WO2007055056A1 - 組織体形成方法及び組織体形成キット - Google Patents

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WO2007055056A1
WO2007055056A1 PCT/JP2006/315930 JP2006315930W WO2007055056A1 WO 2007055056 A1 WO2007055056 A1 WO 2007055056A1 JP 2006315930 W JP2006315930 W JP 2006315930W WO 2007055056 A1 WO2007055056 A1 WO 2007055056A1
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tissue
center
adjacent
cells
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PCT/JP2006/315930
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Inventor
Kohji Nakazawa
Original Assignee
Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry, Science And Technology
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices

Definitions

  • the present invention relates to the formation of a three-dimensional tissue including cells, and more particularly to control of the size of a three-dimensional tissue including proliferating cells.
  • a cultured cell aggregates three-dimensionally to form a tissue body, for example, it is longer than a case where a so-called monolayer is formed by two-dimensionally adhering to a substrate surface. It has been reported that it survives for a long time and expresses its original function in vivo at a higher level. For this reason, technologies for forming 3D tissues from cultured cells are expected to be applied to, for example, simulators that reproduce the behavior of living organisms, alternative technologies for animal experiments in drug development, and regenerative medical technologies using cell transplantation. Speak.
  • Patent Document 1 discloses that primary hepatocytes are cultured in the well by culturing the primary hepatocytes in a cell having a non-cell-adhesive surface formed on a substrate. Is described as forming a three-dimensionally aggregated organization. In this Patent Document 1, it is described that the size of a tissue body is controlled by changing the number of cells placed in a well.
  • Patent Document 2 after endothelial cells are two-dimensionally cultured in a plurality of small regions regularly arranged on the surface of a substrate, the primary liver is formed on the endothelial cell monolayer. It is described that by culturing cells, a tissue body in which the primary hepatocytes are three-dimensionally assembled on the monolayer is formed. Patent Document 2 describes that the interval between a plurality of small regions should be set to a predetermined value or more in order to prevent adhesion between a plurality of tissue bodies formed adjacent to each other.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3270286
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 03Z010302
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a tissue body formation method and a tissue body formation kit capable of controlling the size of a three-dimensional tissue body containing proliferative cells. One of them.
  • a tissue body forming method for forming a three-dimensional tissue body including proliferative cells, and has a predetermined area.
  • the size of the three-dimensional tissue formed in the specific surface region in the culturing step is controlled according to the distance by changing the distance of the base material prepared in the preparing step. To do.
  • the specific surface area and the adjacent surface area may be cell adhesive.
  • a portion of the surface of the base material that surrounds the specific surface region is thin. It may be non-cell-adhesive.
  • the specific surface region and the adjacent surface region are bottom surfaces of the bottomed holes formed in the base material and are non-cell-adhesive.
  • a plurality of the base materials having different distances are prepared.
  • the three-dimensional tissue bodies having different sizes between the plurality of substrates may be formed on the specific surface regions of the plurality of substrates according to the distance.
  • the preparation step the plurality of base materials are prepared so that the distance regularly changes between the plurality of base materials, and in the culturing step, the specific surfaces of the plurality of base materials It is good also as forming the three-dimensional organization body in which the size changed regularly according to the distance between the plurality of base materials in the region.
  • a substantially spherical three-dimensional tissue body having a diameter corresponding to the distance may be formed in the specific surface region. Further, the specific surface area and the plurality of adjacent surface areas are located in a polygon formed by connecting the center of gravity of the specific surface area to the center of gravity of each of the plurality of adjacent surface areas. It may be arranged as follows. Further, the method may further include a step of obtaining calibration data indicating a correlation between the distance of the base material prepared in the preparation step and the size of the three-dimensional tissue formed in the culture step. ,.
  • a method for forming a tissue body according to an embodiment of the present invention includes:
  • a first surface region and a plurality of second surface regions arranged adjacent to the first surface region
  • Each of the plurality of second surface regions arranged such that the distances from the respective centroid points to the centroid points of the first surface region are equal to each other.
  • V a determination process for determining the distance for forming a three-dimensional tissue of a desired size, a specific surface area having the predetermined area and capable of holding the cells, and adjacent to the specific surface area
  • the calibration data may be calibration data acquired using a tissue body formation method including the calibration data acquisition step.
  • the tissue body formation kit is a tissue body formation kit for forming a three-dimensional tissue body containing proliferative cells, A first specific surface region having a predetermined area and capable of holding the cells, and a plurality of first adjacent surface regions arranged adjacent to the first specific surface region and having the predetermined area and capable of holding the cells A plurality of first adjacent surface regions arranged such that the distances from the respective centroid points to the center point of the first specific surface region are equal to each other.
  • a substrate a second specific surface region having the predetermined area and capable of holding the cells, and a plurality of second specific surface regions arranged adjacent to the second specific surface region and having the predetermined area and capable of holding the cells.
  • Two adjacent surface regions each of which A plurality of second adjacent surface regions are formed so that the distance from the center point to the center of gravity of the second specific surface region is equal to each other and is a second distance different from the first distance.
  • the first base material and the second base material may be different portions of one base material.
  • tissue body formation method and a tissue body formation kit capable of controlling the size of a three-dimensional tissue body containing proliferative cells.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram illustrating an example of a substrate surface used in the tissue body forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is an explanatory view of another example of the substrate surface used in the tissue body forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 3 shows an example of a region set used in the tissue formation method according to the present embodiment. It is explanatory drawing.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram illustrating an example of a plurality of region sets having different center-of-gravity intervals used in the tissue forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram illustrating an example of a substrate surface on which a plurality of region sets are used, which is used in the tissue forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram illustrating another example of a region set used in the tissue body forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram illustrating still another example of a region set used in the tissue body forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of still another example of a region set that is used in the tissue formation method according to the present embodiment.
  • FIG. 9 is an explanatory view of still another example of a region set used in the tissue body forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 10 is an explanatory view of still another example of the substrate surface used in the tissue body forming method according to the present embodiment.
  • FIG. 11 is a phase contrast micrograph of an example of a tissue body formed in surface regions having different center intervals in Example 1.
  • FIG. 12 is a graph showing an example of the relationship between the diameter of a tissue body formed in surface regions having different center intervals and culture time in Example 1.
  • FIG. 13 is an example of calibration data showing a linear relationship between the diameter of the tissue body formed in Example 1 and the center interval.
  • FIG. 15 is a graph showing an example of the relationship between the diameter and the culture time of a tissue body formed in specific regions having different positional relationships with adjacent regions in Example 1.
  • FIG. 16 is a phase-contrast photomicrograph of an example of a tissue body formed in surface regions having different diameters with the same center interval and different diameters in Example 2.
  • FIG. 17 is a surface area having different diameters in which the center intervals are equal to each other in Example 2. It is a graph which shows an example of the relationship between the diameter of the structure
  • FIG. 18 is a phase contrast photomicrograph of an example of a tissue body formed in surface regions having different center intervals in Example 3.
  • FIG. 19 is an example of calibration data showing a linear relationship between the diameter of the tissue body formed in Example 3 and the center interval.
  • FIG. 20 is a phase contrast photomicrograph of an example of a tissue body formed in surface regions having different center intervals in Example 4.
  • FIG. 21 is an example of calibration data showing a linear relationship between the diameter of the tissue body formed in Example 4 and the center distance.
  • FIG. 22 is a phase contrast photomicrograph of an example of a tissue body formed in surface regions having different center intervals in Example 5.
  • FIG. 23 is an example of calibration data showing a linear relationship between the diameter of the tissue body formed in Example 5 and the center interval.
  • FIG. 24 is a phase contrast photomicrograph of an example of a tissue body formed in surface regions having different center intervals in Example 6.
  • FIG. 25 is an example of calibration data showing a linear relationship between the diameter of the tissue body formed in Example 6 and the center interval.
  • FIG. 26 is a phase contrast photomicrograph of an example of a tissue body formed in surface regions having different center intervals in Example 7.
  • FIG. 27 is an example of calibration data showing a linear relationship between the diameter of the tissue body formed in Example 7 and the center interval.
  • tissue body forming method a step of preparing at least one substrate surface in which a plurality of surface regions having a predetermined area are spaced apart from each other (hereinafter referred to as “the following method”) "Preparation step”) and by culturing proliferative cells in each surface region of the substrate surface, a three-dimensional tissue body (hereinafter referred to as “tissue body”) containing the cell in each surface region. (Hereinafter referred to as “culture”). Process)).
  • FIG. 1 is an explanatory view of an example of a base material prepared in this preparation step.
  • FIG. 2 is an explanatory view of another example of the base material prepared in this preparation step.
  • the surface 2 of the flat substrate 1 in which a plurality of circular surface regions 3a, 3b having the same diameter are arranged regularly is prepared.
  • the material of the substrate 1 is not particularly limited.
  • glass, synthetic resin, synthetic rubber such as EPDM (Ethylene Propylene Diene Monomer), natural rubber, ceramic, stainless steel and the like can be molded.
  • Examples of the synthetic resin that can be preferably used include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyamide, polyacetal, polyester (polyethylene terephthalate, etc.), polyurethane, polysulfone, polyacrylate, polymethacrylate, polybule, and silicon.
  • Each surface region 3a formed on the substrate 1 shown in Fig. 1 is a cell-adhesive surface.
  • the cell adhesive surface is, for example, a surface exhibiting the property of allowing cells to adhere in a solution such as a culture solution.
  • a solution such as a culture solution.
  • cells that have settled in the surface region 3a in the culture medium adhere to the surface region 3a while changing their shape from a spherical shape to a relatively flat shape as the culture time elapses. .
  • this surface region 3a is, for example, when the surface of the substrate 1 itself exhibits a charged state or hydrophilicity 'hydrophobicity to which cells can adhere in a solution such as a culture solution. It can be formed as a region where the surface of the substrate 1 itself is exposed.
  • the surface region 3a can be formed, for example, as a region in which a cell adhesive substance obtained or synthesized from a living body or a derivative thereof is fixed to a part of the substrate surface 2.
  • this cell adhesive substance for example, it can bind to a specific cell surface molecule (eg, integrin or sugar chain receptor) existing in the cell membrane of cells cultured in the surface region 3a.
  • a specific cell surface molecule eg, integrin or sugar chain receptor
  • an extracellular matrix such as collagen, fibronectin, laminin and the like can be preferably used.
  • the synthesized cell adhesion substance include a specific amino acid sequence exhibiting cell adhesion (for example, arginine'glycine'aspartate sequence (eg, RGD sequence)) and a specific sugar chain sequence (eg, , Galactose side chain, etc.)
  • the compound which has it can be used preferably.
  • an inducer of these cell adhesive substances for example, an arbitrary functional group, a polymer chain, or the like is added to the cell adhesive substance in a predetermined chemical reaction (for example, a condensation reaction between a carboxyl group and an amino group). ) And the like can be preferably used.
  • These cell adhesive substances or derivatives thereof can be obtained, for example, by drying an aqueous solution containing the cell adhesive substance or derivatives thereof at a portion of the substrate surface 2 where each surface region 3a is formed. Can be fixed to each part.
  • these cell adhesive substances or derivatives thereof are, for example, each of functional groups possessed by the cell adhesive substance or derivatives thereof and the substrate surface 2 in an aqueous solution containing the cell adhesive substance or derivatives thereof.
  • a predetermined chemical reaction for example, a chemisorption reaction between a thiol group and a gold surface or a condensation reaction between a carboxyl group and an amino group). It can fix to the said part by couple
  • the portion of the substrate surface 2 shown in FIG. 1 other than the plurality of surface regions 3a is a cell non-adherent peripheral surface 4. That is, each surface region 3a is surrounded by a non-cell-adhesive peripheral surface 4.
  • a plurality of bottomed holes having a predetermined depth (hereinafter referred to as “cavity 100”) are regularly arranged in the base material 1 shown in FIG. It is formed as the bottom surface of Cavity 100.
  • the whole substrate surface 2 shown in FIG. 2 is non-cell-adhesive.
  • the peripheral surface 4 which is a portion other than the portion where the cavity 100 is formed in the substrate surface 2 and the surface region 3b in the cavity 100 are both non-cell-adhesive surfaces.
  • the non-cell-adhesive surface is a surface exhibiting properties inappropriate for cell adhesion in an aqueous solution such as a culture solution. Therefore, for example, a cell that has settled on the peripheral surface 4 or the surface region 3b in the culture solution hardly changes its spherical shape and cannot substantially adhere to the peripheral surface 4 or the surface region 3b.
  • the cells that have settled on the peripheral surface 4 or the surface region 3b cannot be adhered to the peripheral surface 4 or the surface region 3b at all, float in the culture solution, or adhere to them at any time after a predetermined culture time. Can be easily detached by the flow of the culture solution.
  • the peripheral surface 4 and the surface region 3b are, for example, the surface of the substrate 1 itself, In an aqueous solution such as a culture solution, when it shows a charged state inappropriate for cell adhesion or hydrophilicity / hydrophobicity, it can be formed as a region where the surface of the substrate 1 itself is exposed.
  • the peripheral surface 4 and the surface region 3b are formed, for example, as a region where a cell non-adhesive substance obtained or synthesized from a living body or a derivative thereof is fixed on a part of the substrate surface 2. be able to.
  • this non-cell-adhesive substance for example, a substance that does not bind to cell surface molecules present in the cell membrane of cells cultured in the surface regions 3a and 3b can be used.
  • a highly hydrophilic protein such as albumin can be preferably used.
  • Examples of synthesized non-cell-adhesive substances include compounds containing a polymer chain with extremely high hydrophilicity such as polyethylene glycol, MPC (2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine), poly-HEMA Hydroxy ethinoremetatalylate), SPC (segment polyurethane) and the like can be preferably used.
  • a derivative of these cell non-adhesive substances for example, it is preferable to use a derivative obtained by binding an arbitrary functional group or polymer chain to the cell non-adhesive substance by a predetermined chemical reaction or the like. it can.
  • These cell non-adhesive substances or derivatives thereof include, for example, an aqueous solution containing the cell non-adhesive substance or derivatives thereof, a portion surrounding each surface region 3a in the substrate surface 2 shown in FIG. Alternatively, by drying each surface region 3b and the peripheral surface 4 shown in FIG. 2, the portion surrounding each surface region 3a or each surface region 3b and the peripheral surface 4 can be fixed.
