JP5885109B2 - 培養方法及び培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、培養方法及び培養装置に関し、特に、医療への応用に適した細胞及び／又は細胞組織体の製造に関する。

従来、基材表面に接着させて培養した細胞を回収する方法としては、例えば、タンパク質分解酵素やキレート剤を使用する方法、磁力を使用する方法、温度応答性高分子を使用する方法、光応答性高分子を使用する方法があった。

しかしながら、タンパク質分解酵素やキレート剤を使用する方法においては、細胞が傷害を受けることがあった。また、磁力を使用する方法においては細胞を予め磁性化する必要があった。温度応答性高分子や光応答性高分子を使用する方法においては培養期間を通じて温度や光を制御する必要があった。

そこで、特許文献１において、チオレートを介してスペーサ物質が結合した電極表面に細胞を接着させて培養し、次いで、当該細胞が接着している当該電極表面に、当該スペーサ物質が還元脱離する電位を印加して、当該細胞を当該電極表面から脱離させる方法が提案された。

また、非特許文献１においては、中心に細胞接着性ドメイン（ＲＧＤ）、両端にシステイン残基を有するオリゴペプチドを介して金表面に細胞を接着させ、次いで、還元脱離によって当該細胞を当該金表面から脱離させる方法が提案された。

特開２００８−２９５３８２号公報

Seto etal. Biomaterials, 2209-2215, 2010

しかしながら、特許文献１において使用されたスペーサ物質（例えば、アルカンチオールに細胞接着性ペプチドを結合させてなる細胞接着性スペーサ物質）が結合した細胞又は細胞組織体は、生体に移植する場合の安全性が明らかでなかった。

また、非特許文献１において使用されたオリゴペプチドは、金表面で自己組織化するものではなかったため、当該金表面において当該オリゴペプチドは密な層を形成していなかった。このため、培養培地中のタンパク質等の物質が金表面に非特異的に吸着し、５分間の電位の印加によっても、当該金表面に接着した細胞の１０％前後は脱離せずに残存することがあった。

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、医療への応用に適した細胞及び／又は細胞組織体を効率よく製造する培養方法及び培養装置を提供することをその目的の一つとする。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る培養方法は、電極層に接着した細胞を培養する方法であって、一方の末端を構成しチオレートを介して前記電極層に結合する末端アミノ酸と、他方の末端を構成し細胞接着性のアミノ酸配列からなる細胞接着性配列と、前記細胞接着性配列の前記一方の末端側に結合し複数の酸性アミノ酸と複数の塩基性アミノ酸とが１つずつ交互に結合してなる交互配列と、を有するオリゴペプチドで被覆された前記電極層に前記細胞を接着させて培養する第一工程と、前記細胞が接着している前記電極層に、前記オリゴペプチドが還元脱離する電位を印加して、前記細胞を前記電極層から脱離させる第二工程と、を含むことを特徴とする。本発明によれば、医療への応用に適した細胞及び／又は細胞組織体を効率よく製造する培養方法を提供することができる。

また、前記培養方法において、前記電極層は、培養液中に浮いた状態で保持される多孔質膜の表面に形成されていることとしてもよい。また、前記第一工程において、前記電極層に前記細胞を接着させて培養することで前記電極層に接着した細胞組織体シートを形成し、前記第二工程において、前記細胞組織体シートが接着している前記電極層に、前記オリゴペプチドが還元脱離する前記電位を印加して、前記細胞組織体シートを前記電極層から脱離させることとしてもよい。この場合、前記培養方法は、前記電極層から脱離させた複数の前記細胞組織体シートを積層して、前記細胞組織体シートの積層体を形成する第三工程をさらに含むこととしてもよい。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る培養装置は、細胞を接着させて培養するための電極層を有する培養装置であって、前記電極層は、一方の末端を構成しチオレートを介して前記電極層に結合する末端アミノ酸と、他方の末端を構成し細胞接着性のアミノ酸配列からなる細胞接着性配列と、前記細胞接着性配列の前記一方の末端側に結合し複数の酸性アミノ酸と複数の塩基性アミノ酸とが１つずつ交互に結合してなる交互配列と、を有するオリゴペプチドで被覆されていることを特徴とする。本発明によれば、医療への応用に適した細胞及び／又は細胞組織体を効率よく製造する培養装置を提供することができる。

また、前記培養装置において、前記電極層は、培養液中に浮いた状態で保持される多孔質膜の表面に形成されていることとしてもよい。

本発明によれば、医療への応用に適した細胞及び／又は細胞組織体を効率よく製造する培養方法及び培養装置を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る培養方法の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。 本発明の一実施形態において使用するオリゴペプチドで被覆された電極層の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態において使用するオリゴペプチドの一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態において使用する電極層の一例を示す説明図である。 図４Ａに示す電極層に細胞が接着した様子を示す説明図である。 図４Ｂに示す電極層に電位を印加して細胞を脱離させる様子を示す説明図である。 本発明の一実施形態において細胞組織体シートを形成するために電極層で細胞を培養する様子を示す説明図である。 図５Ａに示す細胞を培養することで細胞組織体シートを形成する様子を示す説明図である。 図５Ｂに示す電極層に電位を印加して細胞組織体シートを脱離させる様子を示す説明図である。 本発明の一実施形態において使用する多孔質膜に形成された電極層の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態において多孔質膜に形成された電極層に接着した細胞組織体シートを培養する様子を示す説明図である。 図７Ａに示す細胞組織体シートを培養して、より厚い細胞組織体シートを形成する様子を示す説明図である。 図７Ｂに示す多孔質膜上の電極層に電位を印加して細胞組織体シートを脱離させる様子を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る培養方法の他の例に含まれる主な工程を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において電極層に対するオリゴペプチドの化学吸着を評価した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において電位の印加による電極層からのオリゴペプチドの脱離を評価した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例においてオリゴペプチドで被覆された電極層に対するタンパク質の吸着を評価した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例においてオリゴペプチドで被覆された電極層に電位を印加して得られたサイクリックボルタモグラムの一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において電位の印加により電極層から脱離した細胞の数を評価した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において使用した多孔質膜を含む培養容器の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において使用した多孔質膜の電子顕微鏡写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において培養ディッシュの底面に形成された電極層上で細胞を７日間培養することで形成された細胞組織体シートの断面写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において多孔質膜の表面に形成された電極層上で細胞を７日間培養することで形成された細胞組織体シートの断面写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において多孔質膜の表面に形成された電極層上で細胞を２１日間培養することで形成された細胞組織体シートの断面写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において複数の細胞組織体シートを積層して形成された細胞組織積層体の断面写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において電極層から脱離して回収された細胞の増殖を評価した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において電極層から脱離して回収された細胞組織体シートの生存状態を評価した結果の一例を示す説明図である。

以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態で示す例に限られるものではない。

図１は、本実施形態に係る培養方法（以下、「本方法」という。）の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。図２は、本実施形態で使用するオリゴペプチドで被覆された電極層の一例を示す説明図である。図３は、本実施形態で使用するオリゴペプチドの一例を示す説明図である。図４Ａ〜図４Ｃは、本実施形態において細胞を培養し回収する過程の一例についての説明図である。

本方法は、電極層３０に接着した細胞５０を培養する方法であって、一方の末端を構成しチオレートを介して当該電極層３０に結合する末端アミノ酸１１と、他方の末端を構成し細胞接着性のアミノ酸配列からなる細胞接着性配列１４と、当該細胞接着性配列１４の当該一方の末端側に結合し複数の酸性アミノ酸１３ａと複数の塩基性アミノ酸１３ｂとが１つずつ交互に結合してなる交互配列１３と、を有するオリゴペプチド（以下、「接着性オリゴペプチド１０」という。）で被覆された当該電極層３０に当該細胞５０を接着させて培養する第一工程（以下、「培養工程Ｓ１」という。）と、当該細胞５０が接着している当該電極層３０に、当該接着性オリゴペプチド１０が還元脱離する電位を印加して、当該細胞５０を当該電極層３０から脱離させる第二工程（以下、「脱離工程Ｓ２」という。）と、を含む。

培養工程Ｓ１においては、まず、接着性オリゴペプチド１０で被覆された電極層３０を準備する。接着性オリゴペプチド１０は、上述のように末端アミノ酸１１、交互配列１３及び細胞接着性配列１４を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであれば特に限られない。

接着性オリゴペプチド１０を構成するアミノ酸の数は、特に限られないが、当該接着性オリゴペプチド１０は、例えば、８〜１００個のアミノ酸からなるペプチドとすることができ、１０〜３０個のアミノ酸からなるペプチドとすることが好ましい。図２及び図３に示す例において、接着性オリゴペプチド１０は、１７個のアミノ酸から構成されるペプチドである。

また、接着性オリゴペプチド１０は、電極層３０に自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ）を形成するオリゴペプチドであることが好ましい。すなわち、接着性オリゴペプチド１０は、例えば、４つ以上のアミノ酸からなる交互配列１３を有することが好ましい。この場合、隣接する接着性オリゴペプチド１０の分子間に効果的な静電的相互作用が生じることにより、電極層３０に当該接着性オリゴペプチド１０の自己組織化単分子膜を確実に形成することができる。図２及び図４Ａ〜図４Ｃに示す例において、電極層３０には、接着性オリゴペプチド１０を含み当該電極層３０を被覆する自己組織化単分子膜からなるオリゴペプチド層１００が形成されている。

末端アミノ酸１１は、チオレートを介して電極層３０に結合するアミノ酸であれば特に限られない。すなわち、末端アミノ酸１１は、電極層３０との間でチオレートを介した結合を形成し得る官能基を有する任意のアミノ酸である。

チオレートを形成し得る官能基は、例えば、チオール基（−ＳＨ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）及びスルフィド（−Ｓ−）からなる群より選択される１種以上とすることができる。図２及び図３に示す例において、末端アミノ酸１１は、接着性オリゴペプチド１０のＮ末端を構成するシステイン（Ｃ）である。

接着性オリゴペプチド１０が末端アミノ酸１１を有することにより、当該接着性オリゴペプチド１０による電極層３０の被覆及び後述する当該接着性オリゴペプチド１０の還元脱離を効果的に行うことができる。

細胞接着性配列１４は、細胞接着性のアミノ酸配列であれば特に限られない。すなわち、細胞接着性配列１４は、例えば、使用する細胞５０の表面に存在する分子（例えば、インテグリン等のタンパク質や、糖鎖）に特異的に結合する特定のアミノ酸配列（以下、「特定アミノ酸配列」という。）を含むことができる。図２及び図３に示す例において、細胞接着性配列１４は、接着性オリゴペプチド１０のＣ末端を構成し、アルギニン（Ｒ）とグリシン（Ｇ）とアスパラギン酸（Ｄ）とが結合してなる、いわゆるＲＧＤ配列を特定アミノ酸配列として含んでいる。

