網片從容器上分離並進行內外顛倒的配置。因此，難以用顯微鏡來確認細胞層片之兩面。
關於上述細胞觀察的困難度當中，例如，當製作由複數個細胞層所形成的細胞層片時，特別地容易造成問題。
本發明一態樣的第一目的在於實現一種細胞層片製造裝置，其係為了要確認構成細胞層片的細胞的生長狀況，而在培養基中的細胞層片處於穩定的狀態下，容易地觀察細胞層片的兩面。
此外，本發明一態樣的第二目的在於實現一種細胞層片，其能夠充分地確保厚度，並且提升強度。
[解決問題之手段] 為了解決上述問題，本發明一態樣之細胞層片製造裝置的特徵在於具有：容器，其係提供容置用於培養細胞的培養基；支撐體單元，其具有網片及保持組件，且以可分離方式容置於所述容器中，且所述網片係為使所述細胞附著並予以培養的基材，所述保持組件將所述網片保持為懸浮於所述容器之底面，所述支撐體單元係以在所述培養基中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於所述容器中。
本發明一態樣之細胞層片之特徵在於具有至少兩個細胞層，且於所述兩個細胞層之間配置有網片，所述網片係為使細胞附著並予以培養的基材。
[發明功效] 根據本發明一態樣，可實現一種細胞層片製造裝置，其係為了要確認細胞層片中的細胞的生長狀態而能夠在培養基中的細胞層片的位置處於穩定的狀態下，容易地觀察細胞層片之兩面。另外，根據本發明一態樣，能夠實現可充分確保厚度，且能夠提升強度的細胞層片。
以下描述本發明一實施型態，惟本發明並不限於此。本發明並不限於以下所說明的各個構成，於專利申請範圍中所示範圍內可進行各種變更，將不同的實施型態及實施例中所分別揭示的技術手段予以適當組合，所獲得的實施型態及實施例亦包含於本發明的技術範圍內。此外，記載於本說明書中的所有的文獻皆於本說明書引用為參考文獻。於本說明書當中，當有關數值範圍而記載為「A～B」時，該記載係意指「A以上且B以下」。
1.細胞層片製造裝置 本實施型態之細胞層片製造裝置係以下述為前提之裝置，即：透過將網片設置於培養基中，且於培養基中，使被播種至該網片上的細胞生長，以製造細胞層片。透過將網片設置於培養基(培養液)中，可沿著網片的形狀來使細胞增殖。
本實施型態之細胞層片製造裝置係構成為：容器，其係提供用於容置培養細胞的培養基；支撐體單元。所述支撐體單元係以可分離方式容置於所述容器中，且具有網片、保持組件。所述網片係為使細胞附著並予以培養的基材。此外，所述保持組件係保持所述網片並使其懸浮於所述容器之底表面。此外，所述支撐體單元係容置於所述容器中，且於所述培養基中垂直方向及水平方向的位置為固定。
於此，「保持網片並使其懸浮於所述容器之底表面」係指保持網片，使得網片之兩面並未接觸容器之底面(較佳為容器之內壁及底表面)，且網片之兩面充分地接觸所述培養基。所述保持組件只要是將網片保持為懸浮於所述容器之底表面之構成即可，具體的構成並無限制。
於使用所述網片來製造細胞層片當中，本實施型態之細胞層片製造裝置提升了使用者進行細胞觀察時的便利性。更具體地說，於上述構成當中，所述支撐體單元係以可分離方式容置於容器當中。因此，使用者可從容器中將所述支撐體單元取出並且翻轉之後，再次地將其容置於容器中，藉此可容易地做到翻轉所述支撐體單元。當所述支撐體單元翻轉時，形成於由支撐體單元之保持組件所保持的網片上的細胞層片也跟著翻轉。因此，根據所述構成，可用顯微鏡容易地觀察形成於所述網片上的細胞層片之兩面。
另外，由於所述支撐體單元係以於培養基中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於容器中，因此，於顯微鏡進行觀察細胞層片當中，網片於容器內的位置不變，換言之，也就是形成於網片上的細胞層片的位置不變。因此，根據所述構成，可精確地觀察細胞層片。
此外，於本實施型態之細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述保持組件係以可移除方式保持所述網片。藉此可容易地從所述支撐體上將形成於所述網片上的細胞層片分離出來。因此，例如當在移殖細胞層片時可容易地處理細胞層片。
此外，所述支撐體單元只要是能夠以所述培養基中垂直方向與水平方向的位置固定的方式容納於所述容器中之構成即可，其具體構成並無限制。可列舉例如所述支撐體單元為所述保持組件的比重大於所述培養基之構成。由於所述保持組件的比重大於所述培養基，使得所述組件並不會懸浮於所述培養基中而是沉入其中，尤其是垂直方向的位置穩定。所述保持組件的比重可根據所述培養基的種類而適當設定，例如，當培養基的比重為1時，所述保持組件的比重係以1.1為較佳；以1.5以上為更佳；又以2.0以上為更佳；又以5.0以上為更佳；以10.0以上為最佳。此外，作為構成所述保持組件的材料，可列舉例如聚苯乙烯、聚酯、聚縮醛、聚碳酸酯、聚氯乙烯等。
此外，作為網片，只要是能夠播種細胞，且可增殖細胞的結構即可，並無特別限制。所述網片當中，以具有預定形狀的開口部規則性或非規則性地重複排列的平面狀結構體為較佳。所述網片係以於俯視下具有許多的多角形的開口部為較佳。關於網片的開口部的形狀，典型上為三角形、四角形、六角形等多邊形，惟亦可為圓形、橢圓形或其他多邊形。
於此，將所述網片當中開口部之外的部分稱為框架或是框架部。另外，當開口部為微米尺寸時，網片亦可稱為微網片等。另外，網片的開口部的形狀亦可說是構成網片的框架所包圍出的區域的形狀。
所述網片的開口部可為可通過至少1個所培養的細胞的尺寸。開口部可通過至少1個所培養的細胞的尺寸係指：開口部的尺寸與細胞的尺寸間，具有細胞在變形或是不變形狀態下可通過開口部之關係。開口部可為細胞於不接觸開口部狀態下可通過的尺寸；亦可為細胞一邊與其接觸(換言之即細胞為變形狀態)一邊通過的尺寸。
較佳地，網片之開口片的形狀係為沿著一方向延伸的形狀。「沿著一方向延伸的形狀」係指界定該形狀的複數個軸線當中存在著一個比其他軸(短軸)還要長的軸(長軸)之形狀。作為如此的形狀，可列舉例如長方形、菱形、橢圓形等。當開口部的形狀為長方形時，長邊對應長軸，短邊對應短軸。此外，當開口部的形狀為菱形時，兩個對角線當中較長的對角線對應長軸，較短的對角線對應短軸。「沿著一方向延伸的形狀」可列舉例如長軸(長邊)比短邊(短軸)還要長得多的長方形、長軸比短軸還要長得多的菱形或是橢圓形。當其為長方形時，沿著一方向延伸的形狀係為短邊：長邊為1：2～1：5，較佳為1：2～1：10的形狀。此外，當為菱形時，一方向延伸的形狀係為短軸：長軸為1：2～1：5，較佳為1：2～1：10的形狀。此外，當為橢圓形時，一方向延伸的形狀係為短軸：長軸為1：2～1：5，較佳為1：2～1：10的形狀。當然，本發明並不限於此等構成。另外，「沿著一方向延伸的形狀」並不限於長方形、菱形、橢圓形，只要是在界定該形狀的複數個軸線當中，存在有一個較其他軸還要長得多的軸之形狀即可。
當如上所述般，所述網片之開口部為沿著一方向延伸的形狀時，開口部會具有往一方向拉長地延伸的大的壁面。由於黏附於該壁面上而增殖的細胞數量多，且係具有相同的取向性而增殖，因此，根據所述構成可將增殖的細胞的取向性控制成往開口部的延伸方向。
此外，所述網片的材料只要是細胞可黏附並增殖的材料即可，例如，可使用光固化性樹脂、生物相容性材料、生物降解性材料等。
若使用光固化性樹脂，可透過光刻法來製作所述網片。作為所述光固化性樹脂，可列舉例如丙烯酸化合物、甲基丙烯酸化合物、環氧化合物、異氰酸酯化合物、硫醇化合物、聚矽氧系化合物等。亦可組合兩種以上的此等成分。作為光固化性樹脂的具體例，可列舉例如：氨基甲酸酯丙烯酸酯、聚酯丙烯酸酯、環氧丙烯酸酯、聚(甲基)丙烯酸甲酯、雙酚A乙氧基化丙烯酸酯、脂肪族氨基甲酸酯丙烯酸酯、聚酯丙烯酸酯、聚對苯二甲酸、聚苯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸改性的脂環族環氧化物、雙官能醇醚型環氧化物、丙烯酸有機矽、丙烯酸二甲基矽氧烷、聚二甲基矽氧烷(PDMS)等，惟並不限於此。
此外，當透過光刻法來製作所述網片時，可使用供去除暴露部分的正型光阻劑來製作微網片。例如，作為所述正型的光阻劑，可列舉DNQ(重氮萘醌)酚醛清漆系樹脂正型光阻劑；如叔丁氧羰基、四氫吡喃、苯氧乙基、三甲基甲矽烷基、叔丁氧基羰基甲基等的去保護反應型；如聚苯二醛、聚碳酸酯、聚矽醚(polysilylether)等解聚反應型之光阻劑。此外，作為顯影液，可使用例如四甲基氫氧化銨(TMAH)、二甲基亞碸(DMSO)、MEK(甲乙酮)、GBL(γ-丁內酯)、EL(乳酸乙酯)等。
此外，當所述網片的材料為生物相容性材料或是可生物降解材料時，所獲得的細胞層片可直接與網片一起移殖到生物體中，因此可理想地運用於再生醫療或是藥物開發。
作為所述生物相容性材料，可列舉：聚矽氧；聚醚嵌段醯胺(PEBAX)；聚氨酯；聚矽氧-聚氨酯共聚物；陶瓷；膠原蛋白；羥基磷灰石；尼龍；如聚乙烯對苯二甲酸酯、GoretexTM 等超高分子量聚乙烯；聚氯乙烯；其他來自生物體之材料等，惟並不限於此。此外，所述網片亦可由生物體相容性材料之外的材料形成，亦可為以生物體相容性材料來處理其表面而成之物。
作為所述可生物降解材料，可列舉：聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己內酯(PCL)及此等的共聚物；PHB-PHV系聚(鏈烷酸)類；聚酯類；澱粉、纖維素、殼聚醣等天然高分子或其衍生物等，惟並不限於此。
作為所述網片的材料，於上述當中，以聚酯，特別是聚乙烯對苯二甲酸酯為較佳。由於聚乙烯對苯二甲酸酯對生物體的毒性低，因此可將所獲得的細胞層片移殖到生物體內。此外，為了要抑制螢光顯微鏡觀察時的自體螢光，聚乙烯對苯二甲酸酯係以染色成黑色為較佳。作為聚酯製的網片的具體示例，可列舉天池合纖公司製的織物AG001N0、AG00Z1N0、AG00Z3N0等。此外，作為染色成黑色的聚酯製的網片的具體示例，可列舉天池合纖公司製的織物AG001N1、AG00Z1N9、AG00Z3N9等。
此外，可預先用促進細胞黏附材料來塗覆所述網片。促進細胞黏附材料的使用目的在於為使細胞固定於培養支撐體上以使其易於延伸與增殖，可列舉例如：如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等細胞外基質蛋白；如聚賴氨酸(Polylysine)等帶正電物質等。作為促進細胞黏附材料，具體可列舉康寧基質膠(matrigelTM )。
