CN106860919B - 交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用 - Google Patents

交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种交联脱细胞羊膜、复合型皮肤替代物及其制备方法和应用。所述交联脱细胞羊膜的制备方法包括如下步骤：将脱细胞羊膜浸泡于MES缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺浓度为0.01‑0.1mmol/mg，交联反应1‑10min，清洗，真空冷冻干燥即得。本发明制备获得的交联脱细胞羊膜保留了基底膜的细胞因子，同时机械强度增强。本发明获得脱细胞羊膜作为培养基质制备的复合型皮肤替代物，能够用于创面修复。

Description

交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，特别是涉及一种交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用。
背景技术
真皮替代物的研究一直是组织工程皮肤的重点和难点，也是复合型真皮替代物发展的基础。真皮替代物作为创面修复过程中的支架结构，不仅能促进表皮细胞的增殖、迁移和分化，调节基底膜的形成，而且能引导成纤维细胞和血管内皮细胞的浸润增殖，沉积新的胶原和形成新的血管，从而实现真皮结构重建。
现有的真皮替代物在一定程度上能够模拟正常真皮的组织结构特点，但是除脱细胞真皮外，普遍都缺乏基底膜结构成分。即使采用脱细胞真皮，为了去除表皮细胞层和真皮中的成纤维细胞和血管内皮细胞，一般需要很强的细胞清除剂处理，会对真皮的基底膜成分产生严重的破坏。
人羊膜来源于胎盘的最内层，可在分娩时获得，主要由三部分结构组成：单层立方状表皮细胞，富含细胞生长因子的厚基底膜，以及成纤维细胞散在其中的疏松网状纤维基质。羊膜基质含有I型胶原、IV型胶原、VII型胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖等成分，类似于人体的真皮。羊膜的基底膜主要成分为层粘连蛋白、IV型和VII型胶原，与皮肤和角膜的基底膜成分相似，是人体内最厚的基底膜。同时，羊膜还具有促进上皮化、抑制瘢痕增生、抗炎症、抗血管生成、抗菌和抗病毒等生物特性，且免疫原性极低，因而被广泛用作外科手术材料和创面覆盖物，用于修复各种组织缺损。
在实际应用中，羊膜使用时既可以保留失活的表皮细胞，也可以完全去除表皮细胞。完整羊膜含有大量的细胞生长因子，有利于细胞培育过程中干细胞特性的维持。而脱细胞羊膜借助于良好的基质和基底膜成分，能促进培育细胞的增殖、迁移和分化。部分体细胞在脱细胞羊膜上的扩增速度要明显快于完整羊膜。但是，脱细胞羊膜的机械强度、生物稳定性和可操作性仍然不佳。
发明内容
基于此，有必要提供一种机械强度高的交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用。
一种交联脱细胞羊膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)浸泡：将脱细胞羊膜浸泡于25-35ml MES缓冲液中55-65min；
(2)交联反应：向浸泡后的羊膜所在的缓冲液中加入水溶性碳二亚胺，并使碳二亚胺的浓度为0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒温摇床上，转速28-32rpm，交联反应1-10min；
(3)蒸馏水清洗，真空冷冻干燥，即得。
在其中一个实施例中，在步骤(1)中，所述脱细胞羊膜由以下步骤制备而成：
在无菌条件下，从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗去除羊膜表面的脏污，并去除所述羊膜的绒毛膜，用pH为7.2-7.4的PBS溶液反复漂洗；
将漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH为7.2-7.4的PBS溶液浸泡8-12min此过程重复多次；
用pH为7.2-7.4的PBS溶液重新冲洗后，置于含DMEM：甘油体积比为1：0.5-2的溶液中，-80℃条件下储存6-8个月；
取无感染的储存所得羊膜，4℃条件下，置于在质量百分比为0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育过夜；
再用含有血清的DMEM培养基对其进行终止消化，用pH为7.2-7.4的PBS冲洗多次，备用。