細胞接着性配列１４は、特定アミノ酸配列からなるアミノ酸配列とすることができ、また、当該特定アミノ酸配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側に他のアミノ酸がさらに結合してなるアミノ酸配列とすることもできる。

細胞接着性配列１４に含まれる、特定アミノ酸以外のアミノ酸は、例えば、中性アミノ酸とすることができる。中性アミノ酸は、例えば、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ），グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される１種以上とすることができる。

図２及び図３に示す例において、細胞接着性配列１４は、ＲＧＤ配列と、当該ＲＧＤ配列のＮ末端側に結合したグリシン（Ｇ）と、当該ＲＧＤ配列のＣ末端側に順次結合したセリン（Ｓ）及びプロリン（Ｐ）と、を含んでいる。

細胞接着性配列１４を構成するアミノ酸の数は、特に限られないが、当該細胞接着性配列１４は、例えば、３〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列とすることができ、５〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列とすることが好ましい。図２及び図３に示す例において、細胞接着性配列１４は、６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。

接着性オリゴペプチド１０が細胞接着性配列１４を有することにより、細胞５０の当該接着性オリゴペプチド１０を介した電極層３０への接着を確実に達成することができる。

交互配列１３は、酸性アミノ酸１３ａと塩基性アミノ酸１３ｂとが１つずつ交互に結合することにより形成された、全体として複数の当該酸性アミノ酸１３ａと複数の当該塩基性アミノ酸１３ｂとからなるアミノ酸配列であれば特に限られない。

酸性アミノ酸１３ａは、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）からなる群より選択される１種又は２種とすることができる。塩基性アミノ酸１３ｂは、例えば、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される１種以上とすることができる。交互配列１３は、これら酸性アミノ酸１３ａと塩基性アミノ酸１３ｂとを任意の組み合わせで含むことができる。

図２及び図３に示す例において、交互配列１３は、細胞接着性配列１４のＮ末端側に結合した、４つのリシン（Ｋ）と３つのグルタミン酸（Ｅ）とが１つずつ交互に結合してなるアミノ酸配列である。

交互配列１３を構成する酸性アミノ酸１３ａの数と塩基性アミノ酸１３ｂの数とは、一方が他方より１つだけ多いこととしてもよく、同一であってもよい。酸性アミノ酸１３ａの数及び塩基性アミノ酸１３ｂの数の一方が他方より１つだけ多い場合であっても、例えば、交互配列１３が酸性アミノ酸１３ａ及び塩基性アミノ酸１３ｂを少なくとも２つずつ有することにより、細胞接着性配列１４と結合している交互配列１３の先端部分（合計４つ以上のアミノ酸からなる部分）は電気的に十分中和される。

交互配列１３を構成するアミノ酸の数は、特に限られないが、当該交互配列１３は、例えば、４〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列とすることができ、５〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列とすることが好ましい。図２及び図３に示す例において、交互配列１３は、３個の酸性アミノ酸１３ａと４個の塩基性アミノ酸１３ｂとを含む７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。

接着性オリゴペプチド１０が交互配列１３を有することにより、例えば、当該接着性オリゴペプチド１０又は電極層３０に対するタンパク質等の細胞接着を促進する物質の非特異的な吸着を効果的に回避又は低減することができる。

接着性オリゴペプチド１０は、上述の末端アミノ酸１１、交互配列１３及び細胞接着性配列１４が順次結合してなるアミノ酸配列からなるペプチドとすることができる。また、接着性オリゴペプチド１０は、例えば、末端アミノ酸１１と交互配列１３との間に配置される中間配列１２をさらに含むこともできる。中間配列１２は、一方の末端側で末端アミノ酸１１と結合し、他方の末端側で交互配列１３と結合するアミノ酸配列であれば特に限られない。

中間配列１２は、分子サイズが比較的小さいアミノ酸から構成されることが好ましい。また、中間配列１２は、上述したような中性アミノ酸から構成されることが好ましい。すなわち、中間配列１２は、例えば、アラニン及びグリシンからなる群より選択される１種又は２種からなるアミノ酸配列とすることができる。

中間配列１２を構成するアミノ酸の数は、特に限られないが、当該中間配列１２は、例えば、０〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列とすることができ、２〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列とすることが好ましい。図２及び図３に示す例において、中間配列１２は、３つのグリシンが結合してなるアミノ酸配列である。

接着性オリゴペプチド１０が中間配列１２を有することにより、細胞接着性配列１４及び／又は交互配列１３と電極層３０との相互作用を効果的に回避又は低減することができる。

電極層３０は、その表面に接着性オリゴペプチド１０がチオレートを介して還元脱離可能に結合でき、且つ当該接着性オリゴペプチド１０の還元脱離において作用極として機能する導電性層であれば特に限られない。

すなわち、電極層３０は、例えば、貴金属（例えば、金、白金、銀、銅）、半導体（例えば、シリコン、セレン化亜鉛、炭化ケイ素）及び金属酸化物（例えば、酸化インジウムスズ、酸化亜鉛、酸化スズ）からなる群より選択される１種以上の導電性材料からなる層とすることができる。図２及び図４Ａ〜図４Ｃに示す例において、電極層３０は、貴金属（例えば、金）で形成された薄膜である。

接着性オリゴペプチド１０による電極層３０の被覆は、例えば、図３に示すように、当該電極層３０との間でチオレートを介した結合を形成し得る官能基を含む末端アミノ酸１１を有する遊離の接着性オリゴペプチド１０を使用して行うことができる。

すなわち、この遊離の接着性オリゴペプチド１０と電極層３０とを溶液中で接触させる（例えば、遊離の接着性オリゴペプチド１０を含有する溶液中に電極層３０を浸漬して所定時間保持する）ことにより、図２に示すように、当該接着性オリゴペプチド１０が当該電極層３０との間で自発的にチオレートを形成して当該電極層３０に結合する。

電極層３０に形成されるオリゴペプチド層１００は、図２に示すように、上述の接着性オリゴペプチド１０に加えて、細胞接着性のアミノ酸配列を有しない以外は当該接着性オリゴペプチド１０と同様のアミノ酸配列から構成される他のオリゴペプチド（以下、「非接着性オリゴペプチド２０」という）を含むことができる。

非接着性オリゴペプチド２０は、図２に示すように、一方の末端を構成しチオレートを介して当該電極層３０に結合する末端アミノ酸２１と、他方の末端を構成し複数の酸性アミノ酸２３ａと複数の塩基性アミノ酸２３ｂとが１つずつ交互に結合してなる交互配列２３と、を有するペプチドである。

非接着性オリゴペプチド２０は、接着性オリゴペプチド１０の交互配列１３と同一のアミノ酸配列からなる交互配列２３を有することが好ましい。また、非接着性オリゴペプチド２０は、さらに、接着性オリゴペプチド１０の末端アミノ酸１１と同一のアミノ酸配列からなる末端アミノ酸２１を有することとしてもよい。図２に示す例において、非接着性オリゴペプチド２０の末端アミノ酸２１及び交互配列２３のアミノ酸配列は、それぞれ接着性オリゴペプチド１０の末端アミノ酸１１及び交互配列１３のアミノ酸配列と同一である。

また、非接着性オリゴペプチド２０の交互配列２３は、当該非接着性オリゴペプチド２０の末端部分を構成する。このため、交互配列２３は、その自由端（すなわち、非接着性オリゴペプチド２０の自由端）を構成するアミノ酸の電荷を打ち消すよう、酸性アミノ酸２３ａ及び塩基性アミノ酸２３ｂの一方が他方より１つだけ多いアミノ酸配列からなることが好ましい。図２に示す例において、非接着性オリゴペプチド２０の交互配列２３は、その自由端（Ｃ末端）を構成するリシン（Ｋ）の負電荷を打ち消すよう、リシン（Ｋ）の数がグルタミン酸（Ｅ）の数より１つだけ多いアミノ酸配列から構成されている。そして、接着性オリゴペプチド１０の交互配列１３は、こうして設計された非接着性オリゴペプチド２０の交互配列２３と同一のアミノ酸配列から構成されている。この結果、隣接する接着性オリゴペプチド１０の分子と非接着性オリゴペプチド２０の分子との間、及び隣接する接着性オリゴペプチド１０の分子間においても効果的な静電的相互作用が生じ、電極層３０に自己組織化単分子膜からなるオリゴペプチド層１００が形成されている。

非接着性オリゴペプチド２０を含むオリゴペプチド層１００の形成は、例えば、上述の接着性オリゴペプチド１０の場合と同様に、電極層３０との間でチオレートを介した結合を形成し得る官能基を含む末端アミノ酸２１を有する遊離の当該非接着性オリゴペプチド２０（例えば、図３に示す接着性オリゴペプチド１０から細胞接着性配列１４を除去したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド）を使用して行うことができる。

すなわち、例えば、遊離の接着性オリゴペプチド１０及び遊離の非接着性オリゴペプチド２０を含有する溶液中に電極層３０を浸漬することにより、図２に示すように、当該接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０を、チオレートを介して当該電極層３０に結合させて、オリゴペプチド層１００を形成することができる。

また、このような遊離の非接着性オリゴペプチド２０を使用して、接着性オリゴペプチド１０で被覆された電極層３０を作製することもできる。すなわち、例えば、まず、上述のようにして電極層３０を非接着性オリゴペプチド２０で被覆する。次いで、電極層３０に結合した非接着性オリゴペプチド２０と、細胞接着性配列１４を含む遊離のペプチドと、の化学反応により、当該非接着性オリゴペプチド２０の交互配列２３の先端に当該細胞接着性配列１４を結合させる。この結果、細胞接着性配列１４を有する接着性オリゴペプチド１０により被覆された電極層３０が得られる。こうして、電極層３０には、接着性オリゴペプチド１０を含むオリゴペプチド層１００が形成される。

なお、図２に示す例では、接着性オリゴペプチド１０と非接着性オリゴペプチド２０とからなるオリゴペプチド層１００が形成されているが、これに限られず、例えば、接着性オリゴペプチド１０からなるオリゴペプチド層１００を形成することもできる。

オリゴペプチド層１００が接着性オリゴペプチド１０に加えて非接着性オリゴペプチド２０を含む場合には、当該接着性オリゴペプチド１０と当該非接着性オリゴペプチド２０との比率を変えることにより当該オリゴペプチド層１００に対する細胞５０の接着性を調整することができる。

接着性オリゴペプチド１０と非接着性オリゴペプチド２０との比率（接着性オリゴペプチド１０の含有量：非接着性オリゴペプチド２０の含有量）は、実現すべき細胞５０の接着の程度や当該細胞５０の脱離効率に応じて適宜決定することができ、例えば、モル比率で０．１：１００〜１００：０とすることができる。

