CN101721741A - 一种组织工程化鼓膜细胞支架 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由胶原和壳聚糖混合后烘干制备而成的膜性基质(细胞支架)，制备过程简便，其中胶原成分为鼠尾提取的I型胶原，占混合物重量的90％，壳聚糖成分为75-95％脱乙酰的壳聚糖，占混合物重量的10％。本发明利用这种复合膜作为组织工程化鼓膜构建的细胞支架，发现其适合鼓膜上皮角朊细胞和成纤维细胞生长、增殖，且能够保持成纤维细胞良好的胶原分泌功能。本发明为进一步构建组织工程鼓膜奠定了基础。

Description

一种组织工程化鼓膜细胞支架

技术领域

本发明涉及一种构建组织工程化鼓膜的膜性基质(细胞支架)材料及其制备方法，更具体的，本发明涉及一种新的胶原-壳聚糖膜的制备，利用该材料可以在体外接种角朊细胞及成纤维细胞，从而为构建组织工程化鼓膜提供细胞支架。

背景技术

鼓膜是听觉器官中重要的传音结构之一，它使作用于鼓膜的声压传至卵圆窗膜时提高了17倍，另外，完整的鼓膜-听骨链传音系统还可以保证声波对卵圆窗的单向传音功能，从而提高听觉敏感度。鼓膜是厚度仅为0.1毫米的膜状结构，一面暴露于外界，一面朝向呼吸道黏膜衬里的鼓室，覆盖在容易产生化脓性炎症的含气空腔上，所以很容易受到损伤导致穿孔，鼓膜组织结构的异常，如鼓膜钙化、瘢痕、穿孔等，均可影响鼓膜的正常传音功能。鼓膜穿孔是耳科临床上的常见病、多发病，严重的鼓膜穿孔导致的听力损失甚至可以高达50分贝^[1]。鼓膜长期穿孔，还可引发一系列的病理改变，包括听力下降、言语发育迟缓、慢性耳瘘及胆脂瘤形成等，需要进一步治疗^[2]。常用的治疗方法是鼓室成形术，临床上多选用自体颞骨骨膜、颞肌筋膜或耳屏软骨膜封闭穿孔。虽然取得一定疗效，但功能恢复和远期效果仍不理想^[3、4]。Maning发现，近期的手术成功率为78％，但仅52％能恢复为有功能的中耳腔结构。Gianoli等曾有92％成功率的报道，但经过严格的2年期随访，降至38％。鼓膜的强度及张力主要由放射状纤维维持，而研究发现大部分的穿孔愈合是“假膜愈合”，即仅有上皮层和粘膜层，代替中间纤维层的仅为少量无正常结构的小纤维束^[5]。由于与鼓膜组织结构存在差异，获取自体材料时对机体的损伤和自体材料不足等原因，促使我们期待利用组织工程学技术来解决上述问题，避免患者不必要的损伤，提高听功能恢复的远期疗效。

目前有报道利用异种生物合成移植物，如无细胞性真皮移植物(AlloDerm)、胶原膜、透明质酸为主的生物可吸收膜在临床上或动物实验中作为鼓膜移植物应用^[6-8]。但尚未见具有细胞成分的真正意义上的组织工程化鼓膜构建及应用的研究报道。鼓膜与皮服具有相似的组织结构：同样具有包括外侧角质层及下面颗粒层、棘刺层和基底层的复层鳞状上皮，鼓膜中间的纤维组织层对应表皮的真皮层，均由由结缔组织组成，主要细胞为成纤维细胞。鼓膜组织不含有毛囊及汗腺等皮肤附属器(构建皮肤附属器是现代组织工程皮肤难以攻克的难点)，故组织工程化鼓膜的构建在可行性和实用性方面更具有优势。

