CN114317420A - 虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法 - Google Patents
虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法。每100mL所述虎脂肪间充质干细胞培养液包含5mL～15mL胎牛血清、0.5mL～1.5mL双抗、0.5mL～1.5mL谷氨酰胺、400ng～600ng TGF‑a和400ng～600ng PGE1，以及细胞基础培养液。与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：本发明提供的培养液配方，适用于虎脂肪间充质干细胞的原代培养，填补了脂肪间充质干细胞在虎这一物种上的研究空白，为虎脂肪间充质干细胞体外培养、建系和应用奠定了基础，为后续临床疾病研究提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种虎脂肪间充质干细胞培养液 和虎脂肪间充质干细胞的培养方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesnchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化能 力的成体干细胞，在特定条件下可定向分化为肌肉、软骨、血管、内皮和 神经等多种细胞，是目前最具有临床应用前景的一类成体干细胞。已有多 项研究证明间充质干细胞在心血管疾病、血液疾病、关节损伤等疾病的治 疗中具有显著效果。其中，脂肪来源的间充质干细胞具有材料易得、免疫 原性低、增殖速度快等优点，并且在疾病治疗中避免了伦理和道德上的争议，是一种最佳治疗种子细胞，具有广阔的市场前景。
目前，对人类间充质干细胞(包括脂肪来源的间充质干细胞)的研究 较为深入，但是对虎脂肪间充质干细胞的研究却鲜有报道。如何获得虎脂 肪间充质干细胞是亟待解决的技术问题。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种细胞培养液，该细胞培养液适 用于虎脂肪间充质干细胞的原代培养。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种虎脂肪间充质干细胞培养液，每100mL所述虎脂肪间充质干细胞 培养液包含10mL～15mL胎牛血清、0.5mL～1.5mL双抗溶液、0.5mL～1.5mL谷氨酰胺溶液、400ng～600ngTGF-a和400ng～600ng PGE1，以及 细胞基础培养液，所述双抗溶液包含0.08U/L～0.12U/L青霉素和0.08μ g/L～0.12μg/L链霉素，所述谷氨酰胺溶液包含1mmol/L～3mmol/L谷氨酰胺。
在其中一个实施例中，每100mL所述虎脂肪间充质干细胞培养液包含 10mL～12mL胎牛血清、0.8mL～1.2mL双抗溶液、0.8mL～1.2mL谷氨酰 胺溶液、450ng～550ng TGF-a和400ng～600ng PGE1，以及细胞基础培养 液。
在其中一个实施例中，所述细胞基础培养液包含a-MEM液体培养基。
一种虎脂肪间充质干细胞的培养方法，所述培养方法包括采用所述的 细胞培养液对虎脂肪间充质干细胞进行培养的步骤。
在其中一个实施例中，所述虎脂肪间充质干细胞来源于孟加拉虎。
在其中一个实施例中，培养的阶段为原代培养和/或传代培养。
在其中一个实施例中，获取所述虎脂肪间充质干细胞的步骤包括：采 用胶原酶液对虎脂肪组织进行消化。
在其中一个实施例中，所述胶原酶的种类为Ⅰ型胶原酶。
在其中一个实施例中，消化的条件包括：消化温度为36.5℃～37.5℃， 消化时长≥30min。
在其中一个实施例中，所述胶原酶液的体积是虎脂肪组织的体积的8 倍～12倍，所述胶原酶液含胶原酶的质量百分比为0.8％～1.2％。
在其中一个实施例中，所述虎脂肪组织经双抗溶液浸泡后再采用所述 胶原酶液消化。
在其中一个实施例中，所述双抗溶液包括双抗质量百分比为18％～22％ 的第一浓度梯度溶液、双抗质量百分比为8％～12％的第二浓度梯度溶液和 双抗质量百分比为4.5％～5.5％的第三浓度梯度溶液，所述虎脂肪组织在所 述第一浓度梯度溶液、所述第二浓度梯度溶液和所述第三浓度梯度溶液中 浸泡时长分别为4.5min～5.5min、4.5～5.5min、4.5～5.5min。
在其中一个实施例中，所述双抗溶液的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明提供的培养液配方，适用于虎脂肪间充质干细胞的原代培养， 填补了脂肪间充质干细胞在虎这一物种上的研究空白，为虎脂肪间充质干 细胞体外培养、建系和应用奠定了基础，为后续临床疾病研究提供了新思 路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
图1为实施例2所得的生长曲线图；
图2为实施例3所得的间充质干细胞表面标志物基因鉴定结果图；
图3为实施例4所得的间充质干细胞的分化结果图；
