CN105579576A - 用于制备鼓膜的仿生组织假体的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，并且涉及其相关的装置，用于从间充质干细胞体外制备鼓膜的仿生组织假体；该假体用于修复或重建需要其的患者中受损的鼓膜，例如作为多种创伤或病理的结果。

Description

用于制备鼓膜的仿生组织假体的装置和方法
技术领域
本发明涉及一般而言的医药生物技术领域，更精确地，其涉及一种装置，并且涉及一种相关的方法，用于体外制备鼓膜的仿生组织假体，该假体在需要其的患者中用于修复或重建膜本身。
背景技术
鼓膜不幸地经受各种病症，包括特别是中耳炎、鼓室硬化、珠光瘤和穿孔；后者代表了特别是在儿童中的很常见的临床问题，并且它可以是由许多病因引起的，诸如感染、由于异物进入的外伤、在外耳道的外科器械的插入、物理外伤或震耳欲聋的噪声所引起的。
尽管许多穿孔倾向于自动愈合，来源于穿孔的慢性感染可导致需要鼓膜重建性手术(被称为鼓膜成形术(M.Tos.Manualofmiddleearsurgery.ThiemeMedicalPublishers,Inc.纽约1993年，第1卷，第II部分，第8-13段))的耳聋、二次感染、鳞状上皮囊肿和珠光瘤的形成(参见例如GeneriEA等人的Ikiz.Otol.Neurotol.2003；24：371-6)。
下表中列举出目前为止在该手术中作为鼓膜的替代物所使用的材料(按照类型分类)：
目前，静脉(仅针对小穿孔)、软骨膜和颞筋膜是在鼓膜成形术中最常用的自体材料。特别是，颞筋膜的自身移植物是在外科实践中最常用的方法，其具有范围为88％至95％的封闭穿孔的成功率(RahmanA.等人，ActaOtolaryngol.2008年4月；128(4)：352-9；和KrauseD.S.等人，Cell2001年；105:369-77)。颞筋膜是到现在一直最常用的替代材料，这无疑构成了目前将所有其它材料与之相比的黄金标准，但它也并不是没有缺点的：成功率确实仍然由供体部位的可得性和待治疗的病变的大小所限制。小病变可容易地治疗，而通过普通技术的大穿孔或非外伤病变的治疗，甚至使用已显示最佳结果的材料，也往往被证明是不令人满意的，特别是对于一些患者，手术的风险和缺点是一直不可接受的重要方面。此外，鼓膜穿孔的医药治疗在发展中国家往往不管怎样也是不可及的。
另一方面，由于可能传染感染性疾病，已经很少用来自尸体的鼓膜和硬脑膜的同种移植物，就像异种移植物，这两种类型的移植也通常不被患者所青睐，并且经受排异。最后，目前采用的合成生物材料也具有影响干预结果的缺点，并且事实上合成生物材料会快速降解，并经常会导致中耳纤维化。
因此，目前还没有找到鼓膜修补术过程中待移植的理想替代材料(TehBM,MaranoRJ,ShenY,FriedlandPL,DilleyRJ,AtlasMD.Tissueengineeringofthetympanicmembrane.TissueEngPartBRev.2013Apr；19(2):116-32)。这种材料的确应该是可靠的，保证移植成功率高，并且使共体部位的发病率低。它也应该构成一种载体结构，通过该结构表皮层可以继续封闭损伤。这意味着，该载体应当用间充质细胞进行移植，在中耳的迁移上皮和粘膜之间形成纤维性成分的凝聚(在形态上和功能上将足以代替原始损伤的鼓膜)之前进行新生血管化。
因此，没有已知材料的上述缺点并且可以保证高成功率用于鼓膜成形术干预过程的自体来源的替代材料的发展仍然是需要实现的目标。该目标是特别具有挑战性的，不仅由于组织工程过程中通常固有的难题，而且还由于所讨论的特定组织，即鼓膜的性质。
鼓膜，其具有将由声波产生的振动从外耳传递到内耳的极其重要的作用的同时是非常薄的，鼓膜具有非常复杂的结构：它由松弛部和紧张部两部分组成，各自具有三层结构，其中在两层上皮层之间存在由主要为Ⅱ型胶原的胶原原纤维(fibril)形成的结缔组织的中间层，构成了形成以复杂方式排列的束的纤维(RossM.H.etal.Istologia,TestoeatlanteconelementidiBiologiacellulareandmolecolare,AmbrosianaPublishingHouse,2010)。在表示鼓膜的几乎整个表面的紧张部中，根据纤维的不同排列可以对纤维的不同体系进行区分：放射状纤维体系、圆形纤维体系、抛物线状纤维体系和最后的横向纤维体系。紧张部的这种特定结构在声音的传输中具有根本的重要性，并因此在鼓膜的功能中具有根本的重要性，但在耳的开发中，该结构的形成机理尚未阐明，而当然使开发可充分地再现其功能、模仿其形态的鼓膜的替代材料更加困难。
发明内容
现在本申请人已研制出一种装置和方法，用于体外制备鼓膜的仿生组织替代物，该装置和方法允许从间质干细胞开始制备具有重现天然膜的特性的那些特性、特别是耳鼓的紧张部的中间结缔层的那些特性(在其功能中具有必不可少的重要性)的材料。利用用于培养起始干细胞的作为生物反应器的创新装置，经显示以本发明方法得到的材料具有完全类似于由天然鼓膜的解剖研究检测到的胶原原纤维的尺寸、构成和空间取向的那些特性，从而也能够保持用于声音的正确传输的功能特性。由于磁体的特定体系，本发明的装置还允许，将细胞培养物移至生长溶液内而不与培养物本身接触，却由于外部传导装置和进行细胞培养的生物相容性内部结构之间的连接。