组织工程化鼓膜的构建必须具备2个基本条件：足够数量的形态功能正常的种子细胞和适当的细胞外支架——膜性基质。组织工程皮肤构建与应用研究的已有成就，为种子细胞的获取提供了充分的技术支持，而我们要解决的难点就是支架的构建。组织工程支架材料为种子细胞提供了适合其生长、基质合成及发挥其他功能的生物学环境，是细胞附着的基本框架，并在移植时作为细胞的载体^[9-12]。

理想的组织工程鼓膜细胞支架基质必须具有如下特征：①良好的理化特性：即满足生物材料的一般要求，如无毒性、不致畸等，还要利于种子细胞黏附、生长和分化；②良好的生物相容性；③良好的生物降解性：降解速率应与组织细胞生长速率在时间-空间上相适配，降解时间应能根据组织生长特性进行人为调控或自我调整；④具有三维立体多孔结构：基质材料应可加工成三维立体结构，孔隙率最好达到90％以上，具有较高的面积/体积比，为组织和细胞生长提供足够的空间和交换通道；⑤良好的可塑性和机械强度：基质材料应可预先制作成一定的形状，并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特征；⑥良好的支架-细胞界面：材料应能提供良好的支架-细胞作用界面，利于细胞黏附、生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型。

参考文献：

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发明内容

为了提供合适的组织工程化鼓膜支架材料，本发明通过烘干法制备了胶原-壳聚糖膜，制备过程简便，其中I型胶原占混合物重量的90％，75-95％脱乙酰的壳聚糖占混合物重量的10％。本发明利用这种复合膜作为组织工程化鼓膜构建的细胞支架，发现其适合鼓膜上皮角朊细胞和成纤维细胞生长、增殖，且能够保持成纤维细胞良好的胶原分泌功能。本发明为进一步构建组织工程化鼓膜奠定了基础。

参照下面对本发明例示性实施方案和其中包括的实施例的详细描述，可容易地理解本发明。

作为声明，应理解为上述的说明仅是例示性和说明性的，而不是对本发明的限制。本领域技术人员当然可根据本领域的常规理论和技术改变下面的方案。

附图说明

图1胶原-壳聚糖膜呈白色、半透明状，具有一定弹性的组织，并有一定的抗拉力，适于手术操作。

图2DAPI标记的传代鼓膜上皮层角朊细胞接种于膜表面，48小时大部分细胞贴壁呈鹅卵石样。(×200)

图3DAPI标记的传代鼓膜上皮层角朊细胞接种于膜表面，4天后细胞数量开始增多，并有集落形成。(×200)

图4DAPI标记的传代鼓膜上皮层角朊细胞接种于膜表面，10天细胞接近铺满培养皿的底部，呈现典型的铺路石状。(×200)

图5免疫荧光染色显示胶原-壳聚糖膜上鼓膜角朊细胞胞浆内表达角蛋白(CK)，一抗CK(1∶50)、二抗FITC(1∶200)，绿色荧光为阳性表达，蓝色荧光为核复染(Ho33342)。×200

图6培养皿中鼓膜角朊细胞的核增殖性抗原(PCNA)表达。×200

图7胶原-壳聚糖膜上角朊细胞的核增殖性抗原(PCNA)表达。×200

图8培养皿中鼓膜角朊细胞核增殖性抗原(PCNA)表达的荧光强度测定。

图9胶原-壳聚糖膜上角朊细胞核增殖性抗原(PCNA)表达的荧光强度测定。

图10接种鼓膜上皮层角朊细胞8天的膜石蜡切片，HE染色。×400

图11DAPI标记的传代鼓膜成纤维细胞接种于膜表面，3h即可见细胞贴壁呈梭形或星状。(×200)

图12DAPI标记的传代鼓膜成纤维细胞接种于膜表面，48小时细胞逐渐增多，细胞变长。(×200)

图13DAPI标记的传代鼓膜成纤维细胞接种于膜表面，6天细胞形态为长梭形，细胞集落彼此融合接近长满单层。(×200)