在其中一个实施例中，在步骤(1)中，所述脱细胞羊膜的制备过程，还包括复苏的步骤：
将无感染的储存6-8个月的所述羊膜预先置于-80±5℃和37±2℃环境中反复冻融2-4次后，备用。
上述交联脱细胞羊膜的制备方法制备而成的交联脱细胞羊膜。
上述交联脱细胞羊膜在制备具有创面修复功效的复合型皮肤替代物中的应用。
在其中一个实施例中，所述复合型皮肤替代物的制备过程包括如下步骤：
将上述交联脱细胞羊膜制成片状，将片状的所述交联脱细胞羊膜的基质所在面贴于培养皿的底部，置于培养箱中；
将表皮细胞以1×105的接种量接种于所述交联脱细胞羊膜的非基质所在面，加入皮肤培养基G进行培养；所述培养基G的配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mLFBS、0.01-1μmol/L胰岛素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mL hEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mL BPE和100-500μg/mL氯化钙；
每天更换培养液，培养6-8天，即得所述复合型皮肤替代物。
在其中一个实施例中，所述表皮细胞由尿液细胞经诱导培养而成，其诱导培养的过程如下：
S1，从尿液中提取尿细胞；
S2，将所述尿细胞培养为iPS细胞；
S3，将所述iPS细胞诱导培养获得间充质干细胞；
S4，将所述间充质干细胞诱导培养，即得所述表皮细胞。
在其中一个实施例中，在步骤S1中，所述尿细胞的融合度不小于80％。
在其中一个实施例中，在步骤S2中，所述iPS细胞的融合度不小于90％。
在其中一个实施例中，在步骤S3中，所述间充质干细胞的融合度不小于90％。
本发明的有益效果如下：
本发明利用水溶性碳二亚胺对脱细胞羊膜进行交联反应处理，得到的交联脱细胞羊膜保留了基底膜中的IV型胶原、VII型胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖等成分，并保留了细胞因子的生物活性，同时机械强度增强、抗酶降解能力提高且可操作性好。本发明获得脱细胞羊膜作为培养基质，可以促进表皮细胞在非基质所在表面的生长，加快表皮细胞的体外增殖速度，而且保持了良好的生物组织相容性，可作为皮肤替代物，缩短了皮肤替代物的制备时间。
进一步，本发明将表皮细胞接种于交联脱细胞羊膜的非基质所在表面培养获得复合型皮肤替代物，能够促进创面愈合，促进皮肤结构重建，减轻创面收缩。本发明所用的表皮细胞是从尿细胞经过一系列的诱导、培养获得的，取材方便，对人体无伤害。
附图说明
图1为未脱细胞羊膜的基底膜结构的电镜图；
图2为脱细胞羊膜的基底膜结构的电镜图；
图3为交联脱细胞羊膜培养表皮细胞两天后的电镜图；
图4为脱细胞羊膜培养的表皮细胞两天后的电镜图；
图5为由交联脱细胞羊膜和表皮细胞制备的复合型皮肤替代物的产品图片；
图6为由脱细胞羊膜和表皮细胞制备的表皮-真皮替代物的产品图片；
图7为交联脱细胞羊膜修复裸鼠皮肤缺损两周后的皮肤愈合效果图；
图8为脱细胞羊膜修复裸鼠皮肤缺损两周后的皮肤愈合效果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面对本发明进行更全面的描述。下文中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
一实施方式的交联脱细胞羊膜，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备脱细胞羊膜：
取剖腹产孕妇的胎盘，并经血清检测排除感染原。所用胎盘选自医疗废弃的胎盘，经医院同意，并经医学伦理会审查可以用于实验研究。
在无菌条件下，从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗去除羊膜表面的血迹，并去除羊膜的绒毛膜，用pH为7.2-7.4的PBS溶液反复漂洗。
将漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH为7.2-7.4的PBS浸泡8-12min，此过程重复多次。
用pH为7.2-7.4的PBS溶液重新冲洗后，置于含DMEM：甘油体积比为1：0.5-2的溶液中，-80℃条件下储存6-8个月以覆盖感染的窗口期。
取无感染的储存所得羊膜，置于-80±5℃和37±2℃环境中反复冻融2-4次后，在4℃条件下，置于在质量百分比为0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育过夜。
