CN111790000A - 一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构及其制备方法。一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构，第一部分结构为一层医用尼龙布，第二部分结构为与医用尼龙布的外轮廓形状大小相同的脱细胞羊膜，脱细胞羊膜缝合于尼龙布上，第一部分结构与第二部分结构共同构成脱细胞羊膜支架，第三部分结构为脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞覆于脱细胞羊膜上。一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，步骤如下：步骤a.获取间充质干细胞；步骤b.制备脱细胞羊膜支架；步骤c.将间充质干细胞加载于脱细胞羊膜支架上，获得干细胞羊膜敷料结构。本发明公开的干细胞羊膜敷料结构防卷曲、易辨识正反、不易损坏。

Description

一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构及其制备方法。
背景技术
组织工程的研究内容包括四个方面，包括种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用。其中，种子细胞是应用组织工程的方法再造组织和器官所用的各类细胞，应用于组织工程的种子细胞需要分裂增殖能力强，分泌功能旺盛，没有或仅有极微弱的免疫排斥反应，能连续传代并且传代培养后不发生形态、功能及遗传物质的改变。
脐带间充质干细胞来源于新生儿出生后废弃的脐带组织，其来源广泛，取材方便，干细胞相对纯净，免疫原性低，增殖力强，具有强大的自我更新能力，还具有向脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、肝细胞以及肌细胞分化的潜能，成为组织修复和器官重建的理想的种子细胞来源，广泛用于再生医学中。在脐带间充质干细胞的培养过程中，能够分泌多种细胞因子，可通过旁分泌途径在损伤修复、组织再生、机体免疫调节等方面产生重要作用，其分泌的因子包括：（1）细胞外基质成分，比如各种胶原蛋白和弹性蛋白等；（2）生长因子类，如转化生长因子、碱性成纤维细胞成长因子等；（3）炎症因子及趋化因子类，如前列腺E2、白细胞介素6、白细胞介素8等。
脱细胞羊膜是一种免疫豁免生物移植物，具有抗炎、抗粘连、减轻疼痛、促进上皮化等生物学特性，是重要的生物活性载体来源之一。
目前已经有文献报道，将干细胞接种到脱细胞羊膜支架上用于皮肤创伤修复，但是，其缺点也比较明显：其易卷曲，与支撑物界限模糊，在使用时需要耗时辨认，易干燥且干燥后容易被撕扯损坏等，这些缺点都极大地限制了这种皮肤创伤修复结构材料的临床应用。
经过检索，申请号为CN201920570019.8的实用新型专利公开了一种羊膜载体培养皿，包括设置在培养皿中的环形支撑台和固定套环；所述的支撑台与培养皿同心；在支撑台的台面上设置有40～100um尼龙筛网，所述的尼龙筛网覆盖于支撑台上，其四周热固在支撑台的侧面；所述的培养皿与支撑台之间的间隙形成固定槽，所述的固定套环安装在所述的固定槽中，该实用新型能够有效克服或者负载生物凝胶过程中羊膜难以固定，容易卷曲、漂浮等问题。但是，该结构为辅助结构，羊膜只是暂时固定在培养皿上，在使用时，仍然需要使用镊子将固定套环夹出，由于固定套环的高度、大小问题，在夹出后使用时，仍然是需要将羊膜从固定套环上拆下再使用，在这个过程中，羊膜仍然是易被撕裂破损的，且该结构相当于是一种新的专用的培养结构，在进行羊膜培养时，相当于引入了新复杂结构的器械，增加了制备材料、器械的管理难度。
发明内容
为了解决背景技术中提出的问题，达到“给出一种新的不易卷曲、容易辨别正反面、不易被撕扯损坏的干细胞羊膜敷料结构”的目的，本发明给出了一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构及其制备方法。
一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构，包括三部分结构，第一部分结构为一层医用尼龙布，即无菌的尼龙布，同时，其孔径在100目-200目，以保持其透气性，第二部分结构为与医用尼龙布的外轮廓形状大小相同的脱细胞羊膜，通过尼龙线将脱细胞羊膜缝合于尼龙布上，使尼龙布与羊膜最大程度地贴合，保证羊膜充分伸展，避免培养过程中羊膜卷曲，第一部分结构与第二部分结构共同构成脱细胞羊膜支架，第三部分结构为脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞覆于脱细胞羊膜上。脱细胞羊膜厚度小于1mm，有韧性，白色，半透明。尼龙布为间充质干细胞在羊膜上贴壁提供了平整的环境，可以有效促进脐带间充质干细胞在羊膜上的贴壁及生长，同时为整个结构提供了一定的机械强度。整个结构的正反面易区分，可用镊子夹起，可折叠，在遭受轻微撕扯时也不易断裂。