因此，本发明的主题是一种用于体外制备用于修复或重构鼓膜的组织假体的装置，其基本特征限定在第一项所附权利要求中。
一种用于体外制备上述假体的方法，其基本特征在限定在所附的权利要求11中，并且由此可获得的组织假体表示本发明的另一主题。
根据本发明的制备方法、装置和组织假体的特征和优点将通过作为非限制性实施例给出的本发明的实施方案的下述详细说明以及对附图的参考而变得更加清楚。
附图说明
-图1是本发明的装置的实施方案的透视图；
-图2是图1的装置的底座的透视图；
-图3显示了为图1的装置的组件的磁环的优选实施方案；
-图4显示了在生长细胞的载体上的在图1的装置中的管的横截面；
-图5显示了天然尺寸照片(A)和在静态条件(B)和使用本发明装置(C)的动态条件下以分化培养基的细胞培养物获得的两个样品用立体显微镜拍摄的显微照片；
-图6显示了对图5的两个样品(B)和(C)得到的共聚焦显微镜图像；和在相同培养基的条件下仅将星形支化的聚(ε-己内酯)*PCL的载体替换为加入羟基磷灰石纳米颗粒的星形支化的聚(ε-己内酯)*PCL/HA的载体上得到的另外两个样品；
-图7显示了，对于所分析的不同的样品而言，以采用*PCL中载体和*PCL/HA中载体的本发明主题的系统(以分化培养基的动态培养)产生的细胞结构、以及相对静态的对照组和以非分化培养基的对照组中相对于纤维母细胞抗原表达以及I型和II型胶原表达的由免疫组织化学分析得到的图像。
具体实施方式
在本发明中，术语“静态”和“动态”分别表示存在和不存在机械刺激(特别是由于本发明装置产生的)下培养细胞的模式。
参考附图，特别是图1至4，根据本发明的优选的实施方案的装置包括管1，其具有几乎圆柱形的形状和适于容纳用于根据本发明方法的细胞培养物的材料的尺寸，管1与具有后文详细描述的特定系统的空心柱3连接，空心柱3将特定机械刺激应用至管1以将细胞培养物在管本身的内部移动。
特别地参考图1和2，本发明装置包括底座2，设有孔21和在临近孔21的位置的从底座2升起的台22，本发明装置意图从下面支持管1；因此，台22的上表面将优选地设有凹处23，其具有适用于将管1底部嵌入的形状。另一方面，在底座2中的孔21意图将空心柱3嵌入与管1共轴的位置中。在该位置中，由于设有适于将管1和柱3嵌入的两个孔的板4，还可以通过从上面插入板4而保持柱3和管1，在装置的操作过程中为柱3和管1提供了充分的稳定性，并使管1容易地抽出以替换细胞培养物。
根据本发明的优选实施方案，管1设有配有用于从上面以螺帽封闭的螺纹，优选地管1具有为了使操作人员更好抓取并且易于除去螺帽以对管进行填充操作和清空操作的凸边。
在空心柱3内部，有磁性装置和将磁体可选地向上或向下移动预定距离和时间的电机，还存在固定在相同空心柱3的外部的游标5，设有磁性装置的所述游标5，通过和柱内部的磁性装置相互作用，使游标5以由内部磁性装置引导的运动移动。固定在柱3且在其上自由滑动的游标5反过来也通过两个刚性杆7(优选地由碳制得)连接至围绕管1的环6，刚性杆7将游标5的移动传递至环6，环6在管1的壁上自由向上和向下滑动。在空心柱3中的电机为例如与引导螺钉相连的步进电机，其产生由于磁体体系在管1内部传递的垂直运动。
设有磁性装置的环6确实构成了允许移动并由此将机械刺激给予布置在管1内部的细胞培养物的磁性环体系的外部组件的实施方案。如在后文更好地所描述的，将以薄膜的形式在适合载体上进行适当接种的、待在本发明装置中进行培养的细胞确实布置在维持载体膜的两个环8a和8b之间，并且与载体膜一起的细胞在被插入管1内部之前被封住；该环8a和8b具有能够插入管1的直径，使得它们的平面垂直于管1的纵轴排列，并且环8a和8b设有磁性装置；由于这些磁性装置的存在，环8a和8b与外环6相互作用，并且它们经受伴随具有细胞的载体的运动的外环6的运动。
图3描绘了具有内部磁性装置的环8a和8b的优选实施方案，其中该环沿外周设有意图用于接触管1的内壁的槽9；将两个环中的槽9布置成彼此为直线，以便产生使由具有细胞的载体的存在而将管1分隔的两部分形成液体连通的空间，迫使含有存在于管中的生长培养基的溶液以正切于载体表面的径向运动(从中心向圆周(图4))从载体的一侧传递至另一侧，作为载体多孔性的功能，由此促进载体在溶液中向上和向下运动并保持载体两侧细胞生长培养基的相同浓度。图4显示了管1在细胞载体处的横截面，其中可以观察到的是，外环6围绕管1的壁，并且在外环6内部，两个环中的一个8a设有保持细胞载体位置的槽，事实上插入于两个环8a和8b之间。由于在环本身上存在的磁体，实现了在两个环8a和8b之间载体的封闭。