  • these cell non-adhesive substances or derivatives thereof for example, in an aqueous solution containing the cell non-adhesive substances or derivatives thereof, and a functional group possessed by the cell non-adhesive substances or derivatives thereof, By bonding the surface surrounding the surface region 3a of the substrate surface 2 or the functional groups exposed on the surface region 3b and the peripheral surface 4 shown in FIG. 2 by a predetermined chemical reaction or the like. It can be fixed to the part surrounding each surface region 3a, or to each surface region 3b and the peripheral surface 4.
  • the cavity 100 of the substrate 1 shown in FIG. 2 can be formed on a part of the substrate surface 2 by using an arbitrary processing method selected according to the material of the substrate 1 or the like. it can. Specifically, for example, this cavity 100 is equipped with a drilling force gauge, laser, etc. using a machining center or the like. It can be formed on the substrate surface 2 by the optical fine processing, etching force, embossing, etc. used, or can be formed at the time of forming the substrate 1 by injection molding, press molding, stereolithography or the like.
  • the cavity 100 can be formed, for example, as a bottomed hole having a depth smaller than the thickness of the base material 1 on the surface 2 of the base material 1 having a predetermined thickness. it can. Further, the cavity 100 may be formed as a bottomed hole by, for example, forming a hole penetrating the base material 1 and then bonding another member to one side of the base material 1 to form a bottom surface. it can .
  • a member for forming the bottom surface of the cavity 100 for example, a substrate, a film, or the like made of the same or different material as the base material 1 in which the through hole is formed can be used.
  • the plurality of cavities 100 are formed on the base material 1 as shown in FIG. 2 by using a machining center or the like that precisely controls the processing position by a CAD (Computer Aided Design) program, for example.
  • CAD Computer Aided Design
  • it can be formed regularly so that the distance between the centers of the circular bottom faces is a constant interval.
  • the base material surface 2 shown in FIG. 1 is a substantially flat surface as a whole including each surface region 3a and the peripheral surface 4. That is, each of the surface regions 3a and the peripheral surface 4 are substantially flat surfaces, and are connected to each other so that the entire substrate surface 2 constitutes a substantially flat surface.
  • the substantially flat surface means, for example, a surface that is so small that the unevenness of the surface (for example, the step between each surface region 3a and the peripheral surface 4) is smaller than the thickness of one cell.
  • each surface region 3b and the peripheral region 4 are also formed as substantially flat surfaces.
  • each surface region 3a and each surface region 3b is not unambiguous because the size of cells cultured in each surface region 3a and each surface region 3b varies depending on the type and state thereof.
  • a range of 300-1 ⁇ 10 6 m 2 is preferable, and a range of 5000 to 2 ⁇ 10 5 / ⁇ ⁇ 2 is particularly preferable.
  • the diameter of each surface region 3a and each surface region 3b shown in FIGS. 1 and 2 is in the range of about 2 to 50 times the diameter of the cells cultured in each surface region 3a and each surface region 3b. Is preferably in the range of about 5 to 30 times.
  • each surface region 3a and each surface region 3b defines the number of cells included in the tissue body. That is, when the area of each surface region 3a and each surface region 3b is smaller than 300 m 2 or twice the diameter of the cell, for example, the number of cells necessary to form a tissue body is increased. Cannot adhere to zone 3a and cannot hold the required number of cells on each surface zone 3b.
  • each surface region 3a and each surface region 3b when the area of each surface region 3a and each surface region 3b is 1 ⁇ 10 6 m 2 or larger than 50 times the cell diameter, the tissue formed by each surface region 3a and each surface region 3b is For example, the cells contained in the deep part of the tissue body may be killed or lose their function without being able to receive sufficient nutrients and oxygen from the culture medium outside the tissue body. Because there is.
  • the depth of the cavity 100 of the substrate 1 shown in FIG. 2 is preferably in the range of about 1 to 100 times the diameter of the cell used, and in particular in the range of about 2 to 50 times. Preferably it is. This is because when the depth of the cavity 100 is smaller than the lower limit value, it is difficult to securely hold the cell on the surface region 3b by spilling the cell from within the cavity 100. Further, when the depth of the cavity 100 is larger than the above upper limit value, the supply of oxygen and nutrients to the cells held on the surface region 3b in the cavity 100 may be insufficient. .
  • the substrate surface 2 has at least one region set having the minimum number of surface regions 3a or surface regions 3b necessary for controlling the size of the tissue body in the present method. Contains. That is, this region set is one specific surface region (hereinafter referred to as “specific region”) which is a part of the plurality of surface regions 3a or surface regions 3b, and is adjacent to the specific region around the specific region. And a plurality of surface regions (hereinafter referred to as “adjacent regions”). A plurality of adjacent areas included in the area set are determined from the center of gravity (the center point of the circle in the circular adjacent area, the intersection of the diagonal lines in the rectangular adjacent area, etc.) of the specific area included in the area set. The distance to the center of gravity (hereinafter referred to as “center of gravity center”) is arranged to be equal to each other.
  • one of the characteristic features of this method is that it is formed in a specific region in the culture step by changing the center-of-gravity interval of the region set included in the substrate surface 2 prepared in the preparation step.
  • the size of the three-dimensional tissue containing proliferating cells can be controlled according to the center of gravity distance. It is a point. That is, for example, by preparing the substrate surface 2 including a region set with a predetermined center of gravity interval in the preparation step, at least a specific region of the region set in the culture step has a predetermined size defined by the center of gravity interval. Can be formed.
  • a tissue body having a first size corresponding to the first center-of-gravity interval can be formed in the culturing step, and the specific region and each adjacent region can be formed at a second center-of-gravity interval smaller than the first center-of-gravity interval in the preparation step.
  • the second base surface according to the ratio between the second center-of-gravity interval and the first center-of-gravity interval.
  • a tissue of a second size that is smaller than one size can be formed.
  • a plurality of base material surfaces whose centroid distances change stepwise according to a certain rule are prepared in the preparation step, in the culturing step, a plurality of specific regions on the plurality of base material surfaces are prepared.
  • the center-of-gravity interval changes according to a certain rule for example, the center-of-gravity interval of one or more substrate surfaces changes by a predetermined length with respect to the center-of-gravity interval of one substrate surface. And a case where it changes at a predetermined magnification or changes according to a predetermined function.
  • a tissue array chip in which a plurality of tissue bodies of a desired size defined by the center-of-gravity interval is regularly and densely arranged can be obtained. Further, according to the present method, for example, the center-of-gravity interval to be set for forming a tissue body of a desired size can be screened for each type of cell to be cultured.
  • the shortest distance between the edge of the specific region and the edge of each adjacent region (that is, for example, for the circular surface region 3a and surface region 3b, the circumference of the specific region and each adjacent region).
  • the shortest distance from the circumference of the region is not in general because the size of cells cultured in the specific region and each adjacent region varies depending on the type and condition, but it is in the range of 50-1000 ⁇ m. In particular, it is preferably in the range of 100 to 700 / ⁇ ⁇ . For example, if this shortest distance is less than 50 m, it is formed in a specific area.
  • the tissue array arranged in the above When the size of the tissue cannot be strictly controlled due to fusion or cross-linking between the tissue and the tissue formed in the adjacent region, resulting in the formation of a tissue in which the tissues are bonded together Because there is. Further, when the shortest distance is larger than 1000 / zm, the distance between the tissue formed in the specific region and the tissue formed in the adjacent region is large. It is not possible to obtain the tissue array arranged in the above.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of the region set 10 formed on the base material surface 2 shown in FIGS. 1 and 2.
  • This region set 10 includes a specific region 11 (hatched in FIG. 3) that is one of a plurality of surface regions 3a or surface regions 3b (see FIGS. 1 and 2) formed on the substrate surface 2.
  • six adjacent regions 12 which are other part of the plurality of surface regions 3a or the surface region 3b and are arranged so as to surround the specific region 11 .
  • the specific region 11 and each adjacent region 12 have a circular shape with the same diameter D1.
  • the distance between the center point 11c of the specific region 11 and the center point 12c of each adjacent region 12 (hereinafter referred to as “center interval”) is a constant value L1 that is equal to each other.
  • the specific region 11 has its center point 11c entirely aligned with the center of gravity of the regular hexagon P1 formed by connecting the center points 12c of each of the six adjacent regions 12. It is arranged to be located inside.
  • the length Ml of each of the six sides of the regular hexagon P1 is the same as the center interval L1.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of an example of a plurality of region sets having different centroid distances.
  • the first region set 20 shown in FIG. 4A has one specific region 21 and six adjacent regions 22 formed as circular regions having a constant diameter D2 that are equal to each other.
  • the center distance L2 between the specific area 21 and each adjacent area 22 is equal to each other.
  • the second area set 30 shown in FIG. 4B includes one specific area 31 and six areas formed as a circular area having the same diameter D2 as the specific area 21 and each adjacent area 22 included in the first area set 20.
  • the center area L3 between the specific area 31 and each adjacent area 32 is larger than the center distance L2 of the first area set 20.
  • 4C includes one specific region 41 and six specific regions 21 formed as a circular region having the same diameter D2 as the specific region 21 and each adjacent region 22 included in the first region set 20.
  • the center interval L4 between the specific region 41 and each adjacent region 42 is the center interval L of the second region set 30. It is getting bigger than 3.
  • the preparation step for example, as shown in FIG. 4, specific regions 21, 31, 41 and adjacent regions 22, 32, 42 having the same diameter D2 are included.
  • the regular hexagons P2, P3, and P4 formed by connecting the center points 22c, 32c, and 42c of the first region set 20, second region set 30, and third region set 40 that are similar to each other.
  • the first substrate surface, the second substrate surface, and the third substrate surface may be prepared, for example, as the surfaces of three substrates molded separately from each other. However, it may be prepared as three different parts of one surface of one substrate.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of a part including a plurality of region sets among the plurality of surface regions 3c formed on the substrate surface 2.
  • FIG. 5A focuses on one surface region 51 shown by hatching among the plurality of surface regions 3c as a specific region, and six surface regions 52a, 52b, 52b adjacent to the surface region 51. It is specified by focusing on 52c, 52d, 52e, and 52f as adjacent regions.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of a part including a plurality of region sets among the plurality of surface regions 3c formed on the substrate surface 2.
  • FIG. The region set 50 shown in FIG. 5A focuses on one surface region 51 shown by hatching among the plurality of surface regions 3c as a specific region, and six surface regions 52a, 52b, 52b adjacent to the surface region 51. It is specified by focusing on 52c, 52d, 52e, and 52f as adjacent regions.
  • FIG. 5A is an explanatory diagram of a part including a plurality of region sets
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of another example of the area set.
  • the area set 60 shown in FIG. 6 includes one specific area 61 (area shown by hatching in FIG. 6) formed in a circular shape having the same diameter D6, and the specific area 61.
  • Three adjacent regions 62 arranged in the periphery of the center region L6, and the center distance L6 between the specific region 61 and each adjacent region 62 is equal to each other.
  • the specific region 61 is arranged in the equilateral triangle P6 so that the center point 61c coincides with the center of gravity of the equilateral triangle P6 formed by connecting the center points 62c of the three adjacent regions 62. ing.
  • the length M6 of each of the three sides of the regular triangle P6 is larger than the center interval L6.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of still another example of the area set.
  • the area set 70 shown in FIG. 7A includes one specific area 71 (the area shown by hatching in FIGS. 7A and 7B) formed in a circular shape having the same diameter D7, and around the specific area 71.
  • the four adjacent regions 72 are arranged, and the center distance L7 between the specific region 71 and each adjacent region 72 is equal to each other.
  • the specific area 71 is arranged in the quadrilateral P7 so that the central point 71c is positioned in the square P7 formed by connecting the central points 72c of the four adjacent areas 72. In this region set 70, the length M7 of each of the four sides of the square P7 is larger than the center interval L7.
  • a plurality of pieces regularly arranged at a constant center interval L7 vertically and horizontally so as to include the area set 70 shown in FIG. A substrate surface on which the surface region 3d is formed is prepared.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of still another example of the region set.
  • the area set 80 shown in FIG. 8A has one specific area 81 (an area shown by hatching in FIGS. 8A and 8B) formed in a circular shape having the same diameter D8 and the specific area 81 sandwiched therebetween.
  • Two adjacent regions 82 arranged at the center, and the center distance L8 between the specific region 81 and each adjacent region 82 is equal to each other.
  • the specific area 81 is arranged so as to be positioned on a straight line N8 that connects the center point 82c of each of the two adjacent areas 82 with the center point 81c. That is, the center point 81c of the specific area 81 is located at the midpoint of the straight line N8.
  • a plurality of surface regions 3e are arranged in series at a constant center interval L8 so that a part of the region set 80 shown in FIG. 8A is included.
  • a substrate surface in which a plurality of rows including the plurality of surface regions 3e are arranged in parallel to each other is prepared.
  • Fig. 8B it is included in two adjacent columns.
  • the shortest distance Q8 between the center points 8c of the surface region 3e is larger than the center interval L8 of the region set 80.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram of still another example of the region set.
  • the area set 90 shown in FIG. 9A includes one specific area 91 (an area shown by hatching in FIGS. 9A and 9B) formed in a circular shape having the same diameter D9, and around the specific area 91.
  • the three adjacent regions 92 are arranged, and the center distance L9 between the specific region 91 and each adjacent region 92 is equal to each other.
  • the specific region 91 has the center point 91c that is the longest of the three sides of the isosceles triangle P9 formed by connecting the center points 92c of the three adjacent regions 92 and the center point of the side. Half of them are arranged in the isosceles triangle P9.
  • a plurality of surface regions 3f are arranged at a constant center interval L9 in the vertical and horizontal directions so that a part thereof includes the region set 90 shown in FIG. 9A.
  • the shortest distance Q9 between the center points 9c of the surface region 3f included in two adjacent two-row units is larger than the center interval L9 of the region set 90.
  • each surface region is not limited to the circular shape as described above, and may be, for example, an elliptical shape or a polygonal shape.
  • the polygon formed by connecting the centroid points of the adjacent regions is not limited to a regular polygon, and may be other polygons, for example.
  • the base material on which each surface region is formed is not limited to a flat plate, and may be a highly flexible film or film, for example.
  • the cell-adhesive surface region surrounded by the non-cell-adhesive peripheral surface may be formed as a part of the bottom surface of the cavity as shown in FIG.
  • the substrate surface including the cell-adhesive surface region is not limited to a flat surface as shown in FIG.
  • FIG. 10 is an explanatory view of another example of the substrate surface on which the cell adhesive surface region is formed.
  • a plurality of cylindrical bodies 101 are regularly arranged with a predetermined height on the surface 2, and the plurality of circles are arranged.
  • Each surface region 3g is formed as the upper end surface of each column 101.
