KR100595940B1 - 세포 배양용 막의 지지 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 배양용 막의 지지 장치에 관한 것으로, 중앙에 관통홀, 일면에 둘레를 따라 형성된 돌출부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제1부재; 및 중앙에 관통홀, 일면에 상기 제1부재의 돌출부를 수용하기 위한 수용부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제2부재를 포함하며, 제1부재의 돌출부와 제2부재의 수용부는 그 사이에 세포배양용 막을 고정시킬 수 있도록 맞물리는, 세포배양용 막의 지지 장치를 제공한다. 본 발명에 따른 지지 장치를 이용함으로써 별도의 체결수단없이 막을 지지할 수 있을 뿐만 아니라, 막의 위, 아래 양면에서 모두 목적하는 세포의 배양이 가능하며, 막에 부착된 세포의 기액계면배양시 교반 동적 배양이 가능하여 조직 재구성 기간을 단축시킬 수 있다.

Description

세포 배양용 막의 지지 장치{DEVICE FOR HOLDING A MEMBRANE USED IN CULTURING CELLS}

도 1a 내지 도 1e는 본 발명의 제1태양에 따른 세포배양용 막의 지지 장치에 대한 사시도(도 1a), 측면 분리도(도 1b), 평면도(도 1c), 측면 결합도(도 1d) 및 설계도(도 1e)를 나타낸 것이다.

도 1f 내지 도 1h는 본 발명의 제2태양에 따른 세포배양용 막의 지지 장치에 대한 사시도(도 1f), 측면 분리도(도 1g) 및 설계도(도 1h)를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 제1태양에 따라 링형으로 제조된 지지 장치에 대한 사진(A)으로, 지지 장치에 의해 고정되는 막이 동결건조 양막인 경우(B)와 냉동보존 양막인 경우(C)를 각각 예로 들어 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피 세포를 배양한 후 이를 헤마톡실린/에오신(H/E)으로 염색한 사진을 나타낸 것이다.

A: 동결건조 양막 위에서 기액계면 배양을 3일 수행

B: 동결건조 양막 위에서 기액계면 배양을 6일 수행

C: 냉동보존 양막 위에서 기액계면 배양을 6일 수행

D: 실제 토끼 각막의 상피층

도 4는 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피 세포를 배양한 후 이를 각막 상피세포 분화 특이 단백질인 AE 5로 면역조직화학 염색한 사진을 나타낸 것이다.

A: 동결건조 양막 위에서 기액계면 배양을 3일 수행

B: 동결건조 양막 위에서 기액계면 배양을 6일 수행

C: 냉동보존 양막 위에서 기액계면 배양을 6일 수행

D: 실제 토끼 각막의 상피층

도 5는 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피 세포를 배양한 후 이를 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)로 면역조직화학 염색한 사진을 나타낸 것이다.

A: 동결건조 양막 위에서 기액계면 배양을 3일 수행

B: 동결건조 양막 위에서 기액계면 배양을 6일 수행

C: 냉동보존 양막 위에서 기액계면 배양을 6일 수행

D: 실제 토끼 각막의 상피층

도 6은 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피 세포를 배양한 후 투과전자 현미경(TEM)으로 관찰한 사진이다.

A: 냉동보존 양막 위에서 배양한 각막 상피층의 TEM 사진(기저층)

B: 냉동보존 양막 위에서 배양한 각막 상피층의 TEM 사진(헤미데스모좀)

C: 냉동보존 양막 위에서 배양한 각막 상피층의 TEM 사진(데스모좀)

D: 동결건조 양막 위에서 배양한 각막 상피층의 TEM 사진(기저층)

E: 동결건조 양막 위에서 배양한 각막 상피층의 TEM 사진(헤미데스모좀)

F: 동결건조 양막 위에서 배양한 각막 상피층의 TEM 사진(데스모좀)

도 7은 본 발명에 따른 장치를 이용한 유동배양 방법의 모식도이다.

도 8은 유동배양 방법을 이용하여 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피 세포를 배양한 후 H/E으로 염색한 사진을 나타낸 것이다.

A: 9일동안 정치배양으로 기액계면 배양한 사진

B: 9일동안 유동배양으로 기액계면 배양한 사진

C: 해동한 세포를 이용하여 6일동안 정치배양으로 기액계면 배양한 사진

D: 해동한 세포를 이용하여 6일동안 유동배양으로 기액계면 배양한 사진

도 9는 유동배양 방법을 이용하여 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피 세포를 배양한 후 AE 5로 면역조직화학 염색한 사진을 나타낸 것이다.

A: 6일동안 유동배양으로 기액계면 배양한 사진

B: 9일동안 유동배양으로 기액계면 배양한 사진

도 10은 유동배양 방법을 이용하여 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피 세포를 배양한 후 PCNA로 면역조직화학 염색한 사진을 나타낸 것이다.

A: 6일동안 유동배양으로 기액계면 배양한 사진

B: 9일동안 유동배양으로 기액계면 배양한 사진

도 11은 본 발명의 제1태양에 따른 장치를 이용하여 양막의 간질면에 각막 섬유모세포를 단층으로 배양하고 상피면에는 각막 상피 세포를 배양한 후 H/E으로 염색한 사진을 나타낸 것이다.

A: 정치배양으로 배양한 사진

B: 유동배양으로 배양한 사진

도 12는 본 발명의 제1태양에 따른 장치를 이용하여 양막의 간질면에 각막 섬유모세포를 단층으로 배양하고 상피면에는 각막 상피 세포를 배양한 후의 사진을 나타낸 것으로, 배양 후의 디지털 사진(A) 및 제1부재 및 제2부재를 제거한 후의 사진(B)을 나타낸 것이다.

도 13은 본 발명의 제1태양에 따른 장치를 이용하여 양막의 간질면에 각막 섬유모세포를 단층으로 배양하고 상피면에는 각막 상피 세포를 배양한 후 TEM으로 관찰한 사진이다.

