CN114599776A

CN114599776A - 细胞膜片制造装置及细胞膜片

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Publication number: CN114599776A
Application number: CN202080072410.0A
Authority: CN
Inventors: 堀武志; 岩田博夫; 黑泽修; 谷叙孝; 水田太郎; 石原甲平
Original assignee: Paddy Field Manufacturing Co ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Paddy Field Manufacturing Co ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2022-06-07
Also published as: JP2023116717A; JPWO2021075502A1; EP4047079A1; US20220372419A1; WO2021075502A1; TW202128977A; JP7304022B2; EP4047079A4

Abstract

本发明确保在培养基内细胞膜片的位置稳定的状态下容易地对细胞膜片两面进行观察。细胞膜片制造装置(100)具备容器(20)以及可接触/分离地收纳于容器(20)中的支撑体单元(10)，所述支撑体单元(10)具有网状膜片(2)以及将网状膜片(2)保持为从容器(20)的底面浮起的基座(3)；支撑体单元(10)是以在培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式收纳于容器(20)中。

Description

细胞膜片制造装置及细胞膜片

技术领域

本发明涉及细胞膜片制造装置及细胞膜片。

背景技术

目前，细胞膜片实际上被用作治疗烫伤部位时的皮肤膜片等。未来，细胞膜片还将被用作向心力衰竭患者移植的心肌细胞膜片或向糖尿病患者移植的胰岛细胞膜片，有望被应用到更多的患者身上。

另一方面，人们也正在尝试利用由多个细胞层构成的细胞膜片来重建与生物体内相类似的组织结构。因此也就认识到了三维配置细胞的细胞膜片制作方法的重要性。如果采用现有的、利用温度敏感性培养皿制作细胞膜片的方法进行制作之际，由于所制作的细胞膜片是脆的，所以处理困难的情况多(参照非专利文献1及2)。此外，要在培养皿上制作由多个细胞层(真皮层及表皮层)构成的细胞膜片时，由于成熟的表皮层会形成一种被称为紧密连接的屏障，所以有可能会阻碍对细胞膜片内部的营养供应。

另外，还提议有在非细胞性膜片状支撑体上制作细胞膜片的方法。但是，支撑体如果不与患部细胞融合，该方法就无法将支撑体裸露的一面与患部贴合。即，细胞膜片与患部的贴合面仅限于单面。将这种在成纤维细胞层(真皮层)上配置角质细胞层(表皮层)的细胞膜片贴合于患部时，如上所述贴合面受到限制，很难达到预期效果。这是因为移植细胞膜片时，需要将真皮层侧的面与患部粘附。

除此之外，关于其它制作细胞膜片的方法，还已知有在多孔膜(例如聚碳酸酯制多孔膜)上制作由多个细胞层构成的细胞膜片的方法(参照非专利文献3)。由该方法制作的细胞膜片有望经由多孔膜的孔向细胞供应营养，因此，和在培养皿上制作多层细胞膜片的情况相比，向细胞供应营养具有优势。但是，在多孔膜上制作细胞膜片时，由于所制作的细胞膜片与患部的贴合面也是单面，难以用于移植。因此，根据上述方法制作的细胞膜片主要用于化合物的透过性试验等。

提议有采用明胶、聚乳酸(PLA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)等纳米纤维膜片制作细胞膜片的方法(参照非专利文献4)。该方法利用静电纺丝法制作由纳米纤维构成的膜片，然后在该膜片上培养细胞。该方法存在的问题是：难以通过静电纺丝准确地控制各纳米纤维的配置。并且，由于该纳米纤维的不规则性问题，所制作的细胞膜片可能难以获得高再现性的结果。

另外，为了制作细胞膜片，还提议有采用微型网状膜片。关于采用微型网状膜片的方法，例如报告有(ⅰ)在微型网状膜片上培养细胞，制作二维细胞膜片的方法，以及(ⅱ)在微型网状膜片上培养iPS细胞，制作球状滋养层样细胞的方法等(参照专利文献1及2、以及非专利文献5)。作为采用该微型网状膜片培养细胞方法的应用，开发出了在微型网状膜片上培养株化肝细胞HepG2细胞制作三维细胞膜片的技术。相较于三维球体，该三维细胞膜片改善了细胞的部分功能，并且利于观察细胞及供应营养，这显示了其与流体装置的相容性优异(参照非专利文献6)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO 2015/005349号小册子(2015年1月15日公开)

专利文献2：日本专利特开2019-50773号公报(2019年4月4日公开)

非专利文献

非专利文献1：Green H,Kehinde O,Thomas J.Growth of cultured humanepidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.Proc Natl AcadSci USA.1979；76(11):5665-8.

非专利文献2：Yamada N,Okano T,Sakai H,Karikusa F,Sawasaki Y,SakuraiY.Thermo-responsive polymeric surfaces；control of attachment and detachmentof cultured cells.Die Makromolekulare Chemie,Rapid Communications.1990；11(11):571-6.

非专利文献3：Kojima H,Ishii I,Nakata S,Konishi H.Dose-responseEvaluation Using an Epidermal Model,an Alternative to Skin IrritationTesting.Alternatives to Animal Testing and Experimentation.2006；11(3):1 77-84

非专利文献4：Li J,Minami I,Shiozaki M,Yu L,Yajima S,Miyagawa S,etal.Human Pluripotent Stem Cell–Derived Cardiac Tissue–like Constructs forRepairing the Infarcted Myocardium.Stem Cell Reports.2017；9(5):1546-59

非专利文献5：Okeyo KO,Kurosawa O,Yamazaki S,Oana H,Kotera H,NakauchiH,et al.Cell Adhesion Minimization by a Novel Mesh Culture MethodMechanically Directs Trophoblast Differentiation and Self–AssemblyOrganization of Human Pluripotent Stem Cells.Tissue Eng Part C Methods.2015；21(10):1105-15

非专利文献6：Hori T,Kurosawa O.A Three–dimensional Cell Culture Methodwith a Micromesh Sheet and Its Application to Hepatic Cells.Tissue Eng Part CMethods.2018

发明内容

发明所要解决的课题

在采用微型网状膜片制造细胞膜片的制造方法中，首先要将网状膜片以漂浮于用以培养细胞的培养基中的状态设置于容器内。接着，在微型网状膜片上接种细胞。然后，在培养基中对接种于微型网状膜片上的细胞进行培养。在这样的细胞膜片的制造方法中，为了确认构成细胞膜片的细胞的生长发育情况，需要用显微镜对细胞膜片的两面进行确认。

例如根据专利文献1所公开的技术，用于接种细胞的微型网状膜片设置于悬吊用构件上，该悬吊用构件设置于容器中。如果采用这样的构成，难以(ⅰ)使细胞膜片翻转进行培养，且难以(ⅱ)使细胞膜片翻转进行显微镜观察(即双面观察)。

此外，专利文献2所公开的装置将微型网状膜片保持于收纳培养基的容器内壁所设置的槽内。如果采用这样的构成，难以将微型网状膜片从容器上分离进行正反配置。因此也就难以用显微镜对细胞膜片的两面进行确认。

上述细胞观察所面临的难题，例如在制作由多个细胞层构成的细胞膜片时尤为凸显。

本发明一方面的第一目的在于：实现一种为了确认构成细胞膜片的细胞的生长发育情况，在培养基内细胞膜片位置稳定的状态下容易对细胞膜片两面进行观察的细胞膜片制造装置。

此外，本发明一方面的第二目的在于：实现一种能充分确保厚度并提高强度的细胞膜片。

用于解决课题的技术方案

为了解决上述课题，本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置的特征在于，具备：容器，其收纳用于培养细胞的培养基；以及支撑体单元，其可接触/分离地收纳于所述容器中，具有使所述细胞附着并培养的基材即网状膜片，以及将该网状膜片保持为从所述容器的底面浮起的保持构件；所述支撑体单元以其在所述培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式收纳于所述容器中。

本发明一方面所涉及的细胞膜片的特征在于，具有至少两个细胞层，在所述两个细胞层之间配设有使细胞附着并培养的基材即网状膜片。

发明效果

根据本发明一方面，能够实现一种为了确认细胞膜片中的细胞的生长发育情况，在培养基内细胞膜片位置稳定的状态下容易对细胞膜片两面进行观察的细胞膜片制造装置。进而，根据本发明一方面，能够实现一种能充分确保厚度并提高强度的细胞膜片。

附图说明

图1是表示构成例1的细胞膜片制造装置简要构成的图。

图2是用于说明图1所示细胞膜片制造装置的效果的图。

图3是表示改进例1的细胞膜片制造装置构成的图。

图4是表示改进例2的细胞膜片制造装置构成的图。

图5是表示使用本发明一实施方式所涉及的细胞膜片制造装置制作的皮肤膜片剖面结构的示意图。

图6是表示构成例2的细胞膜片制造装置所具备的支撑体单元简要构成的图。

图7是表示构成例2的细胞膜片制造装置简要构成的图。

图8是表示构成例3的细胞膜片制造装置简要构成的图。

图9是表示构成例4的细胞膜片制造装置简要构成的图。

图10是表示实施例1的结果的图。

图11是表示实施例1的结果的图。

图12是表示实施例2的结果的图。

图13是表示实施例3的结果的图。

图14是表示实施例4的结果的图。

图15是表示实施例5的结果的图。

图16是表示实施例5的结果的图。

图17是表示实施例5的结果的图。

图18是表示实施例6的结果的图。

图19是表示实施例7的结果的图。

图20是表示改进例3的细胞膜片制造装置构成的图。

图21是用于说明改进例3的细胞膜片制造装置的效果的图。

具体实施方式

关于本发明一实施方式的说明，如下所述，但本发明并不限定于此。本发明并不限定于以下所说明的各构成，可以在权利要求书所示的范围内进行各种变更，适当组合不同的实施方式及实施例中分别公开的技术方案所得到的实施方式及实施例也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中所记载的文献整体作为参考文献并入本说明书中。在本说明书中，数值范围记载为“A～B”时，该记载表示“A以上、B以下(包含A和B本值)”之意。