再用含有血清的DMEM培养基对其进行终止消化，用pH为7.2-7.4的PBS溶液冲洗多次，备用。
(2)制备交联脱细胞羊膜
将上述(1)中所得的脱细胞羊膜浸泡于25-35ml MES缓冲液中55-65min。向浸泡后的羊膜所在的缓冲液中加入碳二亚胺，并使水溶性碳二亚胺的浓度为0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒温摇床上，转速为28-32rpm，交联反应1-10min。蒸馏水清洗，真空冷冻干燥，即得。
上述方法制备而成的交联脱细胞羊膜在制备具有创面修复功效的复合型皮肤替代物中的应用。
一实施方式的复合型皮肤替代物，其制备方法包括如下步骤：
(1)诱导形成表皮细胞
S1，从尿液中提取尿细胞：
收集尿液，添加2mL两性霉素(青霉素和链霉素的混合液，两者浓度均为为500μg/ml)。如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱，并于当天完成后续操作。
把收集的尿液进行离心，去上清液，收集位于离心管底部的混悬液1-5mL。将收集的混悬液全部合并后，加入收集所得液体6-10体积的含有两性霉素的PBS(两性霉素与PBS溶液的体积比为5:95)，轻轻混匀，吸去上清，得底部混悬液。
对6孔板进行预处理，即将需要用的孔预先用0.1％明胶包被处理20min以上的，再吸出0.1％的明胶。将获得的底部混悬液置于6孔板的预处理后的孔中，并向该孔中加入2mL培养液A和3μL Primocin(原代细胞抗生素)，置于培养箱内，37℃条件下培养，待尿细胞贴壁生长后，吸去培养液A，用PBS洗一遍，再更换培养液A继续培养。其中，培养液A的配方为：REGM培养基与MEF培养基以1：1的比例混合。
当尿细胞融合度达到80％，则可进行后续传代培养。
S2，将尿细胞培养为iPS细胞：
将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28，各1-5μg混合后共同导入尿细胞中。
再将含有表达转录调控因子的尿细胞置于预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养。
转染后第2d(天)，将培养基更换为培养液B。以后，每天更换新鲜培养液B使克隆继续增殖。其中，培养液B为mTesR1培养基。
转染后第7d，镜下观察形态，挑取与人胚胎干细胞相近细胞，并接种于用matrigel包被的12孔板中，培养液B培养获得诱导多能干细胞(iPS细胞)。
S3，将iPS细胞诱导培养获得间充质干细胞：
弃除原有iPS细胞培养液B，加DMEM/F12培养液清洗一遍，弃除，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g转速下离心5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例置于已被Matrigel包被处理的6孔板中，进行传代培养；待iPS细胞长至6孔板体积的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换间充质干细胞诱导培养基C，并每两天更换一次培养基。其中，间充质干细胞诱导培养基C的配方为：450mL DMEM基础培养基、50mLFBS、1-5mmol/L L-谷酰胺、50-100μg/L bFGF和10-8mol/L地塞米松。
培养4-6d后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液进行消化，采用间充质干细胞培养基D重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至0.1％明胶预先包被处理的细胞培养皿中。其中，间充质干细胞培养基D的培养液配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mLFBS、10-50ng/mL hEGF、1-6ng/mL HGF、1-4ng/mL bFGF、1-10ng/mLPDGF、1-10ng/mL IGF和2-10ng/mLTGF-β。
当细胞达到90％融合后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液消化细胞并按照1：3的比例进行细胞传代。
S4，将间充质干细胞诱导培养形成表皮细胞：
弃除上述间充质干细胞培养液D，加DMEM/F12培养液清洗一遍，弃除清洗液，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g转速下离心5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被处理的6孔板中。