A: 정치배양으로 배양한 사진

B: 유동배양으로 배양한 사진

도 14는 본 발명의 제1태양에 따른 장치에 고정된 콜라젠막 위에서 피부 표피 세포를 배양한 후 이를 H/E로 염색한 사진을 나타낸 것이다.

도 15는 본 발명의 제2태양에 따른 장치에 고정된 양막 위에서 각막 상피층을 배양한 후 이를 H/E로 염색한 사진을 나타낸 것이다.

본 발명은 세포 배양용 막의 지지 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 배양용 막을 지지하기 위한 별도의 체결수단없이 막의 위, 아래 양면에서 모두 목적하는 세포의 배양이 가능할 뿐만 아니라, 막에 부착된 세포의 기액계면 배양시 교반 동적 배양이 가능한 세포배양용 막의 지지 장치에 관한 것이다.

과학의 발달과 더불어 의학도 비약적으로 발전하여 이제는 거의 모든 장기를 이식할 수 있는 수준에까지 이르렀다. 그러나 이런 장기이식의 발달이 인류의 건강증진에는 매우 중요한 역할을 하였으나, 장기이식 수술의 기술적인 어려움, 고비용 및 면역 억제제의 사용에 따른 부작용 등이 한계로 나타났다. 이러한 상황에서, 일부 과학자들은 인공적으로 생체조직 또는 장기를 만들어 이식하는 방법에 대한 연구를 수행하게 되었고, 그 결과 조직공학(tissue engineering)이라는 새로운 분야가 탄생하게 되었다.

조직공학은 세포를 생체적합성(biocompatibility) 기질에 3차원적으로 배양하여 세포-기질 복합체를 제조하고 이를 이용하여 생체조직 및 장기를 재생하는 분야에 관한 학문으로서, 세포공학기술과 생체재료기술이 접목되어 인공조직 및 장기 개발, 유전자 및 세포치료 분야 등에 적용되고 있다. 보다 구체적으로, 뼈와 연골, 근육, 피부, 간, 신장, 심장, 판막 등의 인공 장기 개발 및 조직공학적 재생을 통한 교체, 혈관구성세포와 생분해성 폴리머를 이용해 만든 인공 혈관 개발 및 투명한 생체 재료에 각막상피세포를 이식하여 만든 인공 각막 등의 제조에 위 조직공 학기술이 적용될 수 있다.

이러한 조직공학기술을 이용한 생체조직 및 장기재생을 위해서는, 먼저 생체적합성 막(biocompatible membrane) 또는 바닥막 위에서 세포를 배양하는 것이 필요하고, 이렇게 막에 세포를 배양하기 위해서는 막을 지지해 주는 기구 또는 장치가 필요하게 된다.

상기 막의 구체적인 예로 양막(amniotic membrane)이 사용될 수 있다. 양막은 태아막 중 가장 안쪽에 있는 막으로 모체 쪽으로부터의 각종 감염 및 면역반응 등으로부터 태아를 보호하는 중요한 장벽 역할을 하며, 두터운 바닥막과 무혈관성 간질로 이루어져 있다(Jerzy et al., Ann. of Trans., 4:85-90 (1999); Nancy et al., Aorn Jour., 39:894-899 (1984)). 이러한 양막은 현재 화상 환자의 드레싱과 이식 후 커버에 사용되었을 뿐만 아니라, 신경관, 기도, 점막 조직 재구성(reconstruction)의 지지체로 사용되기도 하였다. 특히, 양막은 1993년 김과 쳉에 의해 윤부결핍 가토의 재건술(Kim et al., Cornea, 14:473-484 (1995))에 사용된 이래 안과 분야에서 많은 임상 연구결과가 발표되고 있을 뿐만 아니라 각막 상피조직의 재구성에 사용되었다. 또한, 심각한 눈 표면의 이상을 가지고 있는 모델 또는 환자에게 양막을 각막 상피 세포의 자가이식을 위한 기질로 사용하여 이식한 경우도 있다(Koizumi et al., Cornea, 19:65-71 (2000); Tsai et al., The New Eng. Jour. of Med., 343:86-93 (2000)).

한편, 상기 양막을 지지하기 위한 기구와 관련하여 노구치 등의 문헌(Noguchi et al., Biochem. and Biophy. res. com., 210:302-309 (1995))은 양 막을 2개의 동심원의 폴리카보네이트 링으로 이루어진 상부 링과 하부 링 사이에 고정시켜, 기도 상피 세포를 양막의 상피면에 접종하여 단층으로 배양, 분화시키기 위한 조직 지지 장치(tissue holding device)를 개시하였고, 미국특허 제 4,446,234호는 천연 장벽 조직(natural barrier tissue)과의 세포 상호 작용을 평가하기 위한 in vitro 어세이 방법에서 포유류 태반에서 유래한 양막이 기질 조직으로 사용될 수 있음을 밝히면서, 양막을 상부 링과 하부 링의 사이에 볼트와 같은 체결수단을 이용하여 고정시킨 것을 일예로 제시하고 있다.

또한, 기존의 양막 위에서의 각막 상피 세포를 배양하는 실험과 연구방법에서는 컬쳐 플레이트 인서트(culture plate insert; Corning Inc., Corning, NY) 또는 트랜스웰 인서트(Transwell™ insert)와 같은 기구를 이용하였는데, 이러한 상업용 기구는 세포배양 전에 양막을 봉합하고 이식하기 전에 봉합사를 제거해야 하는 불편함이 있었고, 양막의 윗면에만 배양할 수 있어 각막의 세 가지 세포 중 한 가지 세포밖에 배양하지 못하는 단점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 양막 봉합 과정의 불편함과 이식시 봉합사를 제거하는 불편함을 해소하고, 막의 위, 아래 양면에서 모두 목적하는 세포의 배양이 가능할 뿐만 아니라, 막에 부착된 세포의 기액계면 배양시 교반 동적 배양이 가능한 세포배양용 막의 지지 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포배양용 막의 지지 장치를 이용하여 막에서 목적하는 세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중앙에 관통홀, 일면에 둘레를 따라 형성된 돌출부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제1부재; 및 중앙에 관통홀, 일면에 상기 제1부재의 돌출부를 수용하기 위한 수용부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제2부재를 포함하며, 제1부재의 돌출부와 제2부재의 수용부는 그 사이에 세포배양용 막을 고정시킬 수 있도록 맞물리는, 세포배양용 막의 지지 장치를 제공한다.