通过在附图中所描绘的特定实施方案中的空心柱中的外部电机，随着非接触式移动的传递，将磁力传递至在管内部的具有细胞的载体。能够通过磁力将具有细胞培养物的载体以非接触的方式吸引并拖拉而穿过管1的任何类型的外部电机适合实现本发明。由此传递至管1内部的磁性环8a和8b的运动使具有细胞的载体作为移动单元与这样的环一起在生长培养基的溶液内部移动，由于槽9生长培养基的溶液可在环8a和8b的外周和管1的内壁之间产生的空间中滑动。环的向上和向下运动基本上对细胞的载体产生两种类型的张力，其在图4中以箭头示意性地描绘：一种比载体中心更大的负载压力；和一种比朝向载体外周更大的水流剪切力；传递至细胞载体的运动由此提供了两个自由度以用于在本发明装置内部的细胞培养物中产生不同生长条件。如在下文详细描述的，对细胞的这些不同生长条件的控制既可以通过针对由电机产生的运动速度和运动幅度来实现，也可以通过针对细胞载体的选择来实现。
由本发明的生物反应器应用在培养基内部的细胞结构上的周期性垂直运动可通过调节周期运动的幅度和其频率对速度值进行调整，例如从几乎静态至约2.5cm/s，优选地从约1.5至约2.0cm/s。将运动的幅度按照管1的尺寸设定，并且它也可以按照在本身内部使用的液态培养基的量的函数进行调整；例如，运动的幅度可包括在约3至10cm之间，优选地在约4至8cm之间。例如，在以上所述范围内较小幅度的运动产生较低的应力，且对鼓膜结构与上皮细胞的共培养物(如鼓膜角化细胞)是特别优选的，然而，较高幅度产生了对与内皮细胞的共培养物(如用于新血管形成)最优选的应力。
具有基本上平行六面体的形状的本发明载体的底座2，除了作为管和具有电机的柱的载体之外，也可作为将驱动电机并对柱3内部磁性装置给予所需的运动速度值和方向所必要的电子组件嵌入。有利地，可将用于调节速度的开关和按钮(未在图中显示)布置在底座2的适当位置上，以便可以由使用者便捷地通过简单地启动按钮对根据本发明的动态细胞生长条件进行修改和控制。
由于优选为永久磁体的磁性装置的存在，本发明装置没有外部电缆，这使得它特别适合在潮湿环境中使用，以及在每次细胞生长周期之前和之后允许必要的清洗和消毒操作。
有必要对可制备本发明的装置的设计和材料按照它们用途的功能进行选择，这预示着在高湿度水平和与室温相比的较高温度下、在无菌环境中连续操作很多小时。用于制造装置的各种部分的材料优选为但本发明的范围还应当被认为包括可以便捷进行清洗和消毒的任何其它的等效材料，该材料能承受在正常操作过程中装置经受的操作条件；然后，通常将装置各部分由不锈钢螺钉连接在一起。根据本发明待进行消毒的磁体优选地选自具有高于高压釜中消毒温度的居里温度的磁体。
根据本发明装置的特别实施方案，该装置将还包括pH传感器和温度传感器，用于检测这些参数，从而评估这些参数对细胞培养物的生长动态的影响，并因此能够修改和控制这些参数以引导细胞在所需方向上生长。本发明装置还可以包括用于测量在细胞培养物中代谢物浓度的合适的分析仪。
如在以下实验部分所示，由本发明的装置产生的在细胞的载体上的张力变形代表机械刺激，其有助于通过产生II型胶原将起始干细胞分化成鼓膜的纤维母细胞的同时保持纤维母细胞表型(非软骨细胞)。本申请人还已经证实，这种机械刺激将在载体上的胶原纤维的组织引导成向纤维的径向圆周排列，来模拟在天然鼓膜中观察到的相同纤维组织。通过化学刺激可进一步有助于起始干细胞分化为纤维母细胞，即，通过使用具有分化作用的适合的培养基。
因此，根据本发明方法的优选实施方案，在引入本发明装置内部的具有细胞的载体以移动培养物之前，将已经接种了细胞的载体加入能够改善干细胞的软骨形成的分化培养基。根据本发明的合适的分化培养基包括，除胎牛血清(FBS)外，至少一种就软骨形成而言的分化剂，像例如TGF-β(转化生长因子β)、抗坏血酸、BMPs(骨形态发生蛋白)、b-FGF(碱性纤维母细胞生长因子)、胰岛素类生长因子和相似物；并且优选地其包括它们的混合物。在本分明的分化培养基中，前述试剂有可能与来自丙酮酸钠、胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、亚油酸、营养混合物F-12/D-MEM(达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基)和类似物中的一种或多种进行结合。可选地，可能的是使用市面上有售的即用软骨形成的分化培养基，像例如通过添加FBS而优化的MiltenyiBiotec’sChondroDiff培养基。
可选地，接种有细胞的载体在被引入到本发明的装置之前，可以加入适合的非分化培养基，像例如任何合适的碱性培养基，像D-MEM或具有胎牛血清的α-MEM(α改良伊格尔氏培养基)。
在根据本发明的方法中的细胞的载体有必要在一种优选生物可降解并且相对于对假体的开发的较长时期内可再吸收的材料。这确保了在生物材料的完全降解发生之前对细胞结构进行完全地开发：尽管体内降解时间极大地依赖于在中耳内的活性病理的存在，约3个月或更久的再吸收的时间被认为是最佳时间，因为其确保了结构的充分发展和体内融合(BeutnerD,HüttenbrinkKB.Passiveandactivemiddleearimplants.Laryngorhinootologie2009May；88Suppl1:S32-47)。载体还必须具有多孔性，诸如促进细胞的凝集现象，和防止细胞经过孔被本发明装置中的培养阶段的生长液的流动带走；因此，载体材料的孔会具有与起始间充质干细胞的直径相比更小的直径。为了能够被适当地布置在管内部的两个环8a和环8b之间并在它们之间以磁性封闭闭合，在本发明装置内的动态培养阶段过程中保持位置，根据本发明的载体优选地由配有一定程度的弹性的材料制得，并具有基本上两维的形状，“大体上两维”表示相对于其它维度厚度可忽略不计，即使该厚度足以容纳细胞并且在植入后的再吸收前事实上执行载体功能；因此，本发明载体表现得像临时“模板”。此外，本发明载体优选地由非多孔材料或具有微米孔或纳米孔的材料制得，然而，在这种情况下，材料具有疏水性，限制了在本发明装置中的培养基的横向流动的现象；换言之，这种类型的载体确保了通过载体本身的流体相对于通过在管1和连接的环8a与8b之间的槽9的流体有所减少或完全不存在。