待间充质干细胞长至6孔板体积的70％-80％时，pH为7.2-7.4的PBS溶液冲洗一遍后，更换表皮细胞诱导培养基E，并每两天更换一次培养基E。其中，表皮细胞诱导培养基E的培养液配方为：450mL DMEM基础培养基、50mLFBS、10-40μg/L KGF、20-80μg/L TGF-β、6-15μg/L PDGF-AB、10-25μg/L VEGF、1-7μg/L IL-2和0.1-0.75μg/ml氢化可的松。
培养4-6d后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液进行消化，采用表皮细胞培养基F重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至细胞培养皿中培养。其中，表皮细胞培养基F的配方为：450mLDMEM/F12培养基、50mL FBS、0.1-1ng/mL氢化可的松、1×10-10mol/L霍乱毒素、0.01-0.1ng/mL胰岛素、1×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、10-25ng/mL hEGF、5-15μg/m L转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μM Y-27632和0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖。
当细胞达到90％融合后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液消化细胞并按照1：3的比例进行细胞传代。
(2)将上述制备的交联脱细胞羊膜制成片状，将片状的交联脱细胞羊膜的基质所在面贴于培养皿的底部，置于培养箱中。
(3)将(1)中诱导形成的表皮细胞以1×105的接种量接种于交联脱细胞羊膜的非基质所在面，加入皮肤培养基-培养液G进行培养。培养液G的配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mLFBS、0.01-1μmol/L胰岛素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mL hEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mL BPE和100-500μg/mL氯化钙。
每天更换培养液，培养6-8天，即得。
在本实施方式中表皮细胞是从尿细胞经过一系列的诱导、培养获得的，取材方便，对人体无伤害，属于优选的情况。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种脱细胞羊膜，其制备过程如下：
(1)取剖腹产孕妇的胎盘，并经血清检测排除HIV、梅毒、HBV和HCV等感染。
(2)在无菌条件下从胎盘的内层剥下羊膜，置于无菌生理盐水中，反复冲洗，除去羊膜表面的血迹，并用镊子钝性去除羊膜的绒毛膜。
(3)将羊膜用pH为7.3的PBS溶液反复漂洗多遍后，用抗生素溶液浸泡5分钟，PBS溶液浸泡10分钟，此过程重复3次。
(4)PBS溶液重新冲洗后将羊膜放入含DMEM和甘油的体积比为1：1的溶液中，-80℃条件下储存6个月以覆盖感染的窗口期。
(5)检测无病毒感染的储存后的羊膜，从-80℃到37℃反复冻融三次，之后置于0.25％的trypsin-EDTA水溶液中，在4℃条件下，孵育过夜。
(6)用含有血清的DMEM对孵育过夜后的羊膜进行终止消化，之后用PBS溶液冲洗三次。
实施例2
本实施例提供一种交联脱细胞羊膜，其制备过程如下：
将实施例1制得的脱细胞羊膜浸泡于30mL MES缓冲液中1h，之后加入EDC，并使其在MES缓冲液中的浓度为0.05mmol/mg，置于恒温摇床上，设置转速为30rpm，37℃条件下，交联反应5min，蒸馏水清洗，真空冷冻干燥，即得。
实施例3
本实施例提供一种复合型皮肤替代物，其制备过程如下：
(1)从尿液中提取尿细胞：
收集尿液，添加2mL两性霉素(青霉素和链霉素的混合液，两者的浓度均为500μg/mL)。
把收集的尿液，置于50mL离心管中，在400g转速下，离心10min，去除上清液，收集位于离心管底部的混悬液5mL。
将合并后的5mL混悬液中加入30mL含有两性霉素的PBS(两性霉素与PBS溶液的体积比为5:95)，轻轻混匀，吸去上清，得底部混悬液。