본 발명에서 사용한 "재구성"이란 표현은 체외에서 실제 조직과 유사한 형태로 인공조직을 만드는 것을 의미한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 조직공학을 이용한 인공장기의 제조에 있어 실제 조직을 구성하는 세포를 막(membrane) 위에서 배양할 때 상기 막을 지지해주는 역할을 하는 장치를 제공하는데 특징이 있다.

구체적으로, 본 발명은 중앙에 관통홀, 일면에 둘레를 따라 형성된 돌출부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제1부재; 및 중앙에 관통홀, 일면에 상기 제1부재의 돌출부를 수용하기 위한 수용부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제2 부재를 포함하며, 제1부재의 돌출부와 제2부재의 수용부는 그 사이에 세포배양용 막을 고정시킬 수 있도록 맞물리는, 세포배양용 막의 지지 장치를 제공한다.

도 1a 내지 도 1e에는 본 발명의 제1태양에 따른 세포배양용 막의 지지 장치에 대한 사시도(도 1a), 측면 분리도(도 1b), 평면도(도 1c), 측면 결합도(도 1d) 및 설계도(도 1e)가 도시되어 있으며, 본 발명의 제1태양에 따라 링형으로 제조된 세포배양용 막의 지지 장치에 대한 사진이 도 2에 도시되어 있다. 이하, 첨부된 도면을 참고하여 설명한다.

상기 제1부재(15) 및 제2부재(16)의 일면에 형성된 레그(leg)(13)는, 제1부재(15)의 돌출부(12)와 제2부재(16)의 수용부(14) 사이에 세포배양용 막을 놓고 맞물리도록 결합하여 막이 지지된 장치를 제조하고, 상기 막이 지지되어 있는 장치를 세포배양배지에 넣어 막에서 세포를 배양할 때, 세포배양배지의 바닥과 막 사이에 공간을 제공하여 줌으로써 기액계면 배양(air liquid interface culture)을 가능하게 하는 역할을 한다.

기액계면 배양은 래프트 컬쳐(raft culture)라고도 하며, 배양하고자 하는 세포가 부착된 막의 아랫면으로는 배지가, 윗면으로는 공기가 접하도록 하여 배양하는 것을 의미한다. 이렇게 기액계면 배양을 하면 밑에서의 영양공급과 위로의 공기와의 접촉으로 실제 조직(예컨대, 피부의 표피세포)의 환경상태와 유사한 상태에서 분화를 유도할 수 있는 장점이 있다.

상기 레그(13)는 배지의 유동성을 고려하여 적정한 수를 갖도록 제조될 수 있으며, 상기 지지 장치의 배지상에서의 균형 유지를 위하여 3개 이상을 구비하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 레그(13)는 세포배양 용기의 높이, 세포배양 용기 내의 배지의 양 및 배지 교체 시기 등을 감안하여 다양한 높이를 갖도록 제조될 수 있다. 레그가 높을수록 배지교체를 자주 하지 않아도 된다는 장점이 있으나, 너무 높으면 배지가 너무 많이 소요되는 단점이 있고, 레그가 너무 낮으면 지지 장치 안팎의 배지의 유동이 적절치 않아 배양이 제대로 되지 않는 단점이 있다. 구체적으로, 상기 레그는 1mm 내지 5mm, 보다 바람직하게는 2mm 내지 4mm의 높이를 갖도록 제조되는 것이 바람직하다.

상기 제1부재(15)의 돌출부(12)의 돌출길이는 상기 제2부재(16)의 수용부(14)의 수용깊이와 동일하며, 제1부재(15)의 돌출부(12)와 제2부재(16)의 수용부(14) 사이에 세포배양용 막을 놓고 양쪽에서 힘을 가하여 돌출부(12)를 수용부(14)에 밀어넣어 조립하면 돌출부(12)와 수용부(14)가 맞물리면서 막을 고정시켜 지지하게 된다. 상기 수용부(14)는 요입홈의 형태인 것이 바람직하며, 돌출부(12)의 형상에 따라 다양한 형상으로 제조될 수 있다.

한편, 상기 장치의 제1부재(15) 및 제2부재(16)는 세포가 배양될 막의 형태 및 배양한 세포를 이식할 부위의 형태 등을 고려하여 중앙에 관통홀(11)을 갖는 원형 또는 삼각형, 사각형 등의 다각형 형태로 제조될 수 있으나, 양막을 고정하여 당기는 힘이 모든 방향에서 일정한 원형의 링형(ring type) 부재로 제조되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제1부재(15) 및 제2부재(16)의 재질로는 생체적합성이 우수하고, 유동배양시 배지에 뜨지 않을 정도의 비중을 갖는 고분자 물질인 것이 바람직한데, 구체적으로, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 상표명: 테프론), 폴리에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리아트릴로니트릴(PAN), 대크론(Dacron) 및 실리콘 등을 사용하는 것이 바람직하고, 테프론을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 세포배양용 막의 지지 장치는 배양하고자 하는 조직의 크기 및 배양기의 크기에 따라 임의로 크기를 조절하여 제조될 수 있으나, 조직의 크기 및 막을 팽팽하게 지지해 줄 수 있는 정도 등을 고려하여 링형으로 제조하는 경우에는 직경이 10mm 내지 150mm 가 되도록 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 지지 장치에 고정될 수 있는 막으로는 일반적으로 조직공학 기술분야에서 세포배양용 막으로 사용될 수 있는 것이면 특별한 제한없이 사용될 수 있으나, 양막을 사용하는 것이 가장 바람직하고, 양막 이외에도 분해성 인공기질로 천연재료인 콜라젠막, 젤라틴막, 키틴막, 키토산막, 알지네이트막, 하이루론산막과 그 유도체들을 이용하여 제조한 막이 이용될 수 있으며, 합성기질로 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))막, PGA(polyglycolic acid)막, PLA(poly(lactic acid))막 등이 이용될 수 있다. 상기 막은 치료를 위해서 배양된 세포로 이루어진 조직을 이식한 후 제거해야 하는 번거로움을 고려하면 생체 흡수 재료를 이용하는 것이 바람직하며, 특히, 분해 생성물이 염증 반응을 일으키지 않는 생체 친화성이 높은 것이 바람직하다.