此外，於本實施型態之細胞層片製造裝置當中，所述容器只要是能夠容置用於培養細胞的培養基即可，其構成(例如形狀)並無特別限制。所述容器可列舉例如用於培養細胞的皿盤、具有複數個井的板(6孔板、12孔板等)、用於細胞培養的管柱。
2.本實施型態之細胞層片製造裝置的構成例1 針對本實施型態之細胞層片製造裝置的構成示例1進行說明。圖1係為作為構成例1的細胞層片製造裝置100的示意構成圖。圖1中的1010係為表示細胞層片製造裝置100當中所具備的支撐體單元10之構成的立體圖。圖1中的1020～1023係為使用了細胞層片製造裝置100的細胞層片製造方法的順序的示意圖。圖1中的1030係為使用了細胞層片製造裝置100所製作的細胞層片之構成的示意圖。此外，圖1中的1040係為表示細胞層片製造裝置100的具體構成的一示例的圖像。
如圖1中的1023所示，細胞層片製造裝置100具有：支撐體單元10、容器20。支撐體單元10係以可分離方式容置於容器20當中。
如圖1中的1010所示，支撐體單元10具有：環狀組件1；網片2；基座3(保持組件)。基座3具有：基座主體3a；筒狀承載部3b；底面抵接部3c；側壁抵接部3d。
基座主體3a係為圓盤狀。筒狀承載部3b係為無底圓筒狀，軸向上的兩端具有開口。筒狀承載部3b係形成為僅從基座本體3a一邊的表面沿著垂直方向突出。筒狀承載部3b係構成為貫穿基座本體3a之內部。換言之，基座本體3a的上側與下側係經由筒狀承載部3b連通。筒狀承載部3b上承載網片2。可藉由顯微鏡等，從筒狀承載部3b當中相對於基座本體3a的反側，穿過筒狀承載部3b來觀察網片2。
從相對於基座本體3a垂直的方向來觀察的俯視圖當中，側壁抵接部3d係為從基座本體3a沿著水平方向延伸的矩形板狀。至少兩個側壁抵接部3d形成為相對於基座本體3a對稱。於圖1中的1010所示的構成當中，形成有4個側壁抵接部3d。側壁抵接部3d當中，其水平方向的前端部分係與容器20之側壁抵接。側壁抵接部3d係具有將基座本體3a與容器20之側壁之間的水平方向間隔維持固定的墊片之作用。因此，即使容器20於水平方向上振動時，仍可透過側壁抵接部3d之前端部與容器20之側壁抵接，而使得於培養基當中基座本體3a的水平方向上的位置不會變動而維持穩定。另外，基座3係構成為使得所有的側壁抵接部3d與容器20之側壁之間形成有尺寸間隙，以使基座3可從容器20分離。
底面抵接部3c係為矩形板狀，且相對於矩形板狀的各個側壁抵接部3d豎立設置。底面抵接部3c係與側壁抵接部3d相交。於圖1中的1010所示的構成當中，底面抵接部3c係沿著垂直方向(重力方向)而與側壁抵接部3d相交。此外，底面抵接部3c當中的垂直方向上的前端部係與容器20之底面抵接。底面抵接部3c具有將基座本體3a與容器20之底面之間的垂直方向上的間隔維持固定的墊片之作用。因此，當基座3容置於容器20當中時，透過底面抵接部3c與容器20之底面抵接，而使得於培養基當中，基座本體3a的垂直方向的位置不會變動而維持穩定。此外，底面抵接部3c係與側壁抵接部3d相交，且形成為從上下兩方向相對於側壁抵接部3d突出。因此，即使將基座3以上下倒置方式容置於容器20中，仍可穩定地維持基座本體3a的垂直方向上的位置。
環狀組件1具有包圍筒狀承載部3b之外周的環狀，並以設置為可從基座3移除。環狀組件1的環狀並無特別限制，可為圓環、四方型環等任意的形狀。於圖1中10101所示構成當中，環狀組件1係為圓形環狀。
網片2係配置於環狀組件1與筒狀承載部3b之間。網片2係以其周緣被環狀組件1與筒狀承載部3b之外側表面所夾持的狀態下，受到基座3的保持。當環狀組件1係為圓環狀，且筒狀承載部3b為圓筒狀時，由穩定保持網片2的觀點來看，環狀組件1之內徑與筒狀承載部3b之外徑之間的差係為越靠近網片2的厚度就越好。
接著說明使用了細胞層片製造裝置100的細胞層片製造方法。首先，如圖1中的1020所示般，於基座3之筒狀承載部3b上承載網片2。然後，於筒狀承載部3b上承載網片2的狀態下，將環狀組件1安裝於筒狀承載部3b上。
此時，環狀組件1係以其內側表面圍繞著筒狀承載部3b之外側表面的方式安裝。因此，如圖1中1021所示般，網片2之周緣係被環狀組件1之內側表面及筒狀承載部3b之外側表面所夾持。藉此來製作用來保持網片2的支撐體單元10。所製作的支撐體單元10當中，筒狀承載部3b的軸向上兩端部的開口當中，一邊的端部的開口係被網片2封閉起來，另一邊的端部的開口則敞開。
接著，將支撐體單元10上下倒置，以使網片2位於比筒狀承載部3b還要下方的位置。其結果為，於支撐體單元10當中基於網片2及筒狀承載部3b之內側表面而形成了具有以網片2為底面的有底筒部10a。如圖1中的1022所示，使用移液器5等，將使細胞4懸浮於培養基6中而成的懸浮液注入於有底筒部10a中。此時，藉由所述懸浮液相對於筒狀承載部3b之內側表面以及網片2的表面張力，使得所述懸浮液並未穿過網片2而保持於網片2上。然後，透過使懸浮液中的細胞4附著於網片2上，將細胞4播種於網片2上。
其後，將支撐體單元10容置於容器20中。接著，以培養基6將容器填滿，並且培養附著於網片2上的細胞4。
如圖1中的1030所示，各個細胞4係自發性地往開口中心延伸並黏附，以填補網片2的開口。當在網片2上培養保持有增殖能力的細胞4時，細胞4不僅往相對網片2的水平方向增殖，也往其垂直方向增殖。其結果為，可獲得以單層或複數層的由細胞4而成的細胞層所形成的細胞層片200，以覆蓋網片2之開口。透過控制播種至網片2上的細胞4的量及/或細胞4的增殖速度，可控制細胞層片200的厚度。由於細胞層片200受到網片2的支撐，因此穩固而易於處理。
此外，細胞層片200係構成為具有至少兩個由細胞4所形成的細胞層，且作為使細胞4附著並予以培養的基材之網片2係配置於所述兩個細胞層之間。也就是說，透過細胞4來構成細胞層片200的兩面。因此，細胞層片200當中，貼到患部的貼附面並不限於單個面。此外，相較於過去使用皿盤或多孔膜來做為支架的細胞層片製造方法，使用了細胞層片製造裝置100的細胞層片製造方法就對細胞4供給營養及觀察細胞4的觀點來看表現優異。此外，透過使用如網片2般具有經圖案化的開口的層片，能夠以高再現性獲得具有相同結構(換句話說為特性)的細胞層片200。
如圖1中的1040所示，容器20亦可為其中形成有複數個井21的板。更具體地說，容器20係為12孔板。於此情況下，具有基座3的支撐體單元10係構成為以可與井21分離的方式而容置於其中。
圖2係為用於說明細胞層片製造裝置100之功效的圖。如同圖2中的2010及2011所示，支撐體單元10係以可與容器20分離的方式容置於其中，因此即使將基座3上下倒置而容置於容器20當中，仍可使用支撐體單元10。因此，當支撐體單元10翻轉時，形成於網片2上的細胞層片也會翻轉，因此可容易地透過顯微鏡7來觀察形成於網片2上的細胞層片的兩面。
此外，如圖2中的2020～2022所示般，若使用細胞層片製造裝置100，可製作具有多種類型的細胞層的細胞層片。更具體地說，可製作出細胞層片，其具有：由細胞4a所形成的第一細胞層；由與細胞4a不同種類的細胞4b所形成的第二細胞層。首先，如圖2中的2020所示，於將細胞4a播種至網片2的狀態下，將支撐體單元10浸漬至培養基6當中。接著，如圖2中的2021所示般，將支撐體單元10上下倒置。此時，網片2當中細胞4a的反側的表面為上側。因此，若使用移液器5從上側向網片2滴下細胞4b的懸浮液，即可亦將細胞4b播種到網片2中細胞4a的反側的表面(參照圖2中的2022)。如上所述，根據細胞層片製造裝置100之構成，不管是對細胞層片之表面還是背面，都可以追加播種細胞。另外，由易於對細胞層片之兩面播種細胞的觀點來看，以如圖2的2020～2022所示般，環狀組件1從筒狀承載部3b突出並附接至基座3為較佳。根據所述構成，當將支撐體內外翻轉時，基於環狀組件1之內側表面及網片2，形成具有以網片2為底面的有底筒部10b。因此，藉著將細胞4b的懸浮液注入有底筒部10b中，可將該懸浮液穩定地保持於網片2上。
另外，根據細胞層片製造裝置100之構成，可容易地從支撐體單元10分離出細胞層片200。如圖2中的2030所示般，透過於容器20內的培養基中培養細胞4，以製作由細胞4所形成的細胞層片200。其後，如圖2中的2031所示般，將支撐體單元10從容器20中分離出。接著，如圖2中的2032所示，從基座3之筒狀承載部3b移除環狀組件1。藉此，可透過使用例如鑷子8，從基座3之筒狀承載部3b上，移除形成於網片2上的細胞層片200。如上所述的容易從細胞層片製造裝置100移除的細胞層片200在進行例如移殖細胞層片時相當方便。
(變形例1) 說明細胞層片製造裝置100的變形例。圖3係為表示作為變形例1之細胞層片製造裝置100A之構成，以及使用了該細胞層片製造裝置100A的細胞層片製造方法的圖。圖3中的3010係為表示細胞層片製造裝置100A所具備的基座3之構成例的立體圖。此外，圖3中的3020～3024係為表示使用了細胞層片製造裝置100A的細胞層片製造方法的圖。圖3中的3030係為表示細胞層片製造裝置100A所具備的蓋體9之構成的截面圖。細胞層片製造裝置100A可製造大面積的細胞層片。
如圖3中的3010所示般，基座3可設計為直徑3.5cm皿盤用(6孔板用)、直徑6cm皿盤用、直徑10cm皿盤用。也就是說，透過增加基座3之筒狀承載部3b之直徑，可將所製作的細胞層片形成為大面積。伴隨於此，可增大網片2的面積。
變形例1的細胞層片製造裝置100A係構成為適於將懸浮液保持於如上述般的大面積的網片2上，以製造大面積的細胞層片。如圖3中的3021～3024所示般，細胞層片製造裝置100A的支撐體單元10A具有蓋體9。蓋體9係構成為覆蓋網片2當中一邊的表面2a。蓋體9當中設置有注入口9i，其係用於使包含細胞4的懸浮液注入至網片2與蓋體9之間。更具體地說，蓋體9係配置為覆蓋住網片2當中與筒狀承載部3b接觸的表面2a。網片2與蓋體9係彼此分離。筒狀承載部3b係配置於網片2與蓋體9之間。藉由筒狀承載部3b使得網片2與蓋體9之間的間隔保持固定。