对6孔板进行预处理，即将需要用的孔预先用0.1％明胶包被处理20min以上的，再吸出0.1％的明胶。将获得的底部混悬液置于6孔板的预处理后的孔中，并向该孔中加入2mL培养液A和3μL Primocin，置于培养箱内，37℃条件下培养，待尿细胞贴壁生长后，吸去培养液A，用PBS洗一遍，再更换为培养液A继续培养。其中，培养液A的配方为：REGM培养基与MEF培养基以1：1的比例混合。
当尿细胞融合度达到80％，进行后续传代培养。
S2，将尿细胞培养为iPS细胞：
将表达转录调控因子2μg OCT4、2μg SOX2、2μg NANOG、2μg KLF4和2μg LIN28共同导入步骤S1中得到的尿细胞中。
再将含有表达转录调控因子的尿细胞置于预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养。
转染后第2d，将培养基更换为培养液B。以后，每天更换新鲜培养液B使克隆继续增殖。其中，培养液B为mTesR1培养基。
转染后第7d，电镜下观察形态，挑取与人胚胎干细胞相近细胞，并接种于用matrigel包被的12孔板中，培养液B培养获得诱导多能干细胞(iPS细胞)。
S3，将iPS细胞诱导培养获得间充质干细胞：
弃除原有iPS细胞培养液B，加DMEM/F12培养液清洗一遍，弃除，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g转速下离心5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例置于已被Matrigel包被处理的6孔板中，进行传代培养；
待iPS细胞长至6孔板体积的75％时，PBS冲洗一遍后，更换间充质干细胞诱导培养基C，并每两天更换一次培养基。其中，间充质干细胞诱导培养基C的配方为：450mL DMEM基础培养基、50mLFBS、3mmol/L L-谷酰胺、80μg/L bFGF和9mol/L地塞米松。
培养4-6d后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液进行消化，采用间充质干细胞培养基D重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至0.1％明胶预先包被处理的细胞培养皿中。
其中，间充质干细胞培养基D的培养液配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mL FBS、35ng/mL hEGF、4ng/mL HGF、2ng/mL bFGF、8ng/mL PDGF、6ng/mL IGF和6ng/mL TGF-β。
当细胞达到90％融合后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液消化细胞并按照1：3的比例进行细胞传代。
S4，将间充质干细胞诱导培养形成表皮细胞：
弃除上述间充质干细胞培养液D，加DMEM/F12培养液清洗一遍，弃除清洗液，加含0.5mM EDTA的DPBS，消化5min后，在400g转速下离心5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被处理的6孔板中。
待间充质干细胞长至6孔板体积的75％时，PBS冲洗一遍后，更换表皮细胞诱导培养基E，并每两天更换一次培养基E。其中，表皮细胞诱导培养基E的培养液配方为：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、25μg/L KGF、50μg/L TGF-β、9μg/L PDGF-AB、18μg/LVEGF、4μg/L IL-2和05μg/ml氢化可的松。
培养4-6d后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液进行消化，采用表皮细胞培养基F重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至细胞培养皿中培养。
其中，表皮细胞培养基F的配方为：450mLDMEM/F12培养基、50mLFBS、0.7ng/mL氢化可的松、1×10-10mol/L霍乱毒素、0.06ng/mL胰岛素、1×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、18ng/mL hEGF、10μg/mL转铁蛋白、7μg/mL谷氨酸、4μMY-27632和0.3mg/mL羧甲基壳聚糖。
当细胞达到90％融合后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液消化细胞并按照1：3的比例进行细胞传代。