또한, 도 1f에 도시한 바와 같이, 상기 본 발명의 제1태양에 따른 세포배양용 막의 지지 장치에는 제1부재(15)와 제2부재(16) 사이에 중간 고리(17)가 삽입될 수 있다. 이렇게 중간 고리가 삽입된 본 발명의 제2태양에 따른 세포배양용 막의 지지 장치는, 특히, 눈깜빡임으로 인해 건조상태(눈을 뜨고 있는 경우)와 습윤상태(눈을 감고 있는 경우)에 반복적으로 노출되어 있는 각막 세포를 배양하여 각막을 재구성하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1g는 본 발명의 제2태양에 따른 장치의 측면 분리도로서 제1부재(15)와 제2부재(16) 사이에 중간 고리(17)가 삽입될 때, 세포배양용 막이 어디에 위치하여야 하는가를 보여주고 있고, 도 1h에는 본 발명의 제2태양에 따른 세포배양용 막의 지지 장치를 제조할 수 있는 설계도가 각 부위의 크기(단위: mm)와 함께 도시되어 있다.

본 발명의 제2태양에 따른 지지 장치를 이용한 구체적인 각막 세포 배양방법은 다음과 같다. 먼저, 양막의 상피면 위에 각막 상피 세포를 접종하고 액침 배양한 후, 제2부재(16)를 제거한다. 제2부재(16)를 제거하더라도 중간 고리(17)와 제1부재(15)에 의해 양막이 여전히 고정된 상태로 존재하게 되고, 제1부재(15)의 레그(13)가 바닥으로 향하도록 놓으면 양막 주위에 양막의 표면보다 높은 벽이 존재하지 않게 된다. 이는 도 1g에서 제2부재(16)를 제거한 상태에서 중간 고리(17)와 결합된 제1부재(15)를 거꾸로 뒤집은 경우에 해당한다. 이렇게 하면, 본 발명의 제1태양에 따른 장치에서 양막 주위에 제1부재 또는 제2부재에 의한 벽이 존재하는 것과는 달리, 양막 주위에 벽이 존재하지 않게 되어 배지가 양막 표면에 보다 용이하게 접촉할 수 있게 된다. 이후, 중간 고리와 결합된 제1부재를 배양 용기의 벽면 한쪽으로 치우치게 한 후 유동배양을 한다. 유동배양을 하게 되면 양막 위의 각막 상피층이 배지에 잠겼다가 공기에 노출되었다가를 반복하게 되는데, 이같은 배양환경은 각막 상피 세포의 실제 환경과 유사하므로 보다 실제에 가까운 각막 상피층을 재구성할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 세포배양용 막의 지지 장치를 이용하여 막에서 목적하는 세포를 배양(조직을 재구성)하는 방법을 제공한다. 위의 방법을 이용함으로써, 예컨대 각막 상피층, 단층의 섬유모세포와 각막 상피층을 재구성하는 것이 가능하며, 실제 각막과 유사한 구조의 각막의 부분층 또는 전층을 재구성할 수 있다.

본 발명에 따른 지지 장치에 막을 고정시켜 피부, 각막, 점막 등의 조직을 재구성한 후 배양 조직을 이식할 경우는 막의 위, 아래의 제1부재 및 제2부재를 분리하여 재구성된 조직을 이식하면 된다.

본 발명에 따른 장치를 이용한 세포배양방법은 정치배양 뿐만 아니라, 교반 동적 배양(Tilting dynamic culture) 또는 유동 배양을 가능하게 하여 분화유도기간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 실제 조직과 유사한 기저층을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 특히, 각막과 같이 튼튼한 바닥막이 필요한 조직구성에 유리하다. 즉, 동적 배양 방법은 확산에 의한 배지 영양분을 공급하는 정치배양보다 양막 위의 세포들에게 신선한 배지 내의 영양분 공급을 원활하게하여 튼튼한 기저층과 단기간에 원하는 세포층을 얻을 수 있다는 장점이 있다.

도 7에는 본 발명에 따른 장치를 이용한 유동배양 방법의 모식도가 도시되어 있다. 도 7에서 교반 장치를 양막을 고정한 지지 장치가 움직이지 않을 정도로 느 린 속도로 움직여 주면, 양막 밑의 배지가 움직이면서 양막 위의 세포에 영양분을 원활히 공급할 수 있게 된다. 이로 인해 확산에 의하여 배지가 양막에 공급되는 기존의 정치 배양보다 원활한 배지 공급을 할 수 있다.

구체적인 유동 배양 조건은 배양하고자 하는 세포의 종류에 따라 다르지만, 지지 장치가 움직이지 않을 정도인 6 내지 10rpm 속도로 3일 내지 12일 동안 배양하는 것이 바람직하다.