本実施形態に係る培養装置（以下、「本装置」という。）は、このように接着性オリゴペプチド１０で被覆された、細胞５０を接着させて培養するための電極層３０を有する培養装置である。本方法は、本装置を使用して好ましく実施することができる。

本装置は、図４Ａ〜図４Ｃに示すように、接着性オリゴペプチド１０で被覆された電極層３０を含み、当該電極層３０に接着した細胞５０を培養液６０中に保持する培養部４０を有している。培養部４０は、細胞５０が接着した電極層３０及び培養液を収容できる器具であれば特に限られず、例えば、培養ディッシュ等の培養容器である。図４Ａ〜図４Ｃに示す例において、培養部４０は、培養ディッシュである。

電極層３０は、図２及び図４Ａ〜図４Ｃに示すように、基材４１の表面に形成することができる。すなわち、電極層３０は、例えば、基材４１の表面に形成された導電性の薄膜とすることができる。

基材４１は、その表面に電極層３０を形成できる材料からなる部材であれば特に限られない。すなわち、基材４１は、例えば、そのままで電極材料として使用するには必ずしも好ましくない金属材料や、ガラス、合成樹脂（ポリスチレンやポリプロピレン等）等の非金属材料からなる部材とすることができる。

電極層３０上の細胞５０を光学顕微鏡により観察する上では、基材４１は、透明性のある材料から構成されることが好ましい。図４Ａ〜図４Ｃに示す例において、基材４１は、透明な樹脂で成形された培養ディッシュの底部である。

基材４１の形状は、その表面に電極層３０を形成できれば特に限られない。すなわち、基材４１は、例えば、平板状、膜状、メッシュ状、棒状の成形体とすることができる。また、電極層３０が形成される基材４１の表面は、例えば、平坦な表面、凹凸が形成された表面（例えば、多孔質体の表面）、湾曲した表面とすることができる。図４Ａ〜図４Ｃに示す例において、基材４１は、平板状の部材であり、その平坦な表面に電極層３０が形成されている。

また、培養部４０は、図４Ａ〜図４Ｃに示すように、電極層３０に電位を印加するために、当該電極層３０と電気的に接続された電気接続部３０ａを有することができる。電気接続部３０ａの配置は、電極層３０に電位を印加可能となるように当該電気接続部３０ａが当該電極層３０と電気的に接続されれば特に限られない。すなわち、電気接続部３０ａは、例えば、培養液６０に浸漬されない培養部４０の一部に形成され、当該培養液６０に浸漬される電極層３０と電気的に接続するよう形成される。

図４Ａ〜図４Ｃに示す例において、電気接続部３０ａは、培養部４０を構成する培養ディッシュの底面に形成されて培養液６０に浸漬される電極層３０から、当該培養液６０に浸漬されない当該培養ディッシュの側壁まで延びるように形成されている。

電気接続部３０ａを構成する材料は、導電性の材料であれば特に限られず、例えば、上述の電極層３０を構成し得る材料と同一の材料とすることができる。図４Ａ〜図４Ｃに示す例において、電気接続部３０ａは、電極層３０と同一の貴金属（例えば、金）で形成された薄膜である。

本方法の培養工程Ｓ１においては、好ましくは上述の本装置を使用して、接着性オリゴペプチド１０で被覆された電極層３０に細胞５０を接着させて培養する。

細胞５０は、接着性オリゴペプチド１０を介して電極層３０に接着できる細胞であれば特に限られない。すなわち、ヒト又はヒト以外の動物（サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）の任意の臓器や組織（肝臓、心臓、膵臓、腎臓、脳、神経、皮膚、血液等）由来の細胞を使用することができる。

具体的に、例えば、臓器や組織の酵素処理や血液の分離処理によって採取された初代細胞や、樹立された株化細胞を使用することができる。また、分化した細胞のみならず、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の未分化細胞を使用することもできる。さらに、これらの細胞に遺伝子操作等の人為的処理を施した細胞を使用することもできる。例えば、ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）細胞や、ｉＰＳ細胞を分化させることにより作製された細胞を使用することもできる。

本方法及び本装置により培養された細胞５０及び／又は当該細胞５０から形成された細胞組織体を回収して医療分野の技術（再生医療技術や人工臓器等）に利用する場合には、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の細胞を好ましく使用することができ、ヒト由来の細胞を特に好ましく使用することができる。

細胞５０としては、その生存や増殖に足場を必要とする接着性細胞、又はその生存や増殖に足場を必要としない非接着性細胞のいずれを使用することもでき、接着性細胞を好ましく使用することができる。また、後述するように、培養工程Ｓ１において、細胞５０が二次元的又は三次元的に集合した細胞組織体を培養する場合には、互いに結合を形成して当該細胞５０の集合体を形成することができる細胞を好ましく使用することができる。細胞５０としては、１種類の細胞を単独で使用することもできるが、２種類以上の細胞が任意の数比率で混在する細胞群を使用することもできる。

電極層３０上での細胞５０の培養は、培養液６０中において当該細胞５０を当該電極層３０に接着させて所定温度（例えば、３７℃）で所定時間（例えば、数時間〜数週間又は数カ月）保持することにより行うことができる。すなわち、例えば、まず、図４Ａに示すような電極層３０を含む培養部４０を準備し、次いで、当該培養部４０に、細胞５０を分散した培養液６０を入れて、３７℃で数時間静置することにより、図４Ｂに示すように、当該培養液６０中においてオリゴペプチド層１００を介して当該細胞５０を当該電極層３０に接着させることができる。

培養液６０としては、細胞５０の生存状態や機能等を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分等を適切な濃度で含む水溶液であれば特に限られない。すなわち、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）等の基礎培地に抗生物質等を添加した培養液や、リン酸緩衝液(Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）等の水溶液を使用することができる。

電極層３０に接着した細胞５０は、典型的には、培養時間の経過に伴って、その形状が球形から比較的扁平な形状に変化する。培養期間中、細胞５０は、培養液６０中の栄養や酸素を消費してタンパク質の分泌等の代謝活動を行う。細胞５０が増殖能力を有する場合、当該細胞５０は、電極層３０に沿って二次元的に、又は互いに重なり合って三次元的に増殖する。

続く脱離工程Ｓ２においては、細胞５０が接着している電極層３０に、接着性オリゴペプチド１０が還元脱離する電位を印加して、当該細胞５０を当該電極層３０から脱離させる。すなわち、細胞５０が接着性オリゴペプチド１０を介して接着している電極層３０に電位を印加して、当該接着性オリゴペプチド１０の還元脱離を起こさせる。

電極層３０に印加する電位は、接着性オリゴペプチド１０が還元脱離し、且つ細胞５０に悪影響を与えない範囲であれば特に限られず、例えば、当該接着性オリゴペプチド１０の還元脱離ピーク電位又は当該還元脱離ピーク電位より負の電位とすることができる。

還元脱離ピーク電位は、使用する接着性オリゴペプチド１０に固有の値として決定することができる。すなわち、例えば、接着性オリゴペプチド１０が結合している電極層３０に、所定の上限電位から所定の下限電位まで、電位を徐々に変化させながら印加した場合に、当該電極層３０に還元電流が流れる電位を、当該接着性オリゴペプチド１０の還元脱離ピーク電位として決定することができる。

具体的に、例えば、サイクリックボルタンメトリー（Ｃｙｃｌｉｃ Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ：ＣＶ）を使用して、所定の初期電位から所定の反転電位まで、所定の掃引速度（電位の変化速度）で電極層３０に電位を掃引印加し、さらに当該反転電位から折り返して再び当該初期電位まで当該所定の掃引速度で電位を掃引印加するとともに、この１サイクルの間、当該電極層３０に流れる電流を測定する。そして、この測定結果として得られる、印加電位と検出電流値との関係を示すサイクリックボルタモグラムにおいて、還元電流を示す負電流のピークが現れた印加電位を還元脱離ピーク電位として決定する。

電極層３０に印加する電位は、電位窓の範囲内とすることができる。すなわち、接着性オリゴペプチド１０の還元脱離ピーク電位より負であって、且つ電位窓の範囲内の電位を使用することができる。なお、電位窓の範囲外であっても、細胞５０に悪影響を与えない範囲内の電位であれば還元脱離に使用することができる。

還元脱離ピーク電位は使用する接着性オリゴペプチド１０によって異なるが、脱離工程Ｓ２における印加電位としては、例えば、−０．１Ｖ〜−２．０Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲内の電位を使用することができ、−０．５Ｖ〜−１．５Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲内の電位を好ましく使用することができる。また、還元脱離ピーク電位より負の電位を電極表面に印加する場合には、例えば、当該還元脱離ピーク電位より０．０５Ｖ〜０．５Ｖだけ負の電位を好ましく使用することができる。

また、接着性オリゴペプチド１０に加えて、上述した非接着性オリゴペプチド２０を使用する場合には、当該接着性オリゴペプチド１０及び当該非接着性オリゴペプチド２０の両方が還元脱離する電位を電極層３０に印加する。すなわち、例えば、接着性オリゴペプチド１０の還元脱離ピーク電位及び非接着性オリゴペプチド２０の還元脱離ピーク電位のいずれよりも負の電位を使用することができる。

なお、例えば、非接着性オリゴペプチド２０のアミノ酸配列が、細胞接着性配列１４を有しない以外は接着性オリゴペプチド１０と同一である場合等、これら接着性オリゴペプチド１０のアミノ酸配列と非接着性オリゴペプチド２０のアミノ酸配列とが同一又は類似である場合には、当該接着性オリゴペプチド１０還元脱離ピーク電位と当該非接着性オリゴペプチド２０の還元脱離ピーク電位とに大差がない（すなわち、細胞接着性配列１４の有無による還元脱離ピーク電位のシフトの程度が小さい）ため、適切な電位を容易に決定することができる。

したがって、接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０の２種類を併用する場合においても、上述のように、印加電位としては、例えば、−０．１Ｖ〜−２．０Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲内の電位を使用することができ、−０．５Ｖ〜−１．５Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲内の電位を好ましく使用することができる。また、還元脱離ピーク電位より負の電位を電極表面に印加する場合には、例えば、当該還元脱離ピーク電位より０．０５Ｖ〜０．５Ｖだけ負の電位を好ましく使用することができる。

接着性オリゴペプチド１０を還元脱離させるための電極層３０への電位の印加は、例えば、上述の還元脱離ピーク電位を決定する場合と同様に、還元脱離ピーク電位を含む所定の電位範囲内において所定の掃引速度で電位を変化させる走査型の印加によって行うことができる。