(2)将上述制备的交联脱细胞羊膜制成片状，将片状的交联脱细胞羊膜的基质所在面贴于培养皿的底部，置于培养箱中。将(1)中诱导形成的表皮细胞以1×105的接种量接种于交联脱细胞羊膜的非基质所在面，加入皮肤培养基-培养液G进行培养。
其中，培养液G的配方为：450mLDMEM/F12培养基、50mLFBS、0.5μmol/L胰岛素、0.5mmol/mL甘氨酸、30ng/mL hEGF、100IU/mL青霉素、30μg/mL BPE和300μg/mL氯化钙。
每天更换培养液，培养6-8天，即得。
实施例4
本实施例提供一种由实施例1制备的脱细胞羊膜为培养基质制备的表皮-真皮替代物。具体制备过程和参数参见实施例3。
实施例5检测及结果分析
(一)电镜测试及结果分析
(1)脱细胞羊膜与未脱细胞羊膜的电镜观察
将实施例1制备获得的脱细胞羊膜与未脱细胞羊膜在电镜下观察基底膜并拍照，结果见图1和图2。
通常，完整羊膜上皮细胞的基底面通过大量的半桥粒结构紧密连接在基底膜表面。由图1可以看出，冷冻保存的未脱细胞处理的羊膜后，虽然上皮细胞的细胞形态有所损伤，但羊膜基质的结构完整性并未受影响，间质网状胶原纤维致密，排列整齐。由图2可以看出，脱细胞羊膜在完全去除上皮细胞的同时，基本保留了基底膜的完整结构，基质也未受影响。
(2)表皮细胞在交联脱细胞羊膜和脱细胞羊膜上的生长状况及皮肤替代物的观察
在电镜下观察实施3和实施例4的表皮细胞培养2d后的生长状况，见图3和图4。由图3和图4可知，表皮细胞在交联脱细胞羊膜上比脱细胞羊膜上的生长状态好，且增殖速度较快。
在电镜下观察实施3和实施例4表皮细胞培养4d后皮肤替代物的结构，见图5和图6。由图5可以看出，由交联脱细胞羊膜制备的复合型皮肤替代物的表面光滑平整，具有一定的硬度，能平铺培养皿表面。而图6可以看出，脱细胞羊膜联羊膜制备的皮肤替代物极其柔软，在培养皿中平铺后容易卷曲。
(二)机械强度测试
对实施例1制备获得的脱细胞羊膜和实施例2制备获得的交联脱细胞羊膜进行机械性能的检测，其检测过程如下：
将实施例1的制备获得的脱细胞羊膜分别切成尺寸为2cm×6cm的待测试样3份，依次命名脱细胞羊膜1、脱细胞羊膜2和脱细胞羊膜3。
将实施例2制备获得的交联脱细胞羊膜分别切成尺寸为2cm×6cm的待测试样3份，依次命名为交联脱细胞羊膜1、交联脱细胞羊膜2和交联脱细胞羊膜3。
将待测试样分别置于智能电子拉力试验机，用50N传感器，速度20mm/min，测定样品的拉伸强度、断裂伸长率和弹性模量，统计结果见表1。
由表1计算可得，交联脱细胞羊膜的平均拉伸强度为(1.598±0.0356)MPa、平均断裂伸长率为(26.194±0.331)％及平均弹性模量为(0.0055±0.0004)Gpa。脱细胞羊膜的平均拉伸强度为(0.849±0.0344)MPa、平均断裂伸长率为(15.729±0.483)％及平均弹性模量为(0.0028±0.0002)GPa。与未交联处理的脱细胞羊膜相比，交联脱细胞羊膜的机械强度显著增加(P<0.05)。
表1交联前后脱细胞羊膜的机械强度变化
组别 拉伸强度(MPa) 断裂伸率(％) 弹性模量(GPa)
交联脱细胞羊膜1 1.528 25.642 0.0048
交联脱细胞羊膜2 1.642 26.786 0.0055
交联脱细胞羊膜3 1.626 26.154 0.0062
脱细胞羊膜1 0.799 15.226 0.0027
脱细胞羊膜2 0.833 15.774 0.0029
脱细胞羊膜3 0.915 16.188 0.0030
(三)细胞生长因子含量的检测
将脱细胞羊膜1、脱细胞羊膜2、脱细胞羊膜3、交联脱细胞羊膜1、交联脱细胞羊膜2和交联脱细胞羊膜3分别置于细胞培养皿中，加入无血清培养基，置于细胞培养箱，37℃条件下，静置7d，收集浸提的培养液并用0.22μm过滤器过滤消毒，用ELISA试剂盒检测EGF、FGF、HGF含量。重复测定3次，统计结果见表2。
表2交联前后脱细胞羊膜的细胞因子含量的变化
组别 EGF(pg/mL) FGF(pg/mL) HGF(pg/mL)
交联脱细胞羊膜1 0.035 0.026 0.142
交联脱细胞羊膜2 0.032 0.025 0.145
交联脱细胞羊膜3 0.03 0.022 0.14
脱细胞羊膜1 0.03 0.025 0.138
脱细胞羊膜2 0.037 0.027 0.135
脱细胞羊膜3 0.029 0.028 0.136
由表2计算可得，交联脱细胞羊膜中EGF的平均含量为(0.0323±0.00145)pg/mL，FGF的平均含量为(0.024±0.0012)pg/mL，HGF的平均含量为(0.142±0.00145)pg/mL。脱细胞羊膜的EGF的平均含量为(0.032±0.0025)pg/mL，FGF的平均含量为(0.0267±0.0008)pg/mL，HGF的平均含量(0.136±0.0008)pg/mL。与未交联处理的脱细胞羊膜相比，交联脱细胞羊膜的细胞生长因子的含量无显著性变化(P＞0.05)。