图4为实施例5、实施例6和对比例细胞培养效果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应 当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实 施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发 明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的 技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所 使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限 制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关 所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任 意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列 项目、或者全部相关所列项目的组合。
术语：
本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为 指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征 的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭 式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个 端点。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固 相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓 度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在 一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范 围内进行波动。
虎作为国家保护动物，其疾病的治疗技术发展迅速，然而对于如关节 炎、神经损伤和肾脏损伤等疾病目前仍无有效治疗药物，间充质干细胞的 治疗为此提供了一个新的思路。为深入研究虎脂肪间充质干细胞在重大疾 病治疗上的应用，虎脂肪间充质干细胞的培养显得尤为重要。目前采用传 统的培养基，包括市面上商品化的完全培养基，培养虎脂肪间充质干细胞 的过程中，脂肪间充质干细胞都不能实现较好的生长，细胞主要表现出来形态的塌陷，衰老等状况。
第一方面，本发明提供一种虎脂肪间充质干细胞培养液，每100mL所 述虎脂肪间充质干细胞培养液包含10mL～15mL胎牛血清、0.5mL～1.5mL 双抗溶液、0.5mL～1.5mL谷氨酰胺溶液、400ng～600ng TGF-a和400ng～ 600ng PGE1，以及细胞基础培养液，所述双抗溶液包含0.08U/L～0.12U/L 青霉素和0.08μg/L～0.12μg/L链霉素，所述谷氨酰胺溶液包含1mmol/L～ 3mmol/L谷氨酰胺。
本发明提供的培养液配方，适用于虎脂肪间充质干细胞的原代培养， 填补了脂肪间充质干细胞在虎这一物种上的研究空白，为虎脂肪间充质干 细胞体外培养、建系和应用奠定了基础，为后续临床疾病研究提供了新思 路。采用本发明提供的培养液配方，在体外培养虎脂肪间充质干细胞的过 程中，包括原代培养和传代培养，虎脂肪间充质干细胞不易出现形态塌陷、 衰老等症状，能很好地维持细胞干性。
本发明提供的细胞培养液，使虎脂肪间充质干细胞培养得以实现，虎 脂肪间充质干细胞来源于虎脂肪组织，来源广泛，材料易得，使后期该细 胞的大量生产和临床应用成为可能。
在其中一个示例中，每100mL所述虎脂肪间充质干细胞培养液包含 10mL～12mL胎牛血清、0.8mL～1.2mL双抗溶液、0.8mL～1.2mL谷氨酰 胺溶液、450ng～550ng TGF-a和400ng～600ng PGE1，以及细胞基础培养 液。
在其中一个示例中，所述细胞基础培养液包含a-MEM液体培养基。
第二方面，本发明提供一种虎脂肪间充质干细胞的培养方法，所述培 养方法包括采用所述的虎脂肪间充质干细胞培养液对虎脂肪间充质干细胞 进行培养的步骤。
本发明的培养方法中，所述虎脂肪间充质干细胞可以来源于，包括但 不限于孟加拉虎。
本发明的培养方法中，培养的阶段为原代培养或/和传代培养。
在其中一个示例中，获取所述虎脂肪间充质干细胞的步骤包括：采用 胶原酶液对虎脂肪组织进行消化。
在其中一个示例中，所述胶原酶的种类为Ⅰ型胶原酶。
可以理解的是，本发明对消化的条件不做特别限定，可以采用合适的 条件消化至无明显的虎脂肪组织剩余，消化的条件包括但不限于：消化温 度为36.5℃～37.5℃，消化时长≥30min。例如消化的条件例如为：36.5℃ 下消化60min、36.7℃下消化35min、36.9℃下消化40min、37℃下消化50min、 37.5℃下消化30min。