根据本发明，可能用于制备载体的材料选自能够以基本上二维载体(致密载体的形式(例如以微米膜或纳米膜的形式)的形式和紧密网状微米纤维或纳米纤维的组织(例如以静电纺丝组织)的形式)进行加工的合成来源的聚合物、天然聚合物或它们的混合物(例如生物人工聚合物)。下文列出了许多种类的合成的和/或天然的聚合物，它们是水可降解的和/或酶可降解的，并且适合用于生物医药用途，其可根据上面示出的要求进行加工。根据本发明很可能使用的合成聚合物选自聚酐类、聚碳酸酯类、聚α酯类、聚酯类、聚氨酯类、聚原酸酯类、聚缩醛类、聚磷腈类、聚酰胺类和它们的共聚物或混合物。在聚α酯类中，优选地使用由例如聚乳酸的聚交酯类、例如聚乙醇酸的聚乙交酯类和例如在本文中表示为PCL的聚(ε-己内酯)的聚己内酯类，线性或在本文中表示为*PCL的星形。星形聚(ε己内酯)(*PCL)对制备本发明是特别优选的。
根据本发明的特别的实施方案，上述聚合物可掺杂纳米颗粒，例如纳米球、纳米管以及类似物，以促进软骨形成样分化和/或调节基础聚合物的化学-物理的、表面或结构的性质，像例如疏水性、粗糙度、弹性模量等；可能被使用的纳米颗粒的示例为羟磷灰石纳米颗粒(HA)(Spadaccino等人，AnnBiomedEng.2009年7月，第37卷：第1376至1389页)、药物释放纳米颗粒和其类似物。
根据本发明可能被使用的天然来源的聚合物可以选自，例如纤维素、壳多糖、透明质酸和其类似物的衍生物的聚多糖类，和像例如纤连蛋白(像纤维蛋白原、胶原和弹性蛋白)的聚合物的蛋白质。
根据本发明的特别优选的实施方案，载体由通过静电纺丝获得的微纤维的非织造织物形式的可能掺有羟磷灰石纳米颗粒(*PCL/HA)的星型聚(ε己内酯)(*PCL)制成。
根据本发明的特别实施方案，载体设有表面上接种有细胞的地形图案(微图案)，其产生能够引导所接种的干细胞排列的路径，并且继而沿由图案本身表示的方向产生胶原。以这种方式，有可能促进胶原团聚体在天然鼓膜中观察到的沿所需方向形成，从而对载体表面的细胞产生地形刺激。出于这些原因，地形图案的使用是根据本发明优选的，即使期望的鼓膜组织假体可通过本发明的装置和制备方法获得而无需使用上述地形图案、细胞培养物和通过由本发明装置加强的连续运动引导的胶原的制备。
实验部分
在下面的实验中，采用人类间充质干细胞，在比萨的意大利比萨大学医院，血液学研究所，从经受髋关节置换手术的患者的骨髓中分离人类间充质干细胞。患者在自由意志和充分知情后给出他们对于采集的书面同意，和研究在收获的细胞物质上进行并在后面进行描述。
细胞的培养物以及对所获得样本细胞活力和空间取向的分析
根据标准流程，通过离心将间充质干细胞按照密度梯度(FicollHistopaque)进行分离，并在加入10％的胎牛血清(FBS；Invitrogen，美国)、200mM的L-谷氨酰胺的(Invitrogen)、100U/mL的青霉素和0.1mg/ml的链霉素(Lonza)的Dulbecco'sModifiedEagleMedium(D-MEM)中进行扩增，并保持在湿润气氛和5％CO2的37℃的培养箱中。
将由此分离的细胞接种在基于星形聚(ε己内酯)的通过静电纺丝获得的微纤维的非织造织物中的载体上，如此或以羟磷灰石纳米颗粒掺杂(分别为*PCL和*PCL/HA)，这样的载体以每个载体接种250000个间充质干细胞，再次使用用于扩增细胞的上述培养基作为培养基。
在将细胞接种在载体上72小时后，向由此获得的*PCL或*PCL/HA的细胞/载体结构的一部分加入分化培养基，该培养基由加入10ng/ml的TGF-β1(Peprotech)、50ng/ml的抗坏血酸(Sigma)、10％的FBS(Invitrogen)、200mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen)、100U/mL的青霉素和0.1mg/ml的链霉素(Lonza)的D-MEM:F-12营养混合物(Sigma-Aldrich)组成。另一方面，将*PCL的细胞/载体结构的一部分保持在非分化培养基中，对细胞培养36小时，以促进其粘附到基底。
将由此制备的所有结构在静态和动态条件下进行7天的进一步细胞培养阶段，即在本发明的生物反应器中，其中施加在载体上的周期运动的幅度被调节在4.55cm并且其频率为0.2Hz，由此导致1.82cm/s的平均速度。