1.细胞膜片制造装置

本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的前提是：网状膜片设置于培养基中，使接种于该网状膜片上的细胞在培养基中生长发育，从而制造细胞膜片。通过将网状膜片设置于培养基(培养液)中，可以使细胞按照网状膜片的形状增殖。

本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置是具备容器和支撑体单元的构成，所述容器收纳用于培养细胞的培养基。所述支撑体单元可接触/分离地收纳于所述容器中，具有网状膜片和保持构件。所述网状膜片是用于使细胞附着并培养的基材。另外，所述保持构件将所述网状膜片保持为从所述容器的底面浮起。所述支撑体单元以其在所述培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式收纳于所述容器中。

此处，“将网状膜片保持为从所述容器的底面浮起”是指按照网状膜片两面不与容器底面(优选为容器内壁以及底面)接触，但网状膜片两面与所述培养基充分接触的方式对网状膜片加以保持。所述保持构件只要是能将网状膜片保持为从所述容器的底面浮起的构成即可，具体构成并无限制。

在上述采用网状膜片制造细胞膜片的操作中，本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置改进了使用者观察细胞的便利性。更具体而言，在上述的构成中，所述支撑体单元可接触/分离地收纳于容器中。因此，使用者能从容器取出所述支撑体单元进行翻转后再次收纳到容器中，从而容易对所述支撑体单元进行翻转。将所述支撑体单元翻转，形成于由支撑体单元的保持构件所保持的网状膜片上的细胞膜片也会翻转。因此，根据上述的构成，容易用显微镜对形成于所述网状膜片上的细胞膜片两面进行观察。

进而，所述支撑体单元以其在培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式收纳于容器中，因此，在用显微镜观察细胞膜片期间，网状膜片在容器内的位置，换言之形成于网状膜片上的细胞膜片的位置不会发生变化。因此，根据上述的构成，能精密地观察细胞膜片。

此外，在本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置中，所述保持构件优选可拆卸地保持所述网状膜片。从而容易将形成于所述网状膜片上的细胞膜片从所述支撑体单元分离。因此，例如在移植细胞膜片时细胞膜片的处理变得容易。

另外，所述支撑体单元只要是能以其在所述培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式收纳于所述容器中的构成即可，其具体构成并无限制。例如可列举所述支撑体单元的所述保持构件比重比所述培养基大的构成。由于所述保持构件比重比所述培养基大，因此所述保持构件不会在所述培养基中漂浮，而是沉下去，垂直方向上的位置尤其稳定。所述保持构件的比重可以根据所述培养基的种类而适当设定，例如当将培养基的比重设为1时，所述保持构件的比重优选为1.1以上，更优选为1.5以上，更优选为2.0以上，更优选为5.0以上，尤其优选为10.0以上。另外，关于构成所述保持构件的材料，例如可列举聚苯乙烯、聚酯、聚缩醛、聚碳酸酯、聚氯乙烯等。

此外，关于网状膜片，只要是能够接种细胞且能增殖细胞的结构，则无特别限制。所述网状膜片优选为特定形状的开口部有规则或无规则地重复排列而成的平面状构造体。所述网状膜片更优选为俯视时具有多个多边形开口部。网状膜片的开口部形状较为典型的是三角形、四边形、六边形等多边形，也可以是圆、椭圆或其它多边形。

在此，将所述网状膜片的开口部以外的部分称为框架或框架部。另外，当开口部为微米尺寸时，网状膜片也称为微型网状膜片等。网状膜片的开口部的形状也可以说是由构成网状膜片的框架所包围区域的形状。

所述网状膜片的开口部可以是能供至少一个所培养的细胞通过的大小。开口部是能供至少一个所培养的细胞通过的大小是指，不论细胞变形或不变形，开口部大小和细胞大小的关系为都能确保细胞通过开口部。开口部可以是细胞在不接触开口部的情况下通过的大小，也可以是细胞一边接触开口部(换言之，细胞一边变形)，一边通过开口部的大小。

网状膜片的开口部的形状优选为沿一方向伸长的形状。“沿一方向伸长的形状”是指用于规定该形状的多条轴线中，存在一个比其它轴(短轴)要长的轴(长轴)的形状。关于这样的形状，例如可列举长方形、菱形、椭圆形等。开口部形状为长方形时，长边对应长轴，短边对应短轴。此外，开口部形状为菱形时，两条对角线中较长的一条对角线对应长轴，较短的一条对角线对应短轴。“沿一方向伸长的形状”例如可列举长轴(长边)远远长于短边(短轴)的长方形，长轴远远长于短轴的菱形或椭圆形。如果是长方形，一方向伸长的形状是短边:长边为1:2～1:5、优选为1:2～1:10的形状。此外，如果是菱形，一方向伸长的形状是短轴:长轴为1:2～1:5、优选为1:2～1:10的形状。如果是椭圆形，一方向伸长的形状是短轴:长轴为1:2～1:5、优选为1:2～1:10的形状。当然，本发明并不限定于这些构成。另外，“沿一方向伸长的形状”并不限定于长方形、菱形、椭圆形，只要是用于规定该形状的多条轴线中存在一个比其它轴要长的轴的形状即可。

如上述的构成所述，当所述网状膜片的开口部为沿一方向伸长的形状时，开口部具有向一方向伸长的大壁面。与该壁面粘附并增殖的细胞数量多，并且增殖时具有相同方向性，因此，根据上述的构成，可以将增殖的细胞的方向性控制为开口部的伸长方向。

此外，所述网状膜片的材料是细胞能够附着、增殖的材料即可，例如可以使用光固化性树脂、生物相容性材料、生物降解性材料等。

如果使用光固化性树脂，可以通过光刻法制作所述网状膜片。关于所述光固化性树脂，例如可列举丙烯酸酯化合物、甲基丙烯酸酯化合物、环氧化合物、异氰酸酯化合物、硫醇化合物、有机硅系化合物等。也可以组合2种以上使用。关于光固化性树脂的具体例，可列举聚氨酯丙烯酸酯、聚酯丙烯酸酯、环氧丙烯酸酯、聚(甲基)丙烯酸甲酯、乙氧基化双酚A丙烯酸酯、脂肪族聚氨酯丙烯酸酯、聚酯丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸改性脂环族环氧化物、2官能醇醚型环氧化物、丙烯酸有机硅、丙烯酸二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等，但并不限定于这些。

此外，如果通过光刻法制作所述网状膜片之时，可以使用曝光部分被除去的正性抗蚀剂来制作微型网状膜片。例如，关于所述正性抗蚀剂，可列举DNQ(重氮萘醌)酚醛系树脂正性抗蚀剂，叔丁氧羰基、四氢呋喃、苯氧基乙基、三甲基硅基、叔丁氧羰基甲基等脱保护反应型正性抗蚀剂，聚邻苯二甲醛、聚碳酸酯、Polysilier lutel等解聚反应型正性抗蚀剂。此外，显影液采用四甲基氢氧化铵(TMAH)、二甲基亚砜(DMSO)、MEK(甲基乙基酮)、GBL(γ-丁内酯)、EL(乳酸乙酯)等。

另外，所述网状膜片的材料为生物相容性材料或生物降解性材料时，由于所获得的细胞膜片可以直接与网状膜片一同移植到生物体内，适宜用于再生医疗或药物创新。

关于所述生物相容性材料，可列举有机硅、嵌段聚醚酰胺(PEBAX)、聚氨酯、有机硅-聚氨酯共聚物、陶瓷、胶原蛋白、羟磷灰石、尼龙、聚对苯二甲酸乙二醇酯、GORE-TEX(商标)等超高分子量聚乙烯、聚氯乙烯、及其它来自生物的材料等，但并不限定于这些。此外，所述网状膜片也可以由生物相容性材料以外的材料形成，用生物相容性材料对表面进行处理。

关于所述生物降解性材料，可列举聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、以及这些的共聚物、PHB-PHV系聚(链烷酸)类、聚酯类、淀粉、纤维素、壳聚糖等天然高分子及其衍生物等，但并不限定于这些。

关于所述网状膜片的材料，上述材料中优选聚酯，尤其优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。聚对苯二甲酸乙二醇酯的生物毒性低，因此能够将所获得的细胞膜片移植到生物体内。并且，在进行荧光显微镜观察时会抑制自体荧光，因此，聚对苯二甲酸乙二醇酯优选染为黑色。关于聚酯制网状膜片的具体例，可列举天池合纤公司制造的材料AG001N0、AG00Z1N0、AG00Z3N0等。另外，关于染为黑色的聚酯制网状膜片的具体例，可列举天池合纤公司制造的材料AG001N1、AG00Z1N9、AG00Z3N9等。

此外，可以预先用细胞粘附促进材料对所述网状膜片进行涂布。细胞粘附促进材料用于使细胞固定于培养支撑体上便于伸展、增殖，例如可列举胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等细胞外基质蛋白质、聚-L-赖氨酸等带阳性电荷物质等。关于细胞粘附促进材料，具体可列举Matrigel(注册商标)。

此外，在本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置中，所述容器只要能够收纳用于培养细胞的培养基即可，其构成(例如形状)并无特别限制。所述容器例如可列举细胞培养用培养皿、具有多个孔的培养板(6孔培养板、12孔培养板等)、细胞培养用柱。