  • the peripheral surface 4 that is a portion other than the cylindrical body 101 on which the surface regions 3g are formed in the substrate surface 2 may be non-cell-adhesive.
  • Each surface region 3g and the peripheral surface 4 surrounding each surface region 3g shown in FIG. 10 are substantially flat surfaces.
  • the culture process will be described.
  • proliferating cells are cultured in a specific region and each adjacent region included in each region set on the surface of the substrate.
  • the cell to be cultured is any animal species as long as it is proliferative under a predetermined culture condition and can be three-dimensionally assembled to form a three-dimensional tissue body. Any cell can be used regardless of the type of organ or tissue.
  • the cells are collected from, for example, a liver, spleen, kidney, nerve, skin, etc. derived from a human or non-human animal (eg, monkey, pig, inu, rat, mouse, etc.).
  • Embryonic Stem cells Primary cells, undifferentiated stem cells, embryonic embryonic stem cells (Embryonic Stem cells), established cell lines, or cells that have undergone genetic manipulation etc. It can be preferably used. In addition, one type of cell can be used alone, or two or more types of cells can be mixed and used in an arbitrary ratio.
  • the culture solution used for culturing the cells may be an aqueous solution containing necessary salts, nutrient components, and the like at appropriate concentrations so that the survival state and function of the cells can be maintained.
  • Any composition can be used.
  • a culture medium in which a growth factor or an antibiotic is added to a basic medium such as Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), So-called physiological saline can be preferably used.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • the cells held without adhering to each adjacent region gradually overlap with each other in the specific region and each adjacent region as the culture time elapses, and gather three-dimensionally to form a three-dimensional organization.
  • the cell adhesive surface region 3a and the cells adhered to the specific region and each adjacent region for example, first grow two-dimensionally in the specific region and each adjacent region, and then stack on each other.
  • a tissue body having a predetermined thickness is formed.
  • the cells held on the specific region and each adjacent region related to the non-cell-adhesive surface region 3b are three-dimensionally assembled with each other in the solution in the cavity 100 and suspended in the solution.
  • a three-dimensional tissue having a predetermined thickness is formed by growing while maintaining the above.
  • the size of the tissue formed in the specific region and each adjacent region can increase with the passage of the culture time as the cells contained in the tissue grow.
  • at least the size of the tissue formed in the specific area is maintained at a constant value according to the center-of-gravity distance between the specific area and each adjacent area. That is, for example, the size of a tissue body formed in a specific region in the culture process gradually increases within a predetermined period after the start of culture, but is a predetermined value defined by the center-of-gravity interval between the specific region and each adjacent region. After reaching the value, the increase is limited and maintained at the predetermined value throughout the subsequent culture period.
  • the specific area of the second base material surface includes the predetermined size of the size of the tissue formed in the specific area of the first base material surface.
  • a size organization can be formed. Specifically, for example, in the preparation step, the first substrate surface on which the first region set 20 shown in FIG. 4A is formed and the second substrate on which the second region set 30 shown in FIG. 4B is formed.
  • the size of the tissue formed in the second specific region 31 included in the second region set 30 is set in the first region set 20 in the culture process.
  • the ratio of the size of the tissue formed in the first specific area 21 included is approximately equal to the ratio of the centroid interval L3 of the second area set 30 to the centroid interval L2 of the first area set 20. .
  • the size of the tissue body is, for example, the representative length of the shape when the outer shape of the tissue body is projected onto the substrate surface, or the thickness of the tissue body on the substrate surface. That is, for example, when the tissue body has a substantially spherical shape (when the tissue body has a dome shape or a substantially spherical shape adhered to the cell adhesive surface region 3a, the tissue body has a cell non-adhesive surface region 3b).
  • the size of the tissue body is the size of the tissue. It is the diameter of the circular shape which projected the external shape of the body on the base-material surface.
  • Such a substantially spherical tissue can be formed regardless of the shape of the surface regions 3a and 3b, but can be preferably formed by circular or polygonal surface regions 3a and 3b, and particularly circular surface regions 3a and 3b. Can be preferably formed.
  • the size of the tissue body is the major axis or the minor axis of the ellipse.
  • the tissue body extends in a string shape along the surface of the base material, the size of the string-shaped tissue body is the length in the major axis direction.
  • the size of the tissue body is a circular diameter obtained by projecting the outer shape of the tissue body onto the surface of the base material, or rises on the base material surface.
  • the thickness of the dome shape is a circular diameter obtained by projecting the outer shape of the tissue body onto the surface of the base material, or rises on the base material surface.
  • the present method is a step of obtaining calibration data indicating a correlation between the center-of-gravity interval of the substrate surface prepared in the preparation step and the size of the tissue body formed in the culture step (hereinafter referred to as "data Data acquisition step) ”.
  • data acquisition step the size of the tissue formed in the cultivation process is first measured. That is, for example, using a phase contrast microscope, a fluorescence microscope, an electron microscope, or the like, an image obtained by photographing the tissue formed on the surface of the substrate is acquired, and the image is obtained on a computer equipped with predetermined image analysis software. The size of the tissue body is quantitatively measured by analysis.
  • calibration data in which the measured size of the tissue body is associated with the center-of-gravity interval between the specific region where the tissue body is formed and each adjacent region is generated. That is, for example, a spherical tissue having a first diameter is formed in the first specific region 21 shown in FIG. 4A, and a second diameter larger than the first diameter is formed in the second specific region 31 shown in FIG. 4B.
  • the first diameter and the first center-of-gravity distance L2 related to the first specific region 21 are associated with each other, and the second diameter and the second diameter are related to each other.
  • the second center-of-gravity interval L3 related to the specific region 31 is associated with the specific region 31.
  • This calibration data is data defining the center-of-gravity interval to be set in order to form, for example, a yarn and woven body of a predetermined size. That is, the calibration data is, for example, a data table or a function in which the size of the tissue body and the center-of-gravity interval for forming the tissue body of the size are associated with each other.
  • this method is based on the calibration data acquired in the calibration data acquisition process!
  • a step of determining a center-of-gravity interval for forming a tissue body of a desired size (hereinafter referred to as “determination step”) may be included.
  • the center-of-gravity interval associated with the desired size is determined from the correlation between the size of the yarn and woven body and the center-of-gravity interval specified by the calibration data already acquired. That is, for example, in the calibration data, the first center-of-gravity interval L2 related to the first specific area 21 shown in FIG.
  • the center of gravity of the substrate surface prepared in the preparation step is determined based on the calibration data.
  • the first center-of-gravity interval L2 is determined.
  • a base material surface on which a plurality of region sets including a specific region whose first center-of-gravity interval L2 is determined in the determination step is prepared.
  • the culturing step by proliferating proliferative cells in each of the specific region and each adjacent region, a plurality of tissues whose sizes are controlled to the first size can be formed in the specific region.
  • the determination step based on a relational expression that defines the proportional relationship.
  • the center-of-gravity interval corresponding to the desired size can be determined.
  • a plurality of region sets having different center-of-gravity spacings can be used. By forming a tissue body in each of the specific regions, the center of gravity interval for forming the tissue body of the desired size is screened.
  • the center-of-gravity interval of the region set in which the structure of the desired size is formed is determined as the center-of-gravity interval corresponding to the desired size. Determine as.
  • each step may be performed at once on a plurality of substrate surfaces having different centroid distances, or on a plurality of substrate surfaces having different centroid intervals. Of these, each step may be repeated for the surface of the substrate at each center of gravity. That is, for example, after preparing a first substrate surface having a first center-of-gravity interval and performing a first cycle of forming a structure on the first substrate surface, the first center-of-gravity interval Different from the second It is also possible to prepare a second substrate surface having a distance between the two centers of gravity and further perform a second cycle in which a tissue body is formed on the second substrate surface.
  • this kit is a first in which a specific region and a plurality of adjacent regions are formed such that the center of gravity is the first distance. And a second base material on which a specific region and a plurality of adjacent regions are formed such that the center distance is a second distance different from the first distance. That is, this kit includes a plurality of substrate surfaces on which any one region set different from each other among a plurality of region sets having different center-of-gravity intervals is formed. Specifically, for example, this kit includes a first base material surface on which the first region set 20 shown in FIG. 4A is formed and a second region set 30 on which the second region set 30 shown in FIG. 4B is formed. And a third substrate surface on which the third region set 40 shown in FIG. 4C is formed.
  • the kit may include a plurality of base materials having different center-of-gravity intervals of the region set as different portions of one base material. That is, each of a plurality of substrate surfaces having different center-of-gravity intervals of the region set included in the kit may be a different portion of the surfaces of one substrate. Specifically, for example, at least one first region set 20 shown in FIG. 4A is formed on a part of the surface of the base material included in the kit, and FIG. 4B is formed on the other part of the surface. At least one second region set 30 shown in FIG. 4 is formed, and at least one third region set 40 shown in FIG. 4C is formed on another part of the surface. In addition, this kit is good also as including multiple base materials in which the several area
  • each of the plurality of base material surfaces having different center-of-gravity intervals of the formed region set included in the kit is a surface of each of the plurality of base materials formed separately from each other. May be. That is, in this case, for example, the kit includes a first substrate having a surface on which at least one first region set 20 shown in FIG. 4A is formed, and the first substrate separately. A second base material having a surface formed with at least one second region set 30 shown in FIG. 4B is formed separately from the first base material and the second base material. And a third substrate having a surface on which at least one third region set 40 shown in FIG. 4C is formed.
  • the kit includes the plurality of substrate surfaces so that the center-of-gravity interval regularly changes between the plurality of substrate surfaces, each of the plurality of substrate surfaces
  • the size of the tissue formed in the specific region changes regularly between the plurality of substrate surfaces according to the center-of-gravity interval.
  • the kit includes a first substrate surface on which the first region set 20 shown in FIG.
  • this kit for example, it is possible to obtain a tissue array chip in which yarns and fabrics of a size controlled according to the distance between the centers of gravity are regularly and densely arranged on the surface of each substrate. it can.
  • a tissue array chip for example, the correlation between the response of cells to drugs (sensitivity, toxicity, etc.) and the size of the tissue formed from the cells can be simply and accurately.
  • a plurality of tissues that also have cancer-derived cell force and change in size at a certain ratio according to the center of gravity interval are formed, and the tissues in the culture solution containing the anticancer agent are formed.
  • the center-of-gravity interval for forming a tissue body of a desired size can be screened easily and accurately.
  • the base material included in the kit has a cell-adhesive surface region
  • the tissue formed in each surface region can be held in a state of being adhered to the surface region.
  • the base material included in this kit has a cell non-adhesive surface region
  • the tissue formed in the surface area floats in the solution and can be easily recovered.
  • Example 1 a glass plate (24 mm ⁇ 24 mm, thickness 200 ⁇ m) was used as a substrate, and a substrate surface 2 as shown in FIG. 1 was produced. That is, as shown in Fig. 3, the position force of the center point of a specific area A set of areas that coincide with the position of the center of gravity of a regular hexagon formed by connecting the center points of six adjacent areas (hereinafter referred to as the "hexagon set"). And the position of the center of gravity of the square formed by connecting the center point of the four adjacent areas as shown in Fig. 7. A substrate surface on which a plurality of region sets (hereinafter referred to as “square sets”) were formed was produced.
  • square sets A substrate surface on which a plurality of region sets
  • a platinum (Pt) thin film having a thickness of 9 nm was formed on the surface of the base material by using a sputtering apparatus (E-1030, Hitachi Ltd.).
  • a stamp made of polydimethylsiloxane (PDMS) having a plurality of cylindrical protrusions having a diameter of 100 / z m and a length of 200 ⁇ m was produced by molding.
  • the distance between the center points of a circular cross section with a diameter of 100 ⁇ m at the tip corresponding to the position of each surface area of the hexagon set in a rectangular area of 10 mm x 10 mm is 150 ⁇ m and 200 mm, respectively.
  • stamps with multiple cylindrical protrusions formed so that the force is less than ⁇ m, 250 ⁇ m, 300 ⁇ m, 350 ⁇ m, 400 ⁇ m, 500 ⁇ m, or ⁇ 600 ⁇ m
  • a plurality of types of substrate surfaces were produced by microcontact printing using each stamp as follows. That is, a collagen solution containing collagen (Cellmatrix, Nitta Gelatin Co., Ltd.) prepared as a cell adhesive substance to be fixed to each surface region was prepared at a concentration of 1.5 mg / mL, and each cylinder of each of the stamps produced above was prepared. The collagen solution was applied to the circular tip surface of each cylindrical protrusion by immersing the tip end of the protrusion in the collagen solution. Then, the tip of each cylindrical projection of each stamp is applied to the tip of each cylindrical projection by pressing the tip of the cylindrical projection against the surface of the base material on which the brush is deposited. The clothed collagen solution was applied to the surface of the substrate. Furthermore, by drying the collagen solution applied to the substrate surface in a nitrogen atmosphere, a surface region where collagen was fixed was formed at a position corresponding to the tip of each cylindrical protrusion of the stamp.
  • collagen Cellmatrix, Nitta Gelatin Co., Ltd.
  • a cell non-adhesive substance was fixed to a portion other than the surface region on the surface of the base material as follows. That is, as a non-cell-adhesive substance immobilized on the surface surrounding each surface region, a synthetic polymer having a polyethylene glycol (PEG) chain with a molecular weight of 30000 and a thiol group (chemical formula: CH 0 (CH CH O) -CH CH SH, Nippon Oil & Fats Co., Ltd.)
  • PEG polyethylene glycol
  • the substrate surface on which the surface region is formed as described above is immersed in an ethanol solution containing this cell non-adhesive substance at a concentration of 5 mM, and the thiol group of the cell non-adhesive substance in a nitrogen atmosphere, By forming a specific chemical bond between the exposed portion of the platinum thin film formed on the substrate surface (that is, the portion other than the surface region of the substrate surface), the surface of the platinum thin film is formed.
  • the non-cell-adhesive substance was immobilized on. Thereafter, in a nitrogen atmosphere, the substrate surface on which the cell non-adhesive substance is fixed is sufficiently dried, and then the substrate surface is immersed in 70% ethanol to remove excess cell non-adherence. The active substance surface force was removed and the substrate surface was sterilized.
  • multiple surface area forces of diameter 100 / zm in the non-cell-adhesive surface 150 ⁇ m, 200 ⁇ m, 250 ⁇ 8 types of substrate surfaces including multiple hexagonal sets arranged in the shape of a clam lj with a center spacing of any force of m, 300 m, 350 ⁇ m, 400 ⁇ m, 500 ⁇ m or 600 ⁇ m, and cells
  • a base material surface including a plurality of square sets in which a surface region having a diameter of 100 m and a center interval of 400 m was arranged in a non-adhesive surface was produced.