图14免疫荧光染色显示胶原-壳聚糖膜上鼓膜成纤维细胞胞浆内表达膜波形蛋白(Vim)，一抗Vim(1∶50)、二抗cy3(1∶200)，红色荧光为阳性表达，蓝色荧光为核复染(Ho33342)。×200

图15培养皿中鼓膜成纤维细胞的核增殖性抗原(PCNA)表达。×200

图16胶原-壳聚糖膜上成纤维细胞的核增殖性抗原(PCNA)表达。×200

图17培养皿中鼓膜成纤维细胞核增殖性抗原(PCNA)表达的荧光强度测定。

图18胶原-壳聚糖膜上成纤维细胞核增殖性抗原(PCNA)表达的荧光强度测定。

图19接种鼓膜成纤维细胞5天膜的石蜡切片，HE染色。×400

图20接种鼓膜纤维层成纤维细胞4天膜的扫描电镜观察

具体实施方式

1、鼠尾胶原的提取：取成年大鼠鼠尾，去除尾上皮肤，将肌腱与肌肉及其它组织分开；将肌腱在70％乙醇中浸泡20min，切碎，用去离子水冲洗；转移至稀乙酸(1∶1000)溶液中，每根鼠尾用250ml乙酸溶液，4℃保持48h；4000r/min离心30min，取上清；加入0.1mol/LNaOH，按6∶1体积比混合，中和乙酸，1500r/min离心5min获取沉淀。

2、配制2％的乙酸溶液；分别将胶原、75％脱乙酰的壳聚糖制成1％的分散液；将两种分散液按照9∶1的比例混合，4℃下恒速搅拌2h，再用磁力搅拌5小时；移入离心管，配平，4℃下2000转/分离心5min，去除分散液中的气泡；将配制好的分散液倒入特制模具中，放置于40℃恒温烤箱中，24h烘干。

试验

胶原-壳聚糖膜构建及在组织工程化鼓膜中的应用

材料与方法

一.主要试剂及仪器

DKSFM角朊细胞无血清培养液、新生牛血清、DMEM培养基(GIBCO公司)；Cy3(Goatanti Rabbit IgG)、FITC(Goat anti-mouse IgG)、PCNA增殖细胞核抗原(mouse anti rate)、Hoachest 33342(Sigma公司)；细胞膜波形蛋白Vimentin抗体(Rabbit anti rate)、角蛋白Keratin抗体(mouse anti rate)(博士德生物公司)；羟脯氨酸测试盒(南京建成生物工程研究所)。Hund倒置显微镜(德国)；超净工作台JDJ-203(苏州净化设备厂)；SAWYO二氧化碳培养箱(日本)；Olympus BX60荧光显微镜(日本)；Olympus FV 1000型激光共聚焦荧光显微镜(日本)。

二.方法

1.胶原-壳聚糖膜的制备(如前所述)

2.胶原-壳聚糖膜表面的细胞种植

(1)胶原-壳聚糖膜的准备

配制1mo l/L N aOH溶液，反复浸泡烘干的胶原-壳聚糖膜，将膜的PH值调至7.2～7.4之间，75％酒精浸泡消毒30min，超净工作台内用含双抗的D-Hank’s液反复清洗5遍以上，最后将膜平整放入24孔板，每孔加入适量DMEM培养基和胎牛血清，37℃、5％CO₂培养箱内孵育过夜、备用。

(2)鼓膜角朊细胞的种植

取处于对数生长期的已标记的第2-3代角质形成细胞悬液，吸尽旧的培养基，加入胰蛋白酶-EDTA消化液37℃消化约10min，镜下观察细胞收缩、变圆，加入FB培养液，用吸管将细胞全部吹打下来，将细胞悬液移入离心管，室温下1500rp/m离心5min。弃去上清，加入DKSFM培养基，吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色活细胞计数，调节细胞密度为1×10⁶个/ml。取出孵育过夜的膜，吸尽孵育用的培养基，每孔加入细胞悬液0.3ml。放入37℃、5％CO₂培养箱培养2h后增添DKSFM培养液1.5ml，48h后换液继续培养，以后每隔2天换液一次。

