JP2016533189A - 鼓膜の生体模倣組織補綴物を調製するための装置およびプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は間葉系幹細胞からの鼓膜の生体模倣組織補綴物をインビトロで調製するプロセスおよび関連する装置に関する。そのような補綴物は、必要としている患者のたとえばさまざまな傷害または病変の結果、傷ついた鼓膜を修復または再建するために用いられる。

Description

本発明は概して医学生体工学の分野に関し、より正確には、必要としている患者における鼓膜自体を修復または再建するために用いられる、鼓膜の生体模倣組織補綴物をインビトロで調製する装置および関連するプロセスに関する。

残念なことに、鼓膜は特に中耳炎、鼓室硬化症、真珠腫および穿孔等のさまざまな病変の影響を受けやすい。穿孔は特に小児において極めて一般的な臨床的問題の代表的なものであり、感染、異物の侵入による傷害、外耳道への手術器具の挿入、身体の傷害または轟音等の多くの病因によって引き起こされることがある。

多くの穿孔は自然に治癒する傾向があるが、穿孔による慢性感染は聴覚障害、二次感染、扁平上皮嚢胞および真珠腫の形成に繋がることがあり（たとえばGeneri E.A.ら、Ikiz. Otol. Neurotol. 2003; 24: 371-6を参照）、これらは鼓膜形成術として知られる鼓膜の再建手術を必要とする事象である（M. Tos. Manual of middle ear surgery. Thieme Medical Publishers, Inc. New York 1993, vol. 1, Part II cap. 8-13）。

現在までにそのような手術において鼓膜の代替として用いられた材料を型によって分類し、以下の表に示す。

現在のところ、静脈（小さな穿孔についてのみ）、軟骨膜および側頭筋膜が、鼓膜形成術において最も一般的に用いられる自家移植材料である。特に、側頭筋膜の自家移植が手術手技において最も一般的な方法であり、穿孔閉鎖の成功率は８８％〜９５％の範囲である（Rahman A.ら、Acta Otolaryngol. 2008 Apr.; 128(4): 352-9;およびKrause D.S.ら、Cell 2001; 105: 369-77）。側頭筋膜は現在まで最も一般的に用いられた代替材料であり、現在のところ他の全ての材料と比較する判断基準を構成していることには疑いがないが、欠点がないわけではなく、それでもまさに、成功率はドナー部位が得られるか否か、および処置すべき病変部の大きさによって限定される。小さな病変部は容易に治癒し得るが、大きな穿孔または通常の手技による非傷害病変部の処置は、最良の結果が得られた材料を用いたとしても、不満足な結果となることが多く、特にある種の患者においては、手術の危険および欠点は、常には許容できない重大な側面である。さらに、発展途上国においては、鼓膜穿孔の医学的処置はいずれにせよ利用できないことが多い。

一方、死体からの鼓膜または硬膜による同種移植は、異種移植と全く同様に感染症の伝染の可能性があるために殆ど行われていない。これらの両方の種類の移植はまた、一般に患者に好まれず、また拒絶反応を起こしやすい。最後に、現在用いられている合成の生体材料も、介入の結果に対する影響を有する欠点があり、実際、急速な分解を受け、中耳の線維症をもたらし得ることが多い。

したがって、現在のところ、鼓膜形成介入術において移植される理想的な代替材料は、いまだに見出されていない（Teh BM, Marano RJ, Shen Y, Friedland PL, Dilley RJ, Atlas MD. Tissue engineering of the tympanic membrane. Tissue Eng Part B Rev. 2013 Apr; 19(2):116-32）。この材料はまさに、信頼性があり、移植の成功率が高いことを保証し、ドナー部位の病変率を低くすることを可能にする必要がある。この材料はまた、それを通って表皮層が進行して欠損を閉鎖することができる、一種の支持フレームワークを構成する必要がある。このことは、このような支持体に間葉系細胞が生着し、遊走する上皮と中耳の粘膜との間に線維要素の凝縮が形成されるまで血管が新生し、これが元の損傷を受けた鼓膜を形態的にも機能的にも適切に代替するようになる必要があることを意味している。

したがって、既知の材料について上に述べた欠点を有さず、鼓膜形成介入術において高い成功率を保証して用いることができる自家由来の代替材料の開発は、今でも達成すべき目標である。このような目標は、一般に組織工学の手法に固有の困難さのためだけでなく、問題の特定の組織の性質そのもの、即ち鼓膜の性質のために、特に挑戦的な目標である。