나아가, 본 발명의 세포배양방법을 이용함으로써 바닥막으로 쓸 수 있는 양막이나 콜라젠막 등을 지지하여 상피세포를 배양, 분화시켜 배양이 어려운 상피세포의 독성 모델을 만들 수 있을 뿐만 아니라 실제 각막과 유사한 전층 각막을 재구성할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 장치를 이용하여 양막의 간질면(stromal side)에 단층의 각막 섬유모세포를 배양하고 양막의 상피면(epithelial side)에는 각막 상피층을 재구성하였다. 그 결과, 도 12의 B에서 보는 바와 같이, 양막 위에 각막 상피층이 잘 형성되어 있는 것을 볼 수 있었고 투명한 각막 상피층을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 지지 장치는 양막 뿐만 아니라 콜라젠막의 지지(고정)에도 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 14 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 각막세포 배양용 막의 지지 장치의 제조

각막(cornea)을 실제 조직과 유사하게 제조하는데 있어 각막세포 배양의 바닥막으로 사용되어질 양막을 지지할 수 있는 각막세포 배양용 양막 지지 장치를 제조하였다. 테프론(TEFLON™)을 재질로 하고 각막의 크기와 배양의 용이성을 고려하여 링형으로 제조하였다. 상기 지지 장치의 제1부재 및 제2부재의 안지름은 각막 직경(평균: 10mm, 전층 각막 이식의 경우는 중간의 7mm 정도의 직경의 각막을 펀칭하여 이식)을 고려하여 14mm로 하였고, 제1부재와 제2부재 사이에 양막을 고정하기 위하여 바깥지름은 22mm(중간 고리를 제1부재와 제2부재 사이에 삽입하는 경우에는 26mm)로 하였다. 상기 지지 장치를 제조할 수 있는 설계도가 각 부위의 크기(단위: mm)와 함께 도 1e 및 도 1h에 도시되어 있다. 기액계면 배양을 하기 위하여 레그를 두었으며 배지의 유동성을 위해 레그를 3개 구비하도록 하였고, 레그의 높이는 2mm로 하였다. 제1부재와 제2부재가 조립된 지지 장치는 시중에 나와 있는 배양 용기를 사용하기 위하여 높이를 9mm로 하였다.

<시험예> 각막세포 배양용 막의 지지 장치를 이용한 세포배양

<시험예 1> 양막의 준비

각막세포를 배양하기 위한 막으로 양막을 사용하였다. 양막은 혈청검사상 B형 및 C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항체, 성병조사실험(VDRL)이 모두 음성이며, 전신적인 질환이 없는 건강한 산모에서 제왕절개를 통해 얻어진 태반을 생리식염수로 세척한 후 무균적인 방법으로 분리하였다(Jerzy et al., Ann. of Trans., 4:85-90 (1999)). 분리된 양막은 0.3％ 오플록사신(ofloxacin)이 포함된 인산완충용액(PBS)으로 3-4차례 세척한 후, 니트로셀룰로스 멤브레인(NC, Osmonics, U.S.A)에 부착하였다.

<1-1> 냉동보존 양막의 준비

니트로셀룰로스 멤브레인(NC, Osmonics, U.S.A)에 부착시킨 양막을 2㎝× 2㎝로 잘라 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)과 글리세롤(Sigma, U.S.A)을 1:1로 혼합한 양막 보존 용액에 넣어 -80℃에서 보관하였다. 배양을 위하여 우선 냉동보존 양막을 재빨리 해동하였다. 해동시킨 양막을 PBS로 3회 세척한 후 0.05％ 트립신(Sigma, T-4799, U.S.A)/0.02％ 에틸렌디아민테트라아세트산(Gibco BRL, Cat. No. 11266-012, U.S.A)으로 37℃에서 30분 동안 처리하고 난 후, 셀 스크레이퍼(Cell Scraper; Nunc, 179693, U.S.A)로 양막 상피 세포를 제거하였다.

양막 상피 세포는 빈틈없이 양막의 상층부를 채우고 있어 양막의 표면을 불규칙하게 한다. 이러한 불규칙한 양막의 표면은 각막 상피 세포의 부착면을 불규칙하게 함으로써 양막 위에서 다른 조직의 상피세포 배양에 방해가 되므로 편평한 배양 표면을 제공하기 위해서는 양막 상피 세포를 제거하는 것이 바람직하다.

양막 상피 세포를 제거한 양막을 다시 PBS로 3-4회 세척 후 상기 실시예 1에서 제조한 지지 장치에 고정시켜 배양에 사용하였다.

<1-2> 동결건조 양막의 준비

앞서 세척한 양막을 0.05％ 트립신(Sigma, T-4799, U.S.A)/0.02％ 에틸렌디아민테트라아세트산(Gibco BRL, Cat. No. 11266-012, U.S.A)으로 37℃에서 30분 동안 처리하고 난 후, 셀 스크레이퍼(Nunc, 179693, U.S.A)로 양막 상피 세포를 제거하였다. 양막 상피 세포를 제거한 양막은 다시 PBS로 3-4회 세척하였다. 세척한 양막은 24시간 -80℃에서 동결 후 -80℃에서 48시간 동안 동결건조(FREEZE DRY SYSTEM, SAMWON, SFDSM06, KOREA)하였다. 동결건조된 양막을 상기 실시예 1에서 제조한 지지 장치에 고정시킨 후, γ 멸균(25kGy, 그린피아, 한국)하여 배양에 사용하였다.

<시험예 2> 콜라젠막의 준비

0.3％ 콜라젠 용액(BioLand Ltd., Korea)으로 콜라젠막을 제조하였다. 먼저, 원하는 콜라젠막의 형태와 크기를 고려하여 원형 또는 다각형의 용기에 2mm의 높이가 되도록 콜라젠 용액을 분주하고 24시간 -80℃에서 동결 후 -80℃에서 48시간 동안 동결건조하여 콜라젠 스폰지(collagen sponge)를 제조하고, 동결건조한 콜라젠 스폰지를 0.3％ 콜라젠 용액에 약간 적신 다음 편평한 용기에 놓고 4℃에서 건조하여 콜라젠막을 제조하였다. 가교결합의 정도에 따라 콜라젠막의 분해속도를 조절할 수 있다. 이렇게 제조된 콜라젠막을 상기 실시예 1에서 제조한 지지 장치에 고정시킨 후, γ 멸균(25kGy, 그린피아, 한국)하여 배양에 사용하였다.

<시험예 3> 각막 섬유모세포, 각막 상피세포, 각막 내피세포의 일차배양

문헌(Soverin Karmiol, Methods of Tissue Engineering, Chapeter 2(Cell isolation and selection), 20페이지, Academic Press, 2002)에 기술되어 있는 조직부착법(Explant culture)의 방법에 따라 각막 섬유모세포 및 각막 상피세포, 각막 내피세포를 일차배양하였다.