(3)鼓膜成纤维细胞的种植

取处于对数生长期的DAPI标记的第4代鼓膜成纤维细胞，弃去旧培养基，加入5ml 0.25％的胰蛋白酶溶液，37℃孵育10min，镜下观察细胞由长梭形变呈圆形，弃去胰蛋白酶液，加入FB培养液，用吸管将细胞全部吹打下来，将细胞悬液移入离心管，室温下1500rpm，离心5min。弃去上清，加入FB培养液，再次吹打，使之形成单细胞悬液。

台盼蓝染色，进行活细胞计数，调整细胞密度至4×10⁵/ml。取出孵育过夜的膜，吸尽孵育用的培养基，每孔加入细胞悬液0.3ml。放入37℃、5％CO₂培养箱培养2h后增添FB培养液1.5ml，24h后换液继续培养，以后每隔2天换液一次。

3.角蛋白(keratin)、细胞膜波形蛋白(vimentin)及核增殖性抗原PCNA免疫组化荧光染色

(1)将培养皿中的培养液吸出。

(2)用Hank’s溶液洗涤2次，每次2min。

(3)加入4％的多聚甲醛溶液，固定30min。

(4)用PBS洗涤3次，每次5min。

(5)加入0.1％Triton X-100处理20min。

(6)5％goat serum封闭1小时。

(7)加入一抗，室温孵育1小时。

(8)用PBS洗涤3次，每次15min。

(9)加入二抗，室温避光放置1小时。

(10)PBS洗涤3次，每次15min，轻轻摇动，弃掉洗涤液。

(11)尽快用Fluoview FV 1000激光扫描共聚焦显微镜观察，以488nm激发光检测FITC标记的绿色荧光，以555nm激发光检测cy3标记的红色荧光，以360nm激发光检测Heochest33342标记的蓝色荧光，同一指标采用一致的成像系统参数设置。

(12)每视野随机选择5个细胞测定荧光表达强度，计算其均值。

阴性对照实验中，用PBS代替第一抗体来排除非特异性的二抗结合。

4.一般形态观察：

分别接种角朊细胞8天及成纤维细胞5天的膜经4％多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，透明，浸腊，包埋，切片，脱腊，然后HE染色，最后树脂封片。光镜下观察，摄片。

5.扫描电镜观察

分别接种角朊细胞8d及成纤维细胞5天的膜经4％戊二醛前固定，再用1％锇酸后固定，系列乙醇脱水，临界点干燥，喷金。扫描电镜观察，摄片。

6.成纤维细胞分泌胶原功能的测定

按羟脯氨酸测试盒说明测定培养上清中羟脯氨酸含量，培养液中胶原含量＝羟脯氨酸含量/13.4％，培养皿中成纤维细胞分泌的胶原量＝培养6天的成纤维细胞的培养液中胶原含量-未作细胞培养的培养液中胶原含量，膜上成纤维细胞分泌的胶原量＝膜上接种6天成纤维细胞的培养液中胶原含量-孵育6天的不含成纤维细胞的膜培养液中胶原含量。

7.统计学方法

实验数据采用Excel统计处理，结果以均数±标准差表示。两组均数间的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.胶原-壳聚糖膜的形貌特征

经实验方法制备的胶原-壳聚糖膜是呈白色、半透明状，具有一定弹性的组织，并有一定的抗拉力，适于手术操作。见图1。

2.胶原-壳聚糖膜上鼓膜上皮层角朊细胞培养及生物学特性的观察

DAPI标记的传代鼓膜上皮层角朊细胞接种于膜表面，在接种后48小时，大部分细胞贴壁(图2)；4天后细胞数量开始增多，并有集落形成(图3)；培养到第10天左右，细胞接近铺满培养皿的底部，呈现典型的铺路石状形态(图4)。