鼓膜は音波によって発生した振動を外耳から内耳へ伝達する極めて重要な機能を有しているが、極めて薄く、極めて複雑な構造を有している。鼓膜は２つの部分、即ちそれぞれが３層構造を有する弛緩部および緊張部からなっており、この中で２つの上皮層の間に、主としてＩＩ型コラーゲンであるコラーゲンフィブリルから形成された結合組織の中間層が存在し、コラーゲンフィブリルは複雑に配置されたバンドルを形成する線維を構成している（Ross M.H.ら、Istologia, Testo e atlante con elementi di Biologia cellulare and molecolare, Ambrosiana Publishing House, 2010）。鼓膜の殆ど全表面を代表する緊張部においては、異なった配置に基づいて線維の異なった系、即ち放射状線維の系、環状線維の系、放物線状線維の系、および最後に横断線維の系を区別することが可能である。緊張部のこのような特定の構成は音の伝達において、したがって鼓膜の機能性において基礎的な重要性を有するが、耳の発育の間にそのような構造が形成される機構はいまだに明らかでなく、もちろんこのために、鼓膜の形態を模倣し、その機能を適切に再現することができる鼓膜の代替材料の開発はさらに困難になっている。

さて、本出願人は、間葉系幹細胞から出発し、天然の膜の特徴を再現する特徴、特に鼓膜の機能において本質的に重要な、鼓膜の緊張部の中間結合層の特徴を備えた材料の調製を可能にする鼓膜の生体模倣組織代替物をインビトロで調製する装置およびプロセスを開発した。出発材料である幹細胞の培養のためのバイオリアクターとして革新的な装置を用いる本発明のプロセスによって得られる材料は、天然の鼓膜の解剖学的研究によって検出されたものと完全に類似したコラーゲンフィブリルの大きさ、組成および空間的配置の特徴を有していることが示され、したがって音を正しく伝達するための機能的な特徴を維持することもできる。また本発明の装置を用いると、独特の磁気システムにより、培養液それ自体に接触することなく、外部変換装置と細胞培養を行う生体親和性の内部構造との組み合わせによって、増殖溶液中で細胞培養液を流動させることが可能になる。

したがって、本発明の主題は、鼓膜を修復または再建するための組織補綴物をインビトロで調製する装置であり、その本質的な特徴は添付した特許請求の範囲の最初に定義している。

その本質的な特徴がここに添付した請求項１１に定義されている上述の補綴物をインビトロで調製するプロセスおよびそれにより得られる組織補綴物は、本発明のさらなる主題を表している。

本発明による調製プロセス、装置および組織補綴物の特徴および利点は、添付した図面も参照して非限定的な例として以下に示すその実施形態の詳細な説明によってさらに明らかになる。

本発明の装置の実施形態の透視図である。 図１の装置の基台の透視図である。 図１の装置の部品である磁気リングの好ましい実施形態を示す図である。 増殖する細胞の支持体における、図１の装置のチューブの断面を示す図である。 分化培地を用いた細胞培養液から得られた２つの試料の、実物大写真（Ａ）ならびに静的条件（Ｂ）および本発明の装置を用いた動的条件（Ｃ）における、立体顕微鏡で撮影した顕微鏡写真である。 図５の２つの試料（Ｂ）および（Ｃ）、ならびに同じ培養条件であるが星形分枝ポリ（ε−カプロラクトン）、＊ＰＣＬの支持体の代わりにヒドロキシアパタイトナノ粒子を添加した星形分枝ポリ（ε−カプロラクトン）、＊ＰＣＬ／ＨＡの支持体上で得た他の２つの試料について得られた共焦点顕微鏡画像である。 ＊ＰＣＬおよび＊ＰＣＬ／ＨＡの支持体を用いる本発明のシステムの主題（分化培地を用いる動的培養）、ならびに関連する静的対照および非分化培地による対照によって産生した細胞構造物における線維芽細胞抗原ならびにＩ型およびＩＩ型コラーゲンの発現に関連する免疫組織化学分析によって得られた画像を、分析した種々の試料について示す図である。

本発明において、「静的」および「動的」という用語はそれぞれ、特に本発明の装置によって発生する機械的刺激の不在下および存在下での細胞培養の方式を意味する。

添付した図面、特に図１〜図４を参照して、本発明の好ましい実施形態による装置は、ほぼ円筒形で本発明のプロセスによる細胞培養のために用いられる材料を収容するために適切な大きさを有するチューブ１を具備し、チューブ１は、以下に詳細に説明する特定のシステムを有してチューブそれ自体の中で細胞培養液を流動させるためにある種の機械的刺激をチューブ１に与える中空カラム３に連結されている。

特に図１および図２を参照して、本発明の装置は基台２を具備し、基台２は穴２１、および穴２１に隣接した位置で基台２から起立し、チューブ１を下方から支持することを意図したスタンド２２を備えている。したがってスタンド２２の上表面には、好ましくはチューブ１の底の収容に適した形状の凹部２３が設けられている。一方、基台２の穴２１は、中空カラム３をチューブ１と同軸の位置に収容することを意図している。その位置において、カラム３およびチューブ１は、チューブ１およびカラム３の収容に適した２つの穴を備えたプレート４を上から挿入することによっても保持されている。これにより、装置を操作する間の適切な安定性が得られ、細胞培養液の交換のためにチューブを容易に取り出すことが可能になっている。

