CN107674857A - 一种表皮干细胞的制备方法及其培养基组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表皮干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)从尿液中收集细胞源；2)将表达转录调控因子通过质粒导入步骤1)得到的传代细胞，进行Ips诱导培养；所述Ips诱导养基为REGM和MEF的混合培养基；3)间充质干细胞的诱导及培养；和4)表皮干细胞的诱导及培养。本发明同时提供了一种表皮干细胞的培养基组。本发明提供的制备方法，细胞源有效地避免了伦理学争议，该制备方法有助于制得细胞分化、增殖情况较均一的表皮干细胞。

Description

一种表皮干细胞的制备方法及其培养基组
技术领域
本发明涉及一种细胞培养技术领域，尤其涉及一种表皮干细胞的制备方法及其培养基组。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，在抵御微生物入侵，紫外线辐射以及防止水分的丢失、调节体温方面起重要作用，当皮肤组织遭到缺损，传统的治疗方法是自体断层皮片移植，但存在供皮量有限和造成额外损伤的问题。
利用体外培养的人工皮肤即组织工程皮肤作为移植的来源可以从根本上解决上述问题，但是如何获得种子细胞却一直困扰着人们。随着医学生物学的发展，皮肤组织工程的深入，以表皮干细胞作为种子细胞逐渐受到人们的关注。越来越多的研究表明表皮干细胞存在着具有多向分化的潜能，如何能建立完善的培养扩增体系是当前迫切解决的问题。
表皮干细胞是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看年，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞，短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞。
因为表皮干细胞的细胞分化、代谢状况的机制尚不清晰，且没有较好的变化标志物，所以，培养生长状态一致性好、易于分离的表皮干细胞是目前面临的一大挑战。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种细胞增殖一致性好、纯度高的表皮干细胞的制备方法。
本发明的目的之二在于提供上述表皮干细胞的培养基组。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种表皮干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)收集细胞源：向尿液中加青霉素/链霉素双抗，收集表皮细胞，用含有抗生素的REGM培养基培养至融合度达到80％，进行传代培养，得传代细胞；
2)Ips细胞的诱导及培养：将表达转录调控因子通过质粒导入步骤1)得到的传代细胞，于孔板中利用Ips诱导培养基进行培养，培养2-3天后，更换为mTesR培养基进行培养，得到Ips细胞；
所述Ips诱导养基为REGM和MEF的混合培养基；
3)间充质干细胞的诱导及培养：用胰酶消化步骤2)得到的Ips细胞，接种至孔板，用mTesR培养基进行培养，至融合度达到70％时，用PBS清洗，加入间充质干细胞诱导培养基进行培养，至细胞发生形变，更换成间充质干细胞培养基，得间充质干细胞；
所述间充质干细胞诱导培养基：为含有FBS、胰岛素、谷氨酰胺、bFGF、SCF和地塞米松的DMEM培养基；
所述间充质干细胞培养基：为含有FBS、hEGF、bFGF、HGF、bFGF、PDGF、TGF-β的DMEM培养基；
4)表皮干细胞的诱导及培养：用含有EDTA的DPBS消化步骤3)得到的间充质干细胞，离心收集细胞沉淀，进行传代至孔板，待融合度为70-80％，更换成表皮细胞诱导培养基，培养4-5天后，用含有EDTA的DPBS消化，利用表皮细胞培养基重悬，制成单细胞悬液，进行传代培养；
所述表皮细胞诱导培养基：为含有FBS、KGF、TGF-β、PDGF-AB、VEGF、IL-2、氢化可的松的DMEM培养基；
所述表皮细胞培养基：为含有氢化可的松、氯化钙、胰岛素、BPE、青霉素、hEGF、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632、羧甲基壳聚糖的DMEM培养基。
进一步地，步骤1)中，将尿液离心，弃去上清液，再将残液用包被有0.1％明胶的6孔板，加入用含有抗生素的REGM培养基进行培养。
进一步地，步骤1)中，所述抗生素为Primocin；每孔加入2mLREGM培养基和3μLPrimocin。
进一步地，步骤2)中，所述表达转录调控因子为OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28。
进一步地，步骤2)中，转染后，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的，挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，用培养基mTesR培养获得Ips细胞。
进一步地，步骤3)中，将步骤2)得到的Ips细胞，用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至包被有Matrigel的6孔板中，mTesR培养基进行培养。
进一步地，步骤4)中，含有EDTA的DPBS中，EDTA的浓度为0.5mM。
进一步地，所述Ips诱导养基为REGM和MEF的按1:1体积比混合的培养基；