2.本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例1

以下对本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例1进行说明。图1是表示作为构成例1的细胞膜片制造装置100的简要构成的图。图1的1010是表示细胞膜片制造装置100所具备的支撑体单元10的构成的立体图。图1的1020～1023是表示使用细胞膜片制造装置100制造细胞膜片的制造方法的步骤图。图1的1030是表示使用细胞膜片制造装置100制作的细胞膜片构成的图。此外，图1的1040是表示细胞膜片制造装置100的一例具体构成的图像。

如图1的1023所示，细胞膜片制造装置100具备支撑体单元10和容器20。支撑体单元10可接触/分离地收纳于容器20中。

如图1的1010所示，支撑体单元10具备环状构件1、网状膜片2和基座3(保持构件)。基座3具有基座主体3a、筒状载置部3b、底面抵接部3c以及侧壁抵接部3d。

基座主体3a为圆盘形状。筒状载置部3b为无底圆筒形状，轴向的两端部开口。筒状载置部3b仅从基座主体3a的一个面沿垂直方向突出而形成。筒状载置部3b是贯穿基座主体3a内部的构成。换言之，基座主体3a的上侧及下侧经由筒状载置部3b而连通。筒状载置部3b上载置有网状膜片2。从相对于基座主体3a而言筒状载置部3b的相反侧，使利用显微镜等通过筒状载置部3b对网状膜片2进行观察成为可能。

从相对于基座主体3a的垂直方向俯视时，侧壁抵接部3d呈从基座主体3a沿水平方向伸长的矩形板状。侧壁抵接部3d至少形成有2个，且相对于基座主体3a对称。在图1的1010所示构成中，侧壁抵接部3d形成有4个。侧壁抵接部3d的水平方向前端部分抵接于容器20的侧壁。侧壁抵接部3d起到将基座主体3a和容器20侧壁之间水平方向的间隔维持为固定的间隔片的作用。因此，即便容器20在水平方向上发生振动，通过侧壁抵接部3d的前端部与容器20的侧壁抵接，在培养基中基座主体3a的水平方向位置不会变动，能维持稳定。另外，基座3为如下构成：所有侧壁抵接部3d均与容器20的侧壁在尺寸上形成一定间隙，以便能与容器20接触/分离。

底面抵接部3c为矩形板状，分别对应于矩形板状侧壁抵接部3d而立设。底面抵接部3c与侧壁抵接部3d相交叉。在图1的1010所示构成中，底面抵接部3c相对于侧壁抵接部3d在垂直方向(重力方向)相交叉。并且，底面抵接部3c中垂直方向的前端部与容器20的底面相抵接。底面抵接部3c起到将基座主体3a和容器20底面之间垂直方向的间隔维持为固定的间隔片的作用。因此，即便基座3被收纳于容器20中，由于通过底面抵接部3c与容器20的底面相抵接，因此在培养基中基座主体3a的垂直方向位置不会变动，能维持稳定。此外，底面抵接部3c与侧壁抵接部3d相交叉，相对于侧壁抵接部3d从上下两方向突出而形成。因此，即便将基座3上下方向翻转地收纳于容器20中，基座主体3a的垂直方向位置仍能维持稳定。

环状构件1具有环绕筒状载置部3b外周的环形状，相对于基座3设置为拆卸可能。环状构件1的环形状并无特别限制，可以是圆环、四角环等任意形状。图1的1010所示的构成中，环状构件1为圆环形状。

网状膜片2配置于环状构件1和筒状载置部3b之间。网状膜片2以其周边被环状构件1的内侧面和筒状载置部3b的外侧面所夹持的状态被基座3所保持。环状构件1为圆环形状且筒状载置部3b为圆筒形状时，从稳定地保持网状膜片2的观点出发，环状构件1的内径与筒状载置部3b的外径之差越接近网状膜片2的厚度越好。

接下来，对使用细胞膜片制造装置100制造细胞膜片的制造方法进行说明。首先，如图1的1020所示，将网状膜片2载置于基座3的筒状载置部3b上。接着，在网状膜片2载置于筒状载置部3b的状态下，将环状构件1安装到筒状载置部3b上。

此时，以其内侧面环绕筒状载置部3b外侧面的方式安装环状构件1。因此，如图1的1021所示，网状膜片2的周边被环状构件1的内侧面和筒状载置部3b的外侧面所夹持。从而制作出保持网状膜片2的支撑体单元10。所制作的支撑体单元10中，在筒状载置部3b的轴向两端部开口之中，一侧端部开口被网状膜片2封闭，另一侧端部开口开放。

然后，将支撑体单元10上下翻转，确保网状膜片2位于筒状载置部3b的下侧。如此结果，在支撑体单元10中通过网状膜片2和筒状载置部3b的内侧面形成以网状膜片2为底面的有底筒部10a。如图1的1022所示，使用移液器5等将培养基6中悬浮有细胞4的悬浮液注入有底筒部10a中。此时，在所述悬浮液相对于筒状载置部3b的内侧面以及网状膜片2的表面张力的作用下，所述悬浮液不会通过网状膜片2，而被保持在网状膜片2上。继而，通过使悬浮液中的细胞4附着到网状膜片2上，从而将细胞4接种到网状膜片2上。

之后，将支撑体单元10收纳到容器20中。接着，用培养基6充满容器20，对附着于网状膜片2上的细胞4进行培养。

如图1的1030所示，各个细胞4朝向开口中心彼此自发地伸展、粘附以堵住网状膜片2的开口。在网状膜片2上对保持有增殖能力的细胞4进行培养时，细胞4不仅会相对于网状膜片2在水平方向增殖，还会向垂直方向增殖。如此结果，能够获得以覆盖网状膜片2开口的方式形成单层或多层由细胞4构成的细胞层的细胞膜片200。通过控制接种于网状膜片2上的细胞4的量以及/或者细胞4的增殖速度，可以控制细胞膜片200的厚度。细胞膜片200被网状膜片2所支撑，因此较为牢固结实，容易处理。

此外，细胞膜片200的构成为：具有至少两个由细胞4构成的细胞层，在所述两个细胞层之间配设有用于使细胞4附着并培养的基材即网状膜片2。即，细胞膜片200的两面由细胞4构成。因此，细胞膜片200与患部的贴合面就不限定于单面。另外，和使用培养皿或多孔膜作为支架的现有细胞膜片制造方法相比，使用细胞膜片制造装置100的细胞膜片制造方法优点在于，便于向细胞4供应营养，以及对细胞4的观察。此外，通过使用如网状膜片2所示具有图案化开口的膜片，能够再现性高地获得具有同样结构(换言之，同样性质)的细胞膜片200。

如图1的1040所示，容器20可以是形成有多个孔21的培养板。更具体而言，容器20是12孔培养板。这时，具备基座3的支撑体单元10是以可接触/分离地收纳于孔21中的方式而构成。

图2是用于说明细胞膜片制造装置100的效果的图。如图2的2010及2011所示，因为支撑体单元10相对于容器20可接触/分离地被收纳，所以即便将基座3上下方向翻转地收纳于容器20中，支撑体单元10仍然可以使用。因此，因为如果将支撑体单元10翻转，形成于网状膜片2上的细胞膜片也会翻转，所以容易用显微镜7对形成于网状膜片2上的细胞膜片两面进行观察。

此外，如图2的2020～2022所示，如果使用细胞膜片制造装置100，可以制作具有多种细胞层的细胞膜片。更具体而言，可以制作具有2层细胞层的细胞膜片，即由细胞4a构成的第一细胞层和由种类不同于细胞4a的细胞4b构成的第二细胞层。首先，如图2的2020所示，在细胞4a被接种于网状膜片2上的状态下将支撑体单元10浸渍于培养基6中。接着，如图2的2021所示，对支撑体单元10进行翻转，使上下颠倒。此时，网状膜片2的与细胞4a相反一侧的面变为上侧。因此，如果使用移液器5等从上侧将细胞4b的悬浮液滴加于网状膜片2上，还可以在网状膜片2的与细胞4a相反一侧的面上接种细胞4b(参照图2的2022)。如此一来，根据细胞膜片制造装置100的构成，细胞膜片中表面及背面的任一面均可追加接种细胞。另外，从容易对细胞膜片两面接种细胞的观点出发，如图2的2020～2022所示，优选环状构件1从筒状载置部3b突出并安装于基座3上。根据该构成，如果翻转支撑体单元10，则通过环状构件1的内侧面和网状膜片2会形成以网状膜片2为底面的有底筒部10b。因此，通过将细胞4b的悬浮液注入有底筒部10b中，可以将该悬浮液稳定地保持于网状膜片2上。

进而，根据细胞膜片制造装置100的构成，容易从支撑体单元10分离细胞膜片200。如图2的2030所示，通过在容器20内的培养基中培养细胞4，制作由细胞4构成的细胞膜片200。之后，如图2的2031所示，将支撑体单元10从容器20分离。然后，如图2的2032所示，从基座3的筒状载置部3b拆下环状构件1。借此，可以使用例如镊子8等将形成于网状膜片2上的细胞膜片200从基座3的筒状载置部3b拆下。这样容易从细胞膜片制造装置100拆卸的细胞膜片200，例如在移植细胞膜片时较为便利。

(改进例1)

对细胞膜片制造装置100的改进例进行说明。图3是表示作为改进例1的细胞膜片制造装置100A的构成、以及使用该细胞膜片制造装置100A制造细胞膜片的制造方法的图。图3的3010是表示细胞膜片制造装置100A所具备的基座3的构成例的立体图。此外，图3的3020～3024是表示使用细胞膜片制造装置100A制造细胞膜片的制造方法的图。图3的3030是表示细胞膜片制造装置100A所具备的盖体9的构成的剖面图。细胞膜片制造装置100A可以制造大面积细胞膜片。