本発明の好ましい実施形態によれば、チューブ１にはスクリューキャップで上から閉鎖するためのねじが備えられており、このスクリューキャップには、操作者によって容易に把持でき、チューブを充填し、および空にする操作のためにキャップを容易に除去できるように、好ましくはギザギザが付けられている。

中空カラム３の内部には磁気手段、ならびに所定の距離と時間だけ磁石を上下交互に動かすモーターがある。一方、同じ中空カラム３の外側にはカーソル５が固定されており、このカーソル５には磁気手段が備えられていて、この磁気手段がカラム内部の磁気手段と相互作用することによって、内部の磁気手段によって誘導される動きでカーソル５を動かす。カラム３に固定され、その上を自由にスライドするカーソル５はまた、好ましくは炭素で作られた２本の硬い棒７を介して、チューブ１を取り巻くリング６に結果として連結されている。この棒７はカーソル５の動作をリング６に伝達し、リング６はチューブ１の壁上を自由に上下にスライドする。中空カラム３の内部のモーターはたとえばステッパモーターであって、ガイドスクリューに連結されており、これは垂直の運動を起こし、これが磁気システムによってチューブ１の内部に伝達される。

磁気手段を備えたリング６は、まさにチューブ１の内部に配置された細胞培養液を流動させ、したがって機械的刺激を与えることを可能にする磁気リングシステムの外部部品の実施形態を構成している。本発明の装置における培養に供される細胞は、以下により良く述べるように、好適には薄膜の形態の適当な支持体の上に播種され、支持フィルムおよびそれとともに細胞を保持し、チューブ１に挿入される前にブロックされた２つのリング８ａおよび８ｂの間にまさに配置されている。これらのリング８ａおよび８ｂは、その平面がチューブ１の長手軸に垂直に配置されるようにチューブ１の中に挿入できるような直径を有し、磁気手段を備えている。これらの磁気手段の存在によって、これらのリングは外部リング６と相互作用し、流動する細胞を含む支持体に付随して動く。

図３に、内部磁気手段８ａおよび８ｂを有するリングの好ましい実施形態を示す。これらのリングには、チューブ１の内壁と接することを意図した溝９が外周に沿って設けられている。これらの溝９は２つのリングにおいて互いに一列に配置されており、細胞を含む支持体の存在によってチューブ１が分割された２つの部分を流体連通させるスペースを作り出している。それによりチューブ内に存在する増殖培地を含んだ溶液が支持体の一方の側から他方へ、支持体の多孔性の機能として中心部から周辺部へ（図４）、支持体の表面に対して接線方向である半径方向に強制的に流動される。それにより溶液中で支持体を上下に容易に移動させ、支持体の両面における細胞の増殖培地の濃度を一定に保つ。図４に、細胞用支持体におけるチューブ１の断面を示す。ここではチューブ１の壁を取り巻く外部リング６と、その内部に、溝を備えた２つの内部リングのうちの１つ８ａを見ることができる。内部リング８ａは、２つのリング８ａおよび８ｂの間にまさに挿入された、細胞を位置決めした支持体を保持している。２つのリング８ａおよび８ｂの間における支持体の閉鎖は、リングそれ自体の上に存在する磁石によって行われる。

磁力は、添付した図面に示した特定の実施形態においては中空カラム内に存在する外部モーターによって、チューブ内の細胞を含む支持体に伝達される。運動の伝達は非接触で行われる。細胞培養液を含む支持体を非接触の方式でチューブ１にわたって磁力を介して係合し、引き動かすことができるいずれの種類の外部モーターも本発明の実施に好適である。このようにしてチューブ１の中の磁気リング８ａおよび８ｂに伝達される動きにより、増殖培地の溶液中のこれらのリングを備えるユニットとして、細胞を含む支持体が移動する。増殖培地は溝９により、リング８ａおよび８ｂの外周とチューブ１の内壁との間に形成された空間にスライドすることができる。リングの上下への移動は、図４で矢印によって図式的に示すように、細胞の支持体に実質的に２種類の張力を発生させる。即ち支持体の中心において大きい誘起圧力と、支持体の周辺部に向かって大きくなる水力学的なせん断応力である。したがって、細胞の支持体に伝達される動きにより、本発明の装置の内部の細胞培養液中の異なった増殖条件の産生には２つの自由度が与えられる。細胞のこのような異なった増殖条件の制御は、以下に詳細に述べるように、モーターによって発生する動きの速度および振幅、ならびに細胞の支持体の選択の両方によって行うことができる。

