CN100998526A - 一种角膜移植物 - Google Patents

Abstract

一种角膜移植物涉及用成纤维细胞构建角膜基质移植物及其制备方法和用途。本发明的角膜基质移植物，包括：(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)成纤维细胞，所述的成纤维细胞接种于生物可降解材料。所述的角膜基质移植物的制备方法是将成纤维细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合。本发明为组织工程化角膜基质的构建提供了一种更广泛的种子细胞来源，从而能应用组织工程技术构建角膜基质为角膜上皮、内皮组织的移植提供适宜的载体。

Description

一种角膜移植物

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及用成纤维细胞构建角膜基质移植物及其制备方法和用途。

背景技术

严重的角膜疾病可以致盲，造成很多的不便和痛苦。目前，角膜移植是临床角膜盲唯一可靠、有效的治疗手段。显微外科技术的发展，极大提高了角膜移植手术成功率。但由于角膜供体缺乏，仍有许多患者不能接受角膜移植术。而且，同种异体角膜移植仍然存在术后免疫反应，甚至出现供体排斥而致手术失败。

在拓宽角膜供体来源的探索中，异种角膜以及人工角膜移植研究卓有成效，时有成功的个案报道，但是最终仍因存在免疫排斥反应以及其他严重的术后并发症，缺乏明确的手术远期效果，无法成功应用于临床。

角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层组织构成。角膜组织含有三种构成细胞：角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞。其中，前弹力层和后弹力层不含有细胞成分。

目前，组织工程化角膜上皮移植的良好临床效果以及人角膜内皮层已在体外构建成功。不过，角膜上皮、内皮组织构成特点是以细胞为主，细胞外成分很少，其生物力学性能差，限制了这种组织进行直接手术缝合。引进载体可提高移植组织力学性能，增加手术可操作性。毫无疑问，自体角膜基质是载体的最佳选择，但是自体角膜基质对于患者非常珍贵，而同种异体角膜供体非常有限。角膜基质细胞取材困难，对供体角膜损伤大，而且难以获得大量有活性的种子细胞，限制了它的应用。

因此，本领域迫切需要一种更佳的种子细胞来源，从而应用组织工程技术构建角膜基质为角膜上皮、内皮组织移植提供适宜的载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的应用于构建角膜基质的种子细胞。

本发明的另一个目的是提供一种组织工程化角膜基质及其制法和用途。

在本发明的第一个方面，提供了一种角膜基质移植物，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；

(b)成纤维细胞，所述的成纤维细胞接种于所述的生物可降解材料；

其中，所述移植物的形状与哺乳动物角膜的形状相同或基本相同。

上述的角膜基质移植物中，所述的成纤维细胞来源于自体成纤维细胞、同种异体成纤维细胞、异种成纤维细胞、骨髓基质细胞来源的成纤维细胞，或其混合物。

在另一优选例中，所述的成纤维细胞来源于皮肤成纤维细胞，更佳地，所述的成纤维细胞来源于自体皮肤成纤维细胞。

上述的角膜基质移植物中，所述的成纤维细胞的含量为1×10⁴-5×10⁶个细胞/mg生物可降解材料；所述的移植物的直径为2-8mm，面积为12-200mm²，厚度为300-1000μm；所述的移植物的形状为圆形、卵圆形、椭圆形或多边形。

上述的角膜基质移植物中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。

在另一优选例中，所述的生物可降解材料为固体可降解材料，更佳地为人工合成的高分子材料。

在本发明的第二个方面，提供了一种角膜基质移植物的制备方法，它包括步骤：将成纤维细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料，从而形成角膜基质移植物，其中，所述移植物的形状与哺乳动物角膜的形状相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的成纤维细胞来源于自体成纤维细胞、同种异体成纤维细胞、异种成纤维细胞、骨髓基质细胞来源的成纤维细胞，或其混合物