於此，網片2與蓋體9之間的間隔係設定成使得細胞4的懸浮液一邊與網片2及蓋體9接觸，一邊被注入至網片2與蓋體9之間。網片2與蓋體9之間的間隔係以1mm～3mm為較佳，以1mm～2mm為更佳，又以1mm～1.5mm為最佳。
換句話說，蓋體9係為封閉起由網片2及筒狀承載部3b所形成的有底筒部10a之組件。蓋體9可為至少包含第一層9a及第二層9b的層疊結構。第一層9a係為離網片2最遠的層，第二層9b係為離網片2最近的層。於圖3中的3030所示之構成當中，蓋體9係構成為第一層9a及第二層9b所形成的雙層結構。作為構成第一層9a的材料，可列舉例如聚矽氧樹脂等。此外，作為構成第二層9b的材料，可列舉例如聚乙烯對苯二甲酸酯(PET)等。另外，蓋體9也可為第一層9a及第二層9b當中的其中一者之單層結構。
於使用了細胞層片製造裝置100A的細胞層片製造方法當中，首先，將支撐體單元配置於皿盤22內。此支撐體單元當中並未設置有蓋體9。此外，所述支撐體係配置為上下倒置成使得網片2位於比筒狀承載部3b還要下側的位置。透過以此方式配置支撐體單元10，以形成有底筒部10a。此有底筒部10a係基於網片2及筒狀承載部3b之內側表面而形成，並且以網片2為底面(參照圖3中的3020)。接著，透過配置蓋體9並且使其封閉起有底筒部10a中原本打開的上部，以製作支撐體單元10A(參考圖3中的3021)。
接著，使用移液器5等，將使細胞4懸浮於培養基6中而成的懸浮液從注入口9i注入至有底筒部10a中(參考圖3中的3022)。此時，細胞4的懸浮液係一邊與網片2及蓋體9兩者接觸，一邊被注入至有底筒部10a內。此時，透過所述懸浮液分別對蓋體9及網片2的表面張力，防止所述懸浮液因為重力而穿過網片2而掉落。此時，即使網片2為大面積，仍可藉著所述懸浮液對蓋體9的表面張力，而使得所述懸浮液被保持於網片2上(參考圖3中的3023)。透過以此方式使懸浮液中的細胞4附著於網片2，可均勻地將細胞4播種至網片2(例如大面積的網片2)。
之後，以培養基6將整個皿盤22填滿，以培養附著至網片2上的細胞(參照圖3中的3024)。
另外，於上述方法當中，係在將蓋體9配置於有底筒部10a之後注入細胞4的懸浮液。然而，亦可於將細胞4的懸浮液注入至有底筒部10a之後，再以使所述懸浮液不會從網片2上掉落的方式來設置蓋體9。
(變形例2) 說明細胞層片製造裝置100的其他變形例。圖4係為係為表示作為變形例2的細胞層片製造裝置100B之構成，以及使用了該細胞層片製造裝置100B的細胞層片製造方法的圖。圖4中的4010係為表示細胞層片製造裝置100B所具備的支撐體單元10B之構成的分解立體圖。圖4中的4020～4022係為表示使用了細胞層片製造裝置100B的細胞層片製造方法的圖。
細胞層片製造裝置100B係與變形例1同樣地，具有蓋體9並可製造大面積的細胞層片。於細胞層片製造裝置100B當中，支撐體單元10B之構成係與變形例1不同。如圖4中的4010所示般，支撐體單元10B之基座3並非筒狀承載部3b從基座本體3a突出之構成。筒狀承載部3b係設置成作為形成於基座本體3a中的開口部。底面抵接部3e設置為相對於基座本體3a而往下方突出，並未往上方突出。此外，側壁抵接部3f係設置為從基座本體3a沿著水平方向延伸。
此外，環狀組件1具有與筒狀承載部3b之內徑幾乎相同的內徑。因此，網片2係被環狀組件1之下表面及基座本體3a之上表面所夾持。
此外，蓋體9係配置為覆蓋住網片2當中與環狀組件1接觸的表面2b。網片2與蓋體9係彼此分離。環狀組件1係配置於網片2與蓋體9之間。藉著環狀組件1使得網片2與蓋體9之間的間隔保持固定。蓋體9係為將基於網片2及環狀組件1而形成的有底筒部10b予以封閉的組件。
於使用了細胞層片製造裝置100B的細胞層片製造方法當中，首先，將支撐體單元10B配置於皿盤22內。支撐體單元10B係配置為使得網片2位於比環狀組件1還要下方的位置。透過上述配置以於支撐體單元10B當中形成有底筒部10b。此有底筒部10b係基於網片2及環狀組件1之內側表面而形成，並以網片2為底面(參考圖4中的4020)。
接著，使用移液器5等，將細胞4懸浮於培養基6中的懸浮液從注入口9i注入至有底筒部10a中，並將細胞4播種至網片2上(參考圖4中的4021及4022)。其後，以培養基6來填滿皿盤22，進行細胞培養。
細胞層片製造裝置100B具有使得所製作的細胞層片不易從支撐體單元10B上分離的結構。然而，透過使用剪刀或刀子，可從支撐體單元10B上切下細胞層片。
使用本實施型態之細胞層片製造裝置所製作的細胞層片係可於培養基中從細胞層片之上表面及下表面兩者來供給營養。於傳統的在皿盤上製作細胞層片的方法當中，由於無法從細胞層片之下表面來供給營養，因此僅靠從上表面供給營養來培養細胞。因此，於限制從細胞層片之上表面供給營養的狀況當中，供給至細胞層片內部的細胞的營養可能不夠充分。
於限制從細胞層片之上表面供給營養的狀況當中，例如，或有製作皮膚片的情況。於製造皮膚片當中，或有透過於纖維芽細胞層(真皮層)上形成角質細胞層(表皮層)以製作皮膚片的情況。於此情況下，由於成熟的表皮細胞會形成緊密連接，因此阻礙了從皮膚片之上方所供給的營養。因此，於傳統的在皿盤上製作細胞層片的方法當中，製作由纖維芽細胞層及真皮層所形成的皮膚片係為困難。
圖5係為表示使用本實施型態之細胞層片製造裝置所製作的皮膚片的截面結構之示意圖。11係為死掉的角質細胞。12係為上述的緊密連接。此外，13係表示角質細胞。14係表示皮膚纖維芽細胞。如圖5所示般，使用本實施型態之細胞層片製造裝置所製作的皮膚片當中，即使來自上方的角質細胞13之層的營養供給減少，也可期待來自下方的皮膚纖維芽細胞14之層所供給的營養。因此，可以向構成皮膚片的角質細胞13及皮膚纖維芽細胞14而供給更多的營養。
此外，作為其他的習知技術，已知於多孔膜上製作複數個由細胞層所形成的皮膚片的方法。由於係使用多孔膜，因此會認為從細胞層片之下表面供給了某種程度的營養。然而，藉此方法所製作的細胞層片係難以直接使用於移殖。其原因在於，當移殖到患部時，並非使表皮層之表面與患部接觸，而是必須一邊使真皮層之表面與患部接觸，一邊移殖皮膚片，因此無法將真皮層被夾在多孔膜與表皮層之間的細胞層片使用於移殖。另一方面，使用本實施型態之細胞層片製造裝置所製作的皮膚片當中，不僅是表皮層表面，真皮層表面中細胞也存在於培養基側，也就是暴露於培養基中。因此，可將皮膚片的真皮層表面貼附至患部。
此外，於腸管細胞及血管內皮細胞等中也觀察到緊密連接12。因此，除了皮膚片之外，本實施型態之細胞層片製造裝置還可在培養及使用含有會形成緊密連接12的腸管細胞或血管內皮細胞等的細胞層片時使用。
(變形例3) 說明細胞層片製造裝置的變形例。圖20及圖21係為表示作為變形例3的細胞層片製造裝置的支撐體單元60的圖。另外，於圖20及圖21當中，省略了對於構成細胞層片製造裝置之容器的描述。
本實施型態之細胞層片製造裝置係構成為：基座3(保持組件)及環狀組件1中的至少其中一者當中係形成有鎖定部67，鎖定部67係將所基座3與所述環狀組件1鎖定以使其彼此不分離，基座3及環狀組件1兩者中的其中一者當中形成有貫穿孔66，貫穿孔66係供用來按壓該兩者中另一者的按壓銷65將其貫穿，藉由對該兩者中另一者的按壓使得所述鎖定解除，且使得基部3與環狀組件1彼此分離。另外，本實施型態之細胞層片製造裝置可為具有按壓銷65之構成，亦可為不具有按壓銷65之構成。當本實施型態之細胞層片製造裝置為不具有按壓銷65之構成時，可將按壓銷65準備為與細胞層片製造裝置不同的構成。
鎖定部67只要是可藉由按壓銷65來解除基座3與環狀組件1之間的鎖定之構成即可，並不限制具體的構成。作為鎖定部67的具體構成，可列舉：(i)形成於基座3及環狀組件1當中的至少其中一者的表面上，且使基座3與環狀組件1之間產生大的摩擦力的摩擦力產生區域；(ii)凸部與鎖定凸部之組合，其中凸部係形成於基座3之表面，鎖定凸部係形成於環狀組件1之表面，且用於鎖定所述凸部於按壓方向上的移動；(iii)凸部與鎖定凸部之組合，其中凸部係形成於環狀組件1之表面，鎖定凸部係形成於基座3之表面，且用於鎖定所述凸部於按壓方向上的移動；以及(iv)上述(iii)與(iii)之組合。摩擦產生區域係可透過例如將用來產生所需摩擦力的材料(例如橡膠)貼附至基座3及環狀組件1當中的至少其中一者之表面而形成。
貫穿孔66只要是形成於基座3及環狀組件1當中的其中一者即可，由支撐體單元60的易操作性的觀點來看，以形成於基座3為較佳。
當著眼於特定的貫穿孔66時，當該貫穿孔66形成於基座3當中時，可構成為於環狀組件1當中與該貫穿孔66彼此相對的區域中並未形成貫穿孔；當該貫穿孔66形成於環狀組件1時，可構成為基座3當中與該貫穿孔66彼此相對的區域中並未形成貫穿孔。若為該構成，並且使按壓銷65貫穿過貫穿孔65，可藉由該按壓銷65有效地按壓兩者中並未形成貫穿孔之一方(即基座3或是環狀組件1)。
貫穿孔66的形狀及數量並無限制。作為貫穿孔66的形狀，可列舉例如圓柱狀及稜柱狀。形成於每一個保持組件或是每一個環狀組件的貫穿孔66的數量可為偶數，亦可為奇數，惟以大致均等地按壓整個的基座3或是環狀組件1之觀點來看，以偶數個為較佳。作為貫穿孔66的數量，可列舉1～10個或是1～20個，可根據基座3及環狀組件1的尺寸來適當地設定貫穿孔66的數量。
更具體地說，於圖20中的20010及圖20中的20011當中，箭頭左側的圖係為支撐體單元60的立體圖。如後述圖21當中也詳細地表示般，基座3當中係形成有用於承載網片2的筒狀承載部3b，且網片2之周緣係被筒狀承載部3b及環狀組件1所夾持。另外，於支撐體單元60當中，亦可於基座3或是環狀組件1之上形成蓋體(未圖示出)。
於圖20中的20010以及圖20中的20011當中，箭頭右側的圖係為透過使按壓銷65貫穿過貫穿孔66並按壓環狀組件1，以解除基座3與環狀組件1之間的鎖定之後的支撐體單元60的分解立體圖。於此等圖式當中，於基座3當中形成有貫穿孔66，且環狀組件1當中與所述貫穿孔66彼此相對的區域中並未形成貫穿孔。因此，若使按壓銷65貫穿過貫穿孔66，可有效地藉由該按壓銷65來按壓環狀組件1，並解除基座3與環狀組件1之間的鎖定。於此等圖式當中，於基座3示例性地形成了4個貫穿孔66。若使按壓銷65貫穿過此等貫穿孔66中的每一個，可大致均等地按壓整個環狀組件1。