本発明のバイオリアクターによって培地の内部における細胞構造物に印加される周期的な垂直運動は、たとえば殆ど静止から約２．５ｃｍ／ｓまで、好ましくは約１．５〜約２．０ｃｍ／ｓの速度値で、周期的運動の振幅およびその振動数を調節することによって、調節することができる。運動の振幅はチューブ１の寸法によって設定され、チューブそれ自体の中で用いられる液体培地の量に応じて調節することもできる。運動の振幅は、たとえば約３〜１０ｃｍ、好ましくは約４〜８ｃｍの間であってよい。例として、上述の範囲における運動の振幅が小さければ応力が小さくなり、鼓膜構造物と上皮細胞との共培養（たとえば鼓膜角化細胞）に特に好ましい。一方、応力をもたらす大きい振幅は主として内皮細胞との共培養（たとえば血管新生）に好ましい。

実質的に平行６面体の形状を有する本発明の支持体の基台２は、チューブおよびモーターを有するカラムのための支持体としての役割の他に、モーターを駆動し、カラム３の中の磁気手段に所望の速度値および運動の方向を与えるために必要な電子部品を収容する役割も果たし得る。有利には、オン／オフスイッチおよび速度調節のためのノブ（図示せず）を基台２の適当な位置に配置し、それにより使用者が単にノブを作動させることによって本発明による動的細胞増殖条件を容易に変更し、制御することができる。

本発明の装置は、好ましくは永久磁石である磁気手段が存在しているので、外部ケーブルを有しない。これにより、特に湿潤環境における使用に適しており、それぞれの細胞増殖サイクルの前後で、必要な洗浄および滅菌の操作をすることが可能になる。

本発明の装置を作製するためのデザインおよび材料は、高い湿度レベルおよび室温より高い温度での無菌的な環境における長時間の連続的操作を見越して、その用途に応じて選択しなければならない。装置のさまざまな部品を作製するために好ましく用いられる材料はＴｅｆｌｏｎ（登録商標）であるが、本発明の範囲には、容易に洗浄および滅菌でき、通常の操作の間に装置が供される操作条件に耐えられる他の任意の等価材料が含まれると考える必要もある。次いで装置の部品は典型的にはステンレススチールのスクリューで相互に連結される。本発明により滅菌に供される磁石は、好ましくはオートクレーブ中の滅菌温度より高いキュリー温度を有する磁石の中から選択される。

本発明の装置の特定の実施形態によれば、細胞培養の増殖動力学に対するｐＨおよび温度の影響を評価し、それにより、これらのパラメーターを変更および制御して、細胞増殖を所望の方向に導くことができるように、装置にはそれらのパラメーターを検知するｐＨセンサーおよび温度センサーも具備される。本発明の装置には、細胞培養液中の代謝物の濃度を測定するための好適な分析器も具備し得る。

以下の実験の部に示すように、本発明の装置によって生じる細胞の支持体に対する張力−変形は、ＩＩ型コラーゲンの産生によって出発材料である幹細胞を鼓膜の線維芽細胞に分化させ、同時に線維芽細胞の表現型（非軟骨細胞）を維持するために寄与する機械的刺激に相当する。本出願人は、そのような機械的刺激が支持体上のコラーゲン線維の組織を線維の半径方向および円周方向の配置に導き、天然の鼓膜において観察される線維の同じ組織を模倣することを示した。出発材料である幹細胞の線維芽細胞への分化は、化学的刺激によって、即ち分化作用を有する好適な培地の使用によって、さらに補助することができる。

したがって、本発明のプロセスの好ましい実施形態によれば、培養液を流動させるために細胞を含む支持体を本発明の装置内に導入する前に、細胞が播種された支持体を幹細胞の軟骨形成を促進することができる分化培地に加える。本発明による好適な分化培地には、ウシ胎児血清（FBS）の他に、軟骨形成の意味における少なくとも１つの分化剤、たとえばＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、アスコルビン酸、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、インスリン様増殖因子等が含まれ、好ましくはそれらの混合物が含まれる。本発明の分化培地においては、上述の薬剤は場合によりピルビン酸ナトリウム、インスリン−トランスフェリン−セレン（ITS）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、リノール酸、栄養混合物Ｆ−１２／Ｄ−ＭＥＭ（Dulbeccoの改変イーグル培地）等の１つまたは複数と組み合わせてもよい。あるいは、市販され、即時使用可能な軟骨形成性分化培地、たとえばＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ培地を用いることもでき、これはＦＢＳの添加によって最適化される。

あるいは、細胞が播種された支持体を本発明の装置に導入する前に、好適な非分化培地、たとえばウシ胎児血清を添加したＤ−ＭＥＭまたはα−ＭＥＭ（α改変イーグル培地）等の任意の好適な基礎培地に加えてもよい。

