JP2005348736A - 細胞培養用膜の支持装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に形成された突出部、及び他方の面に3個以上の脚(leg)を備えた第1部材;及び中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に前記第1部材の突出部を取り込むための受容部、及び他方の面に3個以上の脚を備えた第2部材を含み、第1部材の突出部と第2部材の受容部はその間に介在される細胞培養用膜を固定させ得るように噛み合う、細胞培養用膜の支持装置を提供する。
【選択図】図1a
Description
本発明は、組織工学を用いた人工器官の製造において、実際組織を構成する細胞を膜(membrane)上で培養する際に前記膜を支持する役割をする装置を提供することに特徴がある。
角膜(cornea)を実際組織と類似する形式に製造することにおいて、角膜細胞培養の基底膜として用いられる羊膜を支持できる角膜細胞培養用の羊膜支持装置を製造した。テフロン(登録商標)(TEFLON商品名)を材質とし、角膜の大きさと培養の容易性を考慮して円型に製造した。前記支持装置の第1部材及び第2部材の内径は角膜の直径(平均:10mm、全層角膜移植の場合は中間の7mm程度の直径の角膜をパンチングして移植)を考慮して14mmとし、第1部材と第2部材との間に羊膜を固定するために外径は22mm(中間輪を第1部材と第2部材との間に挿入する場合には26mm)とした。前記支持装置を製造できる設計図を各部位の大きさ(気液界面:mm)と共に図1e及び図1hに示す。気液界面の培養を行うために脚を設け、培地の流動のために脚を3つ備えておき、脚の高さは2mmとした。第1部材と第2部材とが組立てられた支持装置は市販の培養容器を用いるために高さを9mmとした。
<試験例1>羊膜の用意
角膜細胞を培養するための膜として羊膜を用いた。羊膜は、血清検査上B型及びC型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗体、性病研究所(VDRL)実験において全て陰性であり、疾患のない健康な産母より帝王切開によって得られた胎盤を生理食塩水で洗浄した後、無菌環境で行う方法で分離した(Jerzy et al., Ann. of Trans., 4:85-90 (1999))。この分離した羊膜は0.3%オフロキサシン(ofloxacin)を含むリン酸緩衝溶液(PBS)で3〜4回洗浄した後、ニトロセルロースメンブラン(NC, Osmonics, U.S.A)に付着させた。
ニトロセルロースメンブラン(NC, Osmonics, U.S.A)に付着させた羊膜を2cm×2cmに切ってDMEM(Dulbecco's modified essential medium)とグリセロール(Sigma, U.S.A)とを1:1の比率で混合した羊膜保存溶液に入れて−80℃で保管した。培養のためにまず冷凍保存羊膜を迅速に解凍した。解凍させた羊膜をPBSで3回洗浄した後、0.05%トリプシン(Sigma, T-4799, U.S.A)/0.02%エチレンジアミンテトラアセト酸(Gibco BRL, Cat. No. 11266-012, U.S.A)で37℃で30分間処理した後、セルスクレーパー(Cell Scraper; Nunc, 179693, U.S.A)で羊膜上皮細胞を除去した。
予め洗浄した羊膜を0.05%トリプシン(Sigma, T-4799, U.S.A)/0.02%エチレンジアミンテトラアセト酸(Gibco BRL, Cat. No. 11266-012, U.S.A)で37℃で30分間処理した後、セルスクレーパー(Nunc, 179693, U.S.A)で羊膜上皮細胞を除去した。羊膜上皮細胞が除去された羊膜をさらにPBSで3〜4回洗浄した。この洗浄した羊膜を80℃で24時間凍結後、−80℃で48時間凍結乾燥(FREEZE DRY SYSTEM, SAMWON, SFDSM06, KOREA)した。凍結乾燥した羊膜を前記実施例1で製造した支持装置に固定させた後、滅菌(25kGy、グリーンピア、韓国)して培養に用いた。
0.3%コラーゲン溶液(BioLand Ltd., Korea)でコラーゲン膜を製造した。まず、目的とするコラーゲン膜の形態と大きさを考慮して円形又は多角形の容器に2mmの高さになるようにコラーゲン溶液を分株し、80℃で24時間凍結後、−80℃で48時間凍結乾燥してコラーゲンスポンジ(collagen sponge)を製造し、凍結乾燥したコラーゲンスポンジを0.3%コラーゲン溶液に少し濡らして平らな容器に置き、4℃で乾燥してコラーゲン膜を製造した。架橋結合の程度によってコラーゲン膜の分解速度を調節できる。このように製造されたコラーゲン膜を前記実施例1で製造した支持装置に固定した後、滅菌(25kGy、グリーンピア、韓国)して培養に用いた。