  • proliferating cells were cultured in each surface region among the eight types of substrate surfaces prepared as described above.
  • HepG2 cells RB1648, RIKEN Cell Bank
  • a cell line derived from human liver cancer were used as proliferating cells.
  • the culture solution includes Williams's Medium E (Sigma) 10.8 gZL, 58.8 mgZL penicillin (Meiji Seika Co., Ltd.), lOOmgZL streptomycin ( Meiji Seika Co., Ltd.), 2.2 gZL of sodium bicarbonate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10% urchin fetal serum (FBS, Invitrogene Co., Ltd.), and serum-added culture solution It was.
  • Williams's Medium E Sigma
  • 10.8 gZL, 58.8 mgZL penicillin Meiji Seika Co., Ltd.
  • lOOmgZL streptomycin Meiji Seika Co., Ltd.
  • 2.2 gZL of sodium bicarbonate W
  • each substrate after the sterilization treatment was placed on the bottom of a polystyrene culture container (diameter 35 mm, Nippon Betaton Dickinson Co., Ltd.), and on the surface of each substrate in the culture container, 2.
  • OmL of a culture solution in which HepG2 cells were dispersed to a density of 2.5 ⁇ 10 5 ZmL was added.
  • HepG2 cells were cultured in a stationary state at 37 ° C. in an atmosphere of 5% carbon dioxide gas and 95% air.
  • each substrate was transferred to a new culture vessel containing 2.0 mL of fresh culture solution, and the cells that did not adhere to the substrate surface were removed.
  • the culture solution in the culture vessel was replaced with a fresh culture solution every two days.
  • the tissue bodies formed on the surface regions of the substrate surfaces were observed under a phase contrast microscope.
  • Calibration data was obtained by taking a photograph of the body and measuring the diameter of each tissue body based on the micrograph.
  • FIG. 11 is a phase contrast micrograph of a part of the tissue formed on each surface region of the eight types of substrate surfaces on the 14th day of culture.
  • Figure 11A, Figure 11B, Figure 11C, Figure 11D, Figure 11E, Figure 11F, Figure 11G, and Figure 11H have center distances of 150 m, 200 ⁇ m, 250 ⁇ m, 300 ⁇ m, and 350 ⁇ m, respectively.
  • the structures Tl, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ 5, ⁇ 6, ⁇ 7, and ⁇ 8 formed in specific regions with a diameter of 100 m on the substrate surfaces of 400 ⁇ m, 500 ⁇ m and 600 ⁇ m are shown. As shown in FIGS.
  • one dome-shaped or substantially spherical tissue was formed in each surface region of each substrate surface.
  • the diameters of the plurality of tissues formed on the surface of each substrate were substantially equal to each other.
  • the diameter of the tissue formed in the surface region also decreased as the center interval decreased. That is, an increase in the diameter of the tissue body could be suppressed by reducing the center distance.
  • eight types of tissue arrays were obtained in which a plurality of tissue bodies having a uniform diameter defined by each center interval were arranged at high density and regularly.
  • FIG. 12 is a graph showing a specific region of each of eight types of substrate surfaces having different center intervals.
  • 5 is a graph showing the relationship between the diameter of the obtained tissue body and the culture time.
  • the horizontal axis represents the number of days of culture (days) and the vertical axis represents the diameter of the tissue ( ⁇ m).
  • black triangles, white triangles, black squares, white squares, black circles, white circles, black diamonds, and white diamonds have a medium ', spacing force of 150 ⁇ m, Shows the average of measured values for yarns and weaves developed on 200 ⁇ m, 250 ⁇ m, 300 ⁇ m, 350 ⁇ m, 400 ⁇ m, 500 ⁇ m and 600 ⁇ m substrate surfaces .
  • the diameter of the tissue increased with the passage of the culture days until the seventh day of culture, but on the tenth day of culture.
  • FIG. 13 shows calibration data obtained in the data acquisition process of Example 1 and showing the correlation between the diameters of the tissue bodies formed in the specific regions of the eight types of substrate surfaces and the center interval. It is an example.
  • the horizontal axis indicates the center distance m) between the specific region where the tissue is formed and each adjacent region
  • the vertical axis indicates the diameter m) of the tissue.
  • Each symbol shows the average value of the measured values.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region was substantially proportional to the center distance between the specific region and each adjacent region. That is, when the center distance is at least 150 ⁇ m to 600 ⁇ m, the diameter of the tissue formed in the specific region is 108 ⁇ 10 ⁇ m force or 267 ⁇ 25 ⁇ m. It increased linearly with the increase.
  • the diameter could be controlled to increase or decrease the diameter of the tissue body in proportion to the change in the center interval. .
  • HepG2 cells are cultured in a specific region with a diameter of 100 ⁇ m arranged at the center interval X determined corresponding to the desired diameter Y.
  • a spherical structure having the diameter Y can be formed in the specific region.
  • Figure 14 shows the structure of the tissue formed on the 14th day of culturing on the substrate surface on which a hexagonal set or a square set with a surface area diameter of 100 ⁇ m and a central spacing force of 00 ⁇ m was formed. It is a phase-contrast micrograph for an example.
  • FIG. 14A and FIG. 14B show a plurality of tissues T9 formed with a hexagon set surface area and a plurality of tissues T10 formed with a square set surface area, respectively.
  • FIGS. 14A and 14B in both the hexagonal set and the square set, a plurality of regularly arranged tissue bodies having substantially the same diameter are formed. .
  • FIG. 15 shows the relationship between the culture time and the diameter of the tissue formed in a specific region of a hexagonal set or square set having a surface region diameter of 100 ⁇ m and a center spacing force of 00 ⁇ m. It is a graph which shows.
  • the horizontal axis represents the number of days of culture (days), and the vertical axis represents the diameter m) of the tissue.
  • the black circle and white circle symbols indicate the average values of the measured values for the tissue formed in the specific region of the hexagon set and the tissue formed in the specific region of the square set, respectively.
  • both the diameter of the structure formed by the square set and the diameter of the structure formed by the hexagon set increased with the passage of the culture days until the seventh day of culture.
  • Example 2 three types of substrate surfaces having a center distance of 600 m and a surface region diameter of 100 ⁇ m, 200 ⁇ m, or 300 ⁇ m were prepared. Then, HepG2 cells were cultured in each surface region of these three types of substrate surfaces, and the diameter of the tissue formed in the specific region was measured. In addition, production of each substrate surface and The culture of HepG2 cells in the surface region of each substrate surface was performed in the same manner as in the first example.
  • FIG. 16 is a phase contrast micrograph of an example of a tissue body formed in each of the surface regions of the three types of substrate surfaces.
  • Fig. 16A and Fig. 16B show the almost spherical tissues SI and S2 formed on the 5th and 10th days of culture in the surface area of 100m in diameter
  • Fig. 16C and Fig. 16D show the 200m in diameter.
  • Spherical tissues S3 and S4 formed on the 5th and 10th days of culture in the surface area are shown.
  • Figs. 16E and 16F show the 5th and 10th days of culture in the surface area of 300 / zm in diameter.
  • the substantially spherical tissue bodies S5 and S6 formed in the eye are shown.
  • FIG. 16A FIG.
  • the diameters of the formed tissue bodies S1, S3, and S5 increased as the diameter of the surface region increased.
  • the tissue S2 formed in the surface region having a diameter of 100 m and the tissue formed in the surface region having a diameter of 200 m were used.
  • the diameters of the body S4 and the tissue body S6 formed with a surface area of 300 m in diameter were controlled approximately equal to each other.
  • FIG. 17 is a graph showing the relationship between the diameter of a tissue formed in a specific region having a diameter of 100 ⁇ m, 200 ⁇ m, or 300 ⁇ m and the culture time.
  • the horizontal axis represents the number of days of culture (days)
  • the vertical axis represents the diameter of the tissue ( ⁇ m).
  • the round, diamond, and square symbols indicate the average values of the measured values for the structures formed in specific regions with diameters of 100 ⁇ m, 200 ⁇ m, and 300 ⁇ m, respectively.
  • the diameter of the tissue formed in specific regions with diameters of 100 ⁇ m and 200 ⁇ m gradually increased with the passage of culture time until the 7th day of culture.
  • the force reached a substantially constant value in the range of 250 ⁇ m to 300 ⁇ m, and thereafter the increase was suppressed and maintained at the substantially constant value until at least the 28th day of culture.
  • the diameter of the tissue formed in a specific region with a diameter of 300 m remained almost unchanged throughout the 28-day culture period and remained almost 300 m.
  • the specific area is within a range of at least 100 ⁇ m force and 300 ⁇ m regardless of the difference in diameter of the surface area.
  • the diameters of the formed tissue bodies were controlled to a constant value substantially equal to each other from the 10th day of culture to at least the 28th day of culture.
  • Example 3 as in Example 1 above, a plurality of surface regions having a diameter of 100 ⁇ m are formed in a non-cell-adhesive surface at 200 ⁇ m, 300 ⁇ m, 400 ⁇ m, or 500 ⁇ m.
  • 4 types of substrate surfaces including a plurality of hexagonal sets regularly arranged at the center distance of the displacement force, and the human eclampsia as proliferating cells in each surface region of each substrate surface.
  • HeLa cells (RCB0007, RIKEN Cell Bank), a cell line derived from cancer, were cultured.
  • HeLa cells were placed at a density of 2.5 ⁇ 10 5 cells / mL in a culture dish having a diameter of 35 mm with one substrate (24 mm ⁇ 24 mm) placed on the bottom.
  • the culture was started by adding 2. OmL of the dispersed culture solution.
  • the culture medium is DMEM (Invitrogen Corporation) 13.5 gZL, 58.8 mgZL penicillin (Meiji Seika Co., Ltd.), 1 OOmg / L streptomycin (Meiji Seika Co., Ltd.), 2.2 g / L bicarbonate
  • DMEM Invitrogen Corporation
  • penicillin Meiji Seika Co., Ltd.
  • 1 OOmg / L streptomycin Meiji Seika Co., Ltd.
  • 2.2 g / L bicarbonate A serum-added culture solution containing sodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 10% urine fetal serum (Invitrogene Corporation) was used.
  • FIG. 18 is a phase-contrast micrograph of a part of the tissue formed on each surface region of the four types of substrate surfaces on the seventh day of culture.
  • Figures 18A, 18B, 18C, and 18D show medium, spacing forces S of 200 m, 300 ⁇ m, 400 ⁇ m, and 500 ⁇ m on a substrate surface with a diameter of 100 m, respectively.
  • Tissues T20, ⁇ 21, ⁇ 22, and ⁇ 23 formed in a specific region are shown.
  • one dome-shaped or substantially spherical tissue was formed in each surface region of each substrate surface.
  • the base material surface with a small center distance formed a structure with a smaller diameter than the base material surface with a large center distance. .
  • Fig. 19 is an example of calibration data obtained in Example 3 and showing the correlation between the diameter of the tissue formed in each specific region of the four types of substrate surfaces and the center interval.
  • the horizontal axis indicates the center distance ( ⁇ m) between the specific region where the tissue is formed and each adjacent region
  • the vertical axis indicates the diameter (m) of the tissue.
  • Each symbol shows the average value of the measured values.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region was substantially proportional to the center distance between the specific region and each adjacent region.
  • the center distance is at least 200 ⁇ m force to 500 ⁇ m
  • the diameter of the tissue formed in the specific region is In the range of 100 ⁇ 9 / ⁇ m to 154 ⁇ 15 ⁇ m, it increased linearly with the increase of the center distance.
  • Example 4 As in Example 3 described above, four types of substrate surfaces with different center intervals between the surface regions were prepared, and proliferating cells were formed in each surface region of each substrate surface.
  • Mouse embryonic stem cells (ES cells) (129SV line, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) were cultured. That is, in the same manner as in Example 1 above, a culture solution in which ES cells are dispersed to a density of 2.5 ⁇ 10 5 ZmL in a culture dish having a diameter of 35 mm with one substrate placed on the bottom is 2. The culture was started by adding OmL.
  • Knock Out DMEM medium 500 mL, 250 UZmL of leukemia inhibitory factor (LI F) (ESGRO (registered trademark), Invitrogen Corporation), 1 % Non-essential amino acids (Non-Essential Amino Acids: NEAA, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.), 2 mM L—glutamine (Invitrogen Corporation), lOOUZmL penicillin (Invitrogen Corporation), 100 ⁇ gZmL streptomycin (Invitrogen) ), 300 M monothioglycerol (Sigma Co., Ltd.), 25 mM HEPES (Dojindo Laboratories), 15% urine fetal serum (FBS, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) The culture solution was used.
  • LI F leukemia inhibitory factor
  • FIG. 20 is a phase contrast micrograph of a part of the tissue formed on each surface region of the four types of substrate surfaces on the seventh day of culture.
  • Figure 20A, Figure 20B, Figure 20C, and Figure 20D show the identification of a 100 m diameter on a substrate surface with medium, spacing forces of 200 ⁇ m, 300 ⁇ m, 400 ⁇ m, and 500 ⁇ m, respectively.
  • Tissues T30, ⁇ 31, ⁇ 32, and ⁇ 33 formed in the region are shown.
  • one dome-shaped or substantially spherical tissue was formed in each surface region of each substrate surface.
  • Fig. 21 is an example of calibration data obtained in Example 4 and showing the correlation between the diameter of the tissue formed in each specific region of the four types of substrate surfaces and the center interval.
  • the horizontal axis indicates the center distance ( ⁇ m) between the specific region where the tissue is formed and each adjacent region
  • the vertical axis indicates the diameter (m) of the tissue.
  • Each symbol shows the average value of the measured values.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region was substantially proportional to the center distance between the specific region and each adjacent region.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region is within the range of 135 ⁇ 10 m force to 228 ⁇ 15 ⁇ m. It increased linearly with the increase.
  • Example 5 a substrate surface as shown in FIG. 2 was prepared using a flat plate (24 mm ⁇ 24 mm, thickness 400 m) made of polymethyl methacrylate (PMMA) as a substrate. That is, a substrate surface on which a plurality of hexagonal sets including the surface region 3b which is the bottom surface of the cavity 100 was formed.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • a part of the surface of the polymethylmetatalylate flat plate was drilled using a machining center (desk type NC fine processing machine, manufactured by PMT Co., Ltd.) over a 10 mm square rectangle.