所述间充质干细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-160pM胰岛素、1-10mM L-谷氨酰胺、50-200μg/L bFGF、5-50μg/LSCF、2-5×10-8mol/L地塞米松；
所述间充质干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-100ng/mL hEGF、1-100ng/mL bFGF、1-50ng/mL HGF、1-45ng/mLbFGF、2-20ng/mL PDGF、1-25ng/mL TGF-β；
所述表皮细胞诱导培养为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、10-40μg/L KGF、20-80μg/L TGF-β、6-15μg/L PDGF-AB、10-25μg/LVEGF、1-7μg/L IL-2、0.1-0.75μg/mL氢化可的松；
所述表皮细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
0.1-1ng/mL氢化可的松、0.05-1mM氯化钙、0.01-0.1ng/mL胰岛素、0.1-1mg/mLBPE、50-200IU/mL青霉素、10-25ng/mL hEGF、5-15μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μMY-27632、0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种表皮干细胞的培养基组，包括以下培养基：
Ips诱导养基：REGM和MEF的混合培养基；
间充质干细胞诱导培养基：含有FBS、胰岛素、L-谷氨酰胺、bFGF、SCF、地塞米松的DMEM培养基；
间充质干细胞培养基：含有FBS、hEGF、bFGF、HGF、bFGF、PDGF、TGF-β的DMEM培养基；
表皮细胞诱导培养：含有FBS、KGF、TGF-β、PDGF-AB、VEGF、IL-2和氢化可的松的DMEM培养基；
表皮细胞培养基：含有氢化可的松、氯化钙、胰岛素、BPE、青霉素、hEGF、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基。
进一步地，所述Ips诱导养基为REGM和MEF的按1:1体积比混合的培养基；
所述间充质干细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-160pM胰岛素、1-10mM L-谷氨酰胺、50-200μg/L bFGF、5-50μg/LSCF、2-5×10-8mol/L地塞米松；
所述间充质干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-100ng/mL hEGF、1-100ng/mL bFGF、1-50ng/mL HGF、1-45ng/mLbFGF、2-20ng/mL PDGF、1-25ng/mL TGF-β；
所述表皮细胞诱导培养为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、10-40μg/L KGF、20-80μg/L TGF-β、6-15μg/L PDGF-AB、10-25μg/LVEGF、1-7μg/L IL-2、0.1-0.75μg/mL氢化可的松；
所述表皮细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
0.1-1ng/mL氢化可的松、0.05-1mM氯化钙、0.01-0.1ng/mL胰岛素、0.1-1mg/mLBPE、50-200IU/mL青霉素、10-25ng/mL hEGF、5-15μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μMY-27632、0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明开创性地使用人体排泄作为取样标本，有效了避免取血样、骨髓样等不必要的痛苦，同时避免了伦理学顾虑，其具有长远的意义；
2)本发明配制了有益于表皮细胞均一生长、分化阶段一致的培养基组，适用于分离、Ips培养、表皮培养的不同阶段，从免疫荧光鉴定图谱可见，表皮干细胞的形态具有较好的一致性；
3)本发明提供的培养基组能较好地控制细胞的生长、分化和增殖，其作为相配套的培养基组，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的K19免疫荧光鉴定图；
图2为实施例1的K15免疫荧光鉴定图；
图3为实施例2的K19免疫荧光鉴定图；
图4为实施例2的K15免疫荧光鉴定图；
图5为实施例3的K19免疫荧光鉴定图；
图6为实施例3的K15免疫荧光鉴定图；
图7为实施例1-3的流式细胞仪检测图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明提供一种表皮干细胞的制备方法，以人体排泄物为原料来源，取样及制备过程不存在伦理学争议。
以下具体实施方式中，如未特殊说明所采用的试剂或仪器，均可通过市售方式或常规的实验手段获得。
实施例1：
1)培养基的配制
Ips诱导培养基：将REGM与MEF培养基按1:1的体积比的比例混合；
间充质干细胞诱导培养基：取450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、80pM胰岛素、5mML-谷氨酰胺、150μg/L bFGF、25μg/L SCF、2.5×10-8mol/L地塞米松，混匀，即得；