圖21中的21010係為支撐體單元60的俯視圖。圖21中的21011係為該支撐體單元60當中「A-A」位置處的截面圖，係為表示使按壓銷65貫穿貫穿孔66時各個構成的經時變化的截面圖。首先，如圖21中的21011的左側所示，沿著箭頭方向，將按壓銷65插進貫穿孔66。接著，如圖21中的21011的中央處所示，當按壓銷65貫穿過貫穿孔66時，按壓銷65往下方按壓環狀組件1。最後，如圖21中的21011的右側所示，透過使按壓銷65進一步往下方按壓環狀組件1，使得基座3與環狀組件1之間的鎖定解除，並使得基座3與環狀組件1分離，其結果使得筒狀承載部3b及環狀組件1所夾持的網片2(具體為網片2之周緣)被移除。
3.本實施型態之細胞層片製造裝置的構成例2 說明本實施型態之細胞層片製造裝置的構成例2。圖6係為表示構成例2的細胞層片製造裝置所具備的支撐體單元30之示意構成圖。圖6中的6010～6013係為表示支撐體單元30之組裝順序的立體圖。圖6中的6020係為表示支撐體單元30的示意性構成的截面圖。
如圖6中的6010～6013以及6020所示，支撐體單元30具有網片2；一對框架體31, 32；夾子33(夾持組件)；保持組件34；墊片35。保持組件34構成支撐體單元30的本體。由網片2、一對框架體31, 32、夾子33構成網件集合體A。
框架體31及框架體32係為透過夾持網片2來增強網片2的組件。框架體31及框架體32係配置為夾住網片2之周緣。此外，框架體31及框架體32係以可移除方式設置於保持組件34。
此外，如圖6中的6011所示，夾子33係為透過夾持一對框架體31, 32，而使網片2與一對框架體31, 32一體化的組件。透過此夾子33的夾持，使得框架體31與框架體32彼此互不分離，固定為緊貼的狀態。
透過將網片2配置於一對框架體31, 32之間，並將框架體31及框架體32固定於夾子33來建構網件集合體A(參照圖6中的6010～6012)。
保持組件34具有無底筒狀。保持組件34之內徑係大於一對框架體31, 32的外徑。於保持組件34之內壁的彼此相對的兩個部分上，分別形成有用於安裝網件集合體A的安裝部34a。安裝部34a具有平板部34b及平板部34c。平板部34b及平板部34c係彼此分離，且設置為從保持組件34之內壁沿著水平方向往內側突出。透過將網件集合體A之周緣部分插入至平板部34b及平板部34c之間，以將網件集合體A安裝至保持組件34。此外，於保持組件34之上端係形成有沿著水平方向突出的凸邊34d。
於網件集合體A安裝至保持組件34的狀態下，網件集合體A與平板部34b之間具有間隙(參照圖6中的6013)。墊片35係為用於填補網件集合體A與平板部34b之間的組件。藉由此墊片35使得網件集合體A於保持組件34之安裝部34a內的移動被鎖定。因此，可使得網件集合體A穩定地保持於保持組件34內。
此外，於墊片35當中設置有往上方突出的提紐35a。將網件集合體A從保持組件34上分離時，使用者抓取墊片35之提紐35a，並從墊片35上移除保持組件34。接著，從保持組件34上將網件集合體A分離。
圖7係為表示作為構成例2的細胞層片製造裝置100C之構成的圖。圖7當中的7010～7012係為表示使用了細胞層片製造裝置100C的細胞層片製造方法的圖。此外，圖7當中的7020～7022、7030及7031係為用於說明細胞層片製造裝置100C之功效的圖。
於使用了細胞層片製造裝置100C的細胞層片製造方法當中，首先，將支撐體單元30容置於容器23內。此時，配置支撐體單元30，並使得網件集合體A最靠近容器23之底面(參照圖7中的7010)。
此外，保持組件34當中的凸邊34d之下表面係與容器23之整個上端面抵接。此外，保持組件34之外徑係為接近容器23之內徑的尺寸。並且，於保持組件34之外周面與容器23之內側面之間形成有間隙，使得可從容器23上移除保持組件34。藉由上述構成，使得支撐體單元30係以在培養基中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於容器23中。
接著，將細胞4播種於網片2上(參照圖7中的7011)。由於細胞4的播種方法係與使用細胞層片製造裝置100的方法相同，因此省略說明。
接著，以培養基6填滿整個容器23，並且培養附著於網片2上的細胞4。藉此製作細胞層片200。
接著，說明細胞層片製造裝置100C之功效。如上所述，透過從保持組件34上移除墊片35，以使網件集合體A從保持組件34上分離。分離出來的網片集合體A可容易地上下倒置地安裝於保持組件34。因此，如圖7中的7020及7021所示般，可分別於網片2之上表面及下表面上播種不同種類的細胞4a及4b。進一步地，於形成細胞層片200之後，可容易地使細胞層片200從網件集合體A上分離。僅藉著移除夾子33即可使框架體31及框架體32彼此分離。因此，若使框架體31與框架體32分離，即可容易地取出細胞層片200。此外，如圖7當中的7030及7031所示，可藉由顯微鏡7來觀察網片2之兩面。
此外，於細胞層片製造裝置100C當中，係透過保持組件34之凸邊34d與容器23之上端面之間的抵接，以使支撐體單元30保持於容器23內。凸邊34d係為不與培養基6接觸的部分。此外，墊片35之提紐35a也是不與培養基6接觸的部分。因此，當在使用鑷子來將支撐體單元30移動至其他的容器時，透過用鑷子使墊片35往上方移動，可在鑷子並未接觸培養基6的情況下使支撐體單元30移動。另外，當在相對靠近容器23的底部的位置處培養細胞4時，即使移動支撐體單元30細胞4也不會與容器23接觸。
而且，即使是在容器23之底面處培養了不同於細胞4的細胞的情況下，此細胞也不會與支撐體單元30接觸。也就是說，於細胞層片製造裝置100C當中，於(i)支撐體單元30之網片2上；及(ii)容器23之底面等兩處中，同時培養互不相同的細胞時，支撐體單元30不會接觸到於容器23之底面所培養的細胞。另外，由於支撐體單元30係為從容器23之上側插入的結構，因此支撐體單元30相對於容器23的位置是穩定的。
4.本實施型態之細胞層片製造裝置的構成例3 說明本實施型態之細胞層片製造裝置的構成例3。圖8係為表示構成例3之細胞層片製造裝置100D的構成的圖。圖8當中的8010及8020係為表示細胞層片製造裝置100D所具備的支撐體單元40的構成的圖像。此外，圖8當中的8030～8033係為表示使用了細胞層片製造裝置100D的細胞層片製造方法的圖。
支撐體單元40係呈可相對於井(well)24(容器)分離的方式容置於其中的管柱型態。支撐體單元40具有網片2、管柱本體41。藉由網片2構成管柱本體41之下表面。此外，透過將管柱本體41之凸邊部分承載於井24上，使得管柱本體41以在培養基6之內垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於井24中(參照圖8當中的8030)。另外，例如，可透過從市售的TranswellTM 之管柱上去除多孔質膜，並黏貼網片2來製作支撐體單元40。
透過使用細胞層片製造裝置100D，可容易地對所製作的細胞層片進行液相-氣相培養。例如，於皮膚片的製造當中，首先，如圖8當中的8031所示，將皮膚纖維芽細胞14播種至網片2上，並於培養基6內進行培養。接著，如圖8當中的8032所示般，透過將角質細胞13播種至由生長的皮膚纖維芽細胞14所形成的層上，並於培養基6中進行培養，以製作皮膚片。如圖8當中的8033所示般，可在皮膚纖維芽細胞14與培養基接觸，且角質細胞13中的一部分與氣體接觸的狀態下來進行皮膚片的培養，也就是說可進行液相-氣相的培養。
5.本實施型態之細胞層片製造裝置的構成例4 說明本實施型態之細胞層片製造裝置的購成例4。圖9係為表示構成例3之細胞層片製造裝置100E之構成的圖。圖9當中的9010係為表示細胞層片製造裝置100E所具備的支撐體單元50之構成的立體圖。此外，圖9當中的9011係為表示細胞層片製造裝置100E之構成的圖像。
如圖9當中的9011所示，於細胞層片製造裝置100E當中，作為容器，係使用其中形成有複數個井25a的井板26。於圖9當中的9011所示構成當中，井板26係為12孔板。支撐體單元50係以可相對於此井板26可分離方式而容置於其中。支撐體單元50具有網片2、管柱本體51。
管柱本體51具有第一圓環部51a、足部51b、第二圓環部51c。足部51b係為連接第一圓環部51a與第二圓環部51c之間的部分。第一圓環部51a與第二圓環部51c係配置為彼此的中心軸一致。
第一圓環部51a之外徑係大於井板25的井25a之內徑。此外，第二圓環部51c之內徑係小於第一圓環部51a之內徑。第二圓環部51c之底部係被網片2封閉。
於細胞層片製造裝置100E當中，透過將管柱本體51之第一圓環部51a承載於井25a上，使得管柱本體51以在培養基6中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於井25a中。此外，將細胞的懸浮液注入至由第二圓環部51c之內側表面、足部51之內側表面、網片2所形成的空間中。
此外，於細胞層片製造裝置100E當中，透過將管柱本體51之第一圓環部51a放置於井25a上，以將支撐體單元50保持於井25a內。第一圓環部51a係為不與培養基6接觸的部分。因此，當使用鑷子來將支撐體單元50移動至另一個井25a時，透過用鑷子來抓取第一圓環部51a，可在鑷子並未接觸培養基6的情況下使支撐體單元50移動。另外，當在相對靠近井25a的底部的位置處培養細胞時，即使移動支撐體單元50細胞4也不會與井25a接觸。另外，於細胞層片製造裝置100E當中，於(i)支撐體單元50之網片2上；及(ii)井25a之底面等兩處中，同時培養互不相同的細胞時，支撐體單元50不會接觸到於井25a之底面所培養的細胞。
此外，於細胞層片製造裝置100E當中，藉由第一圓環部51a及足部51b而穩定地保持層片2的位置。因此，根據細胞層片製造裝置100E，使得能更穩定地保持支撐體單元50於井25a內的垂直方向及水平方向的位置。
[整理] 為了要解決上述問題，本發明一態樣之細胞層片製造裝置的特徵為具有：容器，其係供容置用於培養細胞的培養基；支撐體單元，其具有網片及保持組件，且以可分離方式容置於所述容器中，且所述網片係為使所述細胞附著並予以培養的基材，所述保持組件將所述網片保持為懸浮於所述容器之底面，所述支撐體單元係以在所述培養基中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於所述容器中。