由于本结构具有一定柔性，且在使用时无需将干细胞羊膜与尼龙布分离，使得整个培养过程、取用过程方便快捷，缩短了操作时间。
进一步地，医用尼龙布大小为4cm×4cm。
一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，步骤如下：步骤a.获取脐带间充质干细胞；步骤b.制备脱细胞羊膜支架；步骤c.将脐带间充质干细胞加载于脱细胞羊膜支架上，构建、获得干细胞羊膜敷料结构。
进一步地，步骤a中，首先收集产妇同意赠与且无病毒污染的脐带组织，使用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞，然后制成单细胞悬液，按照(2-3)×105个/ml细胞密度接种于培养瓶中，随后，在37℃培养箱中，用无血清培养基进行培养，当细胞达到70%-80%融合度时进行传代、扩增，当细胞传至第3代后，收集所有的培养上清液，同时获得第3代脐带间充质干细胞。0代细胞种类比较杂，必须要通过传代培养、纯化才能使用，一般临床使用的是活性最合适的P3-P4代细胞，且传代少，细胞活性好。
进一步地，步骤b中，首先取健康产妇的胎盘羊膜组织，使用生理盐水清洗2-3遍，将羊膜组织表面清洗干净，清洗后在含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中浸泡10min，做消毒处理；第二，将羊膜置于无菌方盘中，使用注射器内芯刮除海绵层，使用生理盐水反复3次浸泡、清洗将羊膜表面处理干净后，置于含有胰酶与EDTA的溶液中，使用摇床进行振荡消化，随后放入生理盐水中进行超声振荡洗涤，彻底除去残留的上皮细胞；第三，将清洗过的羊膜剪成片状，铺于外轮廓形状大小相同的尼龙布上，随后使用缝纫机将羊膜与尼龙布进行缝合，制成脱细胞羊膜支架。需要说明的是，此时无论将羊膜的哪一面与尼龙布紧贴都可以，因为此时羊膜的两面都能负载脐带间充质干细胞。随后，将脱细胞羊膜支架在37℃下干燥，随后置于甘油中密封，在-80℃下保存备用；第四，在进行步骤c之前，将-80℃保存的羊膜取出后，迅速放入37℃的恒温箱内解冻，然后用含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水清洗三遍除去甘油，随后将脱细胞羊膜支架置于新换的含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，在恒温37℃的条件下复水60min待用。
进一步地，健康产妇的胎盘羊膜组织来自于乙肝病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、HIV病毒抗体检测均为阴性的足月生产的剖腹产妇的新鲜胎盘组织，将胎盘组织在无菌条件下钝性剥离羊膜组织。
进一步地，所述的含有青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，青霉素含量为：100U/mL、链霉素含量为：0.1mg/mL、两性霉素B的含量为：0.25μg/mL。
进一步地，步骤b的第二步中，刮除海绵层的羊膜在置于0.25%胰酶与0.02%EDTA的溶液中以后，需要在4℃的摇床内振荡消化12小时；在摇床内振荡消化后，放入生理盐水内进行超声振荡洗涤3-5遍，每遍5-10分钟，彻底除去残留的上皮细胞；在步骤b的第三步中，将清洗过的羊膜剪成4cm×4cm大小。
进一步地，步骤c中，首先，在φ50cm的培养皿中加入1mL无血清培养基，将恒温37℃，复水60min的脱细胞羊膜支架放入培养皿中，并紧贴板底，随后放入恒温箱中孵育30min，将收集到的第3代间充质干细胞经消化后加在脱细胞羊膜支架上；其次，将培养皿放入37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养，第2天更换1次培养基，最终细胞长满整个羊膜界面，得到干细胞羊膜敷料结构，将其放入无菌储存瓶，加入步骤a中收集到的培养上清液，存储待用。
进一步地，在将第3代间充质干细胞经消化后均匀滴加在脱细胞羊膜支架上时，细胞浓度为5×105/mL，加1ml。
需要补充说明的是：事实上，还可以收集整形手术后多余的皮肤组织细胞、胎盘间充质干细胞，用以替代脐带间充质干细胞与尼龙布结合，用于创面修复；敷料结构中使用的医用尼龙布也可以用无纺布代替；为了保持敷料结构更好的透气性，还可以将医用尼龙布或是无纺布的中部剪掉，留下正方形边框提供支撑，边框的每条边的宽度在5mm左右即可。
与现有技术相比，本发明公开的技术方案具有以下有益效果：给出了一种新的干细胞羊膜敷料结构，同时，给出了该干细胞羊膜敷料结构的制备方法，该干细胞羊膜敷料结构的制备方法简单，该干细胞羊膜敷料结构不易卷曲、容易辨别正反面、不易被撕扯损坏，克服了干细胞羊膜的应用缺陷，这对于干细胞羊膜在组织再生的临床应用具有极为重要的意义，该干细胞羊膜敷料结构可以用于糖尿病足、静脉曲张等创面修复。