对由此获得的材料最终进行中性红实验，将活细胞染色为红色，允许它们在空间上定位。该实验的结果表明，对于静态培养的样品和在本发明的生物反应器中培养的样品，在与天然鼓膜可比较的维度上大面积的被细胞覆盖的表面。在图5中，可以观察到，例如，对接种在*PCL上的细胞以及在非分化培养基中的静态和动态条件下培养的细胞所获得的实验结果；特别是，显示了自然尺寸(A)下的照片和在静态条件(B)和在动态条件(C)下的两个样品的立体显微照片。从这些结果中，已经可以注意到，尽管静态培养产生了细胞的均匀分布[图像(B)]，而在本发明设备中动态培养的情况下的，可观察到细胞根据半圆线的团聚现象[图像(C)]。在相同的图像中可观察到清晰的边缘，由于在两种样品中均呈现并且对在周围区域获得的材料的外科耦合有用的载体的支持轮廓的存在，由此在该区域不存在细胞。在另一方面，图6(B)和(C)显示了对与图5的样品类似、但使用分化培养基获得的两个样品所得到的共焦显微镜图像，图6(B’)和(C’)显示了对已经受相同培养条件、但使用在*PCL/HA中的载体替代在*PCL中的载体的两个样品获得的图像。应当注意到的是，在椭圆形的绿色中存在细胞的细胞核，而F-肌动蛋白的细丝被标记为红色。该图像在微观水平上确认了已经由先前的图像所示出的内容，即，作为用于细胞培养的生物反应器的本发明装置的使用，以及基本上保持甚至增加已经通过在静态条件下培养的样品显示的良好的生物活性，还产生了模拟天然膜的紧张部的取向的细胞的特定取向。在图6中，也可能观察到的是针对通过将细胞接种在*PCL中的载体上而制备的对照样品所获得的图像，不采用分化培养基并且在静态培养条件中，从中可以清楚地观察到，细胞活性在这种情况下要低得多。
样本的组织学分析
为了确定所得材料的组成和特性来评估其与天然鼓膜的亲和性，对被认为重要的标志物进行鉴定，即胶原I、II、III和IV以及抗纤维母细胞抗体，对细胞在不同培养条件下的表达进行检测。下表1显示了根据下列标准、通过由显微镜观察所确定的抗原强度的分数：
“-”为阴性
“+”为微阳性
“++”为阳性
“+++”为强阳性
“++++”为非常强阳性
表1
从所得到的结果中，其呈现出典型的纤维母细胞的表面抗原如何在所有样品中表达，然而在分化的样品中增加，且在也经受本发明的装置中的机械刺激的样品中为进一步增加表达。胶原I也可在细胞内水平观察到相似的趋势察到，即在非分化样品中具有低表达，在分化的样品中表达增加，具有普遍地细胞内的细胞质的阳性。胶原II尽管在所有样品中均有表达，但是表达弱，其在本发明的装置中培养的分化样品中、特别是具有在*PCL中的载体的样品中表达增加。
图7显示了通过光学显微镜的代表所分析样品的免疫组织化学图像。该图像突出显示了抗原如何表达以及它们的定位(细胞内或细胞外)以及它们在所分析的细胞结构中的分布。免疫组织化学是一种通过采用抗原-抗体反应来获得信息，然后通过适当的色原体进行检测的方法。该方法基于一系列将表面抗原连接至色原体底物的双分子的序列结合，同时将反应扩大以使其通过光学显微镜清晰地可见，并且在本发明的情况下，其通过以下过程实现。
在消除内含物并对培养基进行再水化之后，将切片进行合适的暴露处理，以使感兴趣抗原与一抗结合。在大多数情况下，采用0.2％的TritonX-100(Sigma)对样品进行10分钟透化，而对抗原胶原II的暴露，将切片在放置于90℃恒温浴中的柠檬酸盐缓冲液(Diapath，意大利)进行10分钟孵育中温育。此后，将切片在含有0.6％的36-体积的过氧化氢的甲醇溶液中孵育，以封闭样品中存在的内源过氧化物酶的活性，在去离子水和PBS1×中洗涤切片，并用获得二抗的动物物种的血清进行孵育温育，在37℃下将山羊血清用PBS1×按1:20进行稀释20分钟，以封闭二抗本身可能的非特异性结合。然后在4℃下用稀释于牛血清白蛋白(BSA)中的一抗对切片进行过夜孵育。所使用的一抗如下：多克隆兔抗胶原I型抗体1:1200(ab34710，abCam公司，美国)、单克隆鼠抗胶原II型抗体1:50(sc52658，SantaCruz公司)、单克隆鼠抗纤维母细胞1:6000抗体(Sigma)。将一些切片仅用0.1％的双BSA孵育而获得阴性对照组。一天后，将切片与生物素化二抗在室温下孵育1小时，然后与过氧化链霉(VectastainEliteABC试剂盒标准，Vector实验室)孵育30分钟。通过将样品在黑暗中与含有0.02％的过氧化氢的色原体底物3-3'-二氨基联苯胺四盐酸(DAB)温育5分钟，免疫反应活性显示为棕色。然后使用苏木素复染30秒，在流水中显影1分钟以使细胞核染色。最后，对切片进行脱水、澄清并安装在香脂中。观察染色和免疫组织化学反应并用光学显微镜拍摄。

Claims (18)

1.一种用于体外制备用于修复或重建鼓膜的组织假体的装置，包括管(1)，所述管(1)中放置有间充质干细胞的载体，所述载体具有阻挡在两个环(8a)和(8b)之间的边缘，所述装置的特征在于，所述环(8a)和(8b)设有适用于与第二外部磁性装置相互作用的第一磁性装置，由此该相互作用确定了：将所述环以环平面垂直于所述管的纵轴而固定至所述管的内壁，并且所述环(8a)和(8b)以及由此地所述载体沿所述管的所述轴、可选地向上和向下地连续运动预定的距离和时间。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述环(8a)和(8b)设有使由所述载体的存在而形成的所述管(1)的两部分形成液体连通的槽(9)。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述第一磁性装置也适用于以磁性封闭对所述两个环(8a)和(8b)之间的所述载体的边缘进行阻挡，并适用于将无覆盖的所述载体的中心部分留下用于细胞接种。