如图3的3010所示，基座3可以设计为供直径3.5cm的培养皿用(6孔培养板用)、直径6cm的培养皿用、直径10cm的培养皿用。即，通过将基座3的筒状载置部3b的直径变大，可以使所制作的细胞膜片成为大面积。与之相伴，使网状膜片2的面积也大即可。

改进例1的细胞膜片制造装置100A的构成适于在这样大面积网状膜片2上保持悬浮液，制造大面积细胞膜片。如图3的3021～3024所示，细胞膜片制造装置100A的支撑体单元10A具备盖体9。盖体9是覆盖网状膜片2的一个面2a的构成。盖体9中设置有注入口9a，用于将包含细胞4的悬浮液注入网状膜片2和盖体9之间。更具体而言，盖体9配置成对网状膜片2中与筒状载置部3b相接触的面2a进行覆盖。网状膜片2与盖体9进行分离。网状膜片2和盖体9之间配置有筒状载置部3b。借助筒状载置部3b，网状膜片2和盖体9的间隔被保持为固定。

这里，设定网状膜片2与盖体9的间隔用于确保使细胞4的悬浮液与网状膜片2和盖体9的双方一边接触，一边注入网状膜片2与盖体9之间。网状膜片2与盖体9的间隔优选设定为1mm～3mm，更优选为1mm～2mm，尤其优选为1mm～1.5mm。

换言之，盖体9是用于封闭由网状膜片2和筒状载置部3b所形成的有底筒部10a的构件。盖体9可以是至少包括第一层9a和第二层9b的层叠结构。第一层9a是距离网状膜片2最远的层，第二层9b是距离网状膜片2最近的层。在图3的3030所示的构成中，盖体9是由第一层9a和第二层9b构成的2层结构。作为构成第一层9a的材料，可列举有机硅树脂等。此外，作为构成第二层9b的材料，可列举聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等。另外，盖体9可以是第一层9a及第二层9b中任一层的单层结构。

在使用细胞膜片制造装置100A制造细胞膜片的制造方法中，首先，要将支撑体单元配置于培养皿22内。该支撑体单元中未设置盖体9。此外，所述支撑体单元以网状膜片2位于筒状载置部3b下侧的方式配置为能上下翻转。如此一来，通过配置支撑体单元10，可形成有底筒部10a。该有底筒部10a通过网状膜片2和筒状载置部3b的内侧面而形成，以网状膜片2为底面(参照图3的3020)。接着，配置盖体9以封闭有底筒部10a的开放的上部，从而制作支撑体单元10A(参照图3的3021)。

继而，使用移液器5等，将细胞4悬浮于培养基6中的悬浮液从注入口9a注入有底筒部10a中(参照图3的3022)。此时，细胞4的悬浮液与网状膜片2和盖体9的双方一边接触，一边注入有底筒部10a内。因此，在所述悬浮液分别相对于盖体9以及网状膜片2的表面张力的作用下，能够防止所述悬浮液因重力通过网状膜片2而滴落。因此，即便网状膜片2为大面积，在所述悬浮液相对于盖体9的表面张力的作用下，所述悬浮液仍被保持在网状膜片2上(参照图3的3023)。如此一来，通过使悬浮液中的细胞4附着于网状膜片2上，可以在网状膜片2(例如大面积的网状膜片2)上均匀地接种细胞4。

其后，用培养基6充满整个培养皿22，对附着于网状膜片2上的细胞4进行培养(参照图3的3024)。

另外，上述方法中，在对有底筒部10a配置盖体9后再注入细胞4的悬浮液。但也可以先将细胞4的悬浮液注入有底筒部10a中，然后设置盖体9以防所述悬浮液从网状膜片2滴落。

(改进例2)

对细胞膜片制造装置100的其它改进例进行说明。图4是表示作为改进例2的细胞膜片制造装置100B的构成、以及使用该细胞膜片制造装置100B制造细胞膜片的制造方法的图。图4的4010是表示细胞膜片制造装置100B所具备的支撑体单元10B的构成的分解立体图。图4的4020～4022是表示使用细胞膜片制造装置100B制造细胞膜片的制造方法的图。

和改进例1一样，细胞膜片制造装置100B具备盖体9，可以制造大面积细胞膜片。在细胞膜片制造装置100B中，支撑体单元10B的构成与改进例1不同。如图4的4010所示，支撑体单元10B的基座3并非是筒状载置部3b从基座主体3a突出的构成。筒状载置部3b设置为形成于基座主体3a中的开口部。底面抵接部3e相对于基座主体3a向下方突出而设置，不向上方突出。此外，侧壁抵接部3f从基座主体3a沿水平方向伸展、设置。

还有，环状构件1具有与筒状载置部3b的内径大致相同的内径。因此，网状膜片2被环状构件1的下表面和基座主体3a的上表面所夹持。

另外，盖体9配置成对网状膜片2中与环状构件1相接触的面2b进行覆盖。网状膜片2与盖体9进行分离。网状膜片2和盖体9之间配置有环状构件1。借助环状构件1，网状膜片2和盖体9的间隔被保持为固定。盖体9是用于封闭由网状膜片2和环状构件1形成的有底筒部10b的构件。

在使用细胞膜片制造装置100B制造细胞膜片的制造方法中，首先，要将支撑体单元10B配置于培养皿22内。支撑体单元10B以网状膜片2位于环状构件1下侧的方式配置。通过这样的配置，在支撑体单元10B中形成有底筒部10b。该有底筒部10b通过网状膜片2和环状构件1的内侧面而形成，以网状膜片2为底面(参照图4的4020)。

接着，使用移液器5等将培养基6中悬浮有细胞4的悬浮液从注入口9a注入有底筒部10a中，在网状膜片2上接种细胞4(参照图4的4021以及4022)。其后，用培养基6充满培养皿22，进行细胞培养。

采用细胞膜片制造装置100B的结构，并不容易从支撑体单元10B分离所制作的细胞膜片。但是，可以通过使用剪刀或刀具从支撑体单元10B剪下细胞膜片。

关于使用本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置制作的细胞膜片，在培养基中可以从细胞膜片上表面和下表面的两个面供应营养。关于在培养皿上制作细胞膜片的现有方法，由于无法从细胞膜片的下表面供应营养，所以只能依赖于上表面的营养供应来培养细胞。因此，在细胞膜片的上表面的营养供应受到限制的状况下，会导致对细胞膜片内部细胞的营养供应不充分。

关于从细胞膜片上表面的营养供应受到限制的状况，例如存在制作皮肤膜片时的状况。在皮肤膜片的制造中，有时会在成纤维细胞层(真皮层)上形成角质细胞层(表皮层)，从而制作皮肤膜片。如此情况下，由于成熟的表皮细胞会形成紧密连接，皮肤膜片上部的营养供应受到阻碍。因此，如果采用在培养皿上制作细胞膜片的现有方法，难以制作由成纤维细胞层和真皮层构成的皮肤膜片。

图5是表示使用本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置制作的皮肤膜片剖面结构的示意图。11表示死去的角质细胞。12表示上述紧密连接。此外，13表示角质细胞。14表示皮肤成纤维细胞。如图5所示，对于使用本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置制作的皮肤膜片，即便来自上部的角质细胞13层的营养供应减少，仍有望从下部的皮肤成纤维细胞14层供应营养。因此，能够由构成皮肤膜片的角质细胞13及皮肤成纤维细胞14供应更多的营养。

此外，关于其它的现有技术，还已知有在多孔膜上制作由多个细胞层构成的皮肤膜片的方法。由于使用多孔膜，可以考虑从细胞膜片的下表面供应一定程度的营养。但通过该方法制作的细胞膜片难以直接用于移植。原因在于，向患部移植时，并不是将表皮层的面与患部接触，而是需要一边使真皮层的面与患部接触一边移植皮肤膜片，这就导致真皮层被夹在多孔膜和表皮层之间的细胞膜片无法用于移植。另一方面，使用本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置制作的皮肤膜片，不仅表皮层面而且真皮层面也是细胞存在于培养基侧，即露出在培养基中。因此，能够将皮肤膜片的真皮层面贴合于患部。

此外，紧密连接12也能观察到肠道细胞、血管内皮细胞等。因此，除了皮肤膜片以外，在要培养及使用包含要形成紧密连接12的肠道细胞、血管内皮细胞等的细胞膜片时，也可以使用本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置。

(改进例3)

对细胞膜片制造装置的改进例进行说明。图20及图21是表示作为改进例3的细胞膜片制造装置的支撑体单元60的图。另外，在图20及图21中，对于构成细胞膜片制造装置的容器，省略记载。

本实施方式的细胞膜片制造装置构成为：基座3(保持构件)以及环状构件1中的至少一方形成有对基座3和环状构件1以不分离的方式进行卡止的卡止部67，并且基座3以及环状构件1中的任一方形成有贯穿孔66，供对另一方进行按压的按压销65贯穿，通过对另一方的按压来解除卡止，基座3和环状构件1进行分离。另外，本实施方式的细胞膜片制造装置可以是具备按压销65的构成，也可以是不具备按压销65的构成。当本实施方式的细胞膜片制造装置为不具备按压销65的构成时，将按压销65作为细胞膜片制造装置另外的构成进行准备即可。

卡止部67是能够通过按压销65解除基座3和环状构件1的卡止的构成即可，并未限制具体构成。关于卡止部67的具体构成，例如可列举(ⅰ)形成于基座3及环状构件1的至少一方的表面、使基座3和环状构件1之间产生大的摩擦力的摩擦力产生区域，(ⅱ)形成于基座3的表面的凸部和形成于环状构件1的表面并卡止上述凸部向按压方向移动的卡止凸部的组合，(ⅲ)形成于环状构件1的表面的凸部和形成于基座3的表面并卡止上述凸部向按压方向移动的卡止凸部的组合，以及(ⅳ)上述(ⅱ)和(ⅲ)的组合。例如可以在基座3及环状构件1的至少一方的表面贴合能够产生期望的摩擦力的材料(例如橡胶)，从而形成摩擦产生区域。