また、電極層３０への電位の印加は、例えば、還元脱離ピーク電位又は当該還元電位ピーク電位より負の一定電位を印加し続ける連続型の印加によって行うこともできる。すなわち、印加する電位を一定の電位に固定し、当該一定の印加電位を所定時間にわたって維持する。

この場合、特に、還元脱離ピーク電位より負の一定電位を所定時間にわたって連続的に印加することが好ましい。こうすれば、電極層３０の全体に還元脱離ピーク電位又は当該還元脱離ピーク電位より負の電位を確実に印加することができる。

このような電位の印加を本装置により行う場合、本装置は、培養部４０に加えて、電極層３０を作用極として含む電極系を有することができる。すなわち、図４Ｃに示す例において、本装置は、電極層３０からなる作用極と、参照極３１と、対極３２と、を含む３電極系を有している。

参照極３１は、参照極として機能するものであれば特に限られず、例えば、銀／塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）とすることができる。対極３２は、対極として機能するものであれば特に限られず、例えば、白金電極とすることができる。なお、本装置は、電極層３０からなる作用極と、参照極３１又は対極３２と、を含む２電極系を有することとしてもよい。

また、本装置は、図４Ｃに示すように、接着性オリゴペプチド１０が還元脱離する電位を電極層３０に印加する電位印加部３３をさらに有することとしてもよい。電位印加部３３としては、例えば、サイクリックボルタンメトリーを使用することができる。

この場合、脱離工程Ｓ２においては、まず、培養液６０中に浸漬され細胞５０が接着した電極層３０と電位印加部３３とを電気的に接続する。図４Ｃに示す例においては、電極層３０と電気的に接続され、培養液６０外まで延び出た電気接続部３０ａと電位印加部３３とを電気的に接続する。

また、図４Ｃに示す例においては、電位印加部３３と電気的に接続された参照極３１及び対極３２を培養液６０中に浸漬する。なお、２電極系を使用する場合には、参照極３１又は対極３２の一方のみ（例えば、参照極３１のみ）を培養液６０中に浸漬することとしてもよい。

そして、電位印加部３３によって電極層３０に電位を印加する。電位印加部３３は、例えば、還元脱離ピーク電位を含む所定の電位範囲内において、所定の掃引速度で電位を変化させながら電極層３０に掃引電位を印加することができる。また、電位印加部３３は、例えば、還元脱離ピーク電位又は当該還元脱離ピーク電位より負の任意の一定電位を連続的に電極層３０に印加することもできる。

脱離工程Ｓ２においては、上述のような電位の印加によって、接着性オリゴペプチド１０を電極層３０から脱離させ、さらに、当該接着性オリゴペプチド１０を介して当該電極層３０に接着していた細胞５０も脱離させる。

すなわち、図４Ｂに示すように、細胞５０が互いに結合しない分散状態で電極層３０に接着していた場合には、接着性オリゴペプチド１０の還元脱離によって、図４Ｃに示すように、当該細胞５０は分散状態で当該電極層３０から脱離する。したがって、この場合、培養液６０中に分散状態で浮遊する個々の細胞５０を回収することができる。

走査型の電位の印加を行う場合には、初期電位と反転電位との間の掃引サイクルを繰り返し実行することにより、電極層３０からの細胞５０の脱離を効率よく行うことができる。また、連続型の電位の印加を行う場合には、走査型の電位印加場合に比べて、より効率よく細胞５０を電極層３０から脱離させることができる。特に、還元脱離ピーク電位より負の一定電位を連続的に印加することにより、電極層３０からの細胞５０の脱離を効率よく且つ確実に行うことができる。また、矩形波等、高い周波数で電位の印加を行うこともできる。

また、本方法においては、複数の細胞５０が互いに結合し、二次元的又は三次元的に集合して形成された細胞組織体を製造することもできる。図５Ａ〜図５Ｃは、本実施形態において細胞組織体を培養し回収する過程の一例についての説明図である。図５Ａ〜図５Ｃに示す例においては、シート状の細胞組織体（以下、「細胞組織体シート５１」という。）を製造する。

すなわち、培養工程Ｓ１において、接着性オリゴペプチド１０で被覆された電極層３０（図２参照）に細胞５０を接着させて培養することで（図５Ａ）、当該電極層３０に接着した細胞組織体シート５１を形成する（図５Ｂ）。次いで、脱離工程Ｓ２において、細胞組織体シート５１が接着している電極層３０に、接着性オリゴペプチド１０が還元脱離する電位を印加して、当該細胞組織体シート５１を当該電極層３０から脱離させる（図５Ｃ）。

具体的に、まず、培養工程Ｓ１においては、図５Ａに示すように、培養液６０中に分散された個々の細胞５０を、オリゴペプチド層１００を介して電極層３０に接着させ、培養する。培養時間の経過に伴い、細胞５０は増殖し、電極層３０に沿って広がる。この結果、増殖した細胞５０は、互いに結合して、図５Ｂに示すように、オリゴペプチド層１００を介して電極層３０に結合した細胞組織体シート５１を形成する。なお、増殖しない細胞５０を使用する場合であっても、例えば、比較的高い密度で当該細胞５０を電極層３０上に播種して培養することにより、当該細胞が互いに結合した細胞組織体シート５１を形成することができる。

そして、脱離工程Ｓ２においては、図５Ｃに示すように、オリゴペプチド層１００を構成する接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０を還元脱離させる電位を電極層３０に印加することで、当該接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０とともに、細胞組織体シート５１を当該電極層３０から脱離させる。

ここで、複数の細胞５０が二次元的又は三次元的に結合して構成される細胞組織体シート５１が電極層３０に接着している場合には、当該細胞組織体シート５１に含まれる多くの細胞５０が当該電極層３０に接着している。このため、細胞組織体シート５１を電極層３０から効率よく脱離させるには、接着している多くの細胞５０の大部分を同時に脱離させる必要がある。

この点、本方法においては、例えば、上述のとおり、接着性オリゴペプチド１０の還元脱離ピーク電位より負の一定電位を電極層３０に連続的に印加することにより、細胞組織体シート５１を当該電極層３０から効率よく脱離させることができる。脱離した細胞組織体シート５１は、培養液６０中に浮遊するため、容易に回収することができる。

なお、本方法により製造される細胞組織体は、複数の細胞５０の集合体であれば上述の細胞組織体シート５１に限られない。すなわち、例えば、上述の細胞組織体シート５１の場合と同様にして、細胞５０が電極層３０上で三次元的に盛り上がりながら集合して形成されるドーム状又は球状の組織体（いわゆるスフェロイド）を培養し回収することもできる。

ここで、例えば、自己組織化しないオリゴペプチドで電極層３０を被覆する場合には、培養液６０に含まれるタンパク質や、細胞５０が分泌するタンパク質が、当該オリゴペプチドの隙間から当該電極層３０に吸着し、その結果、当該細胞５０が当該タンパク質を介して当該電極層３０に強固に接着することがある。この場合、オリゴペプチドが還元脱離する電位を電極層３０に印加しても、当該電極層３０から細胞５０を短時間で効率よく脱離させることは困難である。

これに対し、上述の接着性オリゴペプチド１０で被覆された電極層３０においては、当該接着性オリゴペプチド１０が交互配列１３を有することにより、当該接着性オリゴペプチド１０を含む自己組織化単分子膜（例えば、図２に示すオリゴペプチド層１００）が形成される。この結果、接着性オリゴペプチド１０及び電極層３０に対するタンパク質の非特異的吸着、そして当該電極層３０に対する細胞５０の非特異的接着を効果的に回避又は低減することができる。

このため、接着性オリゴペプチド１０を介して電極層３０に接着した細胞５０は、当該接着性オリゴペプチド１０が還元脱離する電位を当該電極層３０に印加することにより、短時間で効率よく脱離させることができる。

また、本方法及び本装置により培養され回収された細胞５０及び細胞組織体には、電極層３０から脱離した接着性オリゴペプチド１０が細胞接着性配列１４を介して結合することとなる。このため、例えば、接着性オリゴペプチド１０が結合した細胞５０及び／又は細胞組織体を生体（ヒト又はヒト以外の動物）に移植する場合の安全性が問題となり得る。このような安全性の問題は、例えば、アルカンチオールや他の高分子材料が結合した細胞や細胞組織体を移植する場合でも生じる。

この点、接着性オリゴペプチド１０は、アルカンチオール等の生体に存在しない分子と比較して生体適合性が高い。すなわち、接着性オリゴペプチド１０の分解により生成される物質はアミノ酸のみである。したがって、本方法及び本装置により製造された細胞５０及び細胞組織体は、生体に移植する場合の安全性が高い等、生体適合性が高く、医療への応用に適したものとなる。

また、細胞５０及び細胞組織体は、タンパク質分解酵素やキレート剤を使用することなく非侵襲的に回収される。したがって、回収された細胞５０及び細胞組織体は、その代謝活性や所望の機能が損われておらず、生体への移植その他の用途に適した、所望の特性を維持したものとすることができる。

このように、本方法及び本装置によれば、再生医療や人工臓器等の医療への応用に適した細胞５０及び細胞組織体を効率よく製造することができる。なお、本方法及び本装置により製造された細胞５０及び細胞組織体は、医療に限らず他の任意の用途に供することもできる。すなわち、この細胞５０及び細胞組織体は、例えば、動物実験代替法における薬物代謝モデル等、様々な研究ツールとして使用することもできる。

また、図６及び図７Ａ〜図７Ｃに示すように、電極層３０は、培養液６０中に浮いた状態で保持される多孔質膜７０の表面に形成されていることとしてもよい。すなわち、図６に示す例において、多孔質膜７０は、その一方の表面（以下、「上面７１」という。）から他方の表面（以下、「下面７２」という。）まで連通する多数の孔７３が形成された多孔構造を有する膜である。そして、この多孔質膜７０の上面７１に形成された電極層３０には、当該多孔質膜７０の孔７３に対応する開口が形成されている。

多孔質膜７０は、その上面７１に電極層３０を形成することができるものであれば特に限られない。すなわち、多孔質膜７０としては、例えば、図６に示すように、平坦な上面７１を有し、当該上面７１から下面７２まで貫通する孔７３が形成されたものを好ましく使用することができる。

多孔質膜７０を構成する材料は、細胞５０の培養に適したものであれば特に限られず、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリウレタン等の樹脂や、金属薄膜を使用することができる。多孔質膜７０に形成される孔７３のサイズは、細胞５０が通過できない範囲であれば特に限られず、当該孔７３の直径は、例えば、０．１〜３μｍとすることができる。多孔質膜７０の開口率は特に限られず、例えば、１〜２５％とすることができる。