附图说明
图1：使用本发明公开的干细胞羊膜敷料结构前伤口情况。
图2：安装导管情况。
图3：加压包扎、固定导管情况。
图4：使用8天后的创面情况。
图5：使用12天后的创面情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图说明本发明的具体实施方式，公开实施方式的目的在于对本发明进行说明解释，而非是对本发明的限制，一切在本发明的基础上进行简单替换、组合和发展得到的技术方案，都应落入本发明保护范围。
实施例一
一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构，包括三部分结构，第一部分结构为一层医用尼龙布，医用尼龙布大小为4cm×4cm，第二部分结构为与医用尼龙布的外轮廓形状大小相同的脱细胞羊膜，通过尼龙线将脱细胞羊膜缝合于尼龙布上，使尼龙布与羊膜最大程度地贴合，保证羊膜充分伸展，避免培养过程中羊膜卷曲，第一部分结构与第二部分结构共同构成脱细胞羊膜支架，第三部分结构为脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞覆于脱细胞羊膜上。
一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，步骤如下：步骤a.获取脐带间充质干细胞；步骤b.制备脱细胞羊膜支架；步骤c.将脐带间充质干细胞加载于脱细胞羊膜支架上，构建、获得干细胞羊膜敷料结构。
进一步地，步骤a中，首先收集产妇同意赠与且无病毒污染的脐带组织，使用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞，然后制成单细胞悬液，按照2×105个/ml细胞密度接种于培养瓶中，随后，在37℃培养箱中，以无血清培养基进行培养，当细胞达到80%融合度时进行传代、扩增，当细胞传至第3代后，收集所有的培养上清液，同时获得第3代脐带间充质干细胞。
进一步地，步骤b中，首先取健康的剖腹产妇的羊膜组织，健康的剖腹产妇的羊膜组织来自于乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、HIV病毒抗体检测均为阴性的足月生产的剖腹产妇的新鲜胎盘组织，将胎盘组织在无菌条件下钝性剥离羊膜组织，使用生理盐水清洗2-3遍，将羊膜组织表面清洗干净，清洗后在含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中浸泡10min，做消毒处理，含有青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，青霉素含量为：100U/mL、链霉素含量为：0.1mg/mL、两性霉素B的含量为：0.25μg/mL；第二，将羊膜置于无菌方盘中，使用注射器内芯刮除海绵层，使用生理盐水反复3次浸泡、清洗将羊膜表面处理干净后，置于含有0.25%胰酶与0.02%EDTA的溶液中，使用摇床在4℃下进行振荡消化12小时，随后放入生理盐水中进行超声振荡洗涤3遍，每遍5分钟，彻底除去残留的上皮细胞；第三，将清洗过的羊膜剪成4cm×4cm的片状，置于外轮廓形状大小相同的医用尼龙布上，随后使用缝纫机将羊膜与尼龙布进行缝合，制成脱细胞羊膜支架，在37℃下干燥，随后置于甘油中密封，在-80℃下保存备用；第四，在进行步骤c之前，将-80℃保存的羊膜取出后，迅速放入37℃的恒温箱内解冻，然后用含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水清洗三遍除去甘油，随后将脱细胞羊膜支架置于新换的含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，在恒温37℃的条件下复水60min待用。
进一步地，步骤c中，首先，在φ50cm的培养皿中加入1mL无血清培养基，将恒温37℃，复水60min的脱细胞羊膜支架放入培养皿中，并紧贴板底，随后放入恒温箱中孵育30min，将收集到的第3代间充质干细胞经消化后，细胞浓度5×105/mL，均匀滴加1ml在脱细胞羊膜支架上；其次，将培养皿放入37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱培养，第2天更换1次培养基，最终，细胞长满整个羊膜界面，得到干细胞羊膜敷料结构，并放入无菌储存瓶，加入步骤a中收集到的培养上清液，存储待用。