贯穿孔66可以形成于基座3及环状构件1的任一方，但从支撑体单元60易处理的观点出发，优选形成于基座3上。

如果着眼于特定的贯穿孔66，当基座3上形成有该贯穿孔66时，可以是在与该贯穿孔66相向的环状构件1区域不形成贯穿孔的构成；当环状构件1上形成有该贯穿孔66时，可以是在与该贯穿孔66相向的基座3区域不形成贯穿孔的构成。如果是该构成，在贯穿孔66使按压销65贯穿，即可利用该按压销65对未形成贯穿孔的构成(基座3或环状构件1)进行有效地按压。

贯穿孔66的形状及数量并无限制。关于贯穿孔66的形状，例如可列举圆柱状、及方柱状等。每1个保持构件或每1个环状构件要形成的贯穿孔66的数量可以为偶数个，也可以是奇数个，但从大致均等地对基座3或环状构件1整体进行按压的观点出发，优选为偶数个。关于贯穿孔66的数量，例如可列举1～10个、或1～20个，可以根据基座3及环状构件1的大小适当设定贯穿孔66的数量。

更具体而言，在图20的20010及图20的20011中，箭头左侧的图为支撑体单元60的立体图。如后述的图21中也有详细所示，基座3中形成有用于载置网状膜片2的筒状载置部3b，网状膜片2的周边被筒状载置部3b和环状构件1所夹持。另外，支撑体单元60也可以在基座3或环状构件1上具备盖体(未图示)。

在图20的20010及图20的20011中，箭头右侧的图是通过在贯穿孔66使按压销65贯穿，按压环状构件1从而解除基座3和环状构件1的卡止后的支撑体单元60的分解立体图。在这些附图中，基座3上形成有贯穿孔66，并且在与该贯穿孔66相向的环状构件1区域未形成贯穿孔。因此，如果在贯穿孔66使按压销65贯穿，则能利用该按压销65有效地按压环状构件1，解除基座3和环状构件1的卡止。在这些附图中，作为示例，相对于基座3形成有4个贯穿孔66。如果在这些贯穿孔66使按压销65分别贯穿，则能大致均等地对环状构件1整体进行按压。

图21的21010为支撑体单元60的顶视图。图21的21011是该支撑体单元60于“A-A”位置的剖面图，是表示在贯穿孔66使按压销65贯穿时的各构成经时变化的剖面图。首先，如图21的21011的左侧所示，沿箭头方向将按压销65插入贯穿孔66中。接着，如图21的21011的中央所示，如果在贯穿孔66使按压销65贯穿，则按压销65会将环状构件1朝向下侧进行按压。最后，如图21的21011的右侧所示，按压销65将环状构件1朝向下侧进一步按压，从而解除基座3和环状构件1的卡止，基座3和环状构件1进行分离，其结果为，由筒状载置部3b和环状构件1所夹持的网状膜片2(具体为网状膜片2的周边)被拆下。

3.本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例2

对本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例2进行说明。图6是表示构成例2的细胞膜片制造装置所具备的支撑体单元30的简要构成的图。图6的6010～6013是表示支撑体单元30的组装步骤的立体图。图6的6020是表示支撑体单元30的简要构成的剖面图。

如图6的6010～6013、以及6020所示，支撑体单元30具备网状膜片2、一对框体31及32、夹具33(夹持构件)、保持构件34、以及间隔片35。保持构件34构成支撑体单元30的主体。通过网状膜片2、一对框体31及32、以及夹具33构成网状集合体A。

框体31及32是通过夹持网状膜片2从而对网状膜片2进行补强的构件。框体31及32配置成夹住网状膜片2的周边。此外，框体31及32相对于保持构件34可拆卸地被设置。

此外，如图6的6011所示，夹具33是通过夹持一对框体31及32从而使网状膜片2和一对框体31及32成为一体化的构件。通过该夹具33的夹持，框体31及框体32互不分离，以紧密贴合的状态被固定。

在一对框体31及32之间配置网状膜片2，利用夹具33固定框体31及32，从而构建网状集合体A(参照图6的6010～6012)。

保持构件34具有无底筒形状。保持构件34的内径比一对框体31及32的外径大。在保持构件34的内壁中互相相向的两个部分，分别形成有用于安装网状集合体A的安装部34a。安装部34a具有平板部34b及平板部34c。平板部34b及34c是互相分离，从保持构件34的内壁沿水平方向朝向内侧突出而被设置。将网状集合体A的周边部分插入平板部34b及平板部34c之间，从而将网状集合体A安装到保持构件34上。另外，在保持构件34的上端形成有沿水平方向突出的凸缘34d。

在将网状集合体A安装于保持构件34上的状态下，网状集合体A和平板部34b之间有间隙(参照图6的6013)。间隔片35是对网状集合体A和平板部34b之间进行填补的构件。通过该间隔片35卡止网状集合体A在保持构件34的安装部34a内的移动。因此，网状集合体A被稳定地保持于保持构件34内。

此外，间隔片35上设置有向上方突出并伸展的抓手35a。要从保持构件34分离网状集合体A时，使用者应抓住间隔片35的抓手35a，从保持构件34上拆下间隔片35。接着，从保持构件34分离网状集合体A。

图7是表示作为构成例2的细胞膜片制造装置100C的构成等的图。图7的7010～7012是表示使用细胞膜片制造装置100C制造细胞膜片的制造方法的图。此外，图7的7020～7022、7030以及7031是用于说明细胞膜片制造装置100C的效果的图。

在使用细胞膜片制造装置100C制造细胞膜片的制造方法中，首先，要将支撑体单元30收纳于容器23内。此时，按照网状集合体A最接近容器23底面的方式配置支撑体单元30(参照图7的7010)。

此外，保持构件34的凸缘34d的下表面与容器23的整个上端面抵接。还有，保持构件34的外径尺寸接近容器23的内径。并且，在保持构件34的外周面和容器23的内侧面之间形成有间隙，该间隙确保能相对于容器23拆卸保持构件34。通过这样的构成，使支撑体单元30以其在培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式被收纳于容器23中。

接着，在网状膜片2上接种细胞4(参照图7的7011)。细胞4的接种方法与使用细胞膜片制造装置100的方法相同，因此省略说明。

然后用培养基6充满整个容器23，对附着于网状膜片2上的细胞4进行培养。从而制作出细胞膜片200。

接下来，对细胞膜片制造装置100C的效果进行说明。如上所述，通过从保持构件34拆下间隔片35，将网状集合体A从保持构件34进行分离。分离的网状集合体A容易地上下翻转并安装到保持构件34上。因此，如图7的7020及7021所示，可以分别在网状膜片2的上表面及下表面接种不同种类的细胞4a及4b。进而，形成细胞膜片200后，容易地将细胞膜片200从集合体A分离。只需拆下夹具33，框体31及32便容易互相分离。因此，如果使框体31及32分离，便能很容易地取出细胞膜片200。另外，如图7的7030及7031所示，用显微镜7对网状膜片2的两面进行观察是可能的。

此外，在细胞膜片制造装置100C中，通过保持构件34的凸缘34d和容器23的上端面的抵接，支撑体单元30被保持在容器23内。凸缘34d是不与培养基6接触的部分。此外，间隔片35的抓手35a也是不与培养基6接触的部分。因此，在使用镊子将支撑体单元30移动到其它容器时，利用镊子使间隔片35向上方移动，因此，镊子能在不与培养基6接触的情况下移动支撑体单元30。进而，在容器23比较接近底部的位置培养细胞4时，即便移动支撑体单元30，细胞4也不会接触容器23。

另外，即使在容器23的底面培养不同于细胞4的细胞时，该细胞也不会接触支撑体单元30。即，在细胞膜片制造装置100C中，在(ⅰ)支撑体单元30的网状膜片2上以及(ⅱ)容器23的底面共培养互不相同的细胞时，支撑体单元30不会接触在容器23底面培养的细胞。进而，由于支撑体单元30是从容器23的上侧嵌入的结构，因此，支撑体单元30相对于容器23的位置稳定。

4.本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例3

对本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例3进行说明。图8是表示构成例3的细胞膜片制造装置100D的构成的图。图8的8010及8020是表示细胞膜片制造装置100D所具备的支撑体单元40的构成的图像。此外，图8的8030～8033是表示使用细胞膜片制造装置100D制造细胞膜片的制造方法的图。

支撑体单元40是相对于孔24(容器)可接触/分离地被收纳的柱形态。支撑体单元40具备网状膜片2和柱主体41。柱主体41的下表面由网状膜片2构成。此外，通过将柱主体41的凸缘部分放置于孔24上，使柱主体41以其在培养基6中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式被收纳于孔24中(参照图8的8030)。另外，支撑体单元40例如可以通过从市售的Transwell(注册商标)的柱除去多孔质膜，粘贴网状膜片2而制作得到。

通过使用细胞膜片制造装置100D，相对于所制作的细胞膜片，容易进行液相-气相培养。例如，在皮肤膜片的制造中，首先如图8的8031所示，在网状膜片2上接种皮肤成纤维细胞14，在培养基6中进行培养。接着，如图8的8032所示，进而在由生长发育的皮肤成纤维细胞14构成的层上接种角质细胞13，在培养基6中进行培养，从而制作出皮肤膜片。如图8的8033所示，所制作的皮肤膜片可以确保在皮肤成纤维细胞14与培养基相接，且角质细胞13的一部分与气体相接的状态下进行培养，即可以实施液相-气相培养。