구체적인 일차배양 방법은 다음과 같다. 먼저 수술기구를 이용하여 토끼의 안구로부터 각공막 절편(cornealscleral button)을 얻는다. 상기 각공막 절편에서 결막을 완전히 제거한 후, 각막과 공막이 각각 1mm가 포함된 윤부를 얻은 후, 남은 중앙 각막을 수술용 칼을 이용하여 간질부위를 중심으로 상피세포가 있는 층과 내피세포가 있는 층으로 분리한다. 이렇게 분리된 세 부분의 조직으로부터 각막의 세 가지 세포를 조직부착법을 통하여 얻을 수 있다. 각막 상피세포, 각막 섬유모세포, 각막 내피세포를 각각 윤부, 상피세포와 각막 간질층을 일부 포함한 조직, 내피층과 각막 간질층을 일부 포함한 조직으로부터 얻을 수 있다. 각각의 조직을 2 × 2 mm의 크기로 자른다. 각막 상피 세포는 공기와 접촉하고 있는 윤부 부위를 배양용기의 방향으로 하여 부착시켜 얻을 수 있었고, 각막 섬유모세포는 상피세포와 간질층 일부를 포함한 조직을 간질층을 용기의 방향으로 하여 부착시켜 얻을 수 있었다. 또한 각막 내피세포는 내피세포를 용기의 방향으로 하여 부착시켜 얻을 수 있었다. 부착시킨 조직은 조직이 완전히 건조되지 않도록 배양 배지를 소량 넣어 하룻밤동안 배양하였다. 다음날 배지를 첨가하고 3일에 한번씩 배지를 교체하 면서 7일에서 10일정도 배양한다. 부착시킨 조직으로부터 세포가 조직주변으로 흘러나오면서 배양되어 일차 세포를 얻을 수 있다. 각막 상피 세포의 배양 배지는 HCGS(Human corneal growth supplement; Cascade Biologics, U.S.A.)와 0.06mM CaCl₂가 첨가된 EpiLife(Cascade Biologics, U.S.A)를 사용하였다. HCGS에는 0.18㎍/ml의 하이드로코르티손(hydrocortisone), 5㎍/ml의 트랜스페린(transferrin), 0.2％ v/v의 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract; BPE) 및 1ng/ml의 마우스 상피 성장 인자(mEGF)가 함유되어 있다.

각막 섬유모세포 배양 배지는 소 태아 혈청(FBS; GIBCO, U.S.A.)이 10％ 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO, U.S.A.)을 사용하였고, 각막 내피 세포 배양 배지는 Opti-MEM 배지(Opti minimal essential medium; GIBCO)에 FBS 8％, EGF(Sigma, U.S.A.) 10ng/ml, 신경 성장 인자(NGF; R&D, U.S.A.) 20㎍/ml, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF; Sigma, U.S.A.) 10ng/ml, RPMI 비타민 혼합물(RPMI vitamin mixer; Sigma, U.S.A.) 1％ v/v, 아스코르브산(Sigma, U.S.A.) 5㎍/ml, 곤충 지질(insect lipid; Sigma, U.S.A.) 0.2mg/ml, CaCl₂(GIBCO) 0.2mg/ml 및 콘드로틴 설페이트(chondrotin sulfate; Sigma, U.S.A.) 0.08％가 첨가된 배지를 이용하였다.

<시험예 4> 3세대 세포를 이용한 각막 상피층 재구성

배양 용기에서 조직부착법으로 일차세포를 얻었다. 흘러나온 세포의 양에 따라 1:2 또는 1:3으로 계대배양하여 5-7일 후 2세대 세포를 얻었고 1:4 정도로 계대배양하여 4-6일 후 3세대 세포를 얻었다. 이렇게 하여 얻은 3세대 세포를 각막 상피층 재구성에 사용하였다.

양막 위에 3세대 각막 상피 세포 5× 10⁵ 개를 접종하였다. 1-2일 동안 액침 배양을 한 후, 6일 동안 기액계면 배양하여 각막 상피층을 재구성하였다. 배지는 HCGS(Human corneal growth supplement)를 첨가한 EpiLife(Cascade Biologics, U.S.A)를 사용하였다.

재구성된 각막 상피층에 대해 하기 <시험예 9>의 조직학적 검사를 수행하여 그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.

도 3은 재구성된 각막 상피층의 H/E 염색 사진으로, 이로부터 3일동안 기액계면 배양을 한 상피층(A)에서는 접종한 세포가 안정화되어 2-3층의 상피세포가 잘 부착되어 있는 것을 확인할 수 있으며, 6일동안 기액계면 배양을 한 상피층(B 및 C)은 실제 각막의 상피층과 유사한 모습을 확인할 수 있었다.

한편, 도 4는 재구성된 각막 상피층의 AE 5로 면역조직화학 염색한 사진이다. 동결건조 양막에서 각각 3일, 6일동안 기액계면 배양한 것(A 및 B)과 냉동보존 양막에서 6일동안 기액계면 배양한 상피층(C)의 표면 세포(superficial cell)는 각막 상피층의 분화가 잘 되어 실제 각막의 표면 세포와 유사한 모습을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5는 재구성된 각막 상피층을 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)로 면역조직화학 염색한 사진인데, 실제 각막(D)에서 기저층 부근에 증식 능력이 보다 활발한 세포가 관찰된 것과 같이, 양막에서 배양된 각막 상피세포(A 내지 C)에서도 실제의 각막 상피세포와 같이 증식능력이 활발하다는 것을 확인할 수 있었다.

나아가, 도 6은 재구성된 각막 상피층의 투과전자 현미경(TEM) 사진으로, 냉동보존 양막(A)과 동결건조 양막(D) 위에 각막 상피층이 잘 부착되어 있는 것을 확인할 수 있고, 헤미데스모좀(hemidesmosome) 형성으로부터 양막에 각막 상피세포가 잘 부착되었음을 알 수 있을 뿐만 아니라(B 및 E), 데스모좀 형성으로부터 세포 사이의 교류가 원활히 이루어지는 것을 확인할 수 있었다(C 및 F).