文献(Soverin Karmiol, Methods of Tissue Engineering, Chapeter 2(Cell isolation and selection)、20頁、Academic Press, 2002)に記述されている組織付着法(Explant culture)の方法によって角膜繊維芽細胞及び角膜上皮細胞、角膜内皮細胞を一次培養した。
培養容器で組織付着法で一次細胞を得た。この一次細胞の量によって1:2又は1:3で継代培養して5〜7日後2世代細胞を得、約1:4で継代培養して4〜6日後3世代細胞を得た。このようにして得た3世代細胞を角膜上皮層の再構成に用いた。
羊膜上に3世代角膜上皮細胞5×105個を接種した。1〜2日間液体培養した後、6日間気液界面培養して角膜上皮層を再構成した。培地はHCGS(Human corneal growth supplement)を添加したEpiLife(Cascade Biologics, U.S.A)を用いた。
図3は、再構成された角膜上皮層のH/E染色写真で、3日間気液界面培養を行った上皮層(A)では接種した細胞が安定化されて2〜3層の上皮細胞がよく付着していることが確認でき、6日間気液界面培養を行った上皮層(B及びC)は実際の角膜の上皮層と類似する形態が確認できた。
また、図5は、再構成された角膜上皮層をPCNA(proliferating cell nuclear antigen)で免疫組織化学染色した写真で、実際の角膜(D)から基底層付近に増殖能力の活発な細胞が観察されたように、羊膜で培養された角膜上皮細胞(A〜C)も実際の角膜上皮細胞のように増殖能力が活発であることが確認できる。
羊膜上に3世代と解凍した4世代の角膜上皮細胞5×105個を接種した。解凍した4世代の細胞は、3世代の細胞をEpiLife、血清、凍結細胞保護剤(Dimethyl sulfoxide(DMSO))をそれぞれ8:1:1で混合した後、1×106cells/mlの濃度で凍結保存した細胞を迅速に解凍した後、増殖させて得られた。1〜2日液体培養した後、9日間流動培養、例えば、傾斜振動培養(Tilting dynamic culture, RPM:6)を用いて気液界面培養して角膜上皮層を再構成した。培地はHCGSを添加したEpiLife(Cascade Biologics, U.S.A)を用いた。
凍結乾燥羊膜の間質面(stromal side)に細胞を培養する場合は、羊膜のスポンジ層(Spongy layer)と母細胞層(Fibroblast layer)を除去してから培養しなければならない。羊膜の層は上皮面(epithelial side)から上皮層、基底膜、緻密層(Condense layer)、母細胞層、スポンジ層からなる。特に、間質面のスポンジ層は絨毛膜と付着される部位であって粘液性であるため、細胞が付着できずに球形の状態で途中壊死する。そのため羊膜の間質面に培養する際、羊膜の処理が重要である。従って、スポンジ層及び母細胞層が除去された凍結乾燥羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞2×105個を接種した後、5日間培養した。5日間培養した後、羊膜を覆して上皮面に5×105個の上皮細胞を接種し、2日間培養した後、6日間気液界面培養した。
図11は、羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞を単層培養し、上皮面には角膜上皮層を再構成したH/E染色写真で、Aは静置培養、Bは流動培養で培養した写真である。本発明による支持装置によって羊膜の両面に二つの角膜細胞を容易に培養し得ることが分かる。
角質形成細胞の一次培養には酵素分解法(enzymatic digestion)を利用した。表皮組織(foreskin)をそれぞれカルシウムアセテート緩衝溶液(130mM NaCl、10 mM カルシウムアセテート、20mM HEPES、pH7.2)に溶かしたコラゲナーゼ(collagenase)溶液3mg(1000U)/mLとPBSに溶かしたディスパーゼ(dispase)溶液1mg(1.5U)/mL、及び0.05%トリプシン酵素溶液を用いた。角質形成細胞培養には角質形成細胞の分化と線維芽細胞の汚染を防ぐためにヒドロコーチゾン、インシュリン、トリヨードチロニン(triiodothyronine)など角質形成細胞の特異的成長ホルモン(keratinocyte specific growth hormone)を加えた、低いCa2+濃度のK−SFM(serum-free keratinocyte medium, Gibco. Cat.# 320-7005PJ)にEGF(epidermal growth factor, 5.0 g/L)とBPE(bovine pituitary extract, 50 mg/L)を添加した培地を用いた。一次培養で得た角質形成細胞を1:4の2回の継代培養を通じて3世代細胞を得た。コラーゲン膜の上に3世代角質形成細胞を5×105個接種した。1〜2日間液体培養した後、7日間気液界面培養して皮膚表皮層を再構成した。再構成された皮膚表皮層に対して下記<試験例9>の組織学検査のうち、H/E染色を行ってその結果を図14に示す。図14から分かるように、コラーゲン膜上で再構成された皮膚表皮層が得られた。