  • the bottom surface with a circular force of 300 m in diameter is regularly arranged at a center distance of either 330 m, 440 ⁇ m, or 550 ⁇ m. Multiple m 100s of mity were formed.
  • the entire flat plate on which the cavity 100 is formed (that is, the entire base material surface 2 including the surface area 3b and the peripheral surface 4 shown in FIG. 2) is the same as in the first embodiment.
  • a 9 nm thick platinum (Pt) thin film was formed.
  • a platinum thin film is formed in an ethanol solution containing a synthetic polymer having a polyethylene glycol (PEG) chain with a molecular weight of 30000 and a thiol group used in Example 1 described above at a concentration of 5 mM.
  • PEG polyethylene glycol
  • the thiol group of the cell non-adhesive substance and the platinum thin film surface formed on the substrate surface that is, the surface shown in FIG. 2.
  • the cell non-adhesive substance was immobilized on the surface of the platinum thin film by forming a specific chemical bond between the surface region 3b and the substrate surface 2) including the peripheral surface 4).
  • the substrate surface on which the cell non-adhesive substance is fixed is sufficiently dried, and then the substrate surface is immersed in 70% ethanol, thereby surplus cell non-adhesiveness. Remove the substance surface force and sterilize the substrate surface
  • a plurality of surface regions having a diameter of 300 m are formed as 330 ⁇ m as the bottom surface of the cavity formed in the non-cell-adhesive surface.
  • Three types of substrate surfaces containing a plurality of hexagonal sets regularly arranged at a center interval of m, 440 ⁇ m, or 550 ⁇ m were prepared, and each substrate was prepared in the same manner as in Example 1 above.
  • HepG2 cells were cultured as proliferating cells in each surface region of the material surface. That is, culturing was started by seeding 1.0 ⁇ 10 5 HepG2 cells per 10 ⁇ 10 mm rectangular area on the surface of the substrate where the cavity was formed.
  • the culture solution used was the same as in Example 1 above.
  • FIG. 22 is a phase contrast micrograph of a part of the tissue formed on each surface region of the three types of substrate surfaces on the 10th day of culture. 22A, 22B, and 22C, formed on a specific surface area of 300 m in diameter on the substrate surface of medium, f3 ⁇ 4 distance, 330 ⁇ m, 440 ⁇ m, and 550 ⁇ m, respectively. Shown are tissue bodies T40, ⁇ 41, and ⁇ 42. As shown in FIGS. 22A to 22C, in each of the cavities 100 on the surface of each substrate, a substantially spherical tissue was formed one by one in a floating state. The diameters of the plurality of tissues formed on the surface of each substrate were substantially equal to each other.
  • the diameter of the tissue formed in the surface region also decreased as the center interval decreased.
  • the increase in the diameter of the tissue body could be suppressed by reducing the center distance.
  • three types of tissue arrays were obtained in which a plurality of tissue bodies having a uniform diameter defined by each center interval were arranged at high density and regularly.
  • FIG. 23 is a calibration showing the correlation between the diameters of the tissue bodies formed in the specific regions of the three types of substrate surfaces and the center distances acquired in the data acquisition process of Example 5. It is an example of data.
  • the horizontal axis represents the center distance m) between the specific region where the tissue is formed and each adjacent region
  • the vertical axis represents the diameter m) of the tissue.
  • Each symbol shows the average value of the measured values.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region was substantially proportional to the center distance between the specific region and each adjacent region.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region is 183 ⁇ 6 m force to 236 ⁇ 8 m. It increased linearly with the increase.
  • the diameter could be controlled so that the diameter of the tissue body was increased or decreased in proportion to the change in the center distance by changing the center distance.
  • Example 6 as in Example 5 described above, the surface of the cavity is regularly formed with a plurality of surface area forces of 300 m in diameter at a center interval of 330 ⁇ m, 440 ⁇ m, or 550 ⁇ m.
  • RIN— is a cell line derived from rat Langerno and Lance island tumors as proliferating cells in each surface area of each substrate surface.
  • 5F cells ATCC CRL-2058, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
  • the culture was performed by seeding OX 10 5 RIN-5F cells per 10 mm X 10 mm rectangular area of the substrate surface where the cavity was formed. Started.
  • RIMI 1640 medium (Invitrogen Corporation) 500mL, 2mM L-glutamine (Invitrogen Corporation), lOOUZmL A serum-supplemented medium supplemented with penicillin (Invitrogen Corporation), 100 ⁇ g ZmL streptomycin (Invitrogen Corporation), and 10% ushi fetal serum (Invitrogen Corporation) was used.
  • FIG. 24 is a phase contrast micrograph of a part of a tissue body formed on each surface region of three types of substrate surfaces on the 10th day of culture.
  • 24A, 24B, and 24C are formed in a specific area with a diameter of 300 m on the substrate surface of medium, f3 ⁇ 4 distance, 330 ⁇ m, 440 ⁇ m, and 550 ⁇ m, respectively. Shown are tissue bodies T50, ⁇ 51, and ⁇ 52.
  • a substantially spherical tissue was formed one by one in a floating state.
  • a smaller-diameter tissue body was formed on the base material surface having a small center distance in the surface region than on the base material surface having a large center distance.
  • FIG. 25 is an example of calibration data obtained in Example 6 and showing the correlation between the diameters of the tissue bodies formed in the specific regions of the three types of substrate surfaces and the center interval. .
  • the horizontal axis represents the center distance ( ⁇ m) between the specific region where the tissue is formed and each adjacent region, and the vertical axis represents the diameter (m) of the tissue.
  • Each symbol shows the average value of the measured values.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region was substantially proportional to the center distance between the specific region and each adjacent region.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region is 152 ⁇ 9 ⁇ m force and 192 ⁇ 7 / zm. It increased linearly with the increase.
  • Example 7 as in Example 5 described above, the surface of the cavity is regularly formed with a plurality of surface area forces having a diameter of 300 m at a center interval of 330 ⁇ m, 440 ⁇ m, or 550 ⁇ m.
  • Three types of substrate surfaces including a plurality of arranged hexagonal sets were prepared, and mouse ES similar to that used in Example 4 above was used as a proliferative cell in each surface region of each substrate surface.
  • Cells 129SV strain, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
  • the culture was started by seeding 1.0 ⁇ 10 5 mouse ES cells per 10 mm ⁇ 10 mm rectangular area on the substrate surface where the cavity was formed.
  • the culture solution used was the same as in Example 4 above.
  • FIG. 26 is a phase contrast micrograph of a part of the tissue formed on each surface region of the three types of substrate surfaces on the 10th day of culture.
  • 26A, 26B, and 26C are formed in a specific area with a diameter of 300 m on the substrate surface of medium, f3 ⁇ 4 distance, 330 ⁇ m, 440 ⁇ m, and 550 ⁇ m, respectively. Shown are the tissue bodies T60, ⁇ 61, and ⁇ 62.
  • FIGS. 26A to 26C in each of the cavities 100 on the surface of each base material, one substantially spherical tissue was formed in a floating state.
  • a smaller-diameter tissue body was formed on the base material surface having a small center distance in the surface region than on the base material surface having a large center distance.
  • FIG. 27 is an example of calibration data obtained in Example 7 and showing the correlation between the diameter of the tissue body formed in each specific region of the three types of substrate surfaces and the center interval. .
  • the horizontal axis represents the center distance ( ⁇ m) between the specific region where the tissue is formed and each adjacent region, and the vertical axis represents the diameter (m) of the tissue.