4.根据前述权利要求中任一项所述的装置，还包括：
环(6)，设有第二磁性装置，围绕所述管(1)且在所述管(1)上自由滑动；
空心柱(3)，包括内部电机装置和第三磁性装置；和
游标(5)，设有能够与所述第三磁性装置相互作用的第四磁性装置，连接至所述环(6)，固定在所述柱(3)上并且在所述柱(3)上自由滑动，
其中所述电机装置能够产生所述空心柱(3)内的所述第三磁性装置的连续运动，并由此地使所述游标(5)、所述环(6)和所述环(8a)和(8b)产生可选地向上和向下连续运动预定的距离和时间。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述游标(5)和所述环(6)彼此之间通过两根刚性碳杆(7)连接。
6.根据权利要求4所述的装置，还包括设有孔(21)和台(22)的底座(2)，其中所述台(22)在与所述孔(21)相邻的位置从所述底座(2)升起，所述孔(21)适用于将所述空心柱(3)嵌入，并且所述台(22)适用于支持所述管(1)从而将所述柱(3)和所述管(1)以等于所述杆(7)的长度的距离保持在同轴的位置。
7.根据权利要求4所述的装置，还包括设有适用于分别将所述管(1)和所述空心柱(3)嵌入的两个相邻的孔的板(4)，由此在所述装置的操作过程中为所述管(1)和所述空心柱(3)提供足够的稳定性并使所述管在替换细胞培养物时可容易地被抽出。
8.根据权利要求1或4所述的装置，其中所述磁性装置为永久磁体。
9.根据前述权利要求中任一项所述的装置，还包括pH传感器和/或温度传感器和/或分别用于感应和测量所述管(1)内部的pH和/或温度和/或代谢物浓度的适合分析仪。
10.根据前述权利要求中任一项所述的装置，还包括用于调节所述第三磁性装置的运动速度和运动方向的控制装置。
11.一种用于体外制备鼓膜的组织假体的方法，包括以下步骤：
-将间充质干细胞接种在可生物降解并且在比用于制备所述假体所必要时间更长的时间可再吸收的基本上二维的载体上；
-将培养基加入到接种有细胞的所述载体中；
-用所述环之间所述载体的边缘的磁性封闭将接种有细胞并且加入了所述培养基的所述载体阻挡在两个环(8a)和(8b)之间，和
-将权利要求1至10中限定的装置的管(1)插入，并使其可选地向上和向下连续运动预定的距离和时间。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体由非多孔材料制得，或由微孔/纳米孔的疏水性材料制得。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体在其接种细胞的表面具有地形图案，所述图案能够引导所接种的干细胞沿由所述图案指示的方向排列，并继而引导沿由所述图案指示的方向产生胶原。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体由通过静电纺丝获得的微纤维的非织造织物形式的可能掺有羟磷灰石纳米颗粒(*PCL/HA)的星型聚(ε己内酯)(*PCL)制成。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述培养基为分化培养基，所述分化培养基包括胎牛血清和至少一种能够将间充质干细胞分化为纤维母细胞的分化剂，和/或至少一种诱导II型胶原生产的试剂，和/或至少一种能够支持维持成纤维样表型的试剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述分化培养基包括至少一种选自由TGF-β(转化生长因子β)、抗坏血酸、BMP(骨形态发生蛋白)、b-FGF(基本纤维母细胞生长因子)，胰岛素类生长因子和它们的混合物组成的组的分化剂。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述分化培养基还包括由丙酮酸钠、胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、亚油酸和F-12/D-MEM(营养混合物F-12/达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基)组成的组中的一种或多种。
18.一种以在权利要求11至17中限定的方法可获得的鼓膜的组织假体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110914402A (zh) * 2018-02-15 2020-03-24 富有干细胞株式会社 细胞培养装置