(四)毒性检测
对实施例1制备获得的脱细胞羊膜和实施例2制备获得的交联脱细胞羊膜以分别置于无血清的培养基中，37℃下静置7d后，收集浸提培养液并用0.22μm过滤器过滤消毒。
将表皮细胞以1×104cells/孔的浓度接种至96孔板中，表皮细胞培养基培养待细胞完全贴壁后换成浸提培养液培养，隔日换液。
培养2d、4d和6d后分别用CCK-8检测法测定96孔板中表皮细胞的细胞活性，并用分光光度计(Bio-Tek)读取450nm的吸光度(OD450nm)。重复3次，统计结果见表3。
表3交联前后脱细胞羊膜的细胞毒性检测
组别 OD值 成活率/％
交联脱细胞羊膜2d 0.77±0.03 103.45±2.37
交联脱细胞羊膜4d 0.88±0.01 107.77±4.69
交联脱细胞羊膜6d 1.52±0.09 109.83±9.58
脱细胞羊膜2d 0.67±0.01 100
脱细胞羊膜4d 0.80±0.05 102.55±10.58
脱细胞羊膜6d 1.40±0.02 105.22±7.54
由表3的结果可知，表皮细胞分别培养2d、4d和6d之后，交联脱细胞羊膜与脱细胞羊膜相比的细胞毒性均无明显差异(P>0.05)。
实施例5
本实施例提供修复裸鼠皮肤缺损的效果证明试验。
选取4周龄裸鼠20只，1％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，于背部两侧各作约直径2cm的全层皮肤缺损创面，随机分为两组，依次命名为交联处理组和未交联处理组，每组10只。
将实施例3制备的复合型皮肤替代物移植到交联处理组的裸鼠缺损创面上，表皮面朝上，4号手术线间断缝合牢固，2周后观察创面的愈合情况，结果见图7。由图7可知，交联处理组的裸鼠的新生表皮接近正常皮肤，质软，表面平整光滑，创面轻微收缩。
将实施例4制备的表皮-真皮替代物移植到未交联处理组的裸鼠缺损创面上，同法处理，2周后观察创面的愈合情况，结果见图8。由图8可知，2周后未交联处理组的裸鼠的表皮比较薄，伤口的愈合不完整，创面具有一定程度的收缩。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种具有创面修复功效的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)浸泡：将脱细胞羊膜浸泡于25-35ml MES缓冲液中55-65min；
(2)交联反应：向浸泡后的羊膜所在的缓冲液中加入水溶性碳二亚胺，并使碳二亚胺的浓度为0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒温摇床上，转速28-32rpm，交联反应1-10min；
(3)蒸馏水清洗，真空冷冻干燥，即得交联脱细胞羊膜；
(4) 将交联脱细胞羊膜制成片状，将片状的所述交联脱细胞羊膜的基质所在面贴于培养皿的底部，置于培养箱中；将表皮细胞以1×105的接种量接种于制成片状后的交联脱细胞羊膜的非基质所在面，加入皮肤培养基G进行培养；所述培养基G的配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mL FBS、0.01-1μmol/L胰岛素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mL BPE和100-500μg/mL氯化钙；每天更换培养液，培养6-8天，即得所述复合型皮肤替代物；
所述表皮细胞由尿液细胞经诱导培养而成，其诱导培养的过程如下：
S1，从尿液中提取尿细胞；
S2，将所述尿细胞培养为iPS细胞；
S3，将所述iPS细胞诱导培养获得间充质干细胞；
S4，将所述间充质干细胞诱导培养，即得所述表皮细胞：
弃除间充质干细胞培养液D，加DMEM/F12培养液清洗一遍，弃除清洗液，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g转速下离心5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被处理的6孔板中，所述间充质干细胞培养基D的培养液配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mLFBS、10-50ng/mL hEGF、1-6ng/mL HGF、1-4ng/mL bFGF、1-10ng/mLPDGF、1-10ng/mL IGF和2-10ng/mLTGF-β；