在使用时，如图1所示，病例的静脉曲张创面溃烂严重，将病例的创面处理后，从无菌瓶中用镊子取出干细胞脱细胞羊膜，用生理盐水清洗干细胞羊膜2次，每次30s，让尼龙布面在上，移植干细胞羊膜组织工程皮肤，让细胞面紧密接触创面，驱去干细胞羊膜下的气泡；如图2、图3所示，在患处固定医用导管，然后用2层纱布覆盖，加压包扎、固定；观察应用后的创面愈合时间、敷料排斥反应、局部炎症分泌物及水泡发生情况等。每8小时从导管加一次营养液，每3-5天复诊及进行创面处理。3天后首次进行创面处理，干细胞羊膜形状完好，为创面提供一个近似封闭的环境，查体时用镊子揭开羊膜，见创面良好，无明显局部排斥和加重局部炎症反应情况。如图4所示，使用8天后，检查创面有好转迹象，患者感觉良好；如图5所示，12天后创面伤口变浅，较光滑平整，色素沉着减轻，水泡和残余创面形成减少，瘢痕增生也较轻。
创面愈合后2个月进行随访，皮肤弹性好，未见水泡、残余创面、瘢痕发生。
实施例二
本实施例与实施例一并没有本质上的区别，只是在步骤a中，将单细胞悬液，按照3×105个/ml细胞密度接种于培养瓶中，另外，在37℃培养箱中，以无血清培养基进行培养，当细胞达到70%融合度时进行传代、扩增。
一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构，包括三部分结构，第一部分结构为一层医用尼龙布，医用尼龙布大小为4cm×4cm，第二部分结构为与医用尼龙布的外轮廓形状大小相同的脱细胞羊膜，通过尼龙线将脱细胞羊膜缝合于尼龙布上，使尼龙布与羊膜最大程度地贴合，保证羊膜充分伸展，避免培养过程中羊膜卷曲，第一部分结构与第二部分结构共同构成脱细胞羊膜支架，第三部分结构为脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞覆于脱细胞羊膜上。
一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，步骤如下：步骤a.获取脐带间充质干细胞；步骤b.制备脱细胞羊膜支架；步骤c.将脐带间充质干细胞加载于脱细胞羊膜支架上，构建、获得干细胞羊膜敷料结构。
进一步地，步骤a中，首先收集产妇同意赠与且无病毒污染的脐带组织，使用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞，然后制成单细胞悬液，按照3×105个/ml细胞密度接种于培养瓶中，随后，在37℃培养箱中，以无血清培养基进行培养，当细胞达到70%融合度时进行传代、扩增，当细胞传至第3代后，收集所有的培养上清液，同时获得第3代脐带间充质干细胞。
进一步地，步骤b中，首先取健康的剖腹产妇的羊膜组织，健康的剖腹产妇的羊膜组织来自于乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、HIV病毒抗体检测均为阴性的足月生产的剖腹产妇的新鲜胎盘组织，将胎盘组织在无菌条件下钝性剥离羊膜组织，使用生理盐水清洗2-3遍，将羊膜组织表面清洗干净，清洗后在含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中浸泡10min，做消毒处理，含有青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，青霉素含量为：100U/mL、链霉素含量为：0.1mg/mL、两性霉素B的含量为：0.25μg/mL；第二，将羊膜置于无菌方盘中，使用注射器内芯刮除海绵层，使用生理盐水反复3次浸泡、清洗将羊膜表面处理干净后，置于含有0.25%胰酶与0.02%EDTA的溶液中，使用摇床在4℃下进行振荡消化12小时，随后放入生理盐水中进行超声振荡洗涤3遍，每遍5分钟，彻底除去残留的上皮细胞；第三，将清洗过的羊膜剪成4cm×4cm的片状，铺于外轮廓形状大小相同的医用尼龙布上，随后使用缝纫机将羊膜与尼龙布进行缝合，制成脱细胞羊膜支架，在37℃下干燥，随后置于甘油中密封，在-80℃下保存备用；第四，在进行步骤c之前，将-80℃保存的羊膜取出后，迅速放入37℃的恒温箱内解冻，然后用含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水清洗三遍除去甘油，随后将脱细胞羊膜支架置于新换的含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，在恒温37℃的条件下复水60min待用。
进一步地，步骤c中，首先，在φ50cm的培养皿中加入1mL无血清培养基，将恒温37℃，复水60min的脱细胞羊膜支架放入培养皿中，并紧贴板底，随后放入恒温箱中孵育30min，将收集到的第3代间充质干细胞经消化后，细胞浓度5×105/mL，均匀滴加1ml在脱细胞羊膜支架上；其次，将培养皿放入37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱培养，第2天更换1次培养基，最终，细胞长满整个羊膜界面，得到干细胞羊膜敷料结构，并放入无菌储存瓶，加入步骤a中收集到的培养上清液，存储待用。

Claims (10)