根據上述構成，所述支撐體單元係以可分離方式容置於容器中。因此，使用者可透過將所述支撐體單元從容器中取出並翻轉之後，再次地容置於容器中，藉此可容易地翻轉所述支撐體單元。當所述支撐體單元翻轉時，形成於被所述支撐體單元之保持組件所保持的網片上的細胞層片也會翻轉，因此，透過上述構成，可容易地透過顯微鏡來觀察形成於網片上的細胞層片的兩面。
另外，由於支撐體單元係以在培養基中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於容器中，因此，在用顯微鏡觀察細胞層片之過程中，網片於容器內的位置，換句話說也就是形成於網片上的細胞層片的位置不變。因此，根據上述構成，可精確地觀察細胞層片。
於本發明一態樣之細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述保持組件係以可移除方式來保持所述網片。
根據上述構成，可容易地將形成於所述網片上的細胞層片從支撐體單元上分離。
本發明一態樣之細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述保持組件當中形成有用於承載所述網片的筒狀承載部，所述支撐體單元具有環狀組件，所述環狀組件係為圍繞所述筒狀承載部之外周的形狀，且以可移除方式設置於所述保持組件上，且所述網片之周緣係被所述筒狀承載部及所述環狀組件所夾持。
根據所述構成，透過將環狀組件附接至保持組件，並使網片之周緣被筒狀承載部及環狀組件所夾持，藉此能夠使網片穩定地承載於筒狀承載部上。另一方面，透過將環狀組件從保持組件上移除，可將被筒狀承載部及環狀組件所夾持的網片之周緣釋放，藉此可容易地移除承載於筒狀承載部上的網片。
於本發明一態樣之細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述保持組件及所述環狀組件中的至少其中一者當中係形成有鎖定部，所述鎖定部係將所述保持組件與所述環狀組件鎖定以使其彼此不分離，所述保持組件及所述環狀組件兩者中的其中一者當中形成有貫穿孔，所述貫穿孔係供用來按壓該兩者中另一者的按壓銷將其貫穿，藉由對該兩者中另一者的按壓使得所述鎖定解除，且使得所述保持組件與所述環狀組件彼此分離。
根據上述構成，將按壓銷插入至貫穿孔中，並用按壓銷來按壓所述保持組件或是所述環狀組件，藉此可釋放保持組件與環狀組件之間的鎖定，並且藉此而容易地移除承載於筒狀承載部上的網片。
本發明之一態樣的細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述支撐體單元係具有：一對框架體，其係以可移除方式設置於所述保持組件上，且配置為夾住所述網片之周緣；及夾持組件，其透過夾持所述一對框架而使所述網片與所述一對框架體一體化。
根據上述構成，由於配置為夾住網片之周緣的一對框架體，係設置為可從保持組件上移除下來，因此，透過將一對框架體從保持組件上分離，可容易地移除由一對框架體所保持的所述網片。
本發明一態樣之細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述保持組件的比重係大於所述培養基。
根據所述構成，由於保持組件的比重比培養基還要大，因此，可穩定地維持保持組件及被保持組件所保持的網片上所形成的細胞層片於培養基中的垂直方向及水平方向的位置。
本發明一態樣的細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述支撐體單元具有蓋體，所述蓋體係覆蓋所述網片的其中一邊的表面，且所述蓋體當中設置有注入口，所述注入口係用於將包含所述細胞的懸浮液注入至所述網片與所述蓋體之間，且所述蓋體與所述網片之間的間隔係設定為使得所述懸浮液一邊與所述網片及所述蓋體接觸，一邊被注入至所述網片與所述蓋體之間。
根據所述構成，設定蓋體與網片之間的距離，使得懸浮液一邊與網片與蓋體接觸，一邊被注入至網片與蓋體之間。於此情況下，能夠一邊抑制使包含細胞的懸浮液穿過網片而往網片之下方移動，一邊使該懸浮液往橫向擴散。因此，即使增加網片的面積，仍可均勻地使包含細胞的懸浮液於網片上均勻地擴散，並且可容易地使用了大面積的網片來進行細胞培養。
本發明一態樣之細胞層片製造裝置當中，較佳地，所述網片之開口部具有沿著一個方向延伸的形狀。
當如上述構成般，網片之開口部為沿著一方向延伸的形狀時，開口部具有往一方向拉長地延伸的大的壁面。由於黏附於該壁面上而增殖的細胞數量多，且係具有相同取向性而增殖，因此，根據所述構成可將增殖的細胞的取向性控制成往開口部的延伸方向。
本發明一態樣之細胞層片的特徵在於具有至少兩個細胞層，且於所述兩個細胞層之間配置有網片，所述網片係為使細胞附著並予以培養的基材。
根據上述構成，可充分地確保細胞層片的厚度，並且提升細胞層片的強度。此外，根據上述構成，可提供具有複數個種類的細胞層的細胞層片。
[實施例] [實施例1：使用構成例1的細胞層片製造裝置的細胞培養] ＜支撐體單元10的製作＞ 製作容置於12孔板中的基座3的設計圖，並且基於該設計圖，使用3D印表機AGILISTA-3200(基恩斯公司)製作基座3。使用實驗室塗覆機PDS-2010(日本派瑞林公司)，並使用具有優異生物體相容性的聚對二甲苯(DPXC, CAS No.28804-46-8)(日本派瑞林公司)來塗覆3D列印模型(基座3)。網片2係使用聚酯製的微網片(AG00Z3N9)(天池合纖公司)。
此外，使用由PDMS(聚二甲基矽氧烷)(商品名稱：SILPOT 184，東麗道康寧公司)所形成的2mm的板，來製作環狀組件1。2mm的PDMS板的製作方法係如下所述。首先，將主劑及固化劑以10：1比例混合而成的PDMS溶液倒進皿盤當中至厚度2mm，其後，加熱並使其固化。使用直徑8mm及直徑6mm的兩個生物採樣棒(貝印工業公司)，於完成的厚度2mm的PDMS板上，製作環(外徑8mm、內徑6mm)。
將以上述方式製作的環狀組件1、網片2，以及基座3用70%的乙醇清洗並且風乾之後，於無塵工作台中組裝，以完成支撐體單元10。對完成的支撐體單元10進行30分鐘的UV處理之後，將支撐體單元10容置於12孔板的各個井中。
＜細胞培養條件＞ 由JCRB細胞銀行(大阪)取得屬於源自人類肺部的正常纖維芽細胞之Tig-1-20細胞(產品編號JCRB0501)。使用含有10%牛胎血清(FBS)(GIBCO公司)、100單位/mL的青黴素、100μg/mL的鏈黴素(GIBCO公司)的達爾柏克改良伊格爾培養基(DMEM, dulbecco's modified eagle medium)(GIBCO公司)，來培養Tig-1-20細胞。於37℃，5%二氧化碳(CO2 )條件下的培養箱內培養Tig-1-20細胞。
由理化學研究所生物資源中心(RIKEN BRC)取得HepG2細胞(產品編號RCB1886)。使用含有10%牛胎血清(FBS)(GIBCO公司)、100單位/mL的青黴素、100μg/mL的鏈黴素(GIBCO公司)的達爾柏克改良伊格爾培養基(DMEM)(GIBCO公司)，來培養HepG2細胞。於37℃，5%二氧化碳(CO2 )條件下的培養箱中培養(製品編號RCB1886)。
由普羅摩席爾公司(Promo Cell)購入源自人體脂肪組織的間葉系細胞(Human Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue)。使用間葉系幹細胞增殖培養基2(普羅摩席爾公司)來培養源自人體脂肪組織的間葉系細胞。於37℃，5%二氧化碳(CO2 )條件下的培養箱內培養源自人類脂肪組織的間葉系幹細胞。
＜細胞播種及顯微鏡觀察＞ 於支撐體單元10之網片2(直徑4mm圓形區域)上，播種0.5×105 個(1×106 細胞/mL取50μL)的Tig-1-20細胞、HepG2細胞、或是間葉系幹細胞。於播種5小時之後，將培養基3mL加入至內有支撐體單元10的井中。每3天交換一次培養基(3mL/井)。使用數位顯微鏡或是倒立相位差顯微鏡來拍攝細胞的照片。
使用光干涉型斷層掃描成像系統Cell 3imager Estier(迪恩士控股公司, Screen holdings)來解析培養了16天的Tig-1-20細胞層片、HepG2細胞層片，以及間葉系細胞層片。
對於Tig-1-20細胞，於細胞播種之前用膠原蛋白溶液覆蓋網片2。更具體地說，將膠原蛋白酸性溶液I-AC 5mg/mL(高研公司)以1mM HCl溶液稀釋15倍，並將已稀釋的膠原蛋白溶液50μL放置於網片2上。然後，於37℃下靜置30分鐘之後，去除已稀釋的膠原蛋白溶液。接著，以PBS(－)清洗2次，並於37℃的培養箱內保存直到播種細胞時。
＜結果＞ 圖10當中的1010係為細胞播種一天之後的支撐體單元10的顯微鏡圖像。將50μL的細胞懸浮液穩固地保持於網片2(左圖)上。在並未發生間隙中產生氣泡等問題的情況下，完成了將培養基加進至井中(中央圖)。另外，也可上下倒置支撐體單元10(右圖)。
確認到可於網片2上培養Tig-1-20細胞、HepG2細胞，以及間葉系細胞(圖10當中的1011)。由於Tig-1-20細胞對網片2的黏附性較弱，因此以塗覆液塗覆網片2。透過以膠原蛋白溶液進行塗覆，可確認到即使於5小時之後添加培養基細胞層片也不會從網片上分離。
此外，圖11係表示用光干涉型斷層成像系統對培養16天的Tig-1-20細胞層片、HepG2細胞層片，以及間葉系幹細胞層片進行解析而得的結果。發現到如圖11所示，Tig-1-20細胞層片表面及間葉系幹細胞層片表面呈平坦，而相對於此HepG2細胞層片並不平坦。從一側所作的光干涉型斷層成像系統解析當中，將HepG2細胞層片及間葉系幹細胞層片係清楚地解析至接近網片2平面。由於Tig-1-20細胞層片比起此等細胞層片還要薄，因此完成了從一側上的觀察來解析細胞層片表面(圖11)。
[實施例2：使用構成例1的細胞層片製造裝置來製作由3種細胞所形成的細胞層片] ＜細胞培養條件＞ 細胞培養條件係與實施例1相同。