待间充质干细胞长至6孔板体积的70％-80％时，pH为7.2-7.4的PBS溶液冲洗一遍后，更换表皮细胞诱导培养基E，并每两天更换一次培养基E，所述表皮细胞诱导培养基E的培养液配方为：450mL DMEM基础培养基、50mLFBS、10-40μg/L KGF、20-80μg/L TGF-β、6-15μg/LPDGF-AB、10-25μg/L VEGF、1-7μg/L IL-2和0.1-0.75μg/ml氢化可的松；培养4-6d后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液进行消化，采用表皮细胞培养基F重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至细胞培养皿中培养，所述表皮细胞培养基F的配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mL FBS、0.1-1ng/mL氢化可的松、1×10-10mol/L霍乱毒素、0.01-0.1ng/mL胰岛素、1×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、10-25ng/mL hEGF、5-15μg/m L转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μM Y-27632和0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述脱细胞羊膜由以下步骤制备而成：
在无菌条件下，从胎盘的内层剥下羊膜，放置到无菌生理盐水中，反复冲洗去除羊膜表面的脏污，并去除所述羊膜的绒毛膜，用pH为7.2-7.4的PBS溶液反复漂洗；
将漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH为7.2-7.4的PBS溶液浸泡8-12min，此过程重复多次；
用pH为7.2-7.4的PBS溶液重新冲洗后，置于含DMEM：甘油体积比为1：0.5-2的溶液中，-80℃条件下储存6-8个月；
取无感染的储存所得羊膜，4℃条件下，置于在质量百分比为0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育过夜；
再用含有血清的DMEM培养基对其进行终止消化，用pH为7.2-7.4的PBS溶液冲洗多次，备用。
3.根据权利要求2所述的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述脱细胞羊膜的制备过程，还包括复苏的步骤：
将无感染的储存6-8个月的所述羊膜预先依次置于-80±5℃和37±2℃环境中反复冻融2-4次后，备用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，所述从尿液中提取尿细胞包括：
收集尿液，添加2mL两性霉素，所述两性霉素为：青霉素和链霉素的混合液，两者浓度均为500μg/ml；
把收集的尿液进行离心，去上清液，收集位于离心管底部的混悬液1-5mL，将收集的混悬液全部合并后，加入收集所得液体6-10体积的含有两性霉素的PBS，所述两性霉素与PBS溶液的体积比为5:95，轻轻混匀，吸去上清，得底部混悬液；
对6孔板进行预处理，将需要用的孔预先用0.1％明胶包被处理20min以上，再吸出0.1％的明胶；将获得的底部混悬液置于6孔板的预处理后的孔中，并向该孔中加入2mL培养液A和3μL Primocin，置于培养箱内，37℃条件下培养，待 尿细胞贴壁生长后，吸去培养液A，用PBS洗一遍，再更换培养液A继续培养；所述培养液A的配方为：REGM培养基与MEF培养基以1：1的比例混合。
5.根据权利要求4所述的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述尿细胞的融合度不小于80％。
6.根据权利要求1所述的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述iPS细胞的融合度不小于90％。
7.根据权利要求1所述的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述间充质干细胞的融合度不小于90％。
8.如权利要求1～7任一项所述的方法制备得到的具有创面修复功效的复合型皮肤替代物。
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