多孔質膜７０は、図７Ａ〜図７Ｃに示すように、培養液６０中に浮いた状態で保持される。すなわち、多孔質膜７０は、その上面７１側（電極層３０側）のみならず、反対の下面７２側でも培養液６０と接している。

具体的に、図７Ａ〜図７Ｃに示す例において、本装置の培養部４０は、電極層３０が形成された多孔質膜７０を底部として有する第一の培養容器４２と、当該多孔質膜７０が培養液６０中に浮いた状態で保持されるように当該第一の培養容器４２を支持する第二の培養容器４３と、を有している。この結果、多孔質膜７０の孔７３内には下面７２側からも培養液６０が供給される。

そして、本方法の培養工程Ｓ１においては、まず、図７Ａに示すように、培養液６０中に浮いた状態で保持された多孔質膜７０の電極層３０に細胞５０を接着させて培養することで当該電極層３０に接着した細胞組織体シート５１を形成する。

ここで、細胞組織体シート５１は、多数の細胞５０が密に集合した細胞組織体である。このため、例えば、図５Ａ〜図５Ｃに示すように細胞組織体シート５１の一方の表面（電極層３０と反対側の表面）側からしか栄養や酸素が供給されない場合には、当該細胞組織体シート５１の厚みが大きくなると内部の細胞が壊死してしまう。したがって、この場合、細胞組織体シート５１の厚みを増加させるには限界がある。すなわち、一定以上の厚みの細胞組織体シート５１を形成することはできない。

この点、図７Ａ〜図７Ｃに示す例においては、電極層３０が、培養液６０中に浮いた状態で保持された多孔質膜７０に形成されている。したがって、図７Ａにおいて破線の矢印で示すように、電極層３０に接着した細胞組織体シート５１に対して、多孔質膜７０の下面７２側からも、多数の孔７３を通じて、培養液６０中の栄養や酸素を効率よく供給することができる。この結果、図７Ｂに示すように、細胞組織体シート５１を構成する細胞５０を三次元的に増殖させて、図５Ａ〜図５Ｃに示す場合に比べて、より厚みの大きな（細胞５０の層数がより多い）細胞組織体シート５１を形成することができる。

続く脱離工程Ｓ２においては、図７Ｃに示すように、細胞組織体シート５１が接着している電極層３０に、接着性オリゴペプチド１０が還元脱離する電位を印加して、当該細胞組織体シート５１を当該電極層３０から脱離させる。

すなわち、図７Ｃに示す例においては、電極層３０と電位印加部３３とを電気的に接続するとともに、当該電位印加部３３と電気的に接続された参照極３１を培養液６０中に浸漬することにより、当該電極層３０に電位を印加する。なお、図７Ｃに示す例において、第一の培養容器４２は、図４Ａ〜図４Ｃに示す例と同様に、培養液６０外に電気接続部３０ａを有しているため、電極層３０に電位を印加する際には、当該電気接続部３０ａと電位印加部３３とを電気的に接続する。

ここで、接着性オリゴペプチド１０を還元脱離させるためには、当該接着性オリゴペプチド１０が結合した電極層３０と、参照極３１（及び対極３２）と、の間に存在する細胞組織体シート５１による電気的抵抗が小さいほど好ましい。

しかしながら、例えば、図５Ａ〜図５Ｃに示すような場合には、細胞組織体シート５１が大きな電気的抵抗となってしまうため、当該細胞組織体シート５１の外縁部分が接着している電極層３０の一部にしか適切な電位が印加されず、当該一部のみでしか接着性オリゴペプチド１０は脱離しない。このため、細胞組織体シート５１は、その外縁部分から徐々に脱離せざるを得ない。

これに対し、図７Ａ〜図７Ｃに示すように電極層３０が培養液６０中に浮いた状態で保持されている多孔質膜７０に形成されている場合には、図５Ａ〜図５Ｃに示す場合に比べて、細胞組織体シート５１による電気的抵抗が効果的に低減される。このため、図７Ｃにおいて破線の矢印で示すように、多孔質膜７０の下面７２側からも多数の孔７３を通じて、細胞組織体シート５１が接着している電極層３０の全体に適切な電位を印加することができ、当該全体で接着性オリゴペプチド１０を脱離させることができる。したがって、図５Ａ〜図５Ｃに示す場合に比べて、細胞組織体シート５１の脱離をさらに短時間で効率よく達成することができる。

このように、電極層３０を形成する基材として多孔質膜７０を使用することによって、従来は困難であった厚みの大きな細胞組織体シート５１を、従来にない短時間で脱離させることができる。

また、細胞組織体シート５１を回収する際には、培養液６０を、多孔質膜７０の下面７２側から上面７１側へ孔７３を介して流通させることによって、当該多孔質膜７０の上面７１に接着していた細胞組織体シート５１を効率よく回収することもできる。

細胞組織体シート５１の厚みが大きくなることにより、当該細胞組織体シート５１の物理的強度が増す。したがって、この厚い細胞組織体シート５１は、例えば、再生医療等の目的で細胞組織体シート５１を生体に移植するために持ち運ぶ際に破れにくくなる等、その取扱いやすさが顕著に向上する。

なお、多孔質膜７０上に形成された電極層３０は、細胞組織体シート５１を製造する場合に限らず、他の細胞組織体や、分散された個々の細胞５０を製造する場合においても、栄養や酸素の効率的な供給や適切な電位の効率的な印加等、同様の効果をもたらす。

また、細胞組織体シート５１を製造する場合、本方法は、図８に示すように、電極層３０から脱離させた複数の細胞組織体シート５１を積層して、当該細胞組織体シート５１の積層体（以下、「細胞組織積層体」という。）を形成する第三工程（以下、「積層工程Ｓ３」という。）をさらに含むことができる。

すなわち、この場合、培養工程Ｓ１においては、接着性オリゴペプチド１０で被覆された電極層３０に複数の細胞組織体シート５１を接着させて培養する。次いで、脱離工程Ｓ２において、接着性オリゴペプチド１０を還元脱離させることで複数の細胞組織体シート５１を電極層３０から脱離させて回収する。そして、積層工程Ｓ３において、回収された複数の細胞組織体シート５１を積層して、シート状の細胞組織積層体を形成する。なお、複数の細胞組織体シート５１の形成は、例えば、互いに離隔して形成された複数の電極層３０を使用することにより行うことができる。

積層工程Ｓ３においては、複数の細胞組織体シート５１を積層した状態で所定時間培養することもできる。この場合、培養時間の経過に伴って、複数の細胞組織体シート５１を構成する細胞５０が互いに接着し、当該複数の細胞組織体シート５１が一体化して、より厚みの大きな細胞組織積層体を形成することができる。

細胞組織積層体の厚みは、当該細胞組織積層体の形成に使用された複数の細胞組織体シート５１の個々の厚みや、積層する当該細胞組織体シート５１の数によって調整することができる。なお、個々の細胞組織体シート５１の厚みは、例えば、上述した多孔質膜７０を使用することにより調整することができる。

このように、積層工程Ｓ３を含む本方法によれば、所望の厚みを有する細胞組織積層体を確実に且つ効率よく製造することができる。製造された細胞組織積層体は、上述した個々の細胞組織体シート５１と同様、再生医療等の目的で生体に移植する移植片や、その他の様々な用途に好ましく利用することができる。

次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。

［オリゴペプチドの自発的結合と還元脱離のモニタリング］
図２及び図３に示す接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０を設計し、作製した。すなわち、接着性オリゴペプチド１０は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、システイン（Ｃ）と、３つのグリシン（Ｇ）が結合してなる中間配列１２と、４つのリシン（Ｋ）と３つのグルタミン酸（Ｅ）とが１つずつ交互に結合してなる交互配列１３と、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）及びプロリン（Ｐ）が順次結合してなる細胞接着性配列１４と、が順次結合してなる、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであった。

また、非接着性オリゴペプチド２０は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、システイン（Ｃ）と、３つのグリシン（Ｇ）が結合してなる中間配列２２と、４つのリシン（Ｋ）と３つのグルタミン酸（Ｅ）とが１つずつ交互に結合してなる交互配列２３と、が順次結合してなる、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるオリゴペプチドであった。すなわち、非接着性オリゴペプチド２０のアミノ酸配列は、細胞接着性配列１４を有しない以外は上述の接着性オリゴペプチド１０のアミノ酸配列と同一であった。これら接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０は、シグマアルドリッチ社によるカスタムペプチド合成サービスを利用して作製した。

ＱＣＭ（ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）装置（ＱＣＡ９２２、ＳＥＩＫＯ ＥＧ＆Ｇ製）を用いて、接着性オリゴペプチド１０を直径５ｍｍの金薄膜（電極層３０に相当）が形成された水晶振動子表面（ＱＡ−Ａ９Ｍ−ＡＵ、ＳＥＩＫＯ ＥＧ＆Ｇ製）に化学吸着させた。そして、この化学吸着の過程で生じる質量の変化を共振周波数変化として測定した。

すなわち、まず、水晶振動子が固定されたチャンバー（ＱＡ−ＣＬ４、ＳＥＩＫＯ ＥＧ＆Ｇ製）に純水を５００μＬ入れ、共振周波数を安定化させた。次いで、１ｍＭの接着性オリゴペプチド１０を含むオリゴペプチド水溶液２μＬをチャンバー内に静かに注入した。その後、水晶振動子の共振周波数変化を連続的にモニタリングした。

図９に測定の結果を示す。図９において、横軸はオリゴペプチド水溶液をチャンバー内に注入してからの時間（秒）を示し、縦軸は測定された共振周波数変化（Ｈｚ）を示す。図９に示すように、接着性オリゴペプチド１０の金表面への自発的結合は、１５０秒程度で飽和に達し、約１２０Ｈｚの周波数変化が観察された。

使用したＱＣＭ装置は１Ｈｚあたり０.３８ｎｇの感度を有することから、金の表面積１９.６ｍｍ^２を考慮すれば、単位面積（１ｍｍ^２）あたり約２３３ｎｇの接着性オリゴペプチド１０分子が化学吸着したことが示された。

次に、上述のようにして接着性オリゴペプチド１０を自発的に結合させた水晶振動子を純水で洗浄した後、当該接着性オリゴペプチド１０で修飾された水晶振動子を作用極とし、白金板を対極とし、銀／塩化銀（内部溶液：飽和ＮａＣｌ）電極を参照極として、０.５ＭのＫＯＨ水溶液中で３電極系を構成した。

そして、この３電極系を備えた電気化学測定装置（ＱＣＭ９２２、ＳＥＩＫＯ ＥＧ＆Ｇ製）により、開始電圧が−０.３Ｖ、最小掃引電圧が−１.０Ｖ、掃引速度が２０ｍＶ／秒の条件にて、作用極に電位を印加するとともに、当該作用極から得られる共振周波数をモニタリングした。