1.一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构，其特征在于：包括三部分结构，第一部分结构为一层医用尼龙布，第二部分结构为与医用尼龙布的外轮廓形状大小相同的脱细胞羊膜，脱细胞羊膜缝合于尼龙布上，第一部分结构与第二部分结构共同构成脱细胞羊膜支架，第三部分结构为脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞覆于脱细胞羊膜上。
2.如权利要求1所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构，其特征在于：医用尼龙布大小为4cm×4cm。
3.一种如权利要求1所述的用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：步骤如下：步骤a.获取脐带间充质干细胞；步骤b.制备脱细胞羊膜支架；步骤c.将脐带间充质干细胞加载于脱细胞羊膜支架上，构建、获得干细胞羊膜敷料结构。
4.如权利要求3所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：步骤a中，首先收集产妇同意赠与且无病毒污染的脐带组织，使用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞，然后制成单细胞悬液，按照(2-3)×105个/ml细胞密度接种于培养瓶中，随后，在37℃培养箱中，以无血清培养基进行培养，当细胞达到70%-80%融合度时进行传代、扩增，当细胞传至第3代后，收集所有的培养上清液，同时获得第3代脐带间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：步骤b中，首先取健康产妇的胎盘羊膜组织，使用生理盐水将羊膜组织表面清洗干净，清洗后在含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中浸泡10min；第二，将羊膜置于无菌方盘中，刮除海绵层，使用生理盐水将羊膜表面浸泡、清洗干净后，置于含有胰酶与EDTA的溶液中，使用摇床进行振荡消化，随后放入生理盐水中，进行超声振荡洗涤；第三，将清洗过的羊膜剪成片状，铺于外轮廓形状大小相同的尼龙布上，随后使用缝纫机将羊膜与尼龙布进行缝合，制成脱细胞羊膜支架，在37℃下干燥，随后置于甘油中密封，在-80℃下保存备用；第四，在进行步骤c之前，将-80℃保存的羊膜取出后，迅速放入37℃的恒温箱内解冻，然后用含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水清洗除去甘油，随后将脱细胞羊膜支架置于新换的含青霉素、链霉素、两性霉素B的生理盐水中，在恒温37℃的条件下复水60min待用。
6.如权利要求5所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：羊膜组织来自于经检测乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、HIV病毒抗体均为阴性的，足月生产的剖腹产妇的新鲜胎盘组织，将胎盘组织在无菌条件下钝性剥离羊膜组织。
7.如权利要求6所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：所述的含有青霉素、链霉素、两性霉素B的0.9%生理盐水中，青霉素含量为：100U/mL、链霉素含量为：0.1mg/mL、两性霉素B的含量为：0.25μg/mL。
8.如权利要求7所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：步骤b的第二步中，将刮除海绵层的羊膜在置于0.25%胰酶与0.02%EDTA的溶液中以后，需要在4℃的摇床内振荡消化12小时；在摇床内振荡消化后，放入生理盐水内进行超声振荡洗涤，彻底除去残留的上皮细胞；在步骤b的第三步中，将清洗过的羊膜剪成4cm×4cm大小。
9.如权利要求8所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：步骤c中，首先，在φ50cm的培养皿中加入1mL无血清培养基，将恒温37℃，复水60min的脱细胞羊膜支架放入培养皿中，并紧贴板底，随后放入恒温箱中孵育30min，将收集到的第3代脐带间充质干细胞加在脱细胞羊膜支架上；其次，将培养皿放入37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养，第2天更换1次培养基，最终，细胞长满整个羊膜界面，得到干细胞羊膜敷料结构，将其放入无菌储存瓶，加入步骤a中收集到的培养上清液，存储待用。
10.如权利要求9所述的一种用于创面修复的干细胞羊膜敷料结构的制备方法，其特征在于：在将第3代脐带间充质干细胞加在脱细胞羊膜支架上时，细胞浓度为5×105/mL，加1ml。
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