在其中一个示例中，所述胶原酶液的体积是虎脂肪组织的体积的8倍～ 12倍(包括但不限于：8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、 11.5倍、12倍)，所述胶原酶液含胶原酶的质量百分比为0.8％～1.2％(包 括但不限于0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％)。
在其中一个示例中，所述虎脂肪组织经双抗溶液浸泡后再采用所述胶 原酶液消化。
在其中一个示例中，所述双抗溶液包括双抗质量百分比为18％～22％ (包括但不限于：18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、 22％)的第一浓度梯度溶液、双抗质量百分比为8％～12％(包括但不限于： 8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％)的第二浓度梯 度溶液和双抗质量百分比为4.5％～5.5％(包括但不限于4.5％、4.8％、5％、 5.3％、5.5％)的第三浓度梯度溶液，所述虎脂肪组织在所述第一浓度梯度 溶液、所述第二浓度梯度溶液和所述第三浓度梯度溶液中浸泡时长分别为 4.5min～5.5min、4.5min～5.5min、4.5min～5.5min，例如4.5min、4.7min、 5min、5.3min、5.5min。可以理解的是，本发明采用的上述浓度梯度的双 抗溶液，在浸泡的过程中，可以根据所含双抗的浓度，按高浓度至低浓度 的次序浸泡虎脂肪组织。本发明的上述双抗溶液，其来源于市购。
可以理解的是，在消化的过程中，为利于消化，可以将虎脂肪组织的 尺寸控制在合适的大小，例如0.8mm3～1.5mm3，包括但不限于0.8mm3、0.9 mm3、1.0mm3、1.1mm3、1.2mm3、1.3mm3、1.4mm3、1.5mm3。
在其中一个示例中，获取所述虎脂肪间充质干细胞的步骤还包括：对 消化所得产物进行稀释，去除所得稀释液中的组织残渣，离心，弃上清， 沉淀部分经重悬后采用所述脂肪间充质干细胞培养液培养。
在其中一个示例中，去除所得稀释液中的组织残渣的方式可以选用过 滤，例如采用200目筛网过滤。
在其中一个示例中，离心的条件包括：1100rpm～1300rpm离心4.5min～ 5.5min。
在其中一个示例中，稀释和重悬采用所述虎脂肪间充质干细胞培养液。
在其中一个示例中，培养的过程中，在培养开始的第24h和第72h分别 进行换液(更换为新鲜的所述虎脂肪间充质干细胞培养液)。
可以理解的是，在培养的过程中，可以根据虎脂肪间充质干细胞生长 状况进行后续传代。
在其中一个示例中，所述双抗溶液的溶剂包含磷酸盐缓冲液。磷酸盐 缓冲液的配方包括但不限于表1所示的配方。
上述获取所述虎脂肪间充质干细胞的步骤，主要采用胶原酶消化法， 胶原酶消化方法温和，对虎脂肪间充质细胞的损害较少，能获得大量的具 有较强增殖能力的虎脂肪间充质干细胞，可用于后续该细胞的建系、干细 胞特性与治疗疾病等。并且，该方法操作简单，重复性好，从中可获得较 少的杂细胞和无污染的纯净虎间充质干细胞。
本发明的下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方 法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。例如本 实施例中，双抗溶液、血清均购于Hyclone公司，Ⅰ型胶原酶、胎牛血清 购于SIGMA公司，胰蛋白酶购于Hyclone公司，成骨诱导分化基础培养基 购自赛业公司，成脂诱导分化基础培养基A液和成脂诱导分化基础培养基 B液购自赛业公司
实施例1、胶原酶法分离虎脂肪间充质干细胞并对其进行培养
(1)虎脂肪组织的采集
在需进行手术治疗的老虎的手术创口部周围，获取少量脂肪组织，立 即将脂肪组织放入含10％双抗溶液的PBS缓冲溶液中，其中，所述双抗溶 液中含0.1U/L青霉素和0.1μg/L链霉素。
(2)清洗和剪碎组织块
1)将分离到的脂肪组织置于含20％双抗溶液的PBS缓冲溶液中浸泡 5min，清洗干净血块，用镊子取出；
2)将步骤1)中取出的脂肪组织置于含10％双抗的PBS缓冲溶液中浸 泡5min，清洗干净血块，用镊子取出；
3)将步骤2)中取出的脂肪组织置于含5％双抗的PBS缓冲溶液中浸 泡5min，清洗干净血块，用镊子取出；
4)将步骤3)中取出的脂肪组织转移到无菌50mL离心管中，用组织 剪剪至1mm3大小。
(3)胶原酶消化
加入约10倍体积的1％Ⅰ型胶原酶液，置于37℃培养箱中消化30min 以上，至基本没有肉眼可见组织块。
(4)扩增培养
将步骤(3)所得产物用表2所示虎脂肪间充质干细胞培养液稀释后过200目筛网，1200rpm离心5min，弃上清，再加虎脂肪间充质干细胞培养 液吹打均匀后转移至培养皿中，以5％CO2浓度、37℃环境于培养箱中培养 至P5代。
本实施例中所使用的试剂包括：
PBS缓冲溶液的配制配方为：
表1
| 成分 | 含量 |
| NaCl | 8g |
| KCl | 0.2g |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 1.42g |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 0.27g |