<시험예 5> 유동배양 방법을 이용한 각막 상피층 재구성

양막 위에 3세대와 해동한 4세대의 각막 상피 세포 5× 10⁵ 개를 접종하였다. 해동한 4세대의 세포는 3세대의 세포를 EpiLife, 혈청, 동결 세포보호제(Dimethyl sulfoxide(DMSO))를 각각 8:1:1로 혼합한 후 1× 10⁶ cells/ml의 농도로 동결보존한 세포를 재빨리 해동한 다음 증식시켜 얻을 수 있다. 1-2일 액침 배양 후 9일 동안 유동배양 또는 동적배양 방법(Tilting dynamic culture, RPM:6)으로 기액계면 배양하여 각막 상피층을 재구성하였다. 배지는 HCGS를 첨가한 EpiLife(Cascade Biologics, U.S.A)를 사용하였다.

재구성된 각막 상피층에 대해 하기 <시험예 9>의 조직학적 검사를 수행하여 그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다.

도 8은 유동 배양 방법을 이용하여 양막 위에서 각각 9일(A, B), 6일(C, D)동안 재구성한 각막 상피층의 H/E 염색 사진이다. 도 8의 A와 B를 비교하여 볼 때 유동배양 방법이 정치배양보다 동일한 기간동안 더 많은 각막 상피층으로 배양됨을 알 수 있었다. 이는 유동배양이 정치배양보다 양막 위의 각막 상피 세포에 배지의 영양분과 산소를 원활하게 공급하여 상피 세포의 성장과 분화를 촉진하였기 때문이다. 도 9의 C와 D의 비교를 통해서도 이같은 내용을 알 수 있다. 도 9의 C와 D는 해동한 4세대의 각막 상피 세포로 양막 위에서 각막 상피층을 각각 정치배양과 유동배양으로 재구성한 것을 나타낸 것이다. 보통 세포를 액체질소로 저장한 다음 해동하게 되면 저장과 해동의 방법에 따라 다르겠지만 세포가 해를 입게 되는데, 이렇게 해를 입은 세포에 영양분을 충분히 공급할 수 있는 유동배양 방법을 이용하면 도 9의 D와 같이 각막 상피층과 유사한 상피층을 재구성할 수 있다. 정치배양으로는 제대로 된 각막 상피층을 재구성할 수 없었지만(도 9의 C 참조), 유동 배양을 통해서는 실제 각막의 기저층과 유사한 각막 상피층을 얻을 수 있었다.

또한, 도 10은 유동배양 방법을 이용하여 양막 위에서 재구성된 각막 상피층의 PCNA 면역조직화학 염색 사진으로, 도 5의 B와 비교하여 보면, 증식능력이 탁월한 능력을 가지고 있는 세포가 유동 배양에서 얻은 상피층의 기저층에 현저함을 알 수 있다.

<시험예 6> 양막의 간질면과 상피면에 단층의 각막 섬유모세포와 각막 상피층의 재구성

동결건조 양막의 간질면(stromal side)에 세포를 배양하려면 양막의 스폰지층(Spongy layer)과 모세포층(Fibroblast layer)을 제거한 뒤 배양해야 한다. 양막의 층은 상피면(epithelial side)으로부터 상피층, 기저막, 치밀층(Condense layer), 모세포층, 스폰지층으로 이루어져 있다. 특히, 간질면의 스폰지층은 융모막과의 부착되는 부위로 점액성으로 되어 세포가 부착하지 못하고 구형의 상태로 있다가 괴사하게 된다. 그러므로 양막의 간질면에 배양시에는 양막의 처리가 중요하다. 따라서, 스폰지층과 모세포층이 제거된 동결건조 양막의 간질면에 각막 섬유모세포 2× 10⁵ 개의 세포를 접종한 뒤 5일동안 배양하였다. 5일 배양 후 양막을 뒤집어 상피면에 5× 10⁵ 개의 상피 세포를 접종, 2일동안 배양 후 6일동안 기액계면 배양하였다.

배양 후 하기 <시험예 9>의 조직학적 검사를 수행하여 그 결과를 도 11 및 도 13에 나타내었다.

도 11은 양막의 간질면에 각막 섬유모세포를 단층으로 배양하고 상피면에는 각막 상피층을 재구성한 H/E 염색 사진으로, A는 정치 배양, B는 유동 배양으로 배양한 사진이다. 본 발명에 따른 지지 장치의 도움으로 양막의 양면에 두 가지 각막 세포를 용이하게 배양할 수 있음을 알 수 있다.

한편, 도 13은 양막의 간질면에 각막 섬유모세포를 단층으로 배양하고 상피면에는 각막 상피층을 재구성한 TEM 사진으로, 세포 사이의 데스모좀(A 및 C)과 양막과 각막 상피 세포 사이의 헤미데스모좀(B 및 D)을 관찰 할 수 있는 바, 이로부 터 재구성된 각막 상피층은 세포와 세포사이의 결합과 양막과 각막 상피 세포 사이의 결합이 매우 잘 되었다는 것을 알 수 있다.

<시험예 7> 콜라젠막을 이용한 피부 표피층의 재구성

각질형성세포의 일차배양은 효소분해법(enzymatic digestion)을 이용한다. 포피조직(foreskin)을 각각 칼슘 아세테이트 완충용액(130 mM NaCl, 10 mM 칼슘 아세테이트, 20 mM HEPES, pH 7.2)에 녹인 3mg(1000U)/mL의 콜라게나제(collagenase) 용액과 PBS에 녹인 1mg(1.5U)/mL의 디스페이스(dispase) 용액, 그리고 0.05 ％ 트립신 효소 용액을 이용한다. 각질형성세포 배양에는 각질형성세포의 분화와 섬유아세포의 오염을 막기 위해 하이드로코르티손, 인슐린, 트리요오도티로닌(triiodothyronine) 등 각질형성세포 특이적 성장호르몬(keratinocyte specific growth hormone)이 첨가된, 낮은 Ca²⁺ 농도의 K-SFM(serum-free keratinocyte medium, Gibco. Cat.# 320-7005PJ)에 EGF(epidermal growth factor, 5.0 μg/L)와 BPE(bovine pituitary extract, 50 mg/L)를 첨가한 배지를 사용한다. 일차 배양으로 얻은 각질형성세포를 1:4의 두 번의 계대배양을 통하여 3세대 세포를 얻었다. 콜라젠막 위에 3세대 각질형성세포 5× 10⁵ 개를 접종하였다. 1-2일 동안 액침 배양을 한 후, 7일 동안 기액계면 배양하여 피부 표피층을 재구성하였다. 재구성된 피부 표피층에 대해 하기 <시험예 9>의 조직학적 검사 중 H/E 염색을 수행하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 보는 바와 같이, 콜라젠 막 위에서 재구성된 피부 표피층을 얻을 수 있었다.