上述的制备方法中，移植物中成纤维细胞的含量为1×10⁴-5×10⁶个细胞/mg生物可降解材料。

在本发明的第三个方面，提供了一种成纤维细胞的用途，它可用于制备用于角膜移植的角膜基质移植物。

本发明提供了一种更佳的种子细胞即成纤维细胞，构建了组织工程化的角膜基质移植物，为角膜上皮、内皮组织的移植提供了适宜的载体。

附图说明

图1显示了塑型后的PGA材料。

图2显示了显微镜下观察到的皮肤成纤维细胞-PGA复合物的体外培养情况。

图3显示了扫描电镜观察到的皮肤成纤维细胞-PGA复合物的体外培养情况。

图4显示了皮肤成纤维细胞-PGA复合物的组织学特征。

图5显示了新生组织的大体情况。

图6显示了第3周PGA部分降解，新生组织逐步形成。

图7显示了第6周PGA降解基本完全，新生组织大部分形成。

图8显示了第8周PGA降解吸收完全，新生角膜基质样组织形成。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现利用成纤维细胞作为种子细胞与生物可降解材料复合构建角膜基质组织，为角膜上皮、内皮细胞生长和组织形成过程充当载体，提供含有必要生长因子、信号的生理环境，通过缝合方式牢固地固定于受体部位，克服体外培养的上皮组织、内皮组织质地松软无法直接缝合固定、难以转移的缺陷。

本发明所称的角膜基质移植物的形状与哺乳动物角膜的形状相同或基本相同是指移植物的形状与哺乳动物角膜的形状一致或基本一致，所述移植物的面积是哺乳动物角膜面积的40-120％。

种子细胞

可用于本发明角膜基质移植物的种子细胞选自：成纤维细胞、角膜基质细胞或骨髓基质细胞，其中优选成纤维细胞。

本发明用于角膜基质移植物的是成纤维细胞，或成纤维细胞与其他细胞(如角膜基质细胞和/或骨髓基质细胞等)的混合物。在成纤维细胞与其他的混合物中，成纤维细胞与角膜基质细胞和/或骨髓基质细胞的数量之比为1∶10-10000∶1，较佳地为1∶5-100∶1，更佳地为1∶2-10∶1。

研究表明皮肤干细胞在角膜微环境中可以表达角膜上皮细胞特异性标志蛋白，并可形成类似角膜上皮外观，具有透明的多层细胞结构。同样还有研究尝试用口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞，修复角膜上皮缺损，取得了很好的临床效果。本发明人曾利用兔自体皮肤成纤维细胞来替代来源有限的角膜基质细胞，成功修复了角膜基质的缺损。本发明人发现组织微环境对细胞的表型改变起着重要的作用，利用发育同源的细胞在不同微环境作用下相互转化是完全可行的。

本发明的成纤维细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的成纤维细胞，通常，本发明的成纤维细胞是自体的(如真皮、皮下组织以及其他组织中的成纤维细胞)、或同种异体的成纤维细胞(如人胎儿来源的成纤维细胞)。成纤维细胞还可以是衍生自骨髓基质干细胞、或其他干细胞的成纤维细胞。优选自体皮肤成纤维细胞。

可用于本发明的成纤维细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是哺乳动物，更佳地是灵长类动物，尤其是人。

尽管自体的成纤维细胞是优选的，但异体的成纤维细胞的来源也可使用。

分离和获得成纤维细胞的方法是本领域中已知的。常用的分离方案包括：

(a)胶原酶消化、分离法。在全麻无菌条件下取皮肤组织，切成2×2×2mm³大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青，链霉素各100U/ml)冲洗2遍，加入二倍体积的1mg/mlII型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床消化4h后用200目尼龙网筛过滤离心，沉淀细胞用PBS洗2次，计数，台盼蓝染色检查成纤维细胞活力，以1×10⁶/盘密度(培养皿直径100mm)培养细胞。

(b)组织块培养法。在全麻无菌条件下取皮肤组织，切成2×2×2mm³大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青、链霉素各100U/ml)冲洗2遍。将组织块在培养皿表面均匀摆置，将培养皿放置于培养箱中放置2-4小时，轻轻加入培养液，让液体缓慢覆盖组织小块，等待细胞游出。

成纤维细胞的培养方法和培养液是本领域中熟知的。一种优选的方法是将成纤维细胞在饱和湿度、5％CO₂培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％小牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进成纤维细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。

适用于本发明的成纤维细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的成纤维细胞是体外培养的原代至第五十代细胞，且免疫组织化学染色证明I型胶原表达，原位杂交检测证明I型胶原mRNA表达成纤维细胞。

如果必要，可以在成纤维细胞中加入一些角膜基质细胞和/或骨髓基质细胞。分离和获得角膜基质细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是在全麻无菌条件，手术显微镜下，解剖分离角膜基质层组织，放入4℃的PBS中清洗。(1)将角膜基质层组织剪成1mm3大小组织块，置15ml离心管中，加入1.5％II型胶原酶(体积/容积比为1∶5)，37℃恒温振荡器内消化40min。然后收集细胞悬液，以1000r/min速度离心5min，弃去上清液；PBS反复冲洗3次，离心，弃去上清液；加入含10％FBS的F-12培养液10ml，角膜基质细胞接种于培养皿后，放入5％CO₂、37℃、饱和湿度培养箱中进行细胞培养，隔日换液，开始原代细胞培养。