  • Each symbol shows the average value of the measured values.
  • the diameter of the tissue formed in the specific region was substantially proportional to the center distance between the specific region and each adjacent region.
  • the center distance in the range where the center distance is at least 330 ⁇ m force to 550 ⁇ m, the diameter of the tissue formed in the specific region is 182 ⁇ 12 / ⁇ ⁇ force and the like, and the center distance is 215 ⁇ 11 m. It increased linearly with the increase.

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Abstract

　増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズを確実に制御できる組織体形成方法を提供する。 　増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、所定面積をもち、細胞を保持できる特定表面領域（２１）、及び特定表面領域に隣接して配置され、前記所定面積をもち、細胞を保持できる複数の隣接表面領域であって、その各々の重心点から、特定表面領域の重心点までの距離Ｌ２が互いに等しくなるよう配置された複数の隣接表面領域（２２）、が形成された基材を少なくとも一つ準備し、基材のうち、特定表面領域（２１）及び各隣接表面領域（２２）のそれぞれで細胞を培養することによって、特定表面領域（２１）及び各隣接表面領域（２２）のそれぞれで三次元組織体を形成させ、基材の距離Ｌ２を変化させることによって、特定表面領域（２１）に形成される三次元組織体のサイズを、距離Ｌ２に応じて制御する組織体形成方法とする。

Description

明 細 書
組織体形成方法及び組織体形成キット
技術分野
[0001] 本発明は、細胞を含む三次元組織体の形成に関し、特に増殖性の細胞を含む三 次元組織体のサイズの制御に関する。
背景技術
[0002] 培養細胞は、三次元的に集合して組織体を形成した場合には、例えば、基材表面 に二次元的に接着して、いわゆる単層を形成した場合に比べて、より長期間生存し、 生体内における本来の機能をより高いレベルで発現することが報告されている。この ため、培養細胞から三次元組織体を形成する技術は、例えば、生体の挙動を再現す るシミュレータ、薬品開発における動物実験の代替技術、細胞移植による再生医療 技術等への応用が期待されて ヽる。
[0003] そこで、従来、例えば、特許文献 1には、基材に形成された細胞非接着性表面をも つゥ ル内で初代肝細胞を培養することにより、当該ゥエル内で当該初代肝細胞が 三次元的に集合した組織体を形成させることが記載されて 、る。この特許文献 1には 、ゥエル内に入れる細胞の数を変えることにより、組織体のサイズを制御することが記 載されている。
[0004] 一方、例えば、特許文献 2には、基材の表面に規則的に配置された複数の小領域 で内皮細胞を二次元的に培養した後、当該内皮細胞の単層上で初代肝細胞を培養 することによって、当該単層上で当該初代肝細胞が三次元的に集合した組織体を形 成させることが記載されている。この特許文献 2には、互いに隣接して形成される複 数の組織体同士の接着を防止するために、複数の小領域の間隔を所定値以上にす べきことが記載されている。
特許文献 1：特許第 3270286号公報
特許文献 2：国際公開第 03Z010302号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0005] し力しながら、上記特許文献 1に記載の技術にお!、ては、例えば、形成された三次 元組織体が増殖性の細胞を含む場合には、当該細胞が増殖することにより、培養時 間の経過に伴って当該三次元組織体のサイズが増加し続けるため、当該三次元組 織体のサイズを一定に制御することは困難であった。また、上記特許文献 2に記載の 技術にお 1、て、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズの増加を抑制する方法 につ ヽては記載されて ヽな 、。
[0006] したがって、従来、例えば、三次元組織体が増殖性の細胞を含む場合には、培養 時間の経過に伴う当該三次元組織体の肥大化によって、その深部の細胞への栄養 や酸素が次第に枯渴するようになるため、当該三次元組織体に含まれる一部又は全 部の細胞が死滅し、又はその機能を失うこととなって 、た。
[0007] 本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、増殖性の細胞を含む三次元組 織体のサイズを制御できる組織体形成方法及び組織体形成キットを提供することを その目的の一つとする。
課題を解決するための手段
[0008] 上記課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る組織体形成方法は、増 殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、所定面積を もち、前記細胞を保持できる特定表面領域、及び前記特定表面領域に隣接して配 置され、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の隣接表面領域であって 、その各々の重心点から、前記特定表面領域の重心点までの距離が互いに等しくな るよう配置された複数の隣接表面領域、が形成された基材を少なくとも一つ準備する 準備工程と、前記基材のうち、前記特定表面領域及び前記各隣接表面領域のそれ ぞれで前記細胞を培養することによって、前記特定表面領域及び前記各隣接表面 領域のそれぞれで前記細胞を含む三次元組織体を形成させる培養工程と、を含み、 前記準備工程で準備する前記基材の前記距離を変化させることによって、前記培養 工程で前記特定表面領域に形成される前記三次元組織体のサイズを、前記距離に 応じて制御することを特徴とする。
[0009] また、前記特定表面領域及び前記隣接表面領域は、細胞接着性であることとしても よい。また、この場合、前記基材の表面のうち、前記特定表面領域を囲む部分は、細 胞非接着性であることとしてもよい。また、前記特定表面領域及び前記隣接表面領 域は、前記基材に形成された有底孔の底面であって、細胞非接着性であることとして ちょい。
[0010] また、前記準備工程において、前記距離が互いに異なる複数の前記基材を準備し
、前記培養工程において、前記複数の基材の前記特定表面領域に、前記距離に応 じて、前記複数の基材間で互いに異なるサイズの前記三次元組織体を形成させるこ ととしてもよい。また、この場合、前記準備工程において、前記距離が前記複数の基 材間で規則的に変化するよう、前記複数の基材を準備し、前記培養工程において、 前記複数の基材の前記特定表面領域に、前記複数の基材間で前記距離に応じて サイズが規則的に変化した三次元組織体を形成させることとしてもよい。
[0011] また、前記培養工程において、前記特定表面領域に、前記距離に応じた径の略球 形状の三次元組織体を形成させることとしてもよい。また、前記特定表面領域と前記 複数の隣接表面領域とは、前記特定表面領域の重心点が、前記複数の隣接表面領 域の各々の重心点を結んで形成される多角形の中に位置するよう配置されることとし てもよい。また、前記準備工程で準備する前記基材の前記距離と、前記培養工程で 形成される前記三次元組織体のサイズと、の相関関係を示す検量データを取得する 工程をさらに含むこととしてもょ 、。
[0012] また、上記課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る組織体形成方法は
、基材表面に互いに離間して配置された所定面積をもつ複数の表面領域のうち、第 一の表面領域と、前記第一の表面領域に隣接して配置された複数の第二の表面領 域であって、その各々の重心点から、前記第一の表面領域の重心点までの距離が 互いに等しくなるよう配置された複数の第二の表面領域と、のそれぞれで増殖性の 細胞を含む三次元組織体を形成させる場合における、前記第一の表面領域で形成 される三次元組織体のサイズと、前記距離と、の相関関係を示す検量データに基づ
Vヽて、所望のサイズの三次元組織体を形成させるための前記距離を決定する決定ェ 程と、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる特定表面領域、及び前記特定表 面領域に隣接して配置され、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の隣 接表面領域であって、その各々の重心点から、前記特定表面領域の重心点までの 距離が、前記決定工程で決定された距離となるよう配置された複数の隣接表面領域 、が形成された基材を準備する工程と、前記特定表面領域及び前記各隣接表面領 域のそれぞれで前記細胞を培養することにより、前記特定表面領域に、前記細胞を 含む、前記所望のサイズの三次元組織体を形成させる工程と、を含むことを特徴とす る。また、前記検量データは、前記検量データ取得工程を含む組織体形成方法を用 V、て取得された検量データであることとしてもよ 、。
[0013] また、上記課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る組織体形成キット は、増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成するための組織体形成キットであって 、所定面積をもち、前記細胞を保持できる第一特定表面領域、及び前記第一特定表 面領域に隣接して配置された、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の 第一隣接表面領域であって、その各々の重心点から、前記第一特定表面領域の重 心点までの距離が互いに等しい第一距離となるよう配置された複数の第一隣接表面 領域、が形成された第一基材と、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる第二 特定表面領域、及び前記第二特定表面領域に隣接して配置された、前記所定面積 をもち、前記細胞を保持できる複数の第二隣接表面領域であって、その各々の重心 点から、前記第二特定表面領域の重心点までの距離が互いに等しぐ且つ前記第 一距離と異なる第二距離となるよう配置された複数の第二隣接表面領域、が形成さ れた第二基材と、を含むことを特徴とする。また、前記第一基材と前記第二基材とは 、一つの基材のうち互いに異なる部分であることとしてもよ 、。
発明の効果
[0014] 本発明によれば、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズを制御できる組織体 形成方法及び組織体形成キットを提供することができる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる基材表面の一例につ いての説明図である。
[図 2]本実施形態に係る組織体形成方法にお ヽて用いられる基材表面の他の例に ついての説明図である。
[図 3]本実施形態に係る組織体形成方法にお ヽて用いられる領域セットの一例につ いての説明図である。
[図 4]本実施形態に係る組織体形成方法にお ヽて用いられる、重心間隔が互いに異 なる複数の領域セットの一例についての説明図である。
圆 5]本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる、複数の領域セットが 形成された基材表面の一例についての説明図である。
[図 6]本実施形態に係る組織体形成方法にお ヽて用いられる領域セットの他の例に ついての説明図である。
[図 7]本実施形態に係る組織体形成方法にお ヽて用いられる領域セットのさらに他の 例についての説明図である。
[図 8]本実施形態に係る組織体形成方法にぉ ヽて用いられる領域セットのさらに他の 例についての説明図である。
[図 9]本実施形態に係る組織体形成方法にぉ ヽて用いられる領域セットのさらに他の 例についての説明図である。
[図 10]本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる基材表面のさらに他 の例についての説明図である。
[図 11]実施例 1にお 、て、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の 一例につ 、ての位相差顕微鏡写真である。
[図 12]実施例 1にお 、て、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の 直径と培養時間との関係の一例を示すグラフである。
[図 13]実施例 1において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検 量データの一例である。
圆 14]実施例 1において、隣接領域との位置関係が互いに異なる特定領域で形成さ れた組織体の一例につ 、ての位相差顕微鏡写真である。
圆 15]実施例 1において、隣接領域との位置関係が互いに異なる特定領域で形成さ れた組織体の直径と培養時間との関係の一例を示すグラフである。
[図 16]実施例 2において、中心間隔が互いに等しぐ直径が互いに異なる表面領域 で形成された組織体の一例につ ヽての位相差顕微鏡写真である。
[図 17]実施例 2において、中心間隔が互いに等しぐ直径が互いに異なる表面領域 で形成された組織体の直径と培養時間との関係の一例を示すグラフである。
[図 18]実施例 3にお 、て、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の 一例につ 、ての位相差顕微鏡写真である。
[図 19]実施例 3において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検 量データの一例である。
[図 20]実施例 4にお 、て、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の 一例につ 、ての位相差顕微鏡写真である。
[図 21]実施例 4において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検 量データの一例である。
[図 22]実施例 5にお 、て、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の 一例につ 、ての位相差顕微鏡写真である。
[図 23]実施例 5において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検 量データの一例である。
[図 24]実施例 6にお 、て、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の 一例につ 、ての位相差顕微鏡写真である。
[図 25]実施例 6において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検 量データの一例である。
[図 26]実施例 7にお 、て、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の 一例につ 、ての位相差顕微鏡写真である。
[図 27]実施例 7において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検 量データの一例である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の一実施形態に係る組織体形成方法及び組織体形成キットにつ いて、図面を参照しつつ説明する。本実施形態に係る組織体形成方法 (以下、「本 方法」という）は、所定の面積をもつ複数の表面領域が互いに離間して配置された基 材表面を少なくとも一つ準備する工程 (以下、「準備工程」という）と、当該基材表面の うち、当該各表面領域で増殖性の細胞を培養することにより、当該各表面領域に当 該細胞を含む三次元組織体 (以下、「組織体」という）を形成させる工程 (以下、「培養 工程」という）と、を含む。
[0017] まず、準備工程について説明する。図 1は、この準備工程で準備する基材の一例 についての説明図である。また、図 2は、この準備工程で準備する基材の他の例に ついての説明図である。図 1及び図 2に示すように、準備工程では、直径が互いに等 しい円形状の複数の表面領域 3a, 3bが規則的に配置された平板状の基材 1の表面 2を準備する。この基材 1の材質は特に限られず、例えば、ガラス、合成樹脂、 EPD M (Ethylene Propylene Diene Monomer)等の合成ゴム、天然ゴム、セラミツ ク、ステンレス鋼等力も成形される。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエ チレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアタリレート、ポリメタク リレート、ポリビュル、シリコン等を好ましく用いることができる。
[0018] 図 1に示す基材 1に形成された各表面領域 3aは細胞接着性の表面である。ここで、 細胞接着性の表面とは、例えば、培養液等の溶液中において、細胞が接着可能な 特性を示す表面である。したがって、例えば、培養液中において、表面領域 3aに沈 降した細胞は、その形状を、培養時間の経過に伴って、球形から比較的扁平な形状 に変化させつつ、当該表面領域 3aに接着する。
[0019] 具体的に、この表面領域 3aは、例えば、基材 1そのものの表面が、培養液等の溶 液中において、細胞が接着可能な荷電状態や親水性'疎水性を示す場合には、当 該基材 1そのものの表面を露出させた領域として形成できる。また、この表面領域 3a は、例えば、基材表面 2の一部に、生体から取得され若しくは合成された細胞接着性 物質又はこれらの誘導体が固定された領域として形成できる。
[0020] この細胞接着性物質としては、例えば、表面領域 3aで培養する細胞の細胞膜に存 する細胞表面分子 (例えば、インテグリンや糖鎖受容体等）のうち特定のものに対し て結合し得る物質を用いることができる。具体的に、生体から取得された細胞接着性 物質としては、例えば、コラーゲン、フイブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックス を好ましく用いることができる。また、合成された細胞接着性物質としては、例えば、 細胞接着性を示す特定のアミノ酸配列（例えば、アルギニン'グリシン'ァスパラギン 酸配列 ( 、わゆる RGD配列)等)や特定の糖鎖配列 (例えば、ガラクトース側鎖等)を 有する化合物等を好ましく用いることができる。また、これら細胞接着性物質の誘導 体としては、例えば、当該細胞接着性物質に任意の官能基や高分子鎖等を、所定の 化学反応 (例えば、カルボキシル基ゃァミノ基等の間の縮合反応)等によって結合さ せたものを好ましく用いることができる。