＜播種細胞至支撐體單元10之網片2上＞ 用膠原蛋白塗覆支撐體單元10(12孔用)的網片2。其後，對此網片2播種4×105 個(1×107 細胞/mL取40μL)，用CellBrite Green Cytoplasmic質膜標記試劑盒(稀釋80倍，盟基生物科技公司)染色的Tig-1-20細胞。於5小時之後，將3mL的含有FBS(胎牛血清)的DMEM培養基加入至井中。2天之後，從Tig-1-20細胞的上方，播種4×105 個(1.6×107 細胞/mL取25μL)，用CellBrite Red Cytoplasmic質膜標記試劑盒(稀釋120倍，盟基生物科技公司)染色的間葉系幹細胞(MSC, mesenchymal stem cell)。並且，將培養基替換為間葉系幹細胞用的培養基。隔日，將支撐體單元10上下倒置(設置為反放)，從Tig-1-20細胞的上方，播種4×105 個(1.6×107 細胞/mL取25μL)，用0.025mg/mL的DiI(1,1'-十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸鹽, 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)染色的HepG2細胞。隔日，用PBS(－)來清洗細胞，浸漬於4%的磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS, Phosphate buffered saline)於室溫下靜置50分鐘。以PBS(－)清洗之後，將細胞層片連同封固劑VECTASHIELD(偉特公司)固定於蓋玻片與載玻片之間。詳細地說，為了要防止細胞層片被蓋玻片壓碎，將厚度約100μm的耐熱膠帶堆疊三層而成之物放置於蓋玻片與載玻片之間。用共軛焦顯微鏡LSM 800(ZEISS)來解析所固定的細胞層片。
＜結果＞ 圖12當中的1210～1212係表示本實施例的結果。如圖12當中的1210～1212所示，於Tig-1-20細胞層片之上製作出間葉系幹細胞層片。接著，完成於Tig-1-20細胞層片之下製作出HepG2細胞層片。整個細胞層片的厚度為約140-150μm。其結果呈現出(i)可從支撐體單元10的上下兩側來播種細胞；(ii)可製作出由複數種細胞所形成的細胞層片。
[實施例3：使用構成例2之細胞層片製造裝置來培養人體皮膚纖維芽細胞] ＜支撐體單元30之製作＞ 使用3D印表機AGILISTA-3200來製作支撐體單元30當中除了網片2之外的各種組件。以聚對二甲苯(DPXC, CAS. No. 28804-46-8)塗覆所製作的上述各種組件。作為網片2，使用聚酯製的微網片(AG00Z3N9)(天池合纖公司)。作為對照組，還製作支撐體單元30，其中安裝有TanswellTM 中所使用的多孔膜(Transwell聚碳酸酯薄膜, 孔徑0.4μm, 康寧公司)以取代網片2。
＜細胞培養條件＞ 由普羅摩席爾公司購買，並且使用皮膚纖維芽細胞增殖培養基2(普羅摩席爾公司)來培養正常成年人體皮膚纖維芽細胞(NHDF，Normal Human Dermal Fibroblasts)。於37℃，5%二氧化碳(CO2 )條件下的培養箱內培養正常成年人體皮膚纖維芽細胞。
＜細胞播種及顯微鏡觀察＞ 播種1.65×106 個(3×106 細胞/mL取550μL/片)的NHDF至支撐體單元30之網片2。約18小時之後加入培養基。每3天更換一次培養基，並培養14天(6mL/井)。拍攝細胞的倒立相位差顯微鏡圖像(圖11A)。此外，製作蘇木素-伊紅(HE, hematoxylin-eosin)染色切片(新組織科學研究所)，並使用BZ-X710 All-in-one(基恩斯公司)來拍攝細胞層片的截面圖(圖13中的1311)。
＜結果＞ 將結果表示於圖13中的1310及1311。NHDF係以填補網片2的開口之型態存在，且係以覆蓋網片2的網線的方式存在。在由網片2所製作的細胞層片、由多孔膜所製作的細胞層片兩者當中，細胞層片表面均勻且光滑。在由網片2所製作的細胞層片當中，不同於由多孔膜所製作的細胞層片，其中的細胞係暴露於細胞層片之下表面。因此，研判在供給營養及細胞觀察上具有優異表現，且在進行移殖醫療時對於細胞層片的黏附性也表現優異。
[實施例4：使用構成例2之細胞層片製造裝置來培養Tig-1-20細胞] ＜支撐體單元30之製作＞ 本實施例之支撐體單元30的製作方法係與實施例3相同。然而，本實施例之支撐體單元30當中，僅有保持組件34之結構與實施例3有部分差異。於本實施例當中，於保持組件34中並無用來促使培養基從外側流進內側的空隙(參照圖14中的1410)。
此外，Tig-1-20細胞的培養條件(培養基之組成)係與實施例1相同。然而，於本實施例當中並未塗覆網片2。
＜Tig-1-20細胞之播種及顯微鏡觀察＞ 將4×106 個(8×106 細胞/mL取500μL/網目)，用CellBrite Green Cytoplasmic 質膜標記試劑盒(稀釋100倍，盟基生物科技公司)染色；或是未經染色的Tig-1-20細胞，播種至在＜支撐體單元30之製作＞當中所製作的支撐體單元30之網片2上。並且於17小時之後，將6mL的培養基加入至井中。於此3天之後更換了一次培養基。於開始培養的第六天，清洗所製作的細胞層片，並以4%多聚甲醛(PFA, Paraformaldehyde)來固定細胞，並且於清洗後固定至含有DAPI(4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole))的封固劑VECTA當中。使用共軛焦顯微鏡LSM 800(ZEISS)來解析所固定的細胞層片。另一方面，製作用4%的PFA及1%的甲醛所固定的未經螢光染色的細胞層片的HE染色切片(新組織科學研究所)，並且以BZ-X710 All-in-one(基恩斯)來拍攝截面圖。
＜源自人體誘導性多能幹細胞(iPS細胞)之心肌細胞之播種及顯微鏡觀察＞ 為了要從並未用於上述實驗所作解析的Tig-1-20細胞層片(培養6天)之上方追加進行播種源自iPS細胞的心肌細胞，將井內的培養基替換為4mL的MiraCell CM培養基。播種1.8×105 個，用0.025mg/mL DiI(DiI(1,1'-十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸鹽)染色的源自人體iPS細胞的心肌細胞。於約16小時之後追加2mL的培養基。之後，與Tig-1-20細胞一起培養3天，以同於上述方式固定細胞，並以共軛焦顯微鏡進行解析。
＜結果＞ 將結果示於圖14當中的1420～1423。如圖14當中的1420所示，Tig-1-20細胞係隨著微網片的開口形狀取向。也就是說，其取向係幾乎平行於長方形開口的長邊。位於微網片平面以外的部位的細胞，也就是位於微網片平面之上或是下方平面的細胞，其取向也與微網片平面中的細胞的取向方向相同。細胞層片之厚度為約50μm(圖14當中的1421)。此外，從Tig-1-20細胞層片之上追加播種源自人體iPS細胞的心肌細胞，結果得到心肌細胞的取向也與Tig-1-20細胞為相同方向。由此等結果中顯示出，可透過使用微網片來培養細胞，來控制三維細胞層片的取向性(圖14當中的1422及1423)。
[實施例5：使用變形例2之細胞層片製造裝置來培養Tig-1-20細胞] ＜方法＞ ＜支撐體單元10B之製作及細胞培養條件＞ 使用3D印表機AGILISTA-3200來製作環狀組件1及基座3。並且，使用聚對二甲苯(DPXC, CAS No.28804-46-8)來塗覆所製作的環狀組件1及基座3。網片2係使用聚酯製的微網片(AG00Z3N9)(天池合纖公司)。用環狀組件1與基座3夾持網片2，並使用PDMS溶液將其黏合。對完成好的支撐體單元10B進行乙醇處理及UV處理之後，將支撐體單元10B放進10cm的皿盤22中。在實驗中所使用的支撐體單元10B當中，使用1mm的PDMS板來將皿盤22之底面至網片2之間的距離調節為2.5mm(圖15中的1510)。
Tig-1-20細胞的培養條件(培養基之組成)係與實施例1相同，惟並未塗覆網片2。
＜Tig-1-20細胞之播種及顯微鏡觀察＞ 首先，將3mL的Tig-1-20細胞(6×105 細胞/mL)放置於網片2之上。之後，從上方放置蓋體9。接著，從蓋體9之注入口9i加入5mL的細胞懸浮液，用細胞懸浮液填充蓋體9與網片2之間的間隙。於播種細胞的3天之後，將25mL的培養基加入至內有支撐體單元10B的10cm的皿盤22中之後，去除蓋體9。每3天更換一次培養基(35mL培養基/皿盤)，於播種細胞起的14天後完成培養。
如圖15當中的1511所示般，使用刀子從支撐體單元10B上切下細胞層片。用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS, Phosphate buffered saline)(－)來清洗所切下的細胞層片之一部分之後，以4%的PFA進行20分鐘的處理，並且以DiI進行染色(37℃，1小時)。以PBS(－)清洗之後，將細胞層片連同含有DAPI的封固劑VECTASHIELD(偉特公司)固定於蓋玻片與載玻片之間。用共軛焦顯微鏡LSM 800(ZEISS)來解析所固定的細胞層片。
使用PBS(－)來清洗由支撐體單元10B所製作的細胞層片之一部分之後，用4%的PFA進行20分鐘處理以使其固定。接著，分別用50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 約100%的乙醇進行5分鐘處理，然後風乾。然後，使用低真空掃描電子顯微鏡Miniscope TM3030 Plus(日立)來觀察細胞層片。
檢查在支撐體單元10B中所培養的構成細胞層片的細胞的生存率。使用PBS(－)來清洗從支撐體單元10B上所切下的細胞層片的大約一半份量，用0.05%的胰蛋白酶-EDTA進行7分鐘的處理(37℃)，以去除胰蛋白酶，之後，使其懸浮於培養基10mL中。使用Countess II Automated細胞計量器(賽默飛世爾科技公司)來測量細胞的生存率。
＜結果＞ 將結果表示於圖15當中的1512、圖16當中的1611、1612以及圖17當中的1711、1712。使用支撐體單元10B培養14天Tig-1-20細胞(圖15中的1512)。用共軛焦顯微鏡來解析細胞層片之截面，結果得到厚度為約40-45μm(圖16中的1611及1612)。Tig-1-20細胞係隨著網片2的開口形狀取向。也就是說，其取向係幾乎平行於長方形開口的長邊。並不位於網片2之平面中的細胞的取向亦為相同方向。