角膜基质细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将角膜基质细胞在饱和湿度、5％CO₂培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)F12培养基+10％胎牛血清；2)F12培养基+20％小牛血清；3)F12培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进角膜基质细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。所述的角膜基质细胞也可以是成纤维细胞诱导产生的。

本发明中骨髓基质细胞(BMSCs)的来源没有特别限制，一种优选的来源是来自自体的骨髓。分离获得骨髓基质干细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自体骨髓，以密度梯度离心法分离出其中的有核细胞，加入适合的培养液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，GlandIsland，NY，USA)条件培养液)，制成细胞悬液，以约1×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养。48小时后首次换液，加入条件培养液继续培养隔日换液。待细胞生长近汇合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×10⁴/cm²的密度接种进行细胞传代。

生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化角膜基质的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；

(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。

组织工程化角膜基质

体外培养扩增的成纤维细胞接种到生物相容性良好并可被机体吸收的可降解生物材料上形成种子细胞—生物材料复合物，将这一“种子细胞—生物材料”复合物植入到缺损部位，随着生物材料的逐渐降解吸收，种子细胞继续增殖并分泌基质，最终替代生物材料而形成相应的角膜基质组织。

本发明的组织工程化角膜基质的制备方法简便，将一定数量的种子细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合。

本发明的组织工程化角膜基质移植物的形状没有特别限制。通常，移植物的形状与哺乳动物角膜的形状相同或基本相同。以类似于角膜形状的移植物为例，其直径为3-5mm，厚度500-1000μm。

本发明的生物可降解材料为固体性材料，接种密度是按ml细胞悬液。本发明组织工程化角膜基质中的种子细胞浓度通常约为1×10⁵至5×10⁸/ml或更高，较佳地为1×10⁶至1×10⁸/ml，更佳地为5×10⁶至5×10⁷/ml。通常，以培养液调整种子细胞悬液浓度，然后与可降解材料混合。混合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的细胞悬液最大量为宜。

此外，在本发明的组织工程化角膜基质移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而促进成纤维细胞分化为角膜基质细胞，以及保持角膜基质细胞的表型和/或促进角膜基质细胞生长。代表性的物质包括(但并不限于)：血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)-1和2、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)和肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)。

用本发明方法形成的组织工程化角膜基质移植物或角膜基质，可直接植入角膜基质缺损处。

本发明的主要优点在于：

1.成纤维细胞分布广泛，取材容易，解决了角膜基质组织工程化构建种子细胞来源不足的问题；

2.为角膜上皮、内皮细胞生长和组织形成过程中提供含有必要生长因子、信号的生理环境，并且充当载体，通过缝合方式牢固地固定于受体部位，克服体外培养的上皮组织、内皮组织质地松软无法直接缝合固定、难以转移的缺陷；

3.角膜基质组织的构建为组织工程技术构建完整角膜奠定了坚实的基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

兔皮肤成纤维细胞的分离培养

兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉平稳后，兔背部皮肤备皮。常规消毒铺巾，于无菌条件下取一块约5cm×3cm全厚皮片。去除皮片的皮下脂肪组织，保留真皮层，放入PBS中清洗。然后，将皮片剪成约1cm³的组织块置50ml离心管中，加入中性蛋白酶Dispase II(购自Roche)20ml，4℃恒温消化16-24个小时。然后轻轻将表皮层撕掉，将真皮层组织放入0.2％的胶原酶(购自Gibco)中37℃恒温振荡消化2个小时，收集细胞悬液，以1500r/min速度离心5min，弃去上清液，PBS反复冲洗3次，离心，弃去上清液，加入条件培养液10ml(含10％胎牛血清(购自Hyclone)的DMEM(购自吉诺生物)培养液)，混匀，计数，经锥虫蓝拒染试验，细胞活力＞85％用于实验。皮肤成纤维细胞接种于培养皿后，放入5％CO₂37℃饱和湿度培养箱中培养细胞。隔日更换条件培养液(含10％胎牛血清的DMEM培养液)。原代细胞培养5天，备用。

结果

细胞4小时后开始贴壁，24小时后细胞逐渐向两极伸展，呈梭形。2天后，皮肤成纤维细胞排列呈放射状或指纹状走行。细胞内颗粒少，未见空泡，细胞浆分布均匀，胞膜清晰。培养4或5天后，细胞可铺占培养皿底面积80％。