间充质干细胞培养基：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、50ng/mL hEGF、50ng/mLbFGF、25ng/mL HGF、30ng/mL bFGF、15ng/mL PDGF、15ng/mL TGF-β，混匀，即得；
表皮细胞诱导培养基：450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、20μg/L KGF、50μg/LTGF-β、10μg/L PDGF-AB、15μg/L VEGF、5μg/L IL-2、0.5μg/mL氢化可的松，混匀，即得；
表皮细胞培养基：500mL DMEM基础培养基、0.5ng/mL氢化可的松、0.5mM氯化钙、0.05ng/mL胰岛素、0.5mg/mL BPE、100IU/mL青霉素、15ng/mL hEGF、10μg/mL转铁蛋白、5μg/mL谷氨酸、4μM Y-27632、0.25mg/mL羧甲基壳聚糖，混匀，即得；
2)尿液细胞的获取及培养
收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗；收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作；
每份尿液准备六孔板1孔，将此孔用0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体；
将尿液以400g转速离心10min；吸去上清液，残液汇合至同一离心管内，将5mL青霉素/链霉素加至95mL PBS中混匀，与残液进行按4:1进行混合，以400g转速离心10min，吸去上清液，保留0.5-1mL残液，加入包被有0.1％明胶的孔板中，每孔加入2mLREGM培养基加入3μL Primocin；
将培养皿放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理；当尿液细胞融合度达到80％，进行传代培养，得传代细胞。
3)Ips细胞的诱导及培养
将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28或其它转录因子的各种组合共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的6孔板中，用Ips诱导培养基培养；
转染后第2天，将培养基更换为mTesR培养基，每天更换新鲜培养基；使克隆继续增殖；
转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，mTesR培养基培养获得Ips细胞；
4)间充质干细胞的诱导及培养
将制备好的Ips细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至Matrigel包被好六孔板中，mTesR培养基进行培养；
待六孔板中的Ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将Ips培养基清除干净，加入间充质干细胞诱导培养基进行诱导培养，每天更换培养液；
培养5-7d细胞发生形变，更换间充质干细胞培养基进行培养；
5)表皮干细胞的诱导及培养
弃除原有间充质干细胞培养液，加DMEM/F12培养液清洗一遍；
弃除清洗液，加含0.5mM EDTA的DPBS，消化5min；
以400g的速度离心5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；
待间充质干细胞长至六孔板的70％～80％时，PBS冲洗一遍后，更换成表皮细胞诱导培养基，每两天更换一次培养基；
培养4d左右，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，表皮细胞培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3d达到90％后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化，表皮细胞培养基重悬细胞，进行传代培养。
实施例2：
实施例2与实施例1不同的是，1)培养基的配制如下所示：
Ips诱导培养基：将REGM与MEF培养基按1:1的体积比的比例混合；
间充质干细胞诱导培养基：取450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、1pM胰岛素、1mML-谷氨酰胺、50μg/L bFGF、5μg/L SCF、2×10-8mol/L地塞米松，混匀，即得；
间充质干细胞培养基：450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、1ng/mL hEGF、1ng/mLbFGF、1ng/mL HGF、1ng/mL bFGF、2ng/mL PDGF、1ng/mL TGF-β，混匀，即得；
表皮细胞诱导培养基：450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、10μg/L KGF、20μg/LTGF-β、60μg/L PDGF-AB、10μg/L VEGF、1μg/L IL-2、0.1μg/mL氢化可的松，混匀，即得；
表皮细胞培养基：500mL DMEM基础培养基、0.1ng/mL氢化可的松、0.05mM氯化钙、0.01ng/mL胰岛素、0.1mg/mL BPE、50IU/mL青霉素、10ng/mL hEGF、5μg/mL转铁蛋白、1μg/mL谷氨酸、1μM Y-27632、0.1mg/mL羧甲基壳聚糖，混匀，即得。