本発明によるプロセスにおける細胞用支持体は、好ましくは補綴物の成長に必要な時間に比べて長い時間の生物学的分解性および再吸収性を有する材料中になければならない。これにより、生体材料が完全に分解する前に細胞構造物が完全に成長することが保証される。約３カ月またはそれ以上の再吸収時間が最適な時間と考えられる。それによって構造物の完全な成長およびインビボにおける一体化が保証されるからであるが、インビボにおける分解時間は中耳における進行中の病変の存在に強く依存する（Beutner D, Huttenbrink KB. Passive and active middle ear implants. Laryngorhinootologie 2009 May; 88 Suppl 1:S32-47）。支持体はまた、細胞の凝集現象を促進し、本発明の装置における培養の期間中に増殖液の流れによって細胞が孔を通って運び去られることを防止する程度の多孔性を有しなければならない。したがって、支持体の材料の孔は出発材料である間葉系幹細胞の直径より小さい直径を有することになる。チューブの中で２つのリング８ａおよび８ｂの間に適切に配置され、磁気閉鎖によってそれらの間に閉鎖されることが可能であり、かつ本発明の装置の中における動的培養期間中に適切な位置に留まるために、本発明による支持体は、好ましくはある程度の弾性を有し、実質的に二次元の形状を有する材料から作られている。「実質的に二次元の」とは、細胞を保持し、埋め込み後に再吸収されるまでその支持機能を果たすために十分であるとしても、他の次元に比べて無視できる程度の厚みを意味する。したがって本発明の支持体は一時的な「テンプレート」として機能する。本発明の支持体はさらに、好ましくは非多孔質材料から作られ、またはミクロ孔もしくはナノ孔を備えている。しかしこの場合には、材料は本発明の装置内における培地の横方向への流れ現象を制限するために、疎水性の性質を有する。換言すれば、この種の支持体によって、支持体自体を通る流れは、チューブ１の内壁と、連結されたリング８ａおよび８ｂとの間の溝９を通る流れに比べて低減されるか、完全に存在しないことが保証される。

支持体を作るために使用が考えられる材料は、本発明により合成起源のポリマー、天然ポリマーまたはそれらの混合物（たとえばバイオ−人工ポリマー）から選択され、実質的に二次元の支持体の形態、即ち緻密な支持体の形態（たとえばミクロフィルムまたはナノフィルムの形態）およびタイトなメッシュ状のミクロファイバーまたはナノファイバーの組織の形態（たとえば静電紡糸組織の形態）で加工することができるものである。加水分解および／または酵素的に分解することができ、生体医学的用途に適し、上記の要求事項に従って加工することができる数多くの種類の合成および／または天然のポリマーをこの後に列挙する。本発明により用いることが可能な合成ポリマーは、ポリ無水物、ポリカーボネート、ポリアルファエステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリホスファゼン、ポリアミド、およびそれらのコポリマーまたは混合物から選択される。ポリアルファエステルの中ではポリラクチド、たとえばポリ乳酸、ポリグリコリド、たとえばポリグリコール酸、およびポリカプロラクトン、たとえば本明細書においてＰＣＬとして示した、線状および＊ＰＣＬとして示した星形のポリ（ε−カプロラクトン）が好ましく用いられる。本発明の作成に特に好ましいものは星形ポリ（ε−カプロラクトン）（*PCL）である。

本発明の特定の実施形態によれば、軟骨形成様分化を促進し、および／またはたとえばベースポリマーの疎水性、粗度、弾性モジュラス等の化学−物理的特性、表面特性もしくは構造的特性を調節するために、上述のポリマーにナノ粒子、たとえばナノスフェア、ナノチューブ等をドープしてもよい。使用可能なナノ粒子の例としては、ヒドロキシアパタイトナノ粒子（HA）（Spadaccioら、Ann Biomed Eng. 2009 Jul., 37:1376-1389）、薬剤放出ナノ粒子等がある。

本発明により用いることが可能な天然由来のポリマーは、多糖類、たとえばセルロースの誘導体、キチンの誘導体、ヒアルロン酸の誘導体等、ならびにタンパク質、たとえばフィブロネクチンのポリマー、フィブリノーゲン、コラーゲンおよびエラスチンから選択することができる。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、支持体は静電紡糸によって得られたマイクロファイバーの不織布の形態の、場合によりヒドロキシアパタイトナノ粒子をドープした（*PCL/HA）星形ポリ（ε−カプロラクトン）（*PCL）で作られている。

本発明の特定の実施形態によれば、支持体には細胞が播種される表面に地形パターン（ミクロパターン）が設けられ、これにより、播種された幹細胞の配置およびパターン自体によって示された方向に沿ったコラーゲンの引き続く産生を導くことができる流路が形成されている。このようにして、天然の鼓膜において観察される所望の方向に沿ったコラーゲンの凝集塊の形成を促進し、支持体の表面において細胞に地形的な刺激を与えることができる。これらの理由により、上記の地形パターンを用いずに本発明の装置および調製プロセスによって所望の鼓膜の組織補綴物が得られるとしても、本発明による地形パターンの使用が好ましく、本発明の装置によって与えられる連続運動によって細胞培養およびコラーゲンの産生が導かれる。