[0021] これら細胞接着性物質又はその誘導体は、例えば、当該細胞接着性物質又はそ の誘導体を含む水溶液を、基材表面 2のうち各表面領域 3aを形成させる部分で乾燥 させることにより、当該各部分に固定できる。また、これらの細胞接着性物質又はその 誘導体は、例えば、当該細胞接着性物質又はその誘導体を含む水溶液中において 、当該細胞接着性物質又はその誘導体が有する官能基と、基材表面 2のうち各表面 領域 3aを形成させる部分に露出している官能基と、を所定の化学反応 (例えば、チ オール基と金表面等との化学吸着反応や、カルボキシル基ゃァミノ基等の間の縮合 反応)等によって結合させることにより、当該部分に固定できる。
[0022] また、図 1に示す基材表面 2のうち、複数の表面領域 3a以外の部分は、細胞非接 着性の周辺表面 4である。すなわち、各表面領域 3aは、細胞非接着性の周辺表面 4 によって囲まれている。また、図 2に示す基材 1には所定の深さをもつ複数の有底孔（ 以下、「キヤビティ 100」という）が規則的に配置するよう形成されており、各表面領域 3bは、各キヤビティ 100の底面として形成されている。そして、この図 2に示す基材表 面 2は、その全体が細胞非接着性である。すなわち、基材表面 2のうち、キヤビティ 10 0が形成されている部分以外の部分である周辺表面 4と、当該キヤビティ 100内の表 面領域 3bと、はいずれも細胞非接着性の表面である。ここで、細胞非接着性の表面 とは、例えば、培養液等の水溶液中において、細胞の接着に不適切な特性を示す 表面である。したがって、例えば、培養液中において周辺表面 4又は表面領域 3bに 沈降した細胞は、その形状を球状力 ほとんど変化させず、当該周辺表面 4又は表 面領域 3bに実質的に接着できない。すなわち、周辺表面 4又は表面領域 3bに沈降 した細胞は、当該周辺表面 4又は表面領域 3bに全く接着できずに培養液中で浮遊 し、又はいつたん接着したとしても、所定の培養時間経過後には培養液の流れ等に よって容易に脱着する。
[0023] 具体的に、この周辺表面 4及び表面領域 3bは、例えば、基材 1そのものの表面が、 培養液等の水溶液中において、細胞の接着に不適切な荷電状態や親水性 ·疎水性 を示す場合には、当該基材 1そのものの表面を露出させた領域として形成できる。ま た、この周辺表面 4及び表面領域 3bは、例えば、基材表面 2の一部に、生体から取 得され若しくは合成された細胞非接着性物質又はこれらの誘導体が固定された領域 として形成することができる。
[0024] この細胞非接着性物質としては、例えば、表面領域 3a, 3bで培養する細胞の細胞 膜に存する細胞表面分子に対して結合しない物質を用いることができる。具体的に、 生体から取得された細胞非接着性物質としては、例えば、アルブミン等の高い親水 性を示すたんぱく質等を好ましく用いることができる。また、合成された細胞非接着性 物質としては、例えば、ポリエチレングリコール等の極めて高い親水性を示す高分子 鎖を含む化合物や、 MPC (2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン）、 poly— HEMA (ポリヒドロキシェチノレメタタリレート）、 SPC (セグメントィ匕ポリウレタン）等を好 ましく用いることができる。また、これら細胞非接着性物質の誘導体としては、例えば 、当該細胞非接着性物質に任意の官能基や高分子鎖等を、所定の化学反応等によ つて結合させたものを好ましく用いることができる。
[0025] これら細胞非接着性物質又はその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質又 はその誘導体を含む水溶液を、図 1に示す基材表面 2のうち各表面領域 3aを囲む部 分、又は図 2に示す各表面領域 3b及び周辺表面 4で乾燥させることにより、当該各 表面領域 3aを囲む部分、又は当該各表面領域 3b及び周辺表面 4に固定できる。ま た、これら細胞非接着性物質又はその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質 又はその誘導体を含む水溶液中にぉ 、て、当該細胞非接着性物質又はその誘導 体が有する官能基と、基材表面 2のうち各表面領域 3aを囲む部分、又は図 2に示す 各表面領域 3b及び周辺表面 4に露出している官能基と、を所定の化学反応等によつ て結合させることにより、当該各表面領域 3aを囲む部分、又は当該各表面領域 3b及 び周辺表面 4に固定できる。
[0026] また、図 2に示す基材 1のキヤビティ 100は、当該基材 1の材質等に応じて選択され る任意の加工方法を用いて、基材表面 2の一部に形成することができる。具体的に、 例えば、このキヤビティ 100は、マシユングセンタ等を用いた穿孔力卩ェ、レーザー等を 用いた光微細加工、エッチング力卩ェ、エンボスカ卩ェ等により基材表面 2に形成し、又 は射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィ一等による基材 1の成形時に形成する ことができる。
[0027] このようなカ卩ェ方法により、キヤビティ 100は、例えば、所定厚さの基材 1の表面 2に 、当該基材 1の厚さより小さい深さをもつ有底孔として形成することができる。また、こ のキヤビティ 100は、例えば、基材 1を貫通する穴を形成した後に、当該基材 1の片 面に他の部材を貼り合わせて底面とすることにより有底孔として形成することができる 。このキヤビティ 100の底面を形成するための部材としては、例えば、当該貫通孔を 形成した基材 1と同じ又は異なる材質の基板やフィルム等を用いることができる。
[0028] また、複数のキヤビティ 100は、例えば、 CAD (Computer Aided Design)プロ グラムにより加工位置を精密に制御するマシユングセンタ等を用いることにより、図 2 に示すように、基材 1上に、円形の底面の中心間の距離が一定の間隔となるよう規則 的に形成することができる。
[0029] また、図 1に示す基材表面 2は、各表面領域 3aと周辺表面 4とを含むその全体が実 質的に平坦な表面となっている。すなわち、各表面領域 3a及び周辺表面 4はそれぞ れ実質的に平坦な表面であるとともに、基材表面 2の全体が実質的に平坦な表面を 構成するよう互いに連なっている。ここで、実質的に平坦な表面とは、例えば、当該 表面の凹凸 (例えば、各表面領域 3aと周辺表面 4との段差)が細胞 1個分の厚みより 小さい程度に小さい表面をいう。また、図 2に示す基材表面 2のうち、各表面領域 3b 及び周辺領域 4もまたそれぞれ実質的に平坦な表面として形成されている。
[0030] また、各表面領域 3a及び各表面領域 3bの面積は、当該各表面領域 3a及び各表 面領域 3bで培養する細胞のサイズがその種類や状態等によって異なるため一概に は言えないが、例えば、 300-1 X 106 m2の範囲であることが好ましぐ特に 5000 〜2 Χ 105 /ζ πι2の範囲であることが好ましい。すなわち、図 1及び図 2に示す各表面 領域 3a及び各表面領域 3bの直径は、当該各表面領域 3a及び各表面領域 3bで培 養する細胞の直径の 2〜50倍程度の範囲であることが好ましぐ特に 5倍〜 30倍程 度の範囲であることが好ましい。これは、細胞は各表面領域 3a及び各表面領域 3b上 で三次元的に集合して組織体を形成することから、当該各表面領域 3a及び各表面 領域 3bの面積は、当該組織体に含まれる細胞の数を規定するためである。すなわち 、各表面領域 3a及び各表面領域 3bの面積が 300 m2又は細胞の直径の 2倍より小 さい場合には、例えば、組織体を形成するために必要な数の細胞が当該各表面領 域 3aに接着できず、また、当該必要な数の細胞を各表面領域 3b上に保持できない 。また、各表面領域 3a及び各表面領域 3bの面積が 1 X 106 m2又は細胞の直径の 50倍より大きい場合には、当該各表面領域 3a及び各表面領域 3bで形成される組織 体が大きくなりすぎるため、例えば、当該組織体の深部に含まれる細胞が、当該組織 体外の培養液等力 栄養や酸素を十分に受けることができずに死滅し、又はその機 能を失ってしまうことがあるためである。
[0031] また、図 2に示す基材 1のキヤビティ 100の深さは、用いる細胞の径の 1〜100倍程 度の範囲であることが好ましぐ特に 2倍〜 50倍程度の範囲であることが好適である。 これは、キヤビティ 100の深さが上記下限値より小さい場合には、当該キヤビティ 100 内から細胞がこぼれることにより、細胞を表面領域 3b上に確実に保持することが困難 となるためである。また、キヤビティ 100の深さが上記上限値より大きい場合には、当 該キヤビティ 100内の表面領域 3b上で保持されている細胞に対する酸素や栄養分 の供給が不十分となることがあるためである。
[0032] また、基材表面 2は、本方法にお!、て組織体のサイズを制御するために必要な最 低限の数の表面領域 3a又は表面領域 3bを有する領域セットを少なくとも 1つ含んで いる。すなわち、この領域セットは、複数の表面領域 3a又は表面領域 3bの一部分で ある、 1つの特定の表面領域 (以下、「特定領域」という）と、当該特定領域の周辺に、 当該特定領域に隣接して配置される複数の表面領域 (以下、「隣接領域」という）と、 を有する。領域セットに含まれる複数の隣接領域は、その各々の重心点（円形の隣 接領域における円の中心点、四角形の隣接領域における対角線の交点等)から、当 該領域セットに含まれる特定領域の重心点までの距離 (以下、「重心間隔」という）が 互いに等しくなるよう配置されて 、る。
[0033] ここで、本方法に特徴的なことの一つは、準備工程で準備する基材表面 2に含まれ る領域セットの重心間隔を変化させることによって、培養工程で特定領域に形成され る、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズを、当該重心間隔に応じて制御でき る点である。すなわち、例えば、準備工程において所定の重心間隔の領域セットを含 む基材表面 2を準備することによって、培養工程において、少なくとも当該領域セット の特定領域に、当該重心間隔によって規定される所定のサイズの組織体を形成でき る。
[0034] 具体的に、例えば、準備工程において特定領域と各隣接領域とが第一の重心間隔 で互いに離間して配置された領域セットを含む第一の基材表面を準備した場合には 、培養工程において当該第一の重心間隔に応じた第一のサイズの組織体を形成で き、準備工程において特定領域と各隣接領域とが当該第一の重心間隔より小さい第 二の重心間隔で互いに離間して配置された領域セットを含む第二の基材表面を準 備した場合には、培養工程において、当該第二の重心間隔と当該第一の重心間隔 との比率に応じた、当該第一のサイズより小さい第二のサイズの組織体を形成できる 。したがって、例えば、準備工程において互いに重心間隔が一定の規則に従って段 階的に変化する複数の基材表面を準備した場合には、培養工程において、当該複 数の基材表面の複数の特定領域に、当該一定の規則に従って当該複数の基材表 面間で段階的に変化するサイズの組織体を形成できる。ここで、重心間隔が一定の 規則に従って変化する場合としては、例えば、 1つの基材表面の重心間隔に対して、 他の 1又は複数の基材表面の重心間隔が、所定の長さずつ変化し、所定の倍率で 変化し、又は所定の関数に従って変化する場合等を挙げることができる。
[0035] このように、本方法によれば、例えば、重心間隔によって規定される所望サイズの複 数の組織体が規則的且つ高密度に配置された組織体アレイチップを得ることができ る。また、本方法によれば、例えば、培養する細胞の種類ごとに、所望のサイズの組 織体を形成するために設定すべき重心間隔をスクリーニングすることができる。
[0036] なお、特定領域の辺縁部と各隣接領域の辺縁部との最短距離 (すなわち、例えば 、円形状の表面領域 3a及び表面領域 3bについては、特定領域の円周部と各隣接 領域の円周部との最短距離)は、当該特定領域及び各隣接領域で培養する細胞の サイズがその種類や状態等によって異なるため一概には言えないが、 50-1000 μ mの範囲であることが好ましぐ特に 100〜700 /ζ πιの範囲であることが好ましい。こ れは、この最短距離が 50 mより小さい場合には、例えば、特定領域に形成される 組織体と隣接領域に形成される組織体との間で融合や架橋が起こり、当該複数の組 織体が互いに接着した組織体が形成されることにより、組織体のサイズを厳密に制御 できない場合があるためである。また、最短距離が 1000 /z mより大きい場合には、特 定領域に形成される組織体と隣接領域に形成される組織体との距離が大き ヽために 、例えば、複数の組織体を高密度に配置した組織体アレイを得ることができない。
[0037] 図 3は、図 1及び図 2に示す基材表面 2に形成された領域セット 10についての説明 図である。この領域セット 10は、基材表面 2に形成された複数の表面領域 3a又は表 面領域 3b (図 1及び図 2参照）のうちの 1つである特定領域 11 (図 3においてハツチン グを施して示す領域）と、当該複数の表面領域 3a又は表面領域 3bのうちの他の一部 であって、当該特定領域 11を囲むように配置された 6つの隣接領域 12と、を有して いる。特定領域 11及び各隣接領域 12は、互いに等しい直径 D1の円形状である。そ して、特定領域 11の中心点 11cと、各隣接領域 12の中心点 12cと、の距離 (以下、「 中心間隔」という）は、互いに等しい一定値 L1となっている。また、特定領域 11は、そ の中心点 11cが、 6つの隣接領域 12の各々の中心点 12cを結んで形成される正六 角形 P1の重心点と一致するよう、その全体が当該正六角形 P1の中に位置するよう 配置されている。また、この領域セット 10においては、正六角形 P1の 6つの辺の各々 の長さ Mlは、中心間隔 L1と同一になっている。
[0038] 図 4は、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットの一例についての説明図であ る。図 4Aに示す第一領域セット 20は、互いに等しい一定の直径 D2の円形状領域と して形成された 1つの特定領域 21及び 6つの隣接領域 22を有している。特定領域 2 1と各隣接領域 22との中心間隔 L2は、互いに等しくなつている。また、図 4Bに示す 第二領域セット 30は、第一領域セット 20に含まれる特定領域 21及び各隣接領域 22 と同一の直径 D2の円形状領域として形成された 1つの特定領域 31及び 6つの隣接 領域 32を有し、当該特定領域 31と各隣接領域 32との中心間隔 L3は、当該第一領 域セット 20の中心間隔 L2より大きくなつている。また、図 4Cに示す第三領域セット 40 は、第一領域セット 20に含まれる特定領域 21及び各隣接領域 22と同一の直径 D2 の円形状領域として形成された 1つの特定領域 41及び 6つの隣接領域 42を有し、当 該特定領域 41と各隣接領域 42との中心間隔 L4は、第二領域セット 30の中心間隔 L 3よりさらに大きくなつている。
[0039] 準備工程においては、例えば、図 4に示すような、互いに等しい直径 D2の特定領 域 21 , 31, 41及び隣接領域 22, 32, 42を有し、各隣接領域 22, 32, 42の中心点 22c, 32c, 42cを結んで形成される正六角形 P2, P3, P4が互いに相似となる第一 領域セット 20、第二領域セット 30、又は第三領域セット 40のうち、互いに異なるいず れか 1つの領域セットが形成された複数の基材表面を準備する。すなわち、この準備 工程においては、例えば、第一領域セット 20が少なくとも 1つ形成された第一基材表 面と、第二領域セット 30が少なくとも一つ形成された第二基材表面と、第三領域セッ ト 40が少なくとも一つ形成された第三基材表面と、を準備する。なお、この場合の第 一基材表面、第二基材表面、及び第三基材表面は、例えば、互いに別体に成形さ れた 3つの基材の各々の表面として準備されてもょ 、し、 1つの基材の 1つの表面の うち互 ヽに異なる 3つの部分として準備されてもょ 、。
[0040] なお、領域セットは、複数の表面領域のうちの 1つを特定領域として着目することに よって便宜的に特定される。したがって、ある領域セットの特定領域力 他の領域セッ トの複数の隣接領域のうちの 1つである場合もある。図 5は、基材表面 2に形成された 複数の表面領域 3cのうち、複数の領域セットを含む一部分についての説明図である 。図 5Aに示す領域セット 50は、複数の表面領域 3cのうち、ハッチングを施して示す 1つの表面領域 51を特定領域として着目するとともに、当該表面領域 51に隣接する 6つの表面領域 52a, 52b, 52c, 52d, 52e, 52fを隣接領域として着目することによ り特定される。一方、図 5Bに示すように、複数の表面領域 3cのうち、図 5Aに示す領 域セット 50に含まれる 6つの隣接領域 52a, 52b, 52c, 52d, 52e, 52fのうち、黒塗 りで示す 1つの表面領域 52aを特定領域として着目した場合には、図 5Aに示す領域 セットの特定領域 51を 6つの隣接領域のうちの 1つとして含む他の領域セット 55が特 定される。
[0041] また、領域セットに含まれる隣接領域の数や特定領域と隣接領域との位置関係は 図 1〜図 5に示すものに限られない。図 6は、領域セットの他の例についての説明図 である。図 6に示す領域セット 60は、互いに等しい直径 D6の円形状に形成された 1 つの特定領域 61 (図 6においてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域 61 の周辺に配置された 3つの隣接領域 62と、を有し、当該特定領域 61と当該各隣接 領域 62との中心間隔 L6は互いに等しくなつている。そして、特定領域 61は、その中 心点 61cが、 3つの隣接領域 62の各々の中心点 62cを結んで形成される正三角形 P 6の重心に一致するよう当該正三角形 P6の中に配置されている。また、この領域セッ ト 60において、正三角形 P6の 3つの辺の各々の長さ M6は、中心間隔 L6より大きく なっている。