5.本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例4

对本实施方式所涉及的细胞膜片制造装置的构成例4进行说明。图9是表示构成例3的细胞膜片制造装置100E的构成的图。图9的9010是表示细胞膜片制造装置100E所具备的支撑体单元50的构成的立体图。此外，图9的9011是表示细胞膜片制造装置100E的构成的图像。

如图9的9011所示，在细胞膜片制造装置100E中，作为容器使用形成有多个孔25a的孔板26。在图9的9011所示的构成中，孔板26为12孔培养板。支撑体单元50相对于这样的孔板26可接触/分离地被收纳。支撑体单元50具备网状膜片2和柱主体51。

柱主体51具有第一圆环部51a、支脚部51b、以及第二圆环部51c。支脚部51b是对第一圆环部51a和第二圆环部51c之间进行连结的部分。第一圆环部51a和第二圆环部51c按照中心轴一致的方式进行配置。

第一圆环部51a的外径比孔板25的孔25a的内径大。并且，第二圆环部51c的内径比第一圆环部51a的内径小。第二圆环部51c的底部被网状膜片2封闭。

在细胞膜片制造装置100E中，通过将柱主体51的第一圆环部51a放置于孔25a上，使柱主体51以其在培养基6中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式被收纳于孔25a中。另外，细胞悬浮液被注入由第二圆环部51c的内侧面及支脚部51b的内侧面和网状膜片2所形成的空间内。

此外，在细胞膜片制造装置100E中，通过将柱主体51的第一圆环部51a放置于孔25a上，使支撑体单元50被保持在孔25a内。第一圆环部51a是不与培养基6接触的部分。因此，在使用镊子将支撑体单元50移动到其它的孔25a时，利用镊子夹住第一圆环部51a，因此，镊子能在不与培养基6接触的情况下移动支撑体单元50。进而，在孔25a的比较接近底部的位置培养细胞时，即便移动支撑体单元50，细胞4也不会接触孔25a。另外，在细胞膜片制造装置100E中，在(ⅰ)支撑体单元50的网状膜片2上以及(ⅱ)孔25a的底面共培养互不相同的细胞时，支撑体单元50不会接触在孔25a的底面培养的细胞。

此外，在细胞膜片制造装置100E中，网状膜片2的位置是通过第一圆环部51a及支脚部51b稳定地被保持。因此，根据细胞膜片制造装置100E，孔25a内的支撑体单元50在垂直方向及水平方向的位置被更稳定地保持。

〔总结〕

根据上述的构成，所述支撑体单元可接触/分离地收纳于容器中。因此，使用者能从容器取出所述支撑体单元进行翻转后再次收纳到容器中，从而能够容易地对所述支撑体单元进行翻转。如将所述支撑体单元翻转，形成于由所述支撑体单元的保持构件所保持的网状膜片上的细胞膜片也会翻转。因此，根据上述的构成，容易地用显微镜对形成于所述网状膜片上的细胞膜片的两面进行观察。

进而，支撑体单元以其在培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式收纳于容器中，因此，在用显微镜对细胞膜片的观察中，网状膜片在容器内的位置，换言之形成于网状膜片上的细胞膜片的位置不会发生变化。因此，根据上述的构成，能够精密地观察细胞膜片。

在本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置中，优选所述保持构件可拆卸地保持所述网状膜片。

根据上述的构成，能够容易地将形成于所述网状膜片上的细胞膜片从支撑体单元分离。

在本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置中，优选:在所述保持构件上形成有载置所述网状膜片的筒状载置部，所述支撑体单元具备环状构件，其具有环绕所述筒状载置部的外周的形状，相对于所述保持构件可拆卸地被设置，所述网状膜片的周边被所述筒状载置部和所述环状构件所夹持。

根据上述的构成，将环状构件安装于保持构件上，通过用筒状载置部和环状构件夹持网状膜片的周边，从而能够将网状膜片稳定地载置于筒状载置部上。另一方面，通过从保持构件上拆下环状构件，以解放筒状载置部和环状构件所夹持的网状膜片的周边，从而能够容易地将载置于筒状载置部上的网状膜片进行拆卸。

在本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置中，优选:在所述保持构件以及所述环状构件中的至少一方形成有对所述保持构件和所述环状构件以不分离的方式进行卡止的卡止部，并且在所述保持构件以及所述环状构件中的任一方形成有贯穿孔，供对另一方进行按压的按压销贯穿，通过对所述另一方的按压来解除所述卡止，所述保持构件和所述环状构件进行分离。

根据上述的构成，通过将按压销插入贯穿孔，用按压销按压所述保持构件或所述环状构件，以解除保持构件和环状构件的卡止，从而能够容易地将载置于筒状载置部上的网状膜片进行拆卸。

在本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置中，优选:所述支撑体单元具备一对框体和夹持构件，所述一对框体是相对于所述保持构件可拆卸地被设置，配置成夹住所述网状膜片的周边；所述夹持构件是通过夹持所述一对框体从而使所述网状膜片和所述一对框体进行一体化。

根据上述的构成，由于配置成夹住网状膜片周边的一对框体相对于保持构件可拆卸地被设置，因此，通过将一对框体从保持构件分离，从而能够容易地对一对框体所保持的所述网状膜片进行拆卸。

在本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置中，优选所述保持构件的比重比所述培养基大。

根据上述的构成，由于保持构件的比重比培养基大，因此，培养基中的保持构件以及由保持构件所保持的网状膜片上所形成的细胞膜片在垂直方向以及水平方向的位置被稳定地维持。

在本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置中，优选:所述支撑体单元具备盖体，该盖体对所述网状膜片的一个面进行覆盖并且设置有将包含所述细胞的悬浮液注入所述网状膜片和所述盖体之间的注入口，设定所述盖体和所述网状膜片的间隔以使所述悬浮液与所述网状膜片和所述盖体的双方一边接触，一边注入所述网状膜片与所述盖体之间。

根据上述的构成，设定盖体和网状膜片的间隔以使悬浮液与网状膜片和盖体的双方一边接触，一边注入网状膜片与盖体之间。这样的情况下，能够一边抑制包含细胞的悬浮液通过网状膜片向网状膜片的下侧移动，能够将该悬浮液横向一边摊开。因此，即便使网状膜片的面积增大，仍能在网状膜片上均匀地摊开包含细胞的悬浮液，能够容易地使用大面积的网状膜片进行细胞培养。

在本发明一方面所涉及的细胞膜片制造装置中，优选所述网状膜片的开口部为沿一方向伸长的形状。

如上述的构成所述，当网状膜片的开口部为沿一方向伸长的形状时，开口部具有向一方向伸长的大壁面。与该壁面粘附并增殖的细胞数量多，并且增殖时具有相同的方向性，因此，根据上述的构成，能够将增殖的细胞的方向性控制为开口部的伸长方向。

根据上述的构成，能够充分确保细胞膜片的厚度并提高细胞膜片的强度。此外，根据上述的构成，能够提供具有多种细胞层的细胞膜片。

实施例

〔实施例1：使用构成例1的细胞膜片制造装置培养细胞〕

<支撑体单元10的制作>

制作收纳于12孔培养板中的基座3的设计图，根据该设计图，使用3D打印机AGILISTA-3200(基恩士)制作基座3。使用实验室涂布机PDS-2010(日本Parylene)，用生物相容性优异的派瑞林(DPXC，CAS No.28804-46-8)(日本Parylene)覆盖3D打印造型物(基座3)。网状膜片2使用聚酯制微型网状膜片(AG00Z3N9)(天池合纤)。

此外，环状构件1使用由PDMS(聚二甲基硅氧烷)(商品名：SILPOT 184，东丽道康宁)构成的2mm板制作。2mm的PDMS板的制作方法如下所述。首先，将主剂与固化剂按10:1的比率混合，将混合的PDMS溶液流入培养皿中，以确保厚度为2mm，然后加热使其固化。针对所完成的厚度2mm的PDMS板，使用直径8mm及直径6mm的两个活检穿孔器(贝印工业)制作环(外径8mm、内径6mm)。

用70％乙醇对按照上述那样制作的环状构件1、网状膜片2以及基座3进行清洗、风干，然后在超净工作台中进行组装，完成支撑体单元10。对完成的支撑体单元10进行UV处理30分钟，然后将支撑体单元10收纳到12孔培养板的各孔中。

<细胞培养条件>

从JCRB细胞库(大阪)获取来自人肺的正常成纤维细胞的Tig-1-20细胞(产品编号JCRB0501)。使用含有10％胎牛血清(FBS)(GIBCO)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素(GIBCO)的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)(GIBCO)对Tig-1-20细胞进行培养。在37℃、5％二氧化碳(CO₂)条件下的培养箱内对Tig-1-20细胞进行培养。

从理化学研究所生物资源中心(RIKEN BRC)获取HepG2细胞(产品编号RCB1886)。使用含有10％胎牛血清(FBS)(GIBCO)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素(GIBCO)的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)(GIBCO)对HepG2细胞进行培养。在日本理化所生物资源中心(37℃、5％二氧化碳(CO₂))条件下的培养箱内对HepG2细胞(产品编号RCB1886)进行培养。

从Promo Cell公司获取来自人脂肪组织的间充质干细胞(Human MesenchymalStem Cells from Adipose Tissue)。使用间充质干细胞增殖培养基2(Promo Cell公司)对来自人脂肪组织的间充质干细胞进行培养。在37℃、5％二氧化碳(CO₂)条件下的培养箱内对来自人脂肪组织的间充质干细胞进行培养。

<细胞接种和显微镜观察>

在支撑体单元10的网状膜片2(直径4mm圆形区域)上接种0.5×10⁵个(按1×10⁶cells/mL接种50μL)Tig-1-20细胞、HepG2细胞、或者间充质干细胞。接种5小时后，对装有支撑体单元10的孔加入培养基3mL。培养基3天更换1次(3mL/well)。使用数字显微镜或倒置相差显微镜拍摄细胞照片。