实施例3：
实施例3与实施例1不同的是，1)培养基的配制如下所示：
Ips诱导培养基：将REGM与MEF培养基按1:1的体积比的比例混合；
间充质干细胞诱导培养基：取450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、160pM胰岛素、10mM L-谷氨酰胺、200μg/L bFGF、50μg/L SCF、5×10-8mol/L地塞米松，混匀，即得；
间充质干细胞培养基：450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、100ng/mL hEGF、100ng/mL bFGF、50ng/mL HGF、45ng/mL bFGF、20ng/mL PDGF、25ng/mL TGF-β，混匀，即得；
表皮细胞诱导培养基：450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、40μg/L KGF、80μg/LTGF-β、15μg/L PDGF-AB、25μg/L VEGF、7μg/L IL-2、0.75μg/mL氢化可的松，混匀，即得；
表皮细胞培养基：500mL DMEM基础培养基、1ng/mL氢化可的松、1mM氯化钙、0.1ng/mL胰岛素、0.1mg/mL BPE、50IU/mL青霉素、10ng/mL hEGF、5μg/mL转铁蛋白、1μg/mL谷氨酸、1μM Y-27632、0.1mg/mL羧甲基壳聚糖，混匀，即得。
对比例1：
对比例1与实施例1不同的是，表皮培养基为含有10vt％FBS的KSFM培养基。
对比例2：
对比例2与实施例1不同的是，表面培养基中不含有羧甲基壳聚糖。
性能检测与效果评价：
1.MTT法检测细胞活力
取各实施例与对比例得到的表皮干细胞，采用MTT法检测，其活力如下表所示：
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
活力[％] 95.87 89.45 85.88 95.91 75.77
其中实施例1制得的干细胞的活力显著高于实施例2～3、对比例2(p<0.05)且与对比例1相比差异不明显(P>0.05)，说明无血清培养与含血清培养达到了相同的效果，且羧甲基壳聚糖有促进细胞生长的作用，且实施例1的效果更佳。
2.免疫荧光鉴定表皮干细胞表面标志物
用0.25％胰酶消化实施例1制得的细胞，以1×105的接种量接种于12孔板中，待其贴壁，4％的多聚甲醛固定2h，PBS洗三遍；
加200μL的一抗稀释液常温封闭1-2h；所述一抗稀释液为含有10vt％血清、0.3vt％TritonX-100的PBS；
弃去一抗稀释液，加入200μL鼠源CK19、CK15一抗抗体(稀释度为1:100)，4℃孵育过夜，PBS冲洗三次3次，每次5min；
加200μL FITC标记抗鼠二抗(1：400)，常温避光反应1h，PBS冲洗；上机检测前用PI染核。
荧光倒置显微镜下观察结果可见，表皮干细胞的阳性标志物CK19、CK15在多数表皮干细胞中呈阳性表达。荧光素FITC标记抗体与CK19、CK15单克隆抗体结合，在胞浆中表现为绿色荧光，PI试剂染表皮组织来源细胞的胞核为红色。
其中，对实施例1-3制得表皮干细胞的检测结果如图1-6。从图1-6可以看出，CK19、CK15蛋白是表皮干细胞的特异性标记蛋白，如图1和2所示，实施例1中的CK19、CK15的阳性表达量极高分别为95％和92％；如图3和4所示，实施例2中的CK19、CK15的阳性表达量分别为83％和82％；如图5和6所示，实施例3中的CK19、CK15的阳性表达量分别为78％和75％，说明诱导出的细胞均为表皮干细胞且实施例1的实验方案效果最佳。
3.流式细胞仪检测表皮干细胞表面标志物
用0.25％胰酶消化表皮干细胞并收集细胞，细胞数为2×105个；
细胞胞重悬于1mLDPBS中洗涤2次，200g，离心5min，得到的细胞沉淀加入1mL70％预冷的酒精重悬固定2h；
离心弃去固定液，加入200μL鼠源CK19、CK15、CK10一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；
1mL PBS洗涤，分别与FITC标记二抗(稀释度为1:200)常温避光孵育1h；
PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。
其中，对实施例1～3制得表皮干细胞的检测结果如图7。通过流式细胞仪分析显示，实施例1表皮干细胞中CK19蛋白的阳性表达量为96.77％以上，CK15蛋白的阳性表达量为85.22％以上，而CK10蛋白的阴性表达量在3.11％以下；实施例2表皮干细胞中CK19蛋白的阳性表达量为90.28％以上，CK15蛋白的阳性表达量为78.9％以上，而CK10蛋白的阴性表达量在5.23％以下；实施例3表皮干细胞中CK19蛋白的阳性表达量为88.47％以上，CK15蛋白的阳性表达量为65.11％以上，而CK10蛋白的阴性表达量在4.07％以下，均符合表皮干细胞表面标记物的表达结果且实施例1的实验方案效果最佳。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种表皮干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)收集细胞源：向尿液中加青霉素/链霉素双抗，收集表皮细胞，用含有抗生素的REGM培养基培养至融合度达到80％，进行传代培养，得传代细胞；