図１０に測定の結果を示す。図１０において、横軸は電位の印加を開始してからの時間（秒）を示し、右縦軸は印加された電圧（Ｖ ｖｓ． Ａｇ／Ｃｌ）を示し、左縦軸は共振周波数変化（Ｈｚ）を示す。

図１０に示すように、−０．３Ｖから−１．０Ｖまでの負の方向の電位走査において、−０.６Ｖの電位印加から共振周波数の上昇、すなわち接着性オリゴペプチド１０の脱離が観察された。一方、−１．０Ｖから−０．３Ｖまでの正方向の電位走査では共振周波数の大きな変化は観察されなかった。すなわち、−０.６Ｖ付近の電位印加によって接着性オリゴペプチド１０が金表面から脱離し、これに伴う周波数変化は約１１０Ｈｚであることが示された。

このＱＣＭ装置は１Ｈｚあたり０.３８ｎｇの感度を有することから、金の表面積１９.６ｍｍ^２を考慮すれば、単位面積（１ｍｍ^２）あたり約２１３ｎｇの接着性オリゴペプチド１０分子が脱離したことが示された。そして、図９および図１０の比較から、吸着した接着性オリゴペプチド１０分子のうち、９０％以上の分子が電位印加によって脱離することが示された。

［オリゴペプチド修飾表面に対するタンパク質の非特異的吸着量の測定］
ＱＣＭ装置（ＡＦＦＩＮＩＸ ＱＮ、Ｉｎｉｔｉｕｍ社製）を用いて、接着性オリゴペプチド１０を直径１．２ｍｍの金薄膜が形成された水晶振動子表面（Ｉｎｉｔｉｕｍ社製）に化学吸着させた。そして、この水晶振動子表面へのタンパク質の吸着量を測定した。タンパク質としては、フィブロネクチン（ＳＩＧＭＡ製）及び血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ製）を用いた。

まず、水晶振動子の金表面（電極層３０に相当）に１ｍＭの接着性オリゴペプチド１０を含むオリゴペプチド水溶液を滴下し、化学吸着させた。１時間後、この水晶振動子表面を純水で洗浄し、乾燥させた。乾燥した水晶振動子をＱＣＭ装置に取り付け、測定を開始した。共振周波数が±３Ｈｚ／分程度になるまで待ち、安定化させた（５〜１５分間）。この安定した共振周波数をタンパク質吸着前の共振周波数とした。

次に、水晶振動子を一旦取り外し、その金表面に、ＰＢＳに０．１ｍＭのフィブロネクチンを溶解して調製したフィブロネクチン水溶液、又はＰＢＳに０．１ｍＭの血清アルブミン溶液を溶解して調製した血清アルブミンン水溶液を滴下した。３０分後、水晶振動子の金表面をＰＢＳで洗浄し、乾燥させた。水晶振動子を再びＱＣＭ装置に取り付け、安定化させ、その時の共振周波数を読み取った。この安定した共振周波数をタンパク質吸着後の共振周波数とした。

これらタンパク質吸着前の共振周波数とタンパク質吸着後の共振周波数との差からタンパク質吸着前後の共振周波数変化を求めた。そして、使用したＱＣＭ装置は１Ｈｚあたり０.０３ｎｇの感度を有することから、この値を用いてタンパク質の吸着量を算出した。

図１１にタンパク質吸着量の算出結果を示す。図１１において、横軸は用いたタンパク質の種類（フィブロネクチン又は血清アルブミン）を示し、縦軸は水晶振動子の金表面に対する当該タンパク質の吸着量（ｎｇ）を示す。また、図１１において、白抜きの棒グラフは、接着性オリゴペプチド１０を結合させていない水晶振動子を用いた場合の結果を示し、黒塗りの棒グラフは、接着性オリゴペプチド１０を結合させた水晶振動子を用いた場合の結果を示す。

図１１に示すように、水晶振動子の金表面に接着性オリゴペプチド１０を結合させた場合には、当該接着性オリゴペプチド１０を結合しない場合に比べて、フィブロネクチンの吸着は１３％に抑制され、また血清アルブミンの吸着は１１％に抑制された。すなわち、接着性オリゴペプチド１０はタンパク質の吸着を顕著に抑制することが示された。

［還元脱離ピーク電位の測定］
電極層３０を形成する基材として、平坦な耐熱性ガラス基板（直径３インチ、厚さ５００μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ製）を使用した。２５％アンモニア水と３０％過酸化水素水と純水とを１：１：４の体積比で混合した水溶液を沸騰させ、この沸騰した水溶液に上記ガラス基板を浸漬した。その後、ガラス基板を沸騰した純水で濯ぎ、自然乾燥させた。

次に、スパッタデポジション装置（ＣＦＳ−４ＥＳ、芝浦メカトロニクス株式会社製）を使用して、出力１００Ｗ、アルゴン雰囲気０．３Ｐａの条件にて、ガラス基板の表面にクロムを２分間スパッタリングし、厚さ約４ｎｍのクロム薄膜を形成した。さらに、同条件にてガラス基板のクロム薄膜の上に金を２分間スパッタリングし、厚さ約４０ｎｍの金薄膜（電極層３０に相当）を形成した。金薄膜が形成されたガラス基板をダイシングソー（Ａ−ＷＤ−１０Ａ、株式会社東京精密製）にて１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形平板に切断し、純水で洗浄して自然乾燥させた。

上述のようにして作製した電極基板を、非接着性オリゴペプチド２０を１．０μＭで含有するオリゴペプチド水溶液中に一晩浸漬させた。その後、電極基板を純水で洗浄した。このようにして、非接着性オリゴペプチド２０を結合させた金薄膜表面を有する電極基板を得た。

非接着性オリゴペプチド２０が結合した電極基板を作用極とし、白金板を対極とし、銀／塩化銀（内部溶液：飽和ＫＣｌ）電極を参照極として、０．５ＭのＫＯＨ水溶液中で３電極系を構成した。そして、この３電極系を備えた電気化学測定装置（ＡＵＴＯＬＡＢ；Ｍｅｔｒｏｈｍ Ａｕｔｏｌａｂ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）により、開始電圧が−０．３Ｖ、最小掃引電圧が−１．０Ｖ、掃引速度が２０ｍＶ／秒の条件にて、作用極に電位を印加するとともに、当該作用極に流れる電流値をモニタリングした。

図１２に、１サイクルの掃引で得られたサイクリックボルタモグラムを示す。図１２において、横軸は印加した電位（Ｖ ｖｓ． Ａｇ／ＡｇＣｌ）を示し、縦軸は測定された電流値（μＡ）を示す。

図１２に示すように、−０．３Ｖから−１．０Ｖまでの掃引（走査）電位範囲のうち、−０．６Ｖ付近に比較的ブロードな電流のピークが現れた。これは、作用極の表面に−０．６Ｖの負電位を印加したことにより、当該表面に結合していた非接着性オリゴペプチド２０が還元されるとともに当該表面から脱離し、これに伴い、還元電流がピークとして検出された結果と考えられる。こうして、非接着性オリゴペプチド２０の還元脱離ピーク電位は−０．６Ｖと決定された。なお、接着性オリゴペプチド１０のアミノ酸配列と非接着性オリゴペプチド２０のアミノ酸配列とは、前者が細胞接着性配列１４を有すること以外は同一であるため、当該接着性オリゴペプチド１０もまた、当該非接着性オリゴペプチド２０と同程度の電位を印加することにより還元脱離することが予測された。

以上の結果より、金薄膜からなる電極層３０に結合した接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０を当該電極層３０から還元脱離させるためには、当該電極層３０に−０．６Ｖより負に大きい電位（例えば、−１．０Ｖ）を印加することが有効と考えられた。

［細胞脱離試験用電極の準備］
上述した還元脱離ピークの測定と同様に、金薄膜が形成されたガラス基板からなる電極基板を、接着性オリゴペプチド１０を５μＭで含有し、且つ非接着性オリゴペプチド２０を４５μＭで含有するオリゴペプチド水溶液中に一晩浸漬させた。その後、電極基板を純水で洗浄した。このようにして、接着性オリゴペプチド１０と非接着性オリゴペプチド２０とを１：９のモル比で結合させた金薄膜表面を有する電極基板（以下、「１０％接着性電極」という。）を得た。また、同様に、接着性オリゴペプチド１０のみを５０μＭで含有するオリゴペプチド水溶液を使用して、接着性オリゴペプチド１０のみを結合させた金薄膜表面を有する電極基板（以下、「１００％接着性電極」という。）を得た。

また、比較の対照として、Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ(ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ)と、グリシン−アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−セリン配列からなる細胞接着性のＲＧＤペプチド（ペプチド研究所製）と、の結合反応により生成された接着性アルカンチオールを準備し、上述の場合と同様に、当該接着性アルカンチオールを結合させた金薄膜表面を有する電極基板（以下、「アルカンチオール電極」という。）を得た。また、接着性オリゴペプチド１０、非接着性オリゴペプチド２０及び接着性アルカンチオールのいずれも結合させていない金薄膜表面を有する電極基板（以下、「金電極」という。）も準備した。こうして、１０％接着性電極、１００％接着性電極、アルカンチオール電極及び金電極という４種類の電極基板を準備した。

［細胞の準備］
細胞としては、３Ｔ３線維芽細胞（理化学研究所より購入）を使用した。培養液としては、ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ製）に牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ)を１０％添加した培養液を使用した。

この培養液を１２ｍＬ入れた直径１００ｍｍのポリスチレン製ディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、日本ベクトンディッキンソン株式会社製）内で細胞を３日間、前培養することにより、増殖させた。増殖後の細胞をトリプシン処理によって回収した。

［細胞の接着及び培養］
上述のように前培養した細胞を、培養液中に２．５×１０^５個/ｍＬの密度で懸濁し、細胞分散液を調製した。そして、この細胞分散液を、上述のようにして準備した４種類の電極基板のいずれかが収容された直径３５ｍｍのディッシュに２ｍＬ入れた。すなわち、細胞は、５×１０^５個／ディッシュの密度で播種した。そして、温度３７℃、水蒸気飽和させた二酸化炭素５％／９５％空気の雰囲気下にて、細胞を電極表面で２４時間培養した。

［電位印加による細胞の脱離］
上述のようにして培養した細胞が接着した電極基板を作用極とし、白金板を対極とし、銀／塩化銀（内部溶液：飽和ＫＣｌ）電極を参照極として、３電極系を構成した。

直径３５ｍｍのポリスチレン製ディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、日本ベクトンディッキンソン株式会社製)の底面に、作用極の電極基板を水平に固定し、リン酸緩衝液中に浸漬した。さらに、このディッシュ内のリン酸緩衝液には、作用極に加え、対極、参照極も浸漬した。