使用光学相干断层成像系统Cell3imager Estier(SCREEN Holdings)对培养16天的Tig-1-20细胞膜片、HepG2细胞膜片、以及间充质干细胞膜片进行分析。

关于Tig-1-20细胞，在细胞接种前用胶原蛋白溶液覆盖网状膜片2。更具体而言，用1mM HCl溶液对胶原蛋白酸性溶液I-AC 5mg/mL(高研)稀释15倍，将稀释后的胶原蛋白溶液50μL放置于网状膜片2上。在37℃静置30分钟，然后除去稀释过的胶原蛋白溶液。然后，用PBS(-)清洗2次，在细胞接种前放置于37℃培养箱内保管。

<结果>

图10的1010为细胞接种1天后支撑体单元10的显微镜图像。将50μL细胞悬浮液坚实地保持于网状膜片2上(左图)。向孔中加入培养基，并保证不会出现间隙中产生气泡等问题(中央图)。进而，也能够对支撑体单元10上下翻转(右图)。

确认网状膜片2上能够培养Tig-1-20细胞、HepG2细胞、以及间充质干细胞(图10的1011)。Tig-1-20细胞对网状膜片2的粘附性弱，因此用涂布溶液覆盖网状膜片2。通过用胶原蛋白溶液进行涂布，即使5小时后添加培养基，也确认细胞膜片没有从网状膜片脱离。

另外，使用光学相干断层成像系统对培养16天的Tig-1-20细胞膜片、HepG2细胞膜片、以及间充质干细胞膜片进行分析的结果示于图11。如图11所示，可知Tig-1-20细胞膜片表面和间充质干细胞膜片表面平坦，而HepG2细胞膜片并不平坦。在从单侧的光学相干断层成像系统分析中，能够分析为HepG2细胞膜片及间充质干细胞膜片在网状膜片2平面附近都平整。由于Tig-1-20细胞膜片比其它细胞膜片要薄，因此通过单侧观察仍能对其细胞膜片表面进行分析(图11)。

〔实施例2：使用构成例1的细胞膜片制造装置制作由3种细胞构成的细胞膜片〕

<细胞培养条件>

细胞培养条件和实施例1相同。

<在支撑体单元10的网状膜片2上接种细胞>

用胶原蛋白涂布支撑体单元10(12孔培养板用)的网状膜片2。之后，对该网状膜片2接种用CellBrite Green Cytoplasmic Membrane-Labeling Kit(稀释80倍；Biotium,Inc.)染色的Tig-1-20细胞4×10⁵个(按1×10⁷cells/mL使用40μL)进行接种。5小时后对孔中加入含有FBS的DMEM培养基3mL。2天后，从Tig-1-20细胞上接种用CellBrite RedCytoplasmic Membrane-Labeling Kit(稀释120倍；Biotium,Inc.)染色的间充质干细胞(MSC)4×10⁵个(按1.6×10⁷cells/mL使用25μL)进行接种。然后，将培养基置换为间充质干细胞用培养基。第二天，将支撑体单元10上下翻转(设置为相反)，从Tig-1-20细胞上接种用0.025mg/mL Dil(1,1-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)染色的HepG2细胞4×10⁵个(按1.6×10⁷cells/mL使用25μL)进行接种。第二天，用PBS(-)清洗细胞，然后浸渍于4％PFA中，在室温静置50分钟。用PBS(-)清洗后，将细胞膜片连同封固剂VECTASHIELD(VECTOR)一同固定于盖玻片和载玻片之间。详细而言，为了防止盖玻片压坏细胞膜片，将约100微米厚的Kapton胶带层叠3片后放置于盖玻片和载玻片之间。用共聚焦显微镜LSM 800(ZEISS)对所固定的细胞膜片进行分析。

<结果>

图12的1210～1212表示本实施例的结果。如图12的1210～1212所示，能够在Tig-1-20细胞膜片之上制作了间充质干细胞膜片。进而，能够在Tig-1-20细胞膜片之下制作了HepG2细胞膜片。细胞膜片的整体厚度约为140-150μm。结果表明，(ⅰ)能够从支撑体单元10的上下两侧接种细胞，(ⅱ)能够制作由多种细胞构成的细胞膜片。

〔实施例3：使用构成例2的细胞膜片制造装置培养人皮肤成纤维细胞〕

<支撑体单元30的制作>

支撑体单元30中除网状膜片2以外的各种构件采用3D打印机AGILISTA-3200制作。用派瑞林(DPXC，CAS No.28804-46-8)覆盖所制作的上述各种构件。网状膜片2使用聚酯制微型网状膜片(AG00Z3N9)(天池合纤)。作为对照组，也制作将网状膜片2替换为Transwell(注册商标)所使用的多孔膜(Transwell聚碳酸酯膜，0.4μm pore size，康宁公司)并安装而成的支撑体单元30。

<细胞培养条件>

从Promo Cell公司购买正常成人皮肤成纤维细胞(Normal Human DermalFibroblasts:NHDF)，使用成纤维细胞增殖培养基2(Promo Cell公司)进行培养。正常成人皮肤成纤维细胞是在37℃、5％二氧化碳(CO2)条件下的培养箱内进行培养。

<细胞接种和显微镜观察>

在支撑体单元30的网状膜片2上接种1.65×10⁶个(按3×06cells/mL使用550μL/膜片)NHDF。约18小时后加入培养基。3天更换1次培养基，培养14天(6mL/well)。拍摄细胞的倒置相差显微镜图像(图11A)。另外，制作HE染色切片(新组织科学)，用BZ-X710 All-in-one(基恩士)拍摄细胞膜片的剖面图(图13的1311)。

<结果>

结果如图13的1310以及1311所示。NHDF以堵住网状膜片2网眼的形式存在，并以覆盖网状膜片2的网格线的方式存在。关于由网状膜片2制作的细胞膜片和由多孔膜制作的细胞膜片的双方，细胞膜片表面都均匀、光滑。由网状膜片2制作的细胞膜片是与由多孔膜制作的细胞膜片不同，细胞膜片的下表面为细胞裸露在外。因此，便于供应营养及观察细胞，同时在医学移植时便于贴合细胞膜片。

〔实施例4：使用构成例2的细胞膜片制造装置培养Tig-1-20细胞〕

<支撑体单元30的制作>

本实施例的支撑体单元30的制作方法和实施例3相同。但是，本实施例的支撑体单元30是只有保持构件34的结构和实施例3存在部分不同。在本实施例中，保持构件34没有用于从外侧向内侧容易流入培养基的空隙(参照图14的1410)。

另外，Tig-1-20细胞的培养条件(培养基的组成)和实施例1相同。但是，本实施例中不对网状膜片2进行涂布。

<Tig-1-20细胞接种和显微镜观察>

将用CellBrite Green Cytoplasmic Membrane-Labeling Kit(稀释100倍；Biotium,Inc.)染色或未染色的4×10⁶个(按8×10⁶cells/mL使用500μL/mesh)Tig-1-20细胞接种到根据<支撑体单元30的制作>所制作的支撑体单元30的网状膜片2上。然后，培养17小时后对孔中加入6mL的培养基。3天后更换1次培养基。在培养开始后的第6天，清洗所制作的细胞膜片，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞，清洗后固定到包含DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)的封固剂VECTA中。使用共聚焦显微镜LSM 800(ZEISS)对所固定的细胞膜片进行分析。另一方面，制作由4％PFA和1％甲醛固定且未荧光染色的细胞膜片的HE染色切片(新组织科学)，用BZ-X710 All-in-one(基恩士)拍摄剖面图。

<来自人iPS细胞的心肌细胞接种和显微镜观察>

在上述实验中，为了从未用于分析的Tig-1-20细胞膜片(培养6天)上追加接种来自人iPS细胞的心肌细胞，将孔内的培养基置换为4mL的MiraCell CM Culture Medium。接种用0.025mg/mL DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)染色的1.8×10⁵个来自人iPS细胞的心肌细胞。约16小时后追加2mL培养基。其后，与Tig-1-20细胞一同培养3天，和上述同样地固定细胞，并用共聚焦显微镜进行分析。

<结果>

结果如图14的1420～1423所示。如图14的1420所示，Tig-1-20细胞依照微型网状膜片的网眼形状定向。即，大致平行于长方形网眼的长边进行定向。在微型网状膜片平面以外的地方存在的细胞，即在微型网状膜片平面之上或之下的平面存在的细胞也沿和在微型网状膜片平面存在的细胞相同的方向定向。细胞膜片的厚度约为50μm(图14的1421)。此外，从Tig-1-20细胞膜片之上追加接种来自人iPS细胞的心肌细胞的结果，心肌细胞也沿和Tig-1-20细胞相同方向定向。这些结果表明，通过使用微型网状膜片培养细胞，有能够控制三维细胞膜片的方向性的情况(图14的1422及1423)。

〔实施例5：使用改进例2的细胞膜片制造装置培养Tig-1-20细胞〕

<方法>

<支撑体单元10B的制作以及细胞培养条件>

环状构件1及基座3是使用3D打印机AGILISTA-3200制作。然后，用派瑞林(DPXC,CAS No.2880 4-46-8)覆盖所制作的环状构件1以及基座3。网状膜片2使用聚酯制微型网状膜片(AG00Z3N9)(天池合纤)。用环状构件1和基座3夹住网状膜片2，使用PDMS溶液进行粘附。对完成的支撑体单元10B实施乙醇处理以及UV处理后，将支撑体单元10B放入10cm的培养皿22中。在实验中使用的支撑体单元10B中，使用1mm的PDMS板调节从培养皿22的底面到网状膜片2的距离，使距离为2.5mm(图15的1510)。