[0042] また、図 7は、領域セットのさらに他の例についての説明図である。図 7Aに示す領 域セット 70は、互いに等しい直径 D7の円形状に形成された 1つの特定領域 71 (図 7 A及び図 7Bにおいてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域 71の周辺に配 置された 4つの隣接領域 72と、を有し、当該特定領域 71と当該各隣接領域 72との中 心間隔 L7は互いに等しくなつている。そして、特定領域 71は、その中心点 71cが、 4 つの隣接領域 72の各々の中心点 72cを結んで形成される正方形 P7の中に位置す るよう当該四角形 P7の中に配置されている。また、この領域セット 70において、正方 形 P7の 4つの辺の各々の長さ M7は、中心間隔 L7より大きくなつている。また、この 場合、準備工程においては、例えば、図 7Bに示すように、その一部に図 7Aに示す 領域セット 70を含むよう、縦横に一定の中心間隔 L7で規則的に配置される複数の 表面領域 3dが形成された基材表面を準備する。
[0043] また、図 8は、領域セットのさらに他の例についての説明図である。図 8Aに示す領 域セット 80は、互いに等しい直径 D8の円形状に形成された 1つの特定領域 81 (図 8 A及び図 8Bにおいてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域 81を挟むよう に配置された 2つの隣接領域 82と、を有し、当該特定領域 81と当該各隣接領域 82と の中心間隔 L8は互いに等しくなつている。そして、特定領域 81は、その中心点 81c 力 2つの隣接領域 82の各々の中心点 82cを結ぶ直線 N8の上に位置するよう配置 されている。すなわち、特定領域 81の中心点 81cは、直線 N8の中点に位置している 。また、この場合、準備工程においては、例えば、図 8Bに示すように、その一部に図 8Aに示す領域セット 80を含むよう、複数の表面領域 3eが一定の中心間隔 L8で直 列に配置されるとともに、当該複数の表面領域 3eを含む列が、互いに平行に複数配 置された基材表面を準備する。なお、図 8Bにおいて、隣接する 2つの列に含まれる 表面領域 3eの中心点 8c間の最短距離 Q8は、領域セット 80の中心間隔 L8より大きく なっている。
[0044] また、図 9は、領域セットのさらに他の例についての説明図である。図 9Aに示す領 域セット 90は、互いに等しい直径 D9の円形状に形成された 1つの特定領域 91 (図 9 A及び図 9Bにおいてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域 91の周辺に配 置された 3つの隣接領域 92と、を有し、当該特定領域 91と当該各隣接領域 92との中 心間隔 L9は互いに等しくなつている。そして、特定領域 91は、その中心点 91cが、 3 つの隣接領域 92の各々の中心点 92cを結んで形成される二等辺三角形 P9の 3つの 辺のうち最も長 、辺の中点と一致するよう、その半分が当該二等辺三角形 P9の中に 配置されている。また、この場合、準備工程においては、例えば、図 9Bに示すように 、その一部に図 9Aに示す領域セット 90を含むよう、複数の表面領域 3fが縦横に一 定の中心間隔 L9で 2列に配置されるとともに、当該 2列の単位力 互いに平行に複 数配置された基材表面を準備する。なお、図 9Bにおいて、隣接する 2つの 2列単位 に含まれる表面領域 3fの中心点 9c間の最短距離 Q9は、領域セット 90の中心間隔 L 9より大きくなつている。
[0045] なお、各表面領域の形状は、上述のような円形状に限られず、例えば、楕円形状 や多角形であってもよい。また、隣接領域の重心点を結んで形成される多角形は、 正多角形に限られず、例えば、その他の多角形であってもよい。また、各表面領域が 形成される基材は、平板に限られず、例えば、可撓性の高いフィルムや膜等であって もよい。また、細胞非接着性の周辺表面に囲まれた細胞接着性の表面領域は、図 2 に示すようなキヤビティの底面の一部として形成されてもよい。すなわち、例えば、キ ャビティの円形底面の一部であって、その中央部分に細胞接着性の表面領域を形 成するとともに、当該表面領域を囲む当該円形底面の他の一部又は残りの部分全体 を細胞非接着性の周辺表面として形成することもできる。
[0046] また、細胞接着性の表面領域を含む基材表面は、図 1に示すようにその全体が平 坦なものに限られない。図 10は、細胞接着性の表面領域が形成された基材表面の 他の例についての説明図である。図 10に示す基材 1の表面 2には、当該表面 2に所 定の高さをもって凸設された複数の円柱体 101が規則的に配置され、当該複数の円 柱体 101の各々の上端面として各表面領域 3gが形成されている。また、基材表面 2 のうち、各表面領域 3gが形成された円柱体 101以外の部分である周辺表面 4は細胞 非接着性としてもよい。なお、図 10に示す各表面領域 3g及び当該各表面領域 3gを 囲む周辺表面 4はそれぞれ実質的に平坦な表面となっている。
[0047] 次に、培養工程について説明する。この培養工程においては、基材表面のうち、各 領域セットに含まれる特定領域及び各隣接領域で増殖性の細胞を培養する。ここで 、培養する細胞としては、所定の培養条件下で、増殖性を有し、且つ細胞同士が三 次元的に集合して立体的な組織体を形成できるものであれば、由来する動物種や臓 器'組織の種類等を問わず任意の細胞を用いることができる。具体的に、この細胞と しては、例えば、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、サル、ブタ、ィヌ、ラット、マウス等） 由来の肝臓、脾臓、腎臓、神経、皮膚等から採取される初代細胞、未分化な幹細胞 、胚由来の ES細胞（Embryonic Stem cell)、榭立されている株化細胞、又はこ れらに遺伝子操作等を施した細胞等であって、増殖可能な細胞を好ましく用いること ができる。また、一種類の細胞を単独で用いることもできるし、二種類以上の細胞を 任意の比率で混在させて用いることもできる。
[0048] また、細胞を培養する際に用いる培養液としては、当該細胞の生存状態や機能等 を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分等を適切な濃度で含む水溶液 であれば任意の組成のものを用いることができる。具体的に、例えば、この培養液と しては、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Mediu m : DMEM)等の基礎培地に、増殖因子や抗生物質等を添加した培養培地や、い わゆる生理食塩水等を好ましく用いることができる。
[0049] この培養工程において、図 1に示す表面領域 3aとして形成された特定領域及び各 隣接領域に接着することにより保持された細胞、及び図 2に示す表面領域 3bとして 形成された特定領域及び各隣接領域に接着することなく保持された細胞は、培養時 間の経過に伴って、当該特定領域及び各隣接領域で次第に重なり合い、三次元的 に集合して、立体的な組織体を形成する。すなわち、細胞接着性の表面領域 3a〖こ 係る特定領域及び各隣接領域に接着した細胞は、例えば、まず当該特定領域及び 当該各隣接領域で二次元的に増殖し、その後、さらに互いに積み重なるように三次 元的に増殖することにより、所定の厚みをもった組織体を形成する。また、細胞非接 着性の表面領域 3bに係る特定領域及び各隣接領域上に保持された細胞は、キヤビ ティ 100内の溶液中で互いに三次元的に集合しつつ、当該溶液中で浮遊状態を維 持したまま増殖することにより、所定の厚みをもった三次元組織体を形成する。
[0050] この特定領域及び各隣接領域で形成される組織体のサイズは、当該組織体に含ま れる細胞が増殖することによって、培養時間の経過に伴い増加し得る。しかしながら 、本方法においては、少なくとも特定領域に形成された組織体のサイズは、当該特定 領域と各隣接領域との重心間隔に応じた一定値に維持される。すなわち、例えば、 培養工程において特定領域で形成される組織体のサイズは、培養開始後、所定の 期間内は次第に増加するが、当該特定領域と各隣接領域との重心間隔によって規 定される所定値に到達した後は、その増加が制限されて、その後の培養期間を通じ て当該所定値に維持される。
[0051] したがって、例えば、準備工程において、重心間隔が第一の値である領域セットが 形成された第一の基材表面と、重心間隔が当該第一の値の所定倍である第二の基 材表面と、を準備した場合には、培養工程において、第二の基材表面の特定領域に は、第一の基材表面の特定領域に形成される組織体のサイズの当該所定倍のサイ ズの組織体を形成できる。具体的に、例えば、準備工程において、図 4Aに示す第一 の領域セット 20が形成された第一の基材表面と、図 4Bに示す第二の領域セット 30 が形成された第二の基材表面と、を準備した場合には、培養工程において、当該第 二の領域セット 30に含まれる第二の特定領域 31に形成される組織体のサイズの、当 該第一の領域セット 20に含まれる第一の特定領域 21に形成される組織体のサイズ に対する比率は、当該第二の領域セット 30の重心間隔 L3の、当該第一の領域セット 20の重心間隔 L2に対する比率に略等しくなる。
[0052] なお、組織体のサイズとは、例えば、当該組織体の外形を基材表面に投影した場 合の形状の代表長さや、基材表面における組織体の厚みである。すなわち、例えば 、組織体が略球形状である場合 (組織体が細胞接着性の表面領域 3aに接着したド ーム状又は略球形状である場合、組織体が細胞非接着性の表面領域 3bで培養液 中に浮遊した略球形状である場合を含む）には、当該組織体のサイズは、当該組織 体の外形を基材表面に投影した円形状の直径である。このような略球形状の組織体 は、表面領域 3a, 3bの形状に関わらず形成できるが、円形状又は多角形状の表面 領域 3a, 3bで好ましく形成でき、特に円形状の表面領域 3a, 3bで好ましく形成でき る。また、例えば、組織体の外形を基材表面に投影した形状が楕円形である場合に は、当該組織体のサイズは、当該楕円形の長軸又は短軸である。また、例えば、組 織体が基材表面に沿ってひも状に延びる場合には、当該ひも状の組織体のサイズ は、その長軸方向の長さである。また、例えば、組織体が半球形状等のドーム状であ る場合には、当該組織体のサイズは、当該組織体の外形を基材表面に投影した円 形状の直径又は当該基材表面に盛り上がったドーム形状の厚みである。
[0053] また、本方法は、準備工程で準備する基材表面の重心間隔と、培養工程で形成さ れる組織体のサイズと、の相関関係を示す検量データを取得する工程 (以下、「デー タ取得工程」という）を含むこととしてもよい。このデータ取得工程においては、まず培 養工程で形成された組織体のサイズを測定する。すなわち、例えば、位相差顕微鏡 、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡等を用いて、基材表面で形成された組織体を撮影した画 像を取得し、当該画像を所定の画像解析ソフトウェアを備えたコンピュータ上で解析 することにより、当該組織体のサイズを定量的に測定する。
[0054] そして、このデータ取得工程においては、測定された組織体のサイズと、当該組織 体が形成された特定領域と各隣接領域との重心間隔と、を関連付けた検量データを 生成する。すなわち、例えば、図 4Aに示す第一の特定領域 21で第一の直径の球状 組織体が形成され、図 4Bに示す第二の特定領域 31では当該第一の直径より大きい 第二の直径の球状組織体が形成された場合には、当該第一の直径と、当該第一の 特定領域 21に係る第一の重心間隔 L2と、を関連付けるとともに、当該第二の直径と 、当該第二の特定領域 31に係る第二の重心間隔 L3と、を関連付ける。
[0055] この検量データは、例えば、所定のサイズの糸且織体を形成するために設定すべき 重心間隔を規定するデータである。すなわち、この検量データは、例えば、組織体の サイズと、当該サイズの組織体を形成するための重心間隔と、を互いに対応付けた データテーブルや関数等である。
[0056] また、本方法は、検量データ取得工程にお!、て取得された検量データに基づ!/、て 、所望のサイズの組織体を形成させるための重心間隔を決定する工程 (以下、「決定 工程」という）を含むこととしてもよい。この決定工程においては、例えば、既に取得さ れている検量データによって規定される糸且織体のサイズと重心間隔との相関関係か ら、所望のサイズに関連付けられている重心間隔を決定する。すなわち、例えば、検 量データにおいて、図 4Aに示す第一の特定領域 21に係る第一の重心間隔 L2と、 当該第一の特定領域 21で形成される組織体のサイズである第一のサイズと、が関連 付けられて 、る場合であって、当該第一のサイズの組織体を形成した 、場合には、 当該検量データに基づいて、準備工程において準備する基材表面の重心間隔を当 該第一の重心間隔 L2に決定する。この場合、準備工程において、各隣接領域との 重心間隔が決定工程で決定された第一の重心間隔 L2である特定領域を含む領域 セットが複数形成された基材表面を準備する。そして、培養工程において、特定領域 及び各隣接領域のそれぞれで増殖性の細胞を培養することによって、当該特定領域 に、そのサイズが第一のサイズに制御された複数の組織体を形成できる。
[0057] また、例えば、糸且織体のサイズと重心間隔との比例関係を規定する検量データが取 得されている場合には、決定工程において、当該比例関係を規定する関係式に基 づいて、所望のサイズに対応する重心間隔を決定できる。また、所望のサイズの組織 体を形成するための重心間隔力 既に取得されている検量データに基づいて決定で きない場合には、例えば、上述のように、重心間隔が互いに異なる複数の領域セット の各特定領域で組織体を形成させることにより、当該所望のサイズの組織体を形成 するための重心間隔をスクリーニングする。そして、決定工程では、このスクリーニン グにおけるデータ取得工程において取得された検量データに基づいて、所望のサイ ズの組織体が形成された領域セットの重心間隔を当該所望のサイズに対応する重心 間隔として決定する。
[0058] なお、本方法においては、例えば、重心間隔が互いに異なる複数の基材表面につ いて一度に各工程を実施してもよいし、又は、重心間隔が互いに異なる複数の基材 表面のうち、各重心間隔の基材表面について各工程を繰り返してもよい。すなわち、 例えば、第一の重心間隔の第一の基材表面を準備して、当該第一の基材表面で組 織体を形成させる第一のサイクルを実施した後、当該第一の重心間隔とは異なる第 二の重心間隔の第二の基材表面を準備して、当該第二の基材表面で組織体を形成 させる第二のサイクルをさらに実施することとしてもょ 、。
[0059] また、本実施形態に係る組織体形成キット（以下、「本キット」 t 、う）は、重心間隔が 第一の距離となるよう特定領域及び複数の隣接領域が形成された第一の基材と、重 心間隔が当該第一の距離と異なる第二の距離となるよう特定領域及び複数の隣接 領域が形成された第二の基材と、を含む。すなわち、本キットは、重心間隔が互いに 異なる複数の領域セットのうち、互いに異なるいずれか 1つの領域セットが形成された 複数の基材表面を含む。具体的に、例えば、本キットは、図 4Aに示す第一の領域セ ット 20が形成された第一の基材表面と、図 4Bに示す第二の領域セット 30が形成され た第二の基材表面と、図 4Cに示す第三の領域セット 40が形成された第三の基材表 面と、を含む。
[0060] 本キットは、領域セットの重心間隔が互いに異なる複数の基材を、一つの基材のう ち互いに異なる部分として含むこととしてもよい。すなわち、本キットに含まれる、領域 セットの重心間隔が互いに異なる複数の基材表面の各々は、一つの基材の表面のう ち、互いに異なる部分であってもよい。具体的に、例えば、本キットに含まれる基材の 表面の一部には、図 4Aに示す第一の領域セット 20が少なくとも一つ形成され、当該 表面の他の一部には、図 4Bに示す第二の領域セット 30が少なくとも一つ形成され、 当該表面のさらに他の一部には、図 4Cに示す第三の領域セット 40が少なくとも一つ 形成される。なお、本キットは、このように重心間隔の互いに異なる複数の領域セット が互いに異なる表面部分に形成された基材を、複数含むこととしてもよい。
[0061] また、本キットに含まれる、形成されている領域セットの重心間隔が互いに異なる複 数の基材表面の各々は、互いに別体に成形された複数の基材の各々の表面であつ てもよい。すなわち、この場合、例えば、本キットは、図 4Aに示す第一の領域セット 2 0が少なくとも一つ形成された表面を有する第一の基材と、当該第一の基材とは別体 に成形され、図 4Bに示す第二の領域セット 30が少なくとも一つ形成された表面を有 する第二の基材と、当該第一の基材及び当該第二の基材とは別体に成形され、図 4 Cに示す第三の領域セット 40が少なくとも一つ形成された表面を有する第三の基材 と、を含むこととなる。 そして、本キットに含まれる複数の基材表面に形成された特定領域及び各隣接領 域において増殖性の細胞を培養することによって、当該各基材表面の特定領域に、 当該各基材表面の重心間隔によって規定されるサイズの組織体を形成させることが できる。すなわち、上述のように、例えば、本キットが、重心間隔が複数の基材表面間 で規則的に変化するよう、当該複数の基材表面を含む場合には、当該複数の基材 表面の各々の特定領域に形成される組織体のサイズは、当該複数の基材表面間で 、当該重心間隔に応じて規則的に変化することとなる。具体的に、例えば、本キットが 、図 4Aに示す第一の領域セット 20が形成された第一の基材表面と、図 4Bに示す第 二の領域セット 30が形成された第二の基材表面と、図 4Cに示す第三の領域セット 4 0が形成された第三の基材表面と、を含み、当該第一の領域セット 20の中心間隔 L2 、当該第二の領域セット 30の中心間隔 L3、当該第三の領域セット 40の中心間隔 L4 、が一定の割合で順次増加する場合には、当該第一の領域セット 20に形成される第 一の組織体、当該第二の領域セット 30で形成される第二の組織体、当該第三の領 域セット 40で形成される第三の組織体、のサイズもまた、当該一定の割合で順次増 カロするものとすることができる。したがって、本キットによれば、例えば、各基材表面に 、その重心間隔に応じて制御されたサイズの糸且織体が規則的且つ高密度に配置さ れた組織体アレイチップを得ることができる。そして、このような組織体アレイチップを 用いることにより、例えば、細胞の薬剤に対する応答性 (感受性、毒性等）と、当該細 胞から形成された組織体のサイズと、の相関関係を簡便且つ正確に検討することが できる。具体的に、例えば、本キットの基材上に、癌由来細胞力もなり、重心間隔に 応じてサイズが一定の割合で変化する複数の組織を形成させ、抗癌剤を含む培養 液中における当該組織の応答性 (各組織に含まれる細胞の増殖速度、生存率、形態 の変化等)を測定することにより、生体における腫瘍塊のサイズと、当該抗癌剤の薬 効と、の相関関係を予測評価することができる。また、本キットによれば、所望のサイ ズの組織体を形成するための重心間隔を簡便且つ正確にスクリーニングできる。また 、本キットに含まれる