電位印加部としては、ポテンショスタット（北斗電工株式会社製）を使用した。そして、ポテンショスタットにより、作用極に、非接着性オリゴペプチド２０の還元脱離ピーク電位（−０．６Ｖ）より０．４Ｖだけ負である−１．０Ｖの一定電位を連続的に印加した。

次いで、電位の印加を開始した直後、及び電位の印加を開始してから１分、２分、３分が経過した各時点で、作用極の電極表面に接着している細胞の数を位相差顕微鏡下でカウントした。そして、電位の印加開始直後に電極表面に接着している細胞の数を１００％とした場合における、各電位印加時間で当該電極表面に接着している細胞の数の割合（％）を評価した。

図１３には、評価の結果を示す。図１３において、横軸は電位の印加を開始してから経過した時間（分）、縦軸は、各電位印加時間で電極表面に接着している細胞数の割合（％）を示す。黒丸印は１００％接着性電極を使用した場合の結果（「オリゴペプチド（１００％接着性）／金」）、白四角印は１０％接着性電極を使用した場合の結果（「オリゴペプチド（１０％接着性）／金」）、白丸印はアルカンチオール電極を使用した場合の結果（「アルカンチオール／金」）、白三角印は金電極を使用した場合の結果（「金」）、をそれぞれ示している。

図１３に示すように、金薄膜からなる電極表面に細胞を直接接着させた場合（金電極を使用した場合）は、電位の印加によってほとんど細胞は脱離しなかった。一方、接着性オリゴペプチド１０又は接着性アルカンチオールを介して細胞を接着させた場合（１０％接着性電極、１００％接着性電極又はアルカンチオール電極を使用した場合）は、電位印加によって細胞が脱離することが示された。

ただし、アルカンチオール電極を使用した場合には、電位印加開始から２分経過した時点では約４５％の細胞が脱離せずに残存していた。これに対し、接着性オリゴペプチド１０を使用した場合には、接着性アルカンチオールを使用した場合と比較して、より早く細胞が脱離した。すなわち、電位印加開始から２分経過後には、１０％接着性電極及び１００％接着性電極の表面に接着していた細胞のほとんどが脱離し、リン酸緩衝液中に浮遊した。そして、３分後に残存している細胞数はほぼ０％であった。特に、１００％接着性電極を使用した場合には、極めて迅速な細胞の脱離が達成された。

このように、接着性オリゴペプチド１０を介して細胞を電極表面に接着させることにより、電位の印加によって従来よりも効率よく且つ確実に細胞を表面から脱離できることが確認された。

［細胞組織体シート脱離試験用電極の準備］
上述の実施例１と同様に、金薄膜が形成されたガラス基板からなる電極基板を、接着性オリゴペプチド１０を１．０μＭで含有するオリゴペプチド水溶液中に一晩浸漬させることによって、当該接着性オリゴペプチド１０を結合させた金薄膜表面（電極層３０に相当）を有する電極基板を作製した。

［細胞の接着及び培養］
３Ｔ３線維芽細胞（理化学研究所より購入）を、培養液中に５．０×１０^５個/ｍＬの密度で懸濁し、細胞分散液を調製した。そして、この細胞分散液を、電極基板が収容された直径３５ｍｍのディッシュに２ｍＬ入れた。細胞の播種密度以外は上述の実施例１と同様の条件下で細胞を１週間培養した。

この結果、培養開始から４８時間が経過した時点で、細胞は電極表面に接着するとともに、互いに二次元的に結合を形成してシート状の細胞組織体を形成した。すなわち、電極表面に接着した細胞組織体シートが形成された。

［電位印加による細胞組織体シートの脱離］
上述の実施例１と同様に、接着性オリゴペプチド１０及び非接着性オリゴペプチド２０が結合した電極基板からなる作用極を含む３電極系を作製した。そして、ポテンショスタットにより、リン酸緩衝液中において、作用極に−１．０Ｖの一定電位を連続的に印加した。この結果、電位の印加を開始してから５分が経過した時点で、細胞組織体シートの全体が電極表面から脱離し、リン酸緩衝液中に浮遊した。

すなわち、細胞組織体シートが接着した作用極に一定の電位を連続的に印加することにより、シート状の形態を維持したまま当該細胞組織体シートを当該作用極の電極表面から脱離させることができた。

さらに、電極表面から剥離した細胞組織体シートに含まれる細胞の生存状態を確認するために、回収した当該細胞組織体シートを、１０μｇ／ｍＬの濃度のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤＡ、和光純薬工業株式会社製）と４０μｇ／ｍＬの濃度のＥｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＥＢ、和光純薬工業株式会社製）と、を含むリン酸緩衝液中に５分間浸漬した。

こうして、細胞組織体シートに含まれる生存している細胞をＦＤＡにより、死滅している細胞をＥＢにより、それぞれ選択的に蛍光染色した。その結果、回収された細胞組織体シートに含まれる細胞のほとんどが生存していることが確認された。

このように、本方法によれば、電極表面で培養した細胞組織体シートを非侵襲的に、効率よく且つ確実に脱離させて回収できた。すなわち、本方法は、細胞組織体シートの製造方法として極めて有用であることが確認できた。

［多孔質膜に形成された電極層を有する培養装置の作製］
多孔質膜７０に形成された電極層３０を使用して細胞組織体シートを製造した。すなわち、図１４に示すように、多孔質膜７０からなる底部を有する第一の培養容器４２と、当該多孔質膜７０が培養液中に浮遊した状態で保持されるよう当該第一の培養容器４２を保持する第二の培養容器４３とを使用して、図７Ａ〜図７Ｃに示すような培養系を構築した。なお、図１４に示す例において、第二の培養容器４３は、多孔質膜７０が培養液中に浮遊した状態で保持されるよう第一の培養容器４２を支持しつつ当該第二の培養容器４３内に収容される、シリコン製のリング４３ａを有していた。

第一の培養容器４２としては、セルインサートメンブレン（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔ ＃３５３４９３、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ^ＴＭ製）を使用した。この第一の培養容器４２は、その底部として、厚さが約２０〜２５μｍであり、直径が約０．４μｍの貫通孔７３が多数形成され、開口率が約１２．６％である、ポリエチレンテレフタレート製の多孔質膜７０を有していた。図１５には、使用した多孔質膜７０の電子顕微鏡写真を示す。図１５に示すように、この多孔質膜７０には、その一方の表面から他方の表面まで貫通する多数の孔７３が形成されていた。

多孔質膜７０の表面（図６に示す上面７１に相当する表面）への電極層３０の形成は次のようにして行った。スパッタデポジション装置（ＣＦＳ−４ＥＳ、芝浦メカトロニクス株式会社製）を使用して、出力１００Ｗ、アルゴン雰囲気０．３Ｐａの条件にて、インサートメンブレンの多孔質膜７０の表面にクロムを２分間スパッタリングし、厚さ約４ｎｍのクロム薄膜を形成した。さらに、同条件にてガラス基板のクロム薄膜の上に金を２分間スパッタリングし、厚さ約４０ｎｍの金薄膜（電極層３０）を形成した。また、多孔質膜７０の表面に作製した電極層３０へ、接着性オリゴペプチド１０を１．０μＭで含有するオリゴペプチド水溶液中に一晩浸漬させた。その後、電極基板を純水で洗浄した。このようにして、接着性オリゴペプチド１０を結合させた電極層３０を有する多孔質膜７０からなる電極基板を得た。

［細胞の接着及び培養］
前培養した３Ｔ３線維芽細胞を、培養液中に５．０×１０^５個/ｍＬの密度で懸濁し、細胞分散液を調製した。培養液としては、ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ製）に牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ)を１０％添加した培養液を使用した。そして、この細胞分散液を、上述のようにして準備したインサートメンブレンの多孔質膜７０上に２ｍＬ入れた。すなわち、細胞は、1×１０⁶個／インサートメンブレンの密度で播種した。また、第一の培養容器４２を保持する第二の培養容器４３には培養液を２.５ｍL入れた。温度３７℃、水蒸気飽和させた二酸化炭素５％／９５％空気の雰囲気下にて、細胞を電極表面で２週間培養することで、細胞組織体シートを作製した。

［電位印加による細胞組織体シートの脱離］
上述のようにして培養した細胞組織体シートが接着した電極層３０を有する多孔質膜７０を作用極とし、白金板を対極とし、銀／塩化銀（内部溶液：飽和ＮａＣｌ）電極を参照極として、３電極系を構成した。培養容器４３に、作用極を有する培養容器４２を固定し、当該培養容器４２内をリン酸緩衝液５ｍLで満たした。さらに、この培養容器４２内のリン酸緩衝液には、対極、参照極も浸漬した。電位印加部としては、ポテンショスタット（北斗電工株式会社製）を使用した。そして、ポテンショスタットにより、作用極に、−１．０Ｖの一定電位を５分間印加した。さらに、この電圧の印加とともに、培養容器４２をシリコン製のリング４３ａ側（すなわち下方）に押し込むことで、多孔質膜７０の下面７２側から上面７１側へ孔７３を介してリン酸緩衝液を送液することで、当該多孔質膜７０から細胞組織体シートを浮き上がらせて回収した。

上述のようにして電極表面から脱離し回収された細胞組織体シート５１の断面をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、当該断面を位相差顕微鏡観察した。図１６Ａ〜図１６Ｃには、その観察結果を示す。図１６Ａは、培養ディッシュの底面に形成された電極表面で７日間培養され回収された細胞組織体シート５１の観察結果を示す。図１６Ｂは、多孔質膜７０の表面に形成された電極表面で７日間培養され回収された細胞組織体シート５１の観察結果を示す。図１６Ｃは、多孔質膜７０の表面に形成された電極表面で２１日間培養され回収された細胞組織体シート５１の観察結果を示す。

図１６Ａ及び図１６Ｂに示すように、多孔質膜７０の表面に形成された電極表面で細胞を培養することにより（図１６Ｂ）、非多孔質の表面に形成された電極表面を使用する場合（図１６Ａ）に比べて、厚さが顕著に大きい細胞組織体シート５１を製造することができた。さらに、図１６Ｃに示すように、多孔質膜７０の表面に形成された電極表面における細胞の培養を継続することにより、さらに厚さの大きい細胞組織体シート５１を製造することができた。

［細胞組織積層体の作製］
回収した細胞組織体シート上に、新たに回収した２つ目の細胞組織体シートを重ね、温度３７℃、水蒸気飽和させた二酸化炭素５％／９５％空気の雰囲気下にて５分間インキュベートした。さらに、新たな３つ目の細胞組織体シートをその上から重ね、同様にインキュベートすることで、細胞組織積層体を製造した。