2)Ips细胞的诱导及培养：将表达转录调控因子通过质粒导入步骤1)得到的传代细胞，于孔板中利用Ips诱导培养基进行培养，培养2-3天后，更换为mTesR培养基进行培养，得到Ips细胞；
所述Ips诱导养基为REGM和MEF的混合培养基；
3)间充质干细胞的诱导及培养：用胰酶消化步骤2)得到的Ips细胞，接种至孔板，用mTesR培养基进行培养，至融合度达到70％时，用PBS清洗，加入间充质干细胞诱导培养基进行培养，至细胞发生形变，更换成间充质干细胞培养基，得间充质干细胞；
所述间充质干细胞诱导培养基：为含有FBS、胰岛素、谷氨酰胺、bFGF、SCF和地塞米松的DMEM培养基；
所述间充质干细胞培养基：为含有FBS、hEGF、bFGF、HGF、bFGF、PDGF、TGF-β的DMEM培养基；
4)表皮干细胞的诱导及培养：用含有EDTA的DPBS消化步骤3)得到的间充质干细胞，离心收集细胞沉淀，进行传代至孔板，待融合度为70-80％，更换成表皮细胞诱导培养基，培养4-5天后，用含有EDTA的DPBS消化，利用表皮细胞培养基重悬，制成单细胞悬液，进行传代培养；
所述表皮细胞诱导培养基：为含有FBS、KGF、TGF-β、PDGF-AB、VEGF、IL-2、氢化可的松的DMEM培养基；
所述表皮细胞培养基：为含有氢化可的松、氯化钙、胰岛素、BPE、青霉素、hEGF、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632、羧甲基壳聚糖的DMEM培养基。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，将尿液离心，弃去上清液，再将残液用包被有0.1％明胶的6孔板，加入用含有抗生素的REGM培养基进行培养。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述抗生素为Primocin；每孔加入2mLREGM培养基和3μL Primocin。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述表达转录调控因子为OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，转染后，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的，挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，用培养基mTesR培养获得Ips细胞。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将步骤2)得到的Ips细胞，用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至包被有Matrigel的6孔板中，mTesR培养基进行培养。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，含有EDTA的DPBS中，EDTA的浓度为0.5mM。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，
所述Ips诱导养基为REGM和MEF的按1:1体积比混合的培养基；
所述间充质干细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-160pM胰岛素、1-10mM L-谷氨酰胺、50-200μg/L bFGF、5-50μg/L SCF、2-5×10-8mol/L地塞米松；
所述间充质干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-100ng/mL hEGF、1-100ng/mL bFGF、1-50ng/mL HGF、1-45ng/mL bFGF、2-20ng/mL PDGF、1-25ng/mL TGF-β；
所述表皮细胞诱导培养为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、10-40μg/L KGF、20-80μg/L TGF-β、6-15μg/L PDGF-AB、10-25μg/L VEGF、1-7μg/L IL-2、0.1-0.75μg/mL氢化可的松；
所述表皮细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
0.1-1ng/mL氢化可的松、0.05-1mM氯化钙、0.01-0.1ng/mL胰岛素、0.1-1mg/mL BPE、50-200IU/mL青霉素、10-25ng/mL hEGF、5-15μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μM Y-27632、0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖。
9.一种表皮干细胞的培养基组，包括以下培养基：
Ips诱导养基：REGM和MEF的混合培养基；
间充质干细胞诱导培养基：含有FBS、胰岛素、L-谷氨酰胺、bFGF、SCF、地塞米松的DMEM培养基；
间充质干细胞培养基：含有FBS、hEGF、bFGF、HGF、bFGF、PDGF、TGF-β的DMEM培养基；
表皮细胞诱导培养：含有FBS、KGF、TGF-β、PDGF-AB、VEGF、IL-2和氢化可的松的DMEM培养基；