実験の部
以下の実験においては、Ｐｉｓａのａｚｉｅｎｄａ Ｏｓｐｅｄａｌｉｅｒｏ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ Ｐｉｓａｎａ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔにおいて股関節置換術を受けた患者の骨髄から分離したヒト間葉系幹細胞を用いた。患者は十分な情報を得た上での自由意思で、採取および採取した細胞材料について実施される、以下に述べる研究について文書により同意した。

細胞の培養ならびに細胞の生存率および得られた試料中における空間的配向の分析
間葉系細胞は標準的プロトコルに従って密度勾配（Ficoll Histopaque）による遠心によって分離し、１０％のウシ胎児血清（FBS、Invitrogen、USA）、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Lonza）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（D-MEM）中で増殖させ、湿潤雰囲気で５％のＣＯ_２を含むインキュベーター中に３７℃で保存した。

このようにして分離した細胞を、静電紡糸によって得られたままの、またはこれをヒドロキシアパタイトナノ粒子でドープした星形ポリ（ε−カプロラクトン）（それぞれ*PCLおよび*PCL/HA）のマイクロファイバーからなる不織布中の支持体に播種した。これらの支持体には、細胞の増殖に用いた上述の培地を再び培地として用いて、支持体あたり２５万個の間葉系幹細胞を播種した。

支持体上に細胞を播種してから７２時間後に、このようにして得られた＊ＰＣＬまたは＊ＰＣＬ／ＨＡの細胞／支持体構造物の一部に、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（Peprotech）、５０ｎｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Sigma）、１０％ＦＢＳ（Invitrogen）、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Lonza）を添加したＤ−ＭＥＭ：Ｆ−１２栄養混合物（Sigma-Aldrich）からなる分化培地を加えた。一方、＊ＰＣＬの細胞／支持体構造物の一部を非分化培地中に保存し、細胞が基材に容易に接着するよう、さらに３６時間、細胞を培養した。

このようにして調製した全ての構造物を、静的な条件および動的な条件、即ち支持体に加えた周期的な運動の振幅を４．５５ｃｍ、その振動数を０．２Ｈｚに調節し、それにより平均速度を１．８２ｃｍ／ｓとした本発明のバイオリアクター内で、さらに７日間、細胞培養期間に供した。

このようにして得られた材料を最後にニュートラルレッド試験、即ち生細胞を赤色に染色し、それらを空間的に位置させる試験に供した。試験結果は、静的培養の試料、および本発明のバイオリアクターで培養した試料の両方について、天然の鼓膜に匹敵する大きさの、実質的な面積の細胞で覆われた表面を示した。図５において、たとえば＊ＰＣＬ上に播種し、非分化培地中で静的条件および動的条件において培養した細胞について得られた試験結果を見ることができる。特に、実物大の写真（Ａ）ならびに静的条件（Ｂ）および動的条件（Ｃ）における２つの試料の立体顕微鏡写真を示す。これらの結果から、静的培養により細胞の均一な分布［画像（Ｂ）］が得られる一方、本発明の装置における動的培養の場合には、半円状の線による細胞の凝集現象［画像（Ｃ）］を観察することができることが注目される。同じ画像において、支持体の支持枠の存在のために、両方の試料に存在し、周囲領域とともに得られた材料の手術によるカップリングに有用である明確な縁部、したがってこの領域に細胞が存在しないことを見ることができる。一方、図６（Ｂ）および図６（Ｃ）は、図５の試料と類似の２つの試料について得られたが、分化培地を用いて得られた共焦点顕微鏡画像を示す。図６（Ｂ’）および図６（Ｃ’）は、同じ培養条件に供したが、＊ＰＣＬの代わりに＊ＰＣＬ／ＨＡの支持体を用いた２つの試料について得られた画像を示す。楕円形状を有する緑色の部分に細胞の核があり、Ｆ−アクチンのフィラメントは赤で示されていることに注目されたい。このような画像により、以前の画像によって既に示されていたこと、即ち本発明の装置を細胞培養用のバイオリアクターとして用いること、ならびに静的条件下で培養された試料によって既に示された良好な細胞の生存率を実質的に維持し、または増大さえさせることによって、天然の膜の緊張部の配向を模倣する細胞の特定の配向を作り出せることが顕微鏡レベルで確認される。図６において、分化培地なしの静的な培養条件で、＊ＰＣＬの支持体上に細胞を播種することによって作成された対照試料について得られた画像を見ることもできる。この画像から、この場合には細胞の生存率がいかに低いかが明らかに示される。