CN113209388A (zh) * 2021-03-30 2021-08-06 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 一种传递声音和诱导鼓膜再生的纤维膜及其制备方法和应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2897561B1 (en) * 2012-09-21 2020-11-04 Washington University Biomedical patches with spatially arranged fibers
KR101787905B1 (ko) * 2016-07-12 2017-11-15 아주대학교산학협력단 Pcl 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법
US20200384151A1 (en) * 2016-07-12 2020-12-10 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Pcl patch tissue regeneration scaffold and method for manufacturing same
KR102093806B1 (ko) * 2017-02-10 2020-03-26 아주대학교산학협력단 Pcl 및 peg 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법
IT201700004017A1 (it) * 2017-01-16 2018-07-16 React4Life Srl Bioreattore e metodo di utilizzo di detto bioreattore
US20190322973A1 (en) * 2018-04-24 2019-10-24 Providence College Capture device for a cell plate
WO2020144968A1 (ja) * 2019-01-11 2020-07-16 ローツェライフサイエンス株式会社 ガス滅菌に対応可能な駆動機構
JP7132640B2 (ja) * 2020-03-05 2022-09-07 株式会社フルステム 細胞培養装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2728501A (en) * 1999-12-30 2001-07-16 Insound Medical, Inc. Direct tympanic drive via a floating filament assembly
CN101528283A (zh) * 2005-01-24 2009-09-09 纽罗赛斯特克公司 给内耳和其他组织递送治疗剂和/或其他药剂的设备和方法
CN101721741A (zh) * 2008-10-14 2010-06-09 孙建军 一种组织工程化鼓膜细胞支架
WO2010148345A3 (en) * 2009-06-18 2011-03-10 SoundBeam LLC Eardrum implantable devices for hearing systems and methods

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5928945A (en) * 1996-11-20 1999-07-27 Advanced Tissue Sciences, Inc. Application of shear flow stress to chondrocytes or chondrocyte stem cells to produce cartilage
DE10349484A1 (de) * 2003-10-21 2005-05-25 Universität Leipzig Verfahren und Bioreaktor zum Kultivieren und Stimulieren von dreidimensionalen, vitalen und mechanisch widerstandsfähigen Zelltransplantaten
KR100595940B1 (ko) * 2004-06-11 2006-07-05 주식회사 바이오랜드 세포 배양용 막의 지지 장치
WO2006028274A1 (ja) * 2004-09-08 2006-03-16 National University Corporation Nagoya University 細胞培養物の生産と該生産に用いる材料
US20090221076A1 (en) * 2005-03-01 2009-09-03 Gc Corporation Method of fabricating sheet for cartilage tissue regeneration
JP4817847B2 (ja) * 2006-01-11 2011-11-16 独立行政法人農業生物資源研究所 磁気付与型ハイドロゲル薄膜