表皮细胞培养基：含有氢化可的松、氯化钙、胰岛素、BPE、青霉素、hEGF、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基。
10.如权利要求9所述的表皮干细胞的培养基组，其特征在于，
所述Ips诱导养基为REGM和MEF的按1:1体积比混合的培养基；
所述间充质干细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-160pM胰岛素、1-10mM L-谷氨酰胺、50-200μg/L bFGF、5-50μg/L SCF、2-5×10-8mol/L地塞米松；
所述间充质干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、1-100ng/mL hEGF、1-100ng/mL bFGF、1-50ng/mL HGF、1-45ng/mL bFGF、2-20ng/mL PDGF、1-25ng/mL TGF-β；
所述表皮细胞诱导培养为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
10vt％FBS、10-40μg/L KGF、20-80μg/L TGF-β、6-15μg/L PDGF-AB、10-25μg/L VEGF、1-7μg/L IL-2、0.1-0.75μg/mL氢化可的松；
所述表皮细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基：
0.1-1ng/mL氢化可的松、0.05-1mM氯化钙、0.01-0.1ng/mL胰岛素、0.1-1mg/mL BPE、50-200IU/mL青霉素、10-25ng/mL hEGF、5-15μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μM Y-27632、0.01-0.5mg/mL羧甲基壳聚糖。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979177A (zh) * 2020-07-20 2020-11-24 深圳市中佳生物医疗科技有限公司 一种人胆管上皮细胞的制备方法及其培养基
CN114164164A (zh) * 2021-12-07 2022-03-11 深圳市申友健康管理有限公司 一种表皮干细胞体外培养试剂盒及其应用
CN114317420A (zh) * 2021-12-15 2022-04-12 广东长隆集团有限公司 虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法
CN114317420B (zh) * 2021-12-15 2024-05-31 广东长隆集团有限公司 虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106860919A (zh) * 2017-02-20 2017-06-20 广州润虹医药科技有限公司 交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用
CN107129967A (zh) * 2017-06-18 2017-09-05 广东博溪生物科技有限公司 一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系
CN107142244A (zh) * 2017-07-03 2017-09-08 广州润虹医药科技股份有限公司 培养基及其用途与诱导多能干细胞向间充质干细胞转化的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106860919A (zh) * 2017-02-20 2017-06-20 广州润虹医药科技有限公司 交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用
CN107129967A (zh) * 2017-06-18 2017-09-05 广东博溪生物科技有限公司 一种用于原代人表皮细胞培养的无血清培养基体系
CN107142244A (zh) * 2017-07-03 2017-09-08 广州润虹医药科技股份有限公司 培养基及其用途与诱导多能干细胞向间充质干细胞转化的方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979177A (zh) * 2020-07-20 2020-11-24 深圳市中佳生物医疗科技有限公司 一种人胆管上皮细胞的制备方法及其培养基
CN111979177B (zh) * 2020-07-20 2023-05-16 深圳市中佳生物医疗科技有限公司 一种人胆管上皮细胞的制备方法及其培养基
CN114164164A (zh) * 2021-12-07 2022-03-11 深圳市申友健康管理有限公司 一种表皮干细胞体外培养试剂盒及其应用
CN114317420A (zh) * 2021-12-15 2022-04-12 广东长隆集团有限公司 虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法
CN114317420B (zh) * 2021-12-15 2024-05-31 广东长隆集团有限公司 虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法

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