用乙醇來處理細胞層片，以便用電子顯微鏡觀察細胞層片。確認到雖然此處理可能會導致細胞層片收縮變薄，但是細胞卻無間隙地填補了網片2之開口部(圖17當中的1711)。使用胰蛋白酶-EDTA溶液及台盼藍(Trypan blue)溶液來檢查支撐體單元10B中所製作的構成三維細胞層片之細胞的生存率，結果得到約92%的細胞生存(參照圖17當中的1712)。也就是說，在三維培養當中仍有許多細胞生存。
[實施例6：使用構成例4之細胞層片製造裝置來培養HepG2細胞] ＜方法＞ ＜支撐體單元50之製作＞ 使用3D印表機AGILISTA-3200來製作支撐體單元50之管柱本體51。並且，使用聚對二甲苯(DPXC, CAS No.28804-46-8)來塗覆所製作的管柱本體51。網片2係使用聚酯製的微網片(AG00Z3N9)(天池合纖公司)。使用PDMS溶液來將網片2黏合至管柱本體51。對完成的支撐體單元50進行乙醇處理並且風乾之後，放進井板25(12孔板)的井25a進行UV處理。
＜細胞培養條件＞ 由理化學研究所生物資源中心(RIKEN BRC)取得HepG2細胞(產品編號RCB1886)。使用含有10%牛胎血清(FBS)(GIBCO公司)、100單位/mL的青黴素、100μg/mL的鏈黴素(GIBCO公司)的DMEM(達爾柏克改良伊格爾培養基)(GIBCO公司)，來培養HepG2細胞。於37℃，5%二氧化碳(CO2)條件下的培養箱中培養細胞。
＜細胞播種及細胞觀察＞ 將1×105 個(2×106 細胞/mL×50uL/網目)的HepG2細胞播種至支撐體單元50之網片2(φ4mm圓)上。於播種細胞6小時之後，加入2mL的培養基至井25a中。每2天更換一次培養基(2mL/井)。作為對照，將1×105 個HepG2細胞播種至井板25(12孔板)之井25a中。
＜基因表現解析＞ 從開始培養的第10天，從HepG2細胞提取RNA。使用TRIzol RNA分離試劑(賽默飛世爾科技公司)來提取RNA，並使用所提取的RNA以及ReverTra Ace qPCR RT試劑盒(東洋紡公司)來合成cDNA。使用所獲得的cDNA樣品、DNA引子、PowerUp SYBR Green Master 預混液(應用生物系統公司)，以及QuantStudio 5 Real-Time PCR 系統(應用生物系統公司)，來進行基因表現解析。針對作為人體肝臟的成熟標記而為人所知的白蛋白(albumin)及藥物代謝酶CYP1A2，進行了基因表現等級的解析。使用作為管家基因(housekeeping gene)而為人所知的18SrRNA的表現等級來對各個基因的表現等級進行標準化。其值為平均±SE(N=3)。
＜結果＞ 將HepG2細胞的顯微鏡圖像表示於圖18當中的1810。HepG2細胞於6小時之內黏附至網片2。將基因表現解析之結果表示於圖18當中的1811。與在正常的井(2D)上培養HepG2細胞時相比，於支撐體單元50之網片2(網目)上培養時的白蛋白及藥物代謝酶CYP1A2的基因表現量較高。
[實施例7：使用構成例4之細胞層片製造裝置來培養源自人體iPS細胞的心肌細胞] ＜方法＞ ＜細胞培養條件＞ 使用MiraCell CM培養基，根據產品說明書於37℃，存在5%二氧化碳(CO2 )情況下培養源自人體iPS細胞的心肌細胞(MiraCell Cardiomyocytes from ChiPSC12，寶生物公司)。於塗覆有人纖連蛋白的皿盤上進行培養。
＜細胞播種及細胞觀察＞ 於播種細胞之前，用人纖連蛋白塗覆支撐體單元50之網片2。用PBS(＋)來調整經稀釋20倍的纖連蛋白溶液(最終濃度0.05mg/mL)。將50μL的已稀釋纖連蛋白溶液放置於網片2之上，於37℃下靜置1小時以上。
去除纖連蛋白溶液，並將2×104 個(4×105 細胞/mL×50μL/網目)的心肌細胞，播種至支撐體單元50之網片2上(φ4mm的圓)。於6小時之後，加入2mL的培養基至井25a中，以培養心肌細胞。每2天更換一次培養基(2mL/井)。
＜結果＞ 將結果表示於圖19。確認到心肌細胞附著於支撐體單元50之網片2上並且增殖。即使培養了8天，心肌細胞仍保持其搏動能力。
[產業利用性] 本發明可利用於製作再生醫療或移殖等中所使用的細胞層片。
1:環狀組件 2:網片 2a:表面 2b:表面 3:基座(保持組件) 3a:基座主體 3b:筒狀承載部 3c:底面抵接部 3d:側壁抵接部 3e:底面抵接部 3f:側壁抵接部 4:細胞 4a:細胞 4b:細胞 5:移液器 6:培養基 7:顯微鏡 8:鑷子 9:蓋體 9a:第一層 9b:第二層 9i:注入口 10:支撐體單元 10a:底筒部 10A:支撐體單元 10B:支撐體單元 11:(死掉的)角質細胞 12:緊密連接 13:角質細胞 14:皮膚纖維芽細胞 20:容器 21:井(容器) 22:皿盤(容器) 23:容器 24:井 25:井板(容器) 25a:井 26:井板(容器) 30:支撐體單元 31:框架體 32:框架體 33:夾子(夾持組件) 34:保持組件 34a:安裝部 34b:平板部 34c:平板部 34d:凸邊 35:墊片 35a:提紐 40:支撐體單元 41:管柱本體 50:支撐體單元 51:管柱本體 51a:第一圓環部 51b:足部 51c:第二圓環部 60:支撐體單元 65:按壓銷 66:貫穿孔 67:鎖定部 100:細胞層片製造裝置 100A～100E:細胞層片製造裝置 200:細胞層片 1010,1011,1020～1023,1030,1040:圖 1210,1211,1212:圖 1310,1311:圖 1410,1420～1423:圖 1510～1512:圖 1611,1612:圖 1711,1712:圖 1810,1811:圖 2010,2011,2020～2022,2030～2032:圖 3010,3020～3024,3030:圖 4010,4020～4022:圖 6010～6013,6020:圖 7010～7022,7030,7031:圖 8010,8020:圖 9010,9011:圖 20010,20011:圖 A:網件集合體
［圖1］係為構成例1的細胞層片製造裝置的概略構成的示意圖。 ［圖2］係為用於說明圖1所示的細胞層片製造裝置之功效的圖。 ［圖3］係為用於表示變形例1的細胞層片製造裝置之構成的圖。 ［圖4］係為用於表示變形例2的細胞層片製造裝置之構成的圖。 ［圖5］係為使用本發明一實施型態之細胞層片製造裝置所製作的皮膚片的截面結構的示意圖。 ［圖6］係為表示構成例2的細胞層片製造裝置中所具備的支撐體單元的示意構成圖。 ［圖7］係為表示構成例2的細胞層片製造裝置的示意構成圖。 ［圖8］係為表示構成例3的細胞層片製造裝置的示意構成圖。 ［圖9］係為表示構成例4的細胞層片製造裝置的示意構成圖。 ［圖10］係為表示實施例1之結果的圖。 ［圖11］係為表示實施例1之結果的圖。 ［圖12］係為表示實施例2之結果的圖。 ［圖13］係為表示實施例3之結果的圖。 ［圖14］係為表示實施例4之結果的圖。 ［圖15］係為表示實施例5之結果的圖。 ［圖16］係為表示實施例5之結果的圖。 ［圖17］係為表示實施例5之結果的圖。 ［圖18］係為表示實施例6之結果的圖。 ［圖19］係為表示實施例7之結果的圖。 ［圖20］係為表示變形例3的細胞層片製造裝置之構成的圖。 ［圖21］係為用於說明變形例3的細胞層片製造裝置之功效的圖。
1:環狀組件
2:網片
3:基座(保持組件)
3a:基座主體
3b:筒狀承載部
3c:底面接觸部
3d:側壁抵接部
4:細胞
5:移液器
6:培養基
10:支撐體單元
10a:底筒部
20:容器
21:井(容器)
100:細胞層片製造裝置
200:細胞層片
1010,1020~1023,1030,1040:圖

Claims (9)

  1. 一種細胞層片製造裝置，其特徵為具有： 容器，其係提供容置用於培養細胞的培養基； 支撐體單元，其具有網片及保持組件，且以可分離方式容置於所述容器中，且所述網片係為使所述細胞附著並予以培養的基材，所述保持組件將所述網片保持為懸浮於所述容器之底面， 所述支撐體單元係以在所述培養基中垂直方向及水平方向的位置固定的方式容置於所述容器中。
  2. 如請求項1所述之細胞層片製造裝置，其中，所述保持組件係以可移除方式來保持所述網片。
  3. 如請求項2所述之細胞層片製造裝置，其中，所述保持組件當中形成有用於承載所述網片的筒狀承載部， 所述支撐體單元具有環狀組件，所述環狀組件係為圍繞所述筒狀承載部之外周的形狀，且以可移除方式設置於所述保持組件上，且 所述網片之周緣係被所述筒狀承載部及所述環狀組件所夾持。
  4. 如請求項3所述之細胞層片製造裝置，其中，所述保持組件及所述環狀組件中的至少其中一者當中係形成有鎖定部，所述鎖定部係將所述保持組件與所述環狀組件鎖定以使其彼此不分離， 所述保持組件及所述環狀組件兩者中的其中一者當中形成有貫穿孔，所述貫穿孔係供用來按壓該兩者中另一者的按壓銷將其貫穿， 藉由對該兩者中另一者的按壓使得所述鎖定解除，且使得所述保持組件與所述環狀組件彼此分離。
  5. 如請求項2所述之細胞層片製造裝置，其中，所述支撐體單元係具有： 一對框架體，其係以可移除方式設置於所述保持組件上，且配置為夾住所述網片之周緣；及 夾持組件，其透過夾持所述一對框架體而使所述網片與所述一對框架體一體化。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之細胞層片製造裝置，其中，所述保持組件的比重係大於所述培養基。
  7. 如請求項1至5中任一項所述之細胞層片製造裝置，其中，所述支撐體單元具有蓋體，所述蓋體係覆蓋所述網片的其中一邊的表面，且所述蓋體當中設置有注入口，所述注入口係用於將包含所述細胞的懸浮液注入至所述網片與所述蓋體之間，且 所述蓋體與所述網片之間的間隔係設定為使得所述懸浮液一邊與所述網片及所述蓋體兩者接觸，一邊被注入至所述網片與所述蓋體之間。