試料の組織学的分析
得られた材料の組成および特徴を決定し、天然の鼓膜との親和性を評価するため、重要と考えられるマーカー、即ちＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲン、ならびに抗線維芽細胞抗体の同定を行い、細胞のさまざまな培養条件におけるその発現を検出した。以下の表１に、以下の基準に従って顕微鏡観察により決定した抗原の強度のスコアを示す。
「−」：陰性
「＋」：弱陽性
「＋＋」：陽性
「＋＋＋」：強陽性
「＋＋＋＋」：極めて強陽性

得られた結果から、全ての試料において線維芽細胞に典型的な表面抗原がどのように発現するかが明らかになるが、分化した試料における増大および本発明の装置において機械的刺激を与えた試料における発現のさらなる増大を伴っている。同様のパターンが細胞内レベルでＩ型コラーゲンについても観察することができ、これは非分化試料において発現が低く、分化した試料において増大し、細胞内細胞質において広範に陽性となる。ＩＩ型コラーゲンの発現は弱く、全ての試料に存在するが、本発明の装置において培養した分化した試料、特に＊ＰＣＬの支持体を用いた試料において増大している。

図７に、分析した試料に代表的な光学顕微鏡による免疫組織化学画像を示す。このような画像によって、抗原がどのように発現するか、抗原がどこに位置するか（細胞内または細胞外）、および分析した細胞構造物における抗原の分布が明らかになる。免疫組織化学は、抗原抗体反応の利用によって情報を得ることができ、次いで適切な発色剤によって検出することができる方法である。この方法は、表面抗原を発色剤基質に結合させる一連の二分子の配列における結合に基づいており、同時に反応を増幅して光学顕微鏡で明瞭に目視できるようにするもので、本発明の場合は以下の手順によって実施した。

封入および再水和用の媒体を除いた後、切片を適当なマスク除去処理に供して、目的の抗原を一次抗体と結合させた。多くの場合に、試料の透過性増大の処理は０．２％トリトンＸ−１００（Sigma）で１０分行い、一方、抗原ＩＩ型コラーゲンのマスク除去のために９０℃で温度制御した浴に１０分置いたクエン酸塩緩衝液（Diapath、Italia）中で切片をインキュベートした。その後、０．６％の３６倍体積の過酸化水素を含有するメタノール溶液中で切片をインキュベートして、試料中に存在する内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、蒸留水および１倍ＰＢＳで洗浄し、二次抗体それ自体のあり得るかも知れない非特異結合をブロックするために、１倍ＰＢＳで２０倍に希釈した、二次抗体を得た動物種の血清であるヤギ血清と３７℃で２０分インキュベートした。次いで切片をウシ血清アルブミン（BSA）で希釈した一次抗体と４℃で一夜インキュベートした。用いた一次抗体は以下の通りであった。ポリクローナルウサギ抗Ｉ型コラーゲン抗体１２００倍（ab34710、abCam、USA）、モノクローナルマウス抗ＩＩ型コラーゲン抗体５０倍（sc52658、Santa Cruz）、モノクローナルマウス抗線維芽細胞６０００倍抗体（Sigma）。陰性対照は、いくつかの切片を０．１％ｄｉＢＳＡとのみインキュベートすることによって得た。翌日、切片を二次ビオチン化抗体と室温で１時間インキュベートし、次いでペルオキシ化ストレプトアビジン（Vectastain Elite ABC Kit Standard、Vector Lab）と３０分インキュベートした。免疫反応性は、０．０２％の過酸化水素を含有する発色剤基質３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸（DAB）と試料を暗所で５分インキュベートすることによって褐色で示された。次いで、核を染色するため、ヘマトキシリンで３０秒カウンター染色し、流水で１分現像した。最後に、切片を脱水し、透徹化し、バルサムにマウントした。染色および免疫組織化学反応を光学顕微鏡によって観察し、撮影した。

Claims (18)