| 超纯水 | 定容至1L |
| Total | 1L |
虎脂肪间充质干细胞培养液的配方为：
表2
| 成分 | 含量 |
| a-MEM培养基 | 定容至100mL |
| 胎牛血清 | 10mL |
| 双抗溶液(含0.1U/L青霉素和0.1μg//L链霉素) | 1mL |
| 谷氨酰胺溶液(含2mmol/L谷氨酰胺) | 1mL |
| TGF-a | 500ng |
| PGE1 | 500ng |
| Total | 100mL |
实施例2、绘制细胞生长曲线
(1)从实施例1取生长良好的第三代虎间充质干细胞，用0.25％胰蛋 白酶消化后制成细胞悬液；
(2)将虎间充质干细胞稀释至5×106/mL接种至96孔板中，每孔 0.1mL，置于含5％CO2，37℃培养箱中培养；
(3)24h后每天同一时间随机抽取5孔虎间充质干细胞，弃去上清， 用PBS清洗一到两次后，每孔加入配制好的CCK8工作液，然后置于37℃、 5％CO2培养箱孵育1h，然后利用酶标仪测量并记录对应OD值，每孔测量 三次取平均值(4)持续9d，生长曲线的绘制，横坐标代表天数，纵坐标代 表OD值，绘制得到如图1所示的生长曲线图。
实施例3、普通PCR鉴定
本实施例鉴定的细胞表面标记物包括CD105、CD29、CD44、CD90、 CD34，步骤包括：
1、Trizol法提取细胞RNA
(1)从实施例1中选取生长良好的第三代间充质干细胞，接种在明胶 包被过的六孔板上，使细胞长满孔板，弃去培养基，用DEPC-H2O(即DEPC 水)洗涤2次；
(2)加入1mlTrizol液，室温静置5min，吸取液体至1.5mL EP管中， 4℃，12000rpm，5min，离心结束吸取上清；
(3)加入200μL氯仿，混合均匀，室温静置5min，4℃，12000rcf， 15min，离心结束吸取上层水层至新的1.5mL EP管中；
(4)加入0.5ml异丙醇，混合均匀，室温静置5min后，4℃，12000rcf， 10min，离心结束后弃去上清；
(5)加入1mL 75％乙醇，温和震荡离心管悬浮沉淀，4℃，8000rcf， 10min，离心结束后尽量弃去上清，沉淀室温干燥10min；
(6)干燥结束后加入50μL RNase ddH2O溶解沉淀并检测浓度。
2、RNA转录cDNA
按TaKaRA逆转录试剂盒说明书进行相应试剂
3、普通PCR
取200μL的EP管，加入Premix Ex Taq12.5μL，cDNA1μL，ddH2O9.5 μL，上下游引物(CD34、CD44、Thy、Eng、IT)各1μL，充分混匀， 共25μL。
表3、扩增引物
设置程序如下：
表4、设置程序
4、电泳
(1)根据产物的大小，因配制1.5％的电泳胶，配制好的电泳胶冷却 30min；
(2)依次加入marker以及PCR产物，在电压120V，电流200ma，时 间20min；
(3)电泳结束后在照胶仪下观察记录电泳结果，见图2。由图可知， 表面标记物CD90、CD105、CD29、CD44呈阳性表达，表面标记物CD34 呈阴性，结果符合间充质干细胞特性。
实施例4、选取生长状态良好的虎脂肪间充质干细胞进行成脂和成骨诱 导分化鉴定
本实施例所需的试剂包括：
虎脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养液(购自赛业公司)配方：
表5
| 成分 | 含量 |
| 成骨诱导分化基础培养基 | 87.5mL |
| 胎牛血清 | 10mL |
| 谷氨酰胺 | 1mL |
| 双抗 | 1mL |
| 抗坏血酸 | 200μL |
| β-甘油磷酸钠 | 1mL |
| 地塞米松 | 10μL |
| Total | 100.21mL |
虎脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养液(购自赛业公司)配方：
表6
| A液成分 | 含量 |
| 成脂诱导分化基础培养基A液 | 87.5mL |
| 胎牛血清 | 10mL |
| 谷氨酰胺 | 1mL |
| 双抗 | 1mL |
| 胰岛素 | 200μL |
| IBMX | 100μL |
| 罗格列酮 | 100μL |
| 地塞米松 | 10μL |
| Total | 99.91mL |
表7
| B液成分 | 含量 |
| 成脂诱导分化基础培养基B液 | 87.5mL |
| 胎牛血清 | 10mL |
| 谷氨酰胺 | 1mL |
| 双抗 | 1mL |
| 胰岛素 | 200μL |
| Total | 99.7mL |
(一)诱导成脂分化步骤
1.取按照实施例1方法制备的虎脂肪间充质干细胞，待其培养至80％ 融合时，用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；
2.将细胞密度调整至1×105个/mL，加到二十四孔板中，每孔加1mL 细胞悬液；
3.置于37℃、5％CO2条件下培养细胞，每3天换一次表2提供的培养 液；
4.细胞达到100％汇合时，弃去孔内的培养液，用PBS冲洗2次，每孔 加入1ml A液；