实施例2

生物支架聚羟基乙酸(polyglicolic acid，PGA)的制备

取直径为14μm的PGA2mg塑型后(图1)，75％的乙醇浸泡消毒30分钟，磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)反复冲洗3次，自然晾干，置于6孔板中备用。

实施例3

绿色荧光蛋白(GFP)基因转染皮肤成纤维细胞

GFP转染后的实施例1所得的皮肤成纤维细胞培养传代，收集其各代病毒液用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤器进行病毒液过滤，备用。

体外培养的皮肤成纤维细胞生长达70％融合时，加入含5μg/ml鱼精蛋白的病毒液10ml，体外培养到90％细胞融合时传代，观察转染情况。3μg/ml嘌呤霉素持续筛选24小时。细胞生长融合后，接种到制备好的聚羟基乙酸材料上。

实施例4

皮肤成纤维细胞-PGA复合物预制

收集GFP标记的第3代的皮肤成纤维细胞，以10⁷个/ml的浓度20μl接种PGA，加入条件培养液(含10％胎牛血清的DMEM培养液)。然后，放入5％CO₂37℃饱和湿度培养箱中培养，隔日更换条件培养液。体外培养7天，备用。

皮肤成纤维细胞接种于PGA后，每天倒置相差显微镜观察细胞在生物支架中的生长、增殖、基质分泌和细胞形态变化。取培养第6天细胞-PGA复合物，PBS洗涤，2.5％的戊二醛固定，乙醇梯度脱水，醋酸正戊酯置换，CO₂临界点干燥，离子喷射仪喷金，扫描电镜(Philips Quanta 200 FEI)观察。

结果

细胞生物材料PGA复合物

类似于角膜形状的圆形移植物，其直径为3-5mm，厚度500-1000μm。

(图1)

光镜下：接种于PGA后的皮肤成纤维细胞呈圆形，均匀密布于PGA纤维表面和PGA纤维形成的空隙中。接种48小时后，黏附在生物支架上的细胞沿PGA纤维纵轴向两极伸展，细胞形态由圆形变为长梭形。第6天，细胞分泌基质并向邻近PGA纤维支架扩展，邻近细胞互相接触直至连接成小片状，形成拉网状结构充填于PGA纤维形成的空隙中。(图2)

扫描电镜观察：复合物体外培养第6天，皮肤成纤维细胞呈梭形，细胞表面有细小绒毛与褶皱。细胞在PGA接触部位伸出伪足，黏附和包饶PGA纤维。分泌基质连接成片覆盖沉积于PGA表面。(图3)

组织学观察：PGA材料未降解，成纤维细胞在PGA材料间较规则排列，形成薄片状结构。(图4)

实施例5

构建角膜基质层组织

将实施例4中制备的皮肤成纤维细胞-PGA复合物植入自体兔角膜基质层内。其中植入的移植物的尺寸和形状如下：类似于角膜形状的圆形移植物，其直径为3-5mm，厚度500-1000μm。(图1)

具体操作如下：

兔耳缘静脉注射速眠新和氯胺酮，麻醉平稳后，常规消毒铺巾，开睑器开睑，1号缝线悬吊上下直肌，手术显微镜下，从10点钟至3点钟位，掀起角膜基质瓣，其深度约达角膜全层的1/3，植入皮肤成纤维细胞-PGA复合物，基质瓣复位，10-0缝线缝合切口。术后持续观察60天。另外，角膜基质细胞空白的生物材料实验对照组采用与实验组相同的手术方法在角膜基质层内植入PGA。术后观察8周。

大体及组织学动态观察：

术后第20、40、60天进行大体观察并取材。4％甲醛磷酸缓冲液固定组织24h，石蜡包埋，组织学切片，苏木素—伊红(HE)染色。并作组织免疫化学检测I型和VI型胶原的表达。

超微结构观察和胶原纤维直径分布：

分类获取20、40、60天新生组织和正常角膜基质组织，置于2.5％戊二醛液中固定24小时，1％锇酸液固定1小时，50％、70％、80％、90％及100％乙醇溶液梯度脱水，1∶1丙酮包埋液渗透，环氧树酯(EPON)包埋，超薄切片。透射电镜(Philips CM 120)观察。随机抽取兔正常角膜胶原纤维和组织工程角膜胶原纤维，测定其直径。用SAS统计学软件作统计学分析。