  8. 如請求項1至5中任一項所述之細胞層片製造裝置，其中，所述網片之開口部具有沿著一個方向延伸的形狀。
  9. 一種細胞層片，其特徵在於具有至少兩個細胞層，且於所述兩個細胞層之間配置有網片，所述網片係為使細胞附著並予以培養的基材。
TW109135703A 2019-10-16 2020-10-15 細胞層片製造裝置及細胞層片 TW202128977A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-189611 2019-10-16
JP2019189611 2019-10-16
JP2020-010229 2020-01-24
JP2020010229 2020-01-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202128977A true TW202128977A (zh) 2021-08-01

Family

ID=75538235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109135703A TW202128977A (zh) 2019-10-16 2020-10-15 細胞層片製造裝置及細胞層片

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220372419A1 (zh)
EP (1) EP4047079A4 (zh)
JP (2) JP7304022B2 (zh)
CN (1) CN114599776A (zh)
TW (1) TW202128977A (zh)
WO (1) WO2021075502A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT201700004017A1 (it) * 2017-01-16 2018-07-16 React4Life Srl Bioreattore e metodo di utilizzo di detto bioreattore
WO2023210609A1 (ja) * 2022-04-27 2023-11-02 ファーマバイオ株式会社 細胞シート作製方法
WO2024025983A1 (en) * 2022-07-27 2024-02-01 Lung Biotechnology Pbc Transwell for cell culture, method of manufacturing with synthetic bioink and in vitro tissue models

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01174373A (ja) * 1987-12-28 1989-07-10 Aderansu:Kk シャーレ、シャーレシステム及びこれを用いた細胞培養装置並びに培養方法
DE3923279A1 (de) * 1989-07-14 1990-01-18 Will W Prof Dr Minuth Minusheets ist ein neues produkt, um zellen in beliebigen behaeltnissen in hochdifferenzierter form auf einer moeglichst natuerlichen unterlage zu kultivieren
KR100595940B1 (ko) * 2004-06-11 2006-07-05 주식회사 바이오랜드 세포 배양용 막의 지지 장치
US20080076170A1 (en) * 2006-09-27 2008-03-27 Tuija Annala Cell culture insert and cell culture vessel
JP5885109B2 (ja) * 2010-09-10 2016-03-15 国立大学法人 筑波大学 培養方法及び培養装置
WO2013176106A1 (ja) * 2012-05-24 2013-11-28 Ｙｓｅｃ株式会社 細胞シート搬送用容器
WO2015005349A1 (ja) 2013-07-09 2015-01-15 国立大学法人東京大学 細胞培養支持体、細胞培養装置、細胞培養キット、及び細胞シート
WO2016209089A1 (en) * 2015-06-25 2016-12-29 Peter Roderick Dunbar Tissue culture apparatus and method
US11447752B2 (en) * 2016-04-15 2022-09-20 Yamaguchi University In vitro model for blood-brain barrier and method for producing in vitro model for blood-brain barrier
CN109415692A (zh) * 2016-06-24 2019-03-01 株式会社资生堂 三维培养皮肤片、用于其制造的细胞培养容器和该三维培养皮肤片的制造方法
JP7101377B2 (ja) 2017-09-15 2022-07-15 株式会社日立製作所 細胞培養基材、細胞培養容器、及び細胞培養方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4047079A4 (en) 2023-11-22
JP7304022B2 (ja) 2023-07-06
CN114599776A (zh) 2022-06-07
JP2023116717A (ja) 2023-08-22
US20220372419A1 (en) 2022-11-24
WO2021075502A1 (ja) 2021-04-22
EP4047079A1 (en) 2022-08-24
JPWO2021075502A1 (zh) 2021-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3515600B1 (en) Organoid arrays
Pasman et al. Flat and microstructured polymeric membranes in organs-on-chips
Liu et al. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development
TW202128977A (zh) 細胞層片製造裝置及細胞層片
Gupta et al. Lab-on-a-chip devices as an emerging platform for stem cell biology
Pampaloni et al. Three-dimensional tissue models for drug discovery and toxicology
US20060141617A1 (en) Multilayered microcultures
US11384328B2 (en) Cartridge-based system for long term culture of cell clusters
WO2006046490A1 (ja) 細胞組織体マイクロチップ及び細胞組織体の形成方法
JP2011172533A (ja) マイクロ空間構造体を用いた高密度三次元細胞培養法
JP2016093149A (ja) 細胞培養装置および細胞培養方法
JP6690001B2 (ja) 細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム
US20140065659A1 (en) Culture method, group of mature adipocytes, drug screening method
Wang et al. Microfluidic engineering of neural stem cell niches for fate determination
WO2017222065A1 (ja) 三次元培養皮膚シート、その製造に使用するための細胞培養容器及びその製造方法
US20160369221A1 (en) Fluidic device and perfusion system for in vitro complex living tissue reconstruction
JP2010233456A (ja) 細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法
JPWO2021075502A5 (zh)
JP6382938B2 (ja) 細胞培養治具およびこの細胞培養治具を用いた細胞培養方法
KR20160034540A (ko) 3차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 세포 배양 방법
US20210054319A1 (en) Flow bioreactor device for monitoring cellular dynamics
CA2372219A1 (en) Modular cell support systems for the three-dimensional cell growth
Mancinelli et al. Recreating cellular barriers in human microphysiological systems in-vitro
BABA et al. Combined automated culture system for tubular structure assembly and maturation for vascular tissue engineering
Hori et al. Three-dimensional cell sheet construction method with a polyester micromesh sheet