角蛋白是上皮细胞的标记蛋白，免疫荧光方法鉴定角朊细胞，激光扫描共聚焦显微镜下观察，细胞浆内表达，接种于胶原-壳聚糖膜上的鼓膜上皮层角朊细胞均表达标志蛋白，绿色荧光为阳性表达，蓝色荧光为核复染(Ho33342)(图5)。证明胶原-壳聚糖膜对鼓膜角朊细胞的生物学特性均影响且无其它细胞污染。

3.胶原-壳聚糖膜上鼓膜纤维层成纤维细胞培养及生物学特性的观察

DAPI标记的传代鼓膜纤维层成纤维细胞，接种3h，即可见细胞贴壁，逐渐伸展延长，形成2个以上的胞质突起，呈梭形或星状(图11)，48h贴壁细胞逐渐增多，细胞变长(图12)，6天左右细胞形态为长梭形，细胞集落彼此融合接近长满单层，且细胞逐渐呈极性分布(图13)。

细胞膜波形蛋白(Vim)是成纤维细胞的标记蛋白，免疫荧光方法鉴定成纤维细胞，Vim阳性表达呈红色荧光，定位于细胞浆，接种于胶原-壳聚糖膜上的成纤维细胞均表达标志蛋白Vim，激光扫描共聚焦显微镜下观察，细胞浆内表达(图14)。

4.胶原-壳聚糖膜上接种细胞的增殖能力的鉴定

增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。分别为培养皿中及胶原-壳聚糖膜上的鼓膜上皮角朊细胞或成纤维细胞进行PCNA免疫荧光染色，观察它们的细胞增殖能力，PCNA表达为绿色荧光，定位于细胞核。并利用软件分别测定细胞表达的平均荧光强度，进行统计学分析发现胶原-壳聚糖膜上与培养皿中的培养比较，PCNA的表达无显著性差异。见图6-9，图15-18，表1、2。

表1培养皿组及膜上角朊细胞PCNA荧光强度的比较

表2培养皿组及膜上成纤维细胞PCNA荧光强度的比较

5.胶原-壳聚糖膜接种鼓膜细胞的形态学观察

(1)分别将接种鼓膜上皮层角朊细胞8天和接种鼓膜纤维层成纤维细胞5天的膜进行石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察见细胞分布生长于膜表面，接触细胞的膜表层结构相对致密，400倍光镜下鲜见网状结构，而深层的膜结构具有不规则的多孔网状结构，孔径大小基本在50～250μm之间(图10、图19)。

(2)将接种鼓膜纤维层成纤维细胞4d的膜进行扫描电镜观察，可见成纤维细胞呈多突起的长梭形，均紧紧贴附于膜的表面生长，膜呈立体三维网状结构，网孔大小不一，表面孔径大小基本在0.5～20μm之间。图20。

6.胶原-壳聚糖膜上成纤维细胞分泌功能的检测

以相同密度1.0×10⁵/ml接种传3代的成纤维细胞，分别接种于24孔培养板底壁及胶原-壳聚糖膜上，每组5个样本，每样本接种0.2ml，于第6天获取培养液上清，通过羟脯氨酸测定法检测其胶原分泌量，通过统计学分析两组间无显著性差异(p＞0.05)，见表3。

表3培养板组及膜组成纤维细胞胶原分泌的比较(单位：μg/μgprot)