1. 鼓膜を修復または再建するための組織補綴物をインビトロで調製する装置であり、２つのリング（８ａ）および（８ｂ）の間にブロックされた縁部を有する、間葉系幹細胞のための支持体をその中に配置したチューブ（１）を具備する装置において、前記リング（８ａ）および（８ｂ）が、第２の外部磁気手段との相互作用に適した第１の磁気手段を備え、そのような相互作用によって、リング平面がチューブの長手軸に垂直となるように前記チューブの内壁に対する前記リングの固定がなされ、かつ前記リング（８ａ）および（８ｂ）ならびにその結果として前記支持体の連続運動が、所定の距離と時間、チューブの前記軸に沿って上下交互になされることを特徴とする、装置。
2. 前記リング（８ａ）および（８ｂ）が、前記支持体の存在によって生じる前記チューブ（１）の２つの部分を流体連通させる溝（９）を備える、請求項１に記載の装置。
3. 前記第１の磁気手段が、前記２つのリング（８ａ）および（８ｂ）の間の前記支持体の縁部を磁気閉鎖によってブロックし、かつ支持体の中央部分を細胞の播種のために覆わないでおくことにも適している、請求項１に記載の装置。
4. 第２の磁気手段を備え、前記チューブ（１）を取り巻き、その上を自由にスライドするリング（６）と、モーター手段および第３の磁気手段を内部に備える中空カラム（３）と、第３の磁気手段と相互作用できる第４の磁気手段を備え、前記リング（６）に連結され、前記カラム（３）に固定され、その上を自由にスライドするカーソル（５）とをさらに具備し、前記モーター手段が、前記中空カラム（３）内部の前記第３の磁気手段、ならびにその結果として前記カーソル（５）、前記リング（６）ならびに前記リング（８ａ）および（８ｂ）を、所定の距離と時間、上下交互に連続運動させることができる、請求項１から３のいずれかに記載の装置。
5. 前記カーソル（５）および前記リング（６）が、２本の硬い炭素棒（７）を介して相互に連結されている、請求項４に記載の装置。
6. 穴（２１）、および前記穴（２１）に隣接した位置で基台（２）から起立するスタンド（２２）を備えた基台（２）をさらに具備し、前記穴（２１）が前記中空カラム（３）の収容に適しており、前記スタンド（２２）が前記チューブ（１）の支持に適しており、それにより、前記カラム（３）および前記チューブ（１）を前記棒（７）の長さと等しい距離で同軸位置に維持する、請求項４に記載の装置。
7. 前記チューブ（１）および前記中空カラム（３）それぞれの収容に適した隣接する２つの穴を備えたプレート（４）をさらに具備し、それにより、装置を操作する間の適切な安定性が得られ、細胞培養液の交換のためにチューブを容易に取り出すことが可能になる、請求項４に記載の装置。
8. 前記磁気手段が永久磁石である、請求項１または４に記載の装置。
9. 前記チューブ（１）内のｐＨおよび／または温度および／または代謝物濃度をそれぞれ検知し、測定するためのｐＨセンサーおよび／または温度センサーおよび／または適切な分析器をさらに具備する、請求項１から８のいずれかに記載の装置。
10. 前記第３の磁気手段の運動の速度および方向を調節するための制御手段をさらに具備する、請求項１から９のいずれかに記載の装置。
11. 鼓膜の組織補綴物をインビトロで調製するプロセスであって、
    − 前記補綴物の調製に必要な時間よりも長い時間の生物学的分解性および再吸収性を有する、実質的に二次元の支持体の上に間葉系幹細胞を播種する工程、
    − 細胞を播種した前記支持体に培地を添加する工程、
    − 細胞を播種し、培地を添加した前記支持体を２つのリング（８ａ）および（８ｂ）の間にブロックする行程であって、前記リングの間の前記支持体の縁部を磁気で閉鎖する工程、ならびに
    − 請求項１から１０に記載の装置のチューブ（１）の中に挿入し、所定の距離と時間、上下交互に連続運動させる工程
    を含むプロセス。
12. 前記支持体が、非多孔質材料、またはミクロ／ナノ多孔質の疎水性材料から作られている、請求項１１に記載のプロセス。
13. 前記支持体が、細胞を播種した表面に地形パターンを有し、前記パターンが、播種された幹細胞の配置および前記パターンが示す方向に沿ったコラーゲンの引き続く産生を誘導することができる、請求項１１に記載のプロセス。
14. 前記支持体が、静電紡糸によって得られたマイクロファイバーの不織布の形態の、場合によりヒドロキシアパタイトナノ粒子をドープした（*PCL-HA）星形ポリ（ε−カプロラクトン）（*PCL）から作られている、請求項１１に記載のプロセス。
15. 前記培地が、ウシ胎児血清、ならびに間葉系幹細胞を線維芽細胞に分化させることができる少なくとも１種の分化剤および／またはＩＩ型コラーゲンの産生を誘起する少なくとも１種の薬剤および／または線維芽細胞様表現型の維持を支持することができる少なくとも１種の薬剤を含む分化培地である、請求項１１に記載のプロセス。
16. 前記分化培地が、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、アスコルビン酸、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、インスリン様増殖因子、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の分化剤を含む、請求項１５に記載のプロセス。
17. 前記分化培地が、ピルビン酸ナトリウム、インスリン−トランスフェリン−セレン（ITS）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、リノール酸、およびＦ−１２／Ｄ−ＭＥＭ（栄養混合物F-12/Dulbeccoの改変イーグル培地）からなる群の１つまたは複数をさらに含む、請求項１５または１６に記載のプロセス。
18. 請求項１１から１７に記載のプロセスによって得られる鼓膜の組織補綴物。