5.培养三天后，弃去原培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入1ml表6 中的B液；
6.培养24小时后，弃去原培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入1ml表 6中的A液；
7.重复步骤5和步骤6 3次至5次，直至看见明显脂滴，最后将细胞养 在B液中3天；
8.油红O染色分析：弃去孔中培养液，用PBS清洗2次，加入2mL4％ 甲醛溶液固定细胞30min；然后弃去液体，PBS清洗2次，用1mL油红O 工作液染色30min后用PBS清洗2次，显微镜下观察并拍照记作“试验组”。
参照上述步骤1至步骤8进行操作，并在步骤4、步骤5、步骤6、步 骤7中采用表2提供的培养液代替A液和B液，记作“对照组”。
结果见图3。由图可知：对照组细胞形态没有发生明显改变，试验组细 胞在加入诱导分化培养基，胞体变大变圆，部分细胞发生融合，且可见胞 至内出现大小不一的脂质颗粒，进行油红O染色，结果表明试验组的脂质 颗粒能被油红O染成红色，而对照组不被染色。表明虎AD-MSCs具有脂 向分化的能力。
(二)诱导成骨分化步骤
1.采用表2所示虎脂肪间充质干细胞培养液将虎脂肪间充质干细胞培 养至80％融合时，用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；
2.将细胞密度调整至1×105个/ml，加到二十四孔板中，每孔加1ml细 胞悬液；
3.置于37℃、5％CO2条件下培养24h后弃去原培养液，用PBS清洗2 次后加入2ml表5所示成骨诱导分化培养液；
4.以后每3天换一次液，直至2～3周后进行茜素红染色分析；
5.茜素红染色分析：弃去原有培养液，用PBS清洗2次后每孔加入2ml 4％甲醛溶液固定30min；然后弃去液体用PBS洗2次，加入1ml茜素红工 作液反应五min后用PBS清洗2次，在光学显微镜下观察并拍照，记作“试 验组”。
参照上述步骤1至步骤5进行操作，并在步骤3中采用表2提供的培 养液代替表5所示成骨诱导分化培养液，记作“对照组”。
结果如图3所示。由图可知：对照组细胞形态未发生明显变化，未出
实施例5
实施例5是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于 步骤(4)中采用的虎脂肪间充质干细胞培养液配方不同，见表8。其余均 同实施例1。
实施例6
实施例6是实施例1的变化例，相对于实施例1的主要变化之处在于 步骤(4)中采用的虎脂肪间充质干细胞培养液配方不同，见表8。其余均 同实施例1。
对比例1
对比例1是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处在于 步骤(4)中采用的虎脂肪间充质干细胞培养液配方不同，见表8。其余均 同实施例1。
对比例2
对比例2是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处在于 步骤(4)中采用的虎脂肪间充质干细胞培养液配方不同，见表8。其余均 同实施例1。
表8
参照实施例1的步骤验证实施例5、实施例6、对比例1和对比例2提供的 虎脂肪间充质干细胞培养液的培养效果，即分别用实施例5、实施例6、对比例1和对比例2提供的虎脂肪间充质干细胞培养液代替表2所示的虎脂肪间充质干 细胞培养液进行细胞培养。
培养结果见图4。由图可知：采用实施例5和实施例6提供的虎脂肪间 充质干细胞培养液培养效果同实施例1，培养效果较好，细胞没有出现塌陷、 老化；而采用对比例1和对比例2提供的虎脂肪间充质干细胞培养液培养 细胞，细胞塌陷、老化，塌陷、老化的细胞表现为折光性差，细胞形态不 清晰等。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简 洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而， 只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解 本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构 思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。 应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎 逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权 利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的 内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 广东长隆集团有限公司
广东华南珍稀野生动物物种保护中心