Tig-1-20细胞的培养条件(培养基的组成)和实施例1相同，但不对网状膜片2进行涂布。

<Tig-1-20细胞接种和显微镜观察>

首先，将3mL的Tig-1-20细胞(6×10⁵cells/mL)放置于网状膜片2之上。然后，从上放置盖体9。继而，从盖体9的注入口9a加入5mL细胞悬浮液，用细胞悬浮液填充盖体9和网状膜片2的间隙。细胞接种3天后，对装有支撑体单元10B的10cm培养皿22中加入25mL培养基后，除去盖体9。3天更换1次培养基(35mL培养基/培养皿)，从细胞接种14天后结束培养。

如图15的1511所示，使用刀具从支撑体单元10B剪下细胞膜片。用phosphatebuffered saline(PBS)(-)对剪下的细胞膜片的一部分进行清洗后，用4％PFA处理20分钟，并用DiI进行染色(37℃，1小时)。用PBS(-)清洗后，将细胞膜片连同包含DAPI的封固剂VECTASHIELD(VECTOR)一同固定于盖玻片和载玻片之间。用共聚焦显微镜LSM 800(ZEISS)对所固定的细胞膜片进行分析。

用PBS(-)对由支撑体单元10B所制作的细胞膜片的一部分进行清洗后，用4％PFA处理20分钟并固定。接着，用50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、约100％的乙醇各处理5分钟，之后风干。然后使用低真空扫描电子显微镜Miniscope TM3030Plus(日立)观察细胞膜片。

调查在支撑体单元10B中培养的、构成细胞膜片的细胞的存活率。用PBS(-)对从支撑体单元10B剪下的细胞膜片约一半进行清洗，用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理7分钟(37℃)，除去胰蛋白酶后，悬浮于培养基10mL中。使用Countess ll Automated Cell Counter(Thermo Fisher Scientific)测量细胞存活率。

<结果>

结果如图15的1512、图16的1611及1612、以及图17的1711及1712所示。使用支撑体单元10B对Tig-1-20细胞培养14天(图15的1512)。用共聚焦显微镜对细胞膜片的剖面进行分析的结果，厚度约为40-45μm(图16的1611及1612)。Tig-1-20细胞依照网状膜片2的网眼形状定向。即，大致平行于长方形网眼的长边进行定向。在网状膜片2的平面没有的细胞也沿相同方向定向。

为了能用电子显微镜观察细胞膜片，对细胞膜片进行乙醇处理。该处理可能会导致细胞膜片收缩、变薄，但确认了细胞无间隙地堵住网状膜片2的开口部(图17的1711)。使用胰蛋白酶-EDAT溶液和台盼蓝溶液，调查构成由支撑体单元10B所制作的三维细胞膜片的细胞的存活率，结果发现约92％的细胞存活(图17的1712)。即，即便三维培养，也有大量的细胞存活。

〔实施例6：使用构成例4的细胞膜片制造装置培养HepG2细胞〕

<方法>

<支撑体单元50的制作>

支撑体单元50的柱主体51是使用3D打印机AGILISTA-3200制作。然后，用派瑞林(DPXC,CAS No.28804-46-8)覆盖所制作的柱主体51。网状膜片2使用聚酯制微型网状膜片(AG00Z3N9)(天池合纤)。使用PDMS溶液将网状膜片2粘附到柱主体51。对所完成的支撑体单元50进行乙醇处理并风干后，放入孔板25(12孔培养板)的孔25a中进行UV处理。

<细胞培养条件>

HepG2细胞(产品编号RCB1886)是从理化学研究所生物资源中心(RIKEN BRC)获取。使用含有10％胎牛血清(FBS)(GIBCO)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素(GIBCO)的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)(GIBCO)对HepG2细胞进行培养。细胞是在37℃、5％二氧化碳(CO₂)条件下的培养箱内进行培养。

<细胞接种和细胞观察>

将1×10⁵个(2X×10⁶cells/mL×50μL/mesh)的HepG2细胞接种到支撑体单元50的网状膜片2上(

的圆)。细胞接种6小时后，对孔25a加入培养基2mL。培养基2天更换1次(2mL/well)。作为对照，将1×10⁵个HepG2细胞接种到孔板25(12孔培养板)的孔25a中。

<基因表达分析>

在从开始培养的第10天，从HepG2细胞提取RNA。RNA的提取是使用TRIzol RNAIsolation Reagents(Thermo Fisher Scientific)进行，使用提取出的RNA和ReverTraAce qPCR RT Kit(东洋纺)合成cDNA。使用所获得的cDNA样品、DNA引物、PowerUp SYBRGreen Master Mix(APPLIED BIOSYSTEMS)、以及QuantStudio 5Real-Time PCR System(APPLIED BIOSYSTEMS)进行基因表达分析。对作为人肝脏的成熟标志物而为人们熟知的白蛋白及药物代谢酶CYP1A2的基因表达水平进行分析。关于各基因的表达水平，使用作为管家基因而为人们熟知的18SrRNA的表达水平进行标准化。数值为平均±SE(N＝3)。

<结果>

图18的1810表示HepG2细胞的显微镜图像。HepG2细胞在6小时以内粘附到网状膜片2。图18的1811表示基因表达分析的结果。和在常规的孔(2D)上培养HepG2细胞的情况相比较，在支撑体单元50的网状膜片2上(Mesh)培养HepG2细胞时的白蛋白及CYP1A2的基因表达量更高。

〔实施例7：使用构成例4的细胞膜片制造装置培养来自人iPS细胞的心肌细胞〕

<方法>

<细胞培养条件>

来自人iPS细胞的心肌细胞(MiraCell Cardiomyocytes from ChiPSC12，TaKaRa)是依照产品说明书，使用MiraCell CM Culture Medium在37℃、5％CO₂存在下对进行培养。在涂布有人纤连蛋白的培养皿之上进行培养。

<细胞接种和细胞观察>

接种细胞之前，用人纤连蛋白涂布支撑体单元50的网状膜片2。用PBS(+)对稀释20倍的纤连蛋白溶液(最终浓度0.05mg/mL)进行调整。将50μL的已稀释的纤连蛋白溶液放置于网状膜片2之上，在37℃静置1小时以上。

除去纤连蛋白溶液，将2×10⁴个(4×10⁵cells/mL×50μL/mesh)的心肌细胞接种到支撑体单元50的网状膜片2上(

的圆)。6小时后对孔25a加入培养基2mL，培养心肌细胞。培养基是2天更换1次(2mL/well)。

<结果>

结果如图19所示。确认了支撑体单元50的网状膜片2上粘附心肌细胞并增殖。心肌细胞即使培养8天仍保持有搏动功能。

产业上的利用可能性

本发明能够用于制作在再生医疗及移植等领域使用的细胞膜片。

符号说明

1 环状构件

2 网状膜片

3 基座(保持构件)

3b 筒状载置部

4、4a、4b 细胞

9 盖体

9a 注入口

10、10A、10B、30、40、50、60 支撑体单元

20、23 容器

21、24、25a 孔(容器)

22 培养皿(容器)

25、26 孔板(容器)

31、32 框体

33 夹具(夹持构件)

41、51 柱主体(保持构件)

65 按压销

66 贯穿孔

67 卡止部

100、100A、100B、100C、100D、100E 细胞膜片制造装置

200 细胞膜片

Claims

1.细胞膜片制造装置，其特征在于，具备：容器，其收纳用于培养细胞的培养基；以及

支撑体单元，其可接触/分离地收纳于所述容器中，具有使所述细胞附着并培养的基材即网状膜片，以及将该网状膜片保持为从所述容器的底面浮起的保持构件；

所述支撑体单元以其在所述培养基中垂直方向及水平方向的位置均固定的方式收纳于所述容器中。

2.根据权利要求1所述的细胞膜片制造装置，其特征在于，所述保持构件可拆卸地保持所述网状膜片。

3.根据权利要求2所述的细胞膜片制造装置，其特征在于，所述保持构件上形成有载置所述网状膜片的筒状载置部，

所述支撑体单元具备环状构件，其具有环绕所述筒状载置部的外周的形状，相对于所述保持构件可拆卸地被设置，

所述网状膜片的周边被所述筒状载置部和所述环状构件所夹持。

4.根据权利要求3所述的细胞膜片制造装置，其特征在于，所述保持构件以及所述环状构件中的至少一方形成有对所述保持构件和所述环状构件以不分离的方式进行卡止的卡止部，

所述保持构件以及所述环状构件中的任一方形成有贯穿孔，供对另一方进行按压的按压销贯穿，

通过对所述另一方的按压来解除所述卡止，所述保持构件和所述环状构件进行分离。

5.根据权利要求2所述的细胞膜片制造装置，其特征在于，所述支撑体单元具备：

一对框体，相对于所述保持构件可拆卸地被设置，配置成夹住所述网状膜片的周边；以及

夹持构件，通过夹持所述一对框体从而使所述网状膜片和所述一对框体成为一体化。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞膜片制造装置，其特征在于，所述保持构件的比重比所述培养基大。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞膜片制造装置，其特征在于，所述支撑体单元具备盖体，该盖体对所述网状膜片的一个面进行覆盖并且设置有将包含所述细胞的悬浮液注入所述网状膜片和所述盖体之间的注入口，

设定所述盖体和所述网状膜片的间隔以使所述悬浮液与所述网状膜片和所述盖体的双方一边接触，一边注入所述网状膜片与所述盖体之间。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞膜片制造装置，其特征在于，所述网状膜片的开口部为沿一方向伸长的形状。

9.细胞膜片，其特征在于，具有至少两个细胞层，

在所述两个细胞层之间配设有使细胞附着并培养的基材即网状膜片。