図１７には、上述のようにして作製された細胞組織積層体５２の断面をＨＥ染色し、当該断面を位相差顕微鏡観察した結果を示す。図１７に示すように、３枚の細胞組織体シートが積層され一体化することにより、１５０〜２５０μｍの厚さを有する細胞組織積層体５２が得られた。この細胞組織積層体５２は、例えば、ピンセットでつまんで持ち上げても破れない程度に十分な強度を有していた。

［回収された細胞の接着能及び増殖能の評価］
上述の実施例３で使用したインサートメンブレンの多孔質膜７０の表面に、接着性オリゴペプチド１０を結合させた電極層３０を形成し、当該電極層３０上で３Ｔ３線維芽細胞を前培養した。培養液としては、ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ製）に牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ)を１０％添加した培養液を使用した。

培養した細胞が接着した電極層３０を有する多孔質膜７０を作用極とし、白金板を対極とし、銀／塩化銀（内部溶液：飽和ＮａＣｌ）電極を参照極として、３電極系を構成した。上述の実施例３と同様、培養容器４３に、作用極を有する培養容器４２を固定し、当該培養容器４２内を培養液５ｍLで満たした。さらに、この培養容器４２内の培養液には、対極、参照極も浸漬した。電位印加部としては、ポテンショスタット（北斗電工株式会社製）を使用した。そして、ポテンショスタットにより、作用極に、−１．０Ｖの一定電位を５分間印加した。その結果、細胞は電極層３０から脱離し、回収された。

こうして回収された細胞を、２．８５×１０^４個/ｍＬの密度で培養液に懸濁し、細胞分散液を調製した。そして、この細胞分散液を、直径３５ｍｍのポリスチレン製ディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、日本ベクトンディッキンソン株式会社製)の底面に２ｍL入れた。すなわち、細胞は５．７×１０^４個／ディッシュの密度で播種した。そして、温度３７℃、水蒸気飽和させた二酸化炭素５％／９５％空気の雰囲気下にて、細胞を３日間培養し、その間、位相差顕微鏡下で細胞の数を１日おきに計測した。

一方、対照実験として、３Ｔ３線維芽細胞をポリスチレン製ディッシュ上で前培養し、その後、当該細胞をトリプシン処理によって回収した。そして、回収された細胞を、上述の場合と同一の条件で、ポリスチレン製ディッシュの底面に懸濁し、位相差顕微鏡下で細胞の数を１日おきに計測した。

図１８には、細胞の数を計測した結果を示す。図１８において、横軸は培養日数（日）を示し、縦軸は、各培養日において、ポリスチレン製ディッシュの底面１ｍｍ^２あたりに接着していた細胞の数（細胞密度（ｃｅｌｌｓ/ｍｍ^２））を示す。また、図１８において、黒塗り丸印は電気化学的に（接着性オリゴペプチド１０の還元脱離により）脱離させた細胞を培養した場合の結果を示し、白抜き丸印はトリプシン処理により脱離した細胞を培養した場合の結果を示す。

図１８に示すように、接着性オリゴペプチド１０の還元脱離により回収された細胞は、ポリスチレン製ディッシュの底面に接着して増殖した。そして、この細胞の増殖速度（倍加時間：１５±１．６時間）は、対照実験においてトリプシン処理により回収された細胞のそれ（倍加時間：１６±１．５時間）と同等であった。すなわち、接着性オリゴペプチド１０の還元脱離のための電位印加が細胞の活性に与える影響はほとんどないことが確認された。

［多孔質膜に形成された電極層を有する培養装置の作製］
上述の実施例３と同様に、図１４に示すように、接着性オリゴペプチド１０を結合させた電極層３０を有する多孔質膜７０からなる底部を有する第一の培養容器４２（インサートメンブレン）と、当該多孔質膜７０が培養液中に浮遊した状態で保持されるよう当該第一の培養容器４２を保持する第二の培養容器４３とを使用して、図７Ａ〜図７Ｃに示すような培養系を構築した。

［細胞の接着及び培養］
細胞としては、再生医療において有用であるヒト間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）を使用した。このＭＳＣを、培養液中に５．０×１０^５個/ｍＬの密度で懸濁し、細胞分散液を調製した。培養液としては、ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ製）に牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ)を１０％、抗生物質‐抗真菌剤を１％、Ｌ‐グルタミン１％を添加した培養液を使用した。

そして、この細胞分散液を、上述のようにして準備したインサートメンブレンの多孔質膜７０上に２ｍＬ入れた。すなわち、ＭＳＣは、１×１０^６個／インサートメンブレンの密度で播種した。また、第一の培養容器４２を保持する第二の培養容器４３には培養液を２.５ｍL入れた。温度３７℃、水蒸気飽和させた二酸化炭素５％／９５％空気の雰囲気下にて、細胞を電極表面で４日間培養することで、ＭＳＣが集合して形成された細胞組織体シートを作製した。

［コラーゲンゲルの調製］
細胞組織体シートの支持体として、当該細胞組織体シート上にコラーゲンゲルの層を形成した。コラーゲンゲルは、コラーゲン溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ａ、新田ゼラチン製）を使用した形成した。コラーゲン溶液と、１０倍に濃縮された培養液と、緩衝液とを８：１：１の体積比率で混合した。そして、得られた混合溶液を細胞組織体シート上に滴下し、温度３７℃、水蒸気飽和させた二酸化炭素５％／９５％空気の雰囲気下にて、３０分間インキュベートすることで、当該細胞組織体シート上にコラーゲンゲル層を形成した。

［電位印加による細胞組織体シートの脱離］
上述のようにして培養した細胞が接着した電極層３０を有する多孔質膜７０を作用極とし、白金板を対極とし、銀／塩化銀（内部溶液：飽和ＮａＣｌ）電極を参照極として、３電極系を構成した。培養容器４３に、作用極を有する培養容器４２を固定し、当該培養容器４２内をリン酸緩衝液５ｍLで満たした。さらに、この培養容器４２内のリン酸緩衝液に、対極、参照極も浸漬した。電位印加部としては、ポテンショスタット（北斗電工株式会社製）を使用した。そして、ポテンショスタットにより、作用極に、−１．０Ｖの一定電位を５分間印加するとともに、培養容器４２をシリコン製のリング４３ａ側に押し込むことで、多孔質膜７０の下面７２側から上面７１側へ孔７３を介してリン酸緩衝液を送液することで、当該多孔質膜７０から細胞組織体シートを浮き上がらせて回収した。

［回収された細胞組織体シートの生存状態の評価］
上述のようにして電位印加により電極層３０から脱離させ回収した細胞組織体シートを、上述の実施例２と同様に、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤＡ）で染色し、蛍光顕微鏡にて撮影した。

図１９には、染色された細胞組織体シートを蛍光顕微鏡で撮影して得られた写真を示す。図１９において、白色又はグレーで示される部分がＦＤＡで染色された細胞組織体シートを示し、黒色の部分はバックグラウンドを示す。

図１９に示すように、回収された細胞組織体シートの全体がＦＤＡにより蛍光染色された。すなわち、再生医療において有用であるＭＳＣから形成した細胞組織体シートは、電位印加により効率よく回収され、且つ回収後の当該細胞組織体シートを構成するＭＳＣは生存していることが確認された。

１０ 接着性オリゴペプチド、１１ 末端アミノ酸、１２ 中間配列、１３ 交互配列、１３ａ 酸性アミノ酸、１３ｂ 塩基性アミノ酸、１４ 細胞接着性配列、２０ 非接着性オリゴペプチド、２１ 末端アミノ酸、２２ 中間配列、２３ 交互配列、２３ａ 酸性アミノ酸、２３ｂ 塩基性アミノ酸、２４ 細胞接着性配列、３０ 電極層、３０ａ 電気接続部、３１ 参照極、３２ 対極、３３ 電位印加部、４０ 培養部、４１ 基材、４２ 第一の培養容器、４３ 第二の培養容器、４３ａ リング、５０ 細胞、５１ 細胞組織体シート、５２ 細胞組織積層体、６０ 培養液、７０ 多孔質膜、７１ 上面、７２ 下面、７３ 孔、１００ オリゴペプチド層。

Claims (6)

1. 電極層に接着した細胞を培養する方法であって、
   一方の末端を構成しチオレートを介して前記電極層に結合する末端アミノ酸と、
   他方の末端を構成し細胞接着性のアミノ酸配列からなる細胞接着性配列と、
   前記細胞接着性配列の前記一方の末端側に結合し複数の酸性アミノ酸と複数の塩基性アミノ酸とが１つずつ交互に結合してなる交互配列と、
   を有するオリゴペプチドで被覆された前記電極層に前記細胞を接着させて培養する第一工程と、
   前記細胞が接着している前記電極層に、前記オリゴペプチドが還元脱離する電位を印加して、前記細胞を前記電極層から脱離させる第二工程と、
   を含み、
   前記酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）からなる群より選択される１種以上であり、
   前記塩基性アミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される１種以上であり、
   前記オリゴペプチドは、８〜１００個のアミノ酸から構成される
   ことを特徴とする培養方法。
2. 前記電極層は、培養液中に浮いた状態で保持される多孔質膜の表面に形成されている
   ことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
3. 前記第一工程において、前記電極層に前記細胞を接着させて培養することで前記電極層に接着した細胞組織体シートを形成し、
   前記第二工程において、前記細胞組織体シートが接着している前記電極層に、前記オリゴペプチドが還元脱離する前記電位を印加して、前記細胞組織体シートを前記電極層から脱離させる
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の培養方法。
4. 前記電極層から脱離させた複数の前記細胞組織体シートを積層して、前記細胞組織体シートの積層体を形成する第三工程をさらに含む
   ことを特徴とする請求項３に記載の培養方法。
5. 細胞を接着させて培養するための電極層を有する培養装置であって、
   前記電極層は、
   一方の末端を構成しチオレートを介して前記電極層に結合する末端アミノ酸と、
   他方の末端を構成し細胞接着性のアミノ酸配列からなる細胞接着性配列と、
   前記細胞接着性配列の前記一方の末端側に結合し複数の酸性アミノ酸と複数の塩基性アミノ酸とが１つずつ交互に結合してなる交互配列と、
   を有するオリゴペプチドで被覆されており、
   前記酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）からなる群より選択される１種以上であり、
   前記塩基性アミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される１種以上であり、
   前記オリゴペプチドは、８〜１００個のアミノ酸から構成される
   ことを特徴とする培養装置。
6. 前記電極層は、培養液中に浮いた状態で保持される多孔質膜の表面に形成されている
   ことを特徴とする請求項５に記載の培養装置。

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