<120> 虎脂肪间充质干细胞培养液和虎脂肪间充质干细胞的培养方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacagcacca tcagtgtgac atcc 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagcagtag caggcagtga gg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaggaggag gaaggaggag gag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaagcaggg agcacttgga cag 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggctcttgct tctgctctc 19
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcactctcc atcacattcc caacc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atccagagcc aggtagccaa gg 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgtgcgagt agatgtacca gagtg 25
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtggagaaga ccgtgatgcc ttac 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccagcagccg tgtaacattc ctc 23
Claims (10)
1.一种虎脂肪间充质干细胞培养液，其特征在于，每100mL所述虎脂肪间充质干细胞培养液包含10mL～15mL胎牛血清、0.5mL～1.5mL双抗溶液、0.5mL～1.5mL谷氨酰胺溶液、400ng～600ng TGF-a和400ng～600ng PGE1，以及细胞基础培养液，
所述双抗溶液包含0.08U/L～0.12U/L青霉素和0.08μg/L～0.12μg/L链霉素，
所述谷氨酰胺溶液包含1mmol/L～3mmol/L谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的虎脂肪间充质干细胞培养液，其特征在于，每100mL所述虎脂肪间充质干细胞培养液包含10mL～12mL胎牛血清、0.8mL～1.2mL双抗溶液、0.8mL～1.2mL谷氨酰胺溶液、450ng～550ng TGF-a和400ng～600ng PGE1，以及细胞基础培养液。
3.根据权利要求1或者2所述的虎脂肪间充质干细胞培养液，其特征在于，所述细胞基础培养液包含a-MEM液体培养基。
4.一种虎脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括采用权利要求1至3任一项所述的虎脂肪间充质干细胞培养液对虎脂肪间充质干细胞进行培养的步骤。
5.根据权利要求4所述的虎脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述虎脂肪间充质干细胞来源于孟加拉虎。
6.根据权利要求4所述的虎脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，培养的阶段为原代培养或/和传代培养。
7.根据权利要求4至6任一项所述的虎脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，获取所述虎脂肪间充质干细胞的步骤包括：采用胶原酶液对虎脂肪组织进行消化。
8.根据权利要求7所述的虎脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述胶原酶的种类为Ⅰ型胶原酶；
或/和，消化的条件包括：消化温度为36.5℃～37.5℃，消化时长≥30min；
或/和，所述胶原酶液的体积是虎脂肪组织的体积的8倍～12倍，所述胶原酶液含胶原酶的质量百分比为0.8％～1.2％。
9.根据权利要求7所述的虎脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述虎脂肪组织经双抗溶液浸泡后再采用所述胶原酶液消化。
10.根据权利要求9所述的虎脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述双抗溶液包括双抗质量百分比为18％～22％的第一浓度梯度溶液、双抗质量百分比为8％～12％的第二浓度梯度溶液和双抗质量百分比为4.5％～5.5％的第三浓度梯度溶液，所述虎脂肪组织在所述第一浓度梯度溶液、所述第二浓度梯度溶液和所述第三浓度梯度溶液中依次浸泡的时长为4.5min～5.5min、4.5～5.5min、4.5～5.5min；
或/和，所述双抗溶液的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
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