讨论

胶原蛋白广布于人体各组织中，系各组织中的重要成分并构成组织细胞外基质ECM，其性质是一种天然的组织支架材料。它的生物学性质与功能主要表现在：(1)低抗原性，与其它具有免疫原性的蛋白质相比，胶原蛋白的免疫原性非常低。(2)可生物降解性(易被人体吸收)，可生物降解性是胶原蛋白能作器官移植材料被利用的基础。(3)生物相溶性，即胶原蛋白与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。(4)成纤维性能，天然的纤维在组织中以特定的顺序组织起来。例如鼓膜中的纤维就以环状和放射状排列，有利于提供合适的强度及弹性。(5)力学性能，天然胶原紧密的螺旋结构对高强度的力学性能起重要作用，在生物体中，胶原是为结缔组织提供强度的主要蛋白组分，因而可在广范围内满足肌体对机械强度的要求。实际应用中，常常通过一定方法提高胶原的拉伸强度及抗降解能力，降低膨胀率，改善胶原的力学性能与抗水性。如将胶原与其它物理、化学性质不同的合成或天然高分子共混，组成一种多相固体材料，在性能上胶原与其它高分子取长补短，互相补充，既可改善胶原材料的性能，又可制备出单一胶原材料所不具有的优良特性的新材料。

壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基产物，来源广泛，具有无毒性、生物相容性好，可控的降解性，和无免疫原性等优点，而且具有广谱的抑制细菌、真菌生长作用，收缩变形幅度显著低于胶原凝胶。壳聚糖成膜后拥有良好的透光率和力学强度，但单独作为生物支架由于表面电荷作用，不利于细胞生长和增殖。胶原和壳聚糖互补制成膜后可以提高生物学性能成为较理想的生物材料，改良了壳聚糖的吸附力，利于细胞的黏附生长、迁移和增殖。此外，壳聚糖分子链刚性较好，胶原填入网孔可提高力学性能。壳聚糖本身降解缓慢且能抑制多种蛋白酶活性，如可直接同胶原酶结合，延缓了胶原酶对胶原蛋白的降解。

一种生物材料在用于临床前，必须经过一系列的生物学性能测试，用细胞培养法评价生物材料的组织相容性已是公认的方法之一，其特点是操作简单、重复性好、费用较为低廉，在一定程度上可以替代动物体内实验。因此，细胞培养法广泛应用于评价不同的生物材料的安全性能。本实验分别将传代的鼓膜上皮角朊细胞和成纤维细胞在胶原-壳聚糖膜上接种培养，观察到细胞保持正常的生长形态，分别进行keratin、vimentin免疫荧光染色，结果表明细胞的生物学特性亦未受到影响。增殖细胞核抗原(PCNA)在细胞增殖的启动上起重要作用，它与细胞DNA合成关系密切，其量的变化与DNA合成一致，是反映细胞增殖状态的良好指标。分别在培养皿及膜上接种的上皮细胞和成纤维细胞PCNA荧光免疫染色的平均荧光强度无显著性差异(p＞0.05)，说明在膜上生长的鼓膜细胞同样具有良好的细胞增殖能力。另外在培养皿上接种6天的成纤维细胞胶原分泌量为11.26±0.68，膜上接种6天的成纤维细胞胶原分泌量为12.02±0.8，无显著性差异(p＞0.05)，这表明成纤维细胞的胶原分泌功能未受影响。以上实验证实了本专利中采用热干法制备的具有三维多孔结构的胶原-壳聚糖膜适合鼓膜上皮角朊细胞和成纤维细胞生长、增殖，且能保持成纤维细胞良好的胶原分泌功能。

Claims (8)

1.一种烘干法制备膜性混合物，其含有胶原和壳聚糖。

2.根据权利要求1的混合物，其中的胶原为I型胶原。

3.根据权利要求1或2的混合物，其中I型胶原占混合物重量的90％。

4.根据权利要求1-3任一项的混合物，其中75-95％脱乙酰的壳聚糖占混合物重量的10％。

5.根据权利要求1-4任一项的混合物在制备用于组织工程鼓膜构建的用途。

6.一种用于替代鼓膜移植物的膜性基质材料，其含有胶原和壳聚糖。

7.根据权利要求5的膜性基质(细胞支架)，其中I型胶原占支架重量的90％。

8.根据权利要求7的膜性基质(细胞支架)，其中75-95％脱乙酰的壳聚糖与胶原的重量比为1∶9。

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