中間輪が挿入されて支持装置に固定された羊膜上皮面上に解凍した4世代の角膜上皮細胞5×105個を接種し、1〜2日間液体培養した。培地はHCGS(Human corneal growth supplement)を添加したEpiLife(Cascade Biologics, U.S.A)を用いた。その後、中間輪の挿入された支持装置より第2部材を除去し、中間輪と結合された第1部材を脚を底面に向かうようにして培養容器の壁面の一方に片寄るように位置づけ、6rpmの速度で6日間流動培養した。
組織学検査は組織検査学(全国臨床病理教授協議会、高麗医学、1992)と病理組織特殊染色図鑑(キム・ジュホ、シングァン出版社、1993)を参考して行った。
(1)ヘマトキシリン/エオシン染色(hematoxlyn/eosin(H/E) staining)
標本を4%ホルムアルデヒド溶液でしょりした後、パラフィンで固定したものを切断して得た切片をヘマトキシリン−エオシン染色を行った。
標本を4%ホルムアルデヒド溶液で処理した後、パラフィンに固定したものを切断して得た切片を角膜上皮細胞の分化特異的蛋白質であるAE5で染色した。この染色を通じて再構成された角膜上皮層が正しく分化されたかを観察した。
(3)PCNA染色
標本を4%ホルムアルデヒド溶液で処理した後、パラフィンで固定したものを切断して得た切片をPCNA染色を行う。この染色を通じて増殖能のある細胞を観察した。
羊膜上皮細胞を除去した羊膜と除去していない羊膜の表面と断面、再構成された角膜上皮層の断面を電子顕微鏡で観察した。4%グルタールアルデヒドと2%ホルムアルデヒドで組織を固定した後、2%オスミウムテトロキシド(osmium tetroxide)で再固定した。再固定された組織を脱水した後、コーティングして走査電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope(SEM), JSM-35CF, Jeol, Japan)と透過電子顕微鏡(Transmission Electron Microscope(TEM), JEM-200CX, Jeol, Japan)で観察した。
Claims (11)
- 中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に形成された突出部、及び他方の面に3個以上の脚を備えた第1部材;及び
中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に前記第1部材の突出部を取り込むための受容部、及び他方の面に3個以上の脚を備えた第2部材を含み、
第1部材の突出部と第2部材の受容部とはその間に細胞培養用膜を固定させ得るように噛み合う、細胞培養用膜の支持装置。 - 前記第1部材の突出部と第2部材の受容部との間に中間輪が挿入されることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記第1部材及び第2部材は円型部材であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記第1部材及び第2部材の材質がポリテトラフルオロエチレン(PTFE;商標名:テフロン(登録商標))、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリアクリロニトリル(PAN)、ポリエチレンテレフタレート(PET)及びシリコーンからなる群から選択される生体適合高分子物質であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記受容部は凹溝の形態であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記膜が羊膜、コラーゲン膜、ゼラチン膜、キチン膜、キトサン膜、アルジネート膜、ヒアルロン酸膜、PLGA(poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))膜、PGA(polyglycolic acid)膜、PLA(poly(lactic acid))膜からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞培養用膜の支持装置と前記膜とを用いて、目的とする細胞を培養する方法。
- 目的とする細胞が角膜上皮細胞、皮膚表皮細胞、粘膜上皮細胞及び気道上皮細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 目的とする細胞を気液界面培養で培養する請求項7に記載の方法。
- 気液界面培養を傾斜振動培養で行う請求項9に記載の方法。
- 傾斜振動培養を6〜10rpmの速度で3〜12日間培養することを特徴とする請求項10に記載の方法。
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