<시험예 8> 중간 고리가 삽입된 지지 장치에 고정된 양막에서의 각막 상피층의 재구성

중간 고리가 삽입된 지지 장치에 고정된 양막의 상피면 위에 해동한 4세대의 각막 상피 세포 5× 10⁵ 개를 접종하고, 1-2일 액침 배양하였다. 배지는 HCGS(Human corneal growth supplement)를 첨가한 EpiLife(Cascade Biologics, U.S.A)를 사용하였다. 이후, 중간 고리가 삽입된 지지 장치에서 제2부재를 제거하고, 중간 고리와 결합된 제1부재를 레그를 바닥면으로 향하게 하여 배양 용기의 벽면 한쪽으로 치우치게 위치시키고, 6rpm의 속도로 6일간 유동배양하였다.

재구성된 각막 상피층에 대해 하기 <시험예 9>의 조직학적 검사 중 H/E 염색을 수행하여 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 8의 C 및 D 사진과 비교하여 도 15의 각막 상피층이 실제 각막과 더 유사하게 재구성된 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 9> 조직학적 검사

조직학 검사는 조직검사학(전국임상병리교수혐의회, 고려의학, 1992)과 병리조직특수염색도감(김주호, 신광출판사, 1993)을 참고하여 실시하였다.

(1) 헤마톡실린/에오신 염색(hematoxlyn/eosin(H/E) staining)

표본들을 4％ 포름알데히드 용액으로 고정한 후, 파라핀에 박힌 것을 절단하여 얻은 절편을 헤마톡실린/에오신 염색을 한다.

(2) AE 5 염색

표본들을 4％ 포름알데히드 용액으로 고정한 후, 파라핀에 박힌 것을 절단하여 얻은 절편을 각막 상피세포 분화 특이 단백질인 AE 5로 염색을 한다. 이 염색을 통하여 재구성된 각막 상피층이 올바로 분화되었는지 관찰할 수 있다.

(3) PCNA 염색

표본들을 4％ 포름알데히드 용액으로 고정한 후, 파라핀에 박힌 것을 절단하여 얻은 절편을 PCNA 염색을 한다. 이 염색을 통하여 증식능이 있는 세포를 관찰할 수 있다.

(4) 전자현미경 검사

양막상피세포를 제거한 양막과 제거하지 않은 양막의 표면과 단면, 재구성된 각막 상피층의 단면을 자세하게 살펴보기 위하여 전자현미경으로 관찰하였다. 4％ 글루타르알데히드와 2％ 포름알데히드로 조직을 고정한 뒤, 2％ 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)로 재고정하였다. 재고정된 조직을 탈수시킨 후 코팅하여 주사전자 현미경(Scanning Electron Microscope(SEM), JSM-35CF, Jeol, Japan)과 투과전자 현미경(Transmission Electron Microscope(TEM), JEM-200CX, Jeol, Japan)으로 관찰하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포배양용 막의 지지 장치는 별도의 체결수단없이 막을 지지할 수 있을 뿐만 아니라, 막의 위, 아래 양면에서 모두 목적 하는 세포의 배양이 가능하며, 막에 부착된 세포의 기액계면 배양시 교반 동적 배양이 가능하여 조직 재구성 기간을 단축시킬 수 있다. 나아가, 이렇게 재구성된 조직은 독성용 모델 뿐만 아니라 이식용으로도 사용할 수 있다.

Claims (11)

1. 중앙에 관통홀, 일면에 둘레를 따라 형성된 돌출부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제1부재;

   중앙에 관통홀, 일면에 상기 제1부재의 돌출부를 수용하기 위한 수용부, 및 타면에 3개 이상의 레그를 구비한 제2부재; 및

   상기 제1부재와 상기 제2부재 사이에 위치하는 중간 고리를 포함하며,

   제1부재의 돌출부와 중간 고리는 그 사이에 세포배양용 막을 고정시킬 수 있도록 맞물리고, 중간 고리와 맞물린 제1부재의 돌출부가 제2부재의 수용부와 맞물리는, 세포배양용 막의 지지 장치.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 제1부재 및 제2부재는 링형 부재인 것을 특징으로 하는 장치.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 제1부재 및 제2부재의 재질은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 상표명: 테프론), 폴리에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리아트릴로니트릴(PAN), 대크론(Dacron) 및 실리콘으로 이루어진 그룹에서 선택되는 생체적합 고분자 물질인 것을 특징으로 하는 장치.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 수용부는 요입홈의 형태인 것을 특징으로 하는 장치.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 막은 양막, 콜라젠막, 젤라틴막, 키틴막, 키토산막, 알지네이트막, 하이루론산막, PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))막, PGA(polyglycolic acid)막, PLA(poly(lactic acid))막으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
7. 제 1 항, 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 세포배양용 막의 지지 장치를 이용하여 막에서 목적하는 세포를 배양하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   목적하는 세포가 각막 상피 세포, 피부 표피 세포, 점막 상피 세포 및 기도 상피 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7 항에 있어서,

   목적하는 세포를 기액계면 배양으로 배양하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서,

    기액계면 배양을 교반 동적 배양으로 수행하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서,

    교반 동적 배양은 6 내지 10rpm의 속도로 3 내지 12일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.

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