结果

1.新生组织大体标本观察

实验组：回植后，细胞与生物材料复合物占据角膜中央，呈白色，不透明。到第20天左右，PGA降解加速，中央角膜组织逐渐恢复透明，同时可见新生血管从切口向新生组织侵入。第40天左右，新生血管逐渐消退。至第60天时，角膜中央基本透明(图5)。单纯材料对照组未发生排斥现象，大体观察结果与实验组比较，未见明显差异。

2.组织学观察及荧光显微镜观察

实验组：第20天，聚羟基乙酸部分降解，新生组织逐渐形成(图6)。第40天，聚羟基乙酸降解基本完全，新生角膜基质样组织大部分形成，新生组织呈嗜酸性，染色偏红与周围组织存在明确分界线(图7)。第60天，聚羟基乙酸降解吸收完全，新生角膜基质样组织基本形成，胶原与角膜表面平行，排列较整齐，新生组织与周围组织染色相似，分界线不明显(图8)。免疫组织化学检测结果显示第60天新生组织和正常角膜基质组织中基质细胞均表达I型和VI型胶原。

对照组：荧光显微镜下观察：实验组第60天组织学切片可检测到发出绿色荧光的组织工程化角膜基质组织。

3.胶原纤维直径分布的统计学分析

随机抽取兔正常角膜60次，测得胶原纤维直径平均为26.8nm；随机抽取新生角膜组织胶原纤维60次，测得胶原纤维直径平均为26.4nm。统计学分析提示新生组织和兔正常角膜胶原纤维直径分布差异无显著意义。

讨论

本发明将皮肤成纤维细胞与生物材料复合物回植角膜基质层内，借助正常角膜所提供的上皮和内皮以及局部的微环境，发现皮肤成纤维细胞可以作为种子细胞构建角膜基质组织。本发明中随着聚羟基乙酸降解，新生组织逐渐形成，组织学切片证实有新生角膜基质样组织的形成，新生组织分泌大量I型胶原，并且胶原纤维直径基本一致。同时，在组织形成过程中，细胞—生物材料复合物逐渐恢复透明。其机制可能就是角膜局部的微环境改变了皮肤成纤维细胞原有的表型，使其向角膜基质细胞转化，从而形成了具有正常功能的组织工程化角膜基质组织。

另外皮肤成纤维细胞可取自自体，来源广泛，取材容易，其作为种子细胞将有效解决种子细胞的来源问题，为全层角膜组织构建奠定基础。

在组织构建过程中，本发明实施例中的手术后有新生血管向皮肤成纤维细胞—聚羟基乙酸复合物侵入，但随着时间的推移，新生血管逐渐减少。

由于新生角膜基质组织细胞来源有两种可能，一是可能来源于体外培养扩增的种子细胞，二是可能来源于邻近组织细胞活跃增生，而植入的细胞则可能被机体吸收。因此，为了进一步明确新生组织细胞的来源，本发明应用GFP标记种子细胞示踪角膜基质构建过程，旨在通过对特殊标记的检测说明种子细胞在组织构建过程中的转归。在本发明的结果显示，角膜内有一条发射绿色荧光的角膜基质层组织，说明该组织的细胞表达GFP，证实了组织工程化组织中细胞来源于GFP基因转染后体外培养扩增了的种子细胞。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种角膜基质移植物，其特征在于，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；

(b)成纤维细胞，所述的成纤维细胞接种于所述的生物可降解材料；

其中，所述移植物的形状与哺乳动物角膜的形状相同或基本相同。

2.如权利要求1所述的角膜基质移植物，其特征在于，所述的成纤维细胞来源于自体成纤维细胞、同种异体成纤维细胞、异种成纤维细胞、骨髓基质细胞来源的成纤维细胞，或其混合物。

3.如权利要求1或2所述的角膜基质移植物，其特征在于，所述的成纤维细胞来源于皮肤成纤维细胞。

4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的成纤维细胞的含量为1×10⁴-5×10⁶个细胞/mg生物可降解材料。

5.如权利要求1所述的角膜基质移植物，其特征在于，所述的移植物的直径为2-8mm，面积为12-200mm²，厚度为300-1000μm。

6.如权利要求1所述的角膜基质移植物，其特征在于，所述的移植物的形状为圆形、卵圆形、椭圆形或多边形。

7.如权利要求1所述的角膜基质移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。

8.一种如权利要求1所述的角膜基质移植物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

将成纤维细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料，从而形成角膜基质移植物，其中，所述移植物的形状与哺乳动物角膜的形状相同或基本相同。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，移植物中成纤维细胞的含量为1×10⁴-5×10⁶个细胞/mg生物可降解材料。

10.一种成纤维细胞的用途，其特征在于，用于制备用于角膜移植的角膜基质移植物。

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