NL1036038C (en) * 2008-10-09 2010-04-14 Univ Eindhoven Tech Multilayer preform obtained by electro-spinning, method for producing a preform as well as use thereof.
EP2468846A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-27 Ludwig-Maximilians-Universität München A method of examining tissue growth and conditioning of cells on a scaffold and a perfusion bioreactor
EP2500410A1 (en) * 2011-03-18 2012-09-19 Ludwig-Maximilians-Universität München Bioreactor with mechanical and electrical stimulation means
EP2731549B1 (en) * 2011-07-11 2021-09-15 Ear Science Institute Australia Device for ear drum repair

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2728501A (en) * 1999-12-30 2001-07-16 Insound Medical, Inc. Direct tympanic drive via a floating filament assembly
CN101528283A (zh) * 2005-01-24 2009-09-09 纽罗赛斯特克公司 给内耳和其他组织递送治疗剂和/或其他药剂的设备和方法
CN101721741A (zh) * 2008-10-14 2010-06-09 孙建军 一种组织工程化鼓膜细胞支架
WO2010148345A3 (en) * 2009-06-18 2011-03-10 SoundBeam LLC Eardrum implantable devices for hearing systems and methods

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANISUR RAHMAN: "Stem cells and enhanced healing of chronic tympanic membrane", 《ACTA OTO-LARYNGOLOGICA》 *
BING MEI TEH: "Tissue Engineering of the Tympanic Membrane", 《TISSUE ENGINEERING》 *
MORGAN E. HOTT: "Fabrication of Tissue Engineered Tympanic", 《THE LARYNGOSCOPE》 *
SASA JANJANIN: "Mold-Shaped, Nanofiber Scaffold-Based Cartilage Engineering Using", 《JOURNAL OF SURGICAL RESEARCH》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110914402A (zh) * 2018-02-15 2020-03-24 富有干细胞株式会社 细胞培养装置
CN110914402B (zh) * 2018-02-15 2023-04-25 富有干细胞株式会社 细胞培养装置
US11661575B2 (en) 2018-02-15 2023-05-30 Fullstem Co., Ltd. Cell culture device
CN113209388A (zh) * 2021-03-30 2021-08-06 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 一种传递声音和诱导鼓膜再生的纤维膜及其制备方法和应用

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Publication number Publication date
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WO2015040554A1 (en) 2015-03-26
US20160228606A1 (en) 2016-08-11
EP3047016A1 (en) 2016-07-27
JP2016533189A (ja) 2016-10-27
ITFI20130220A1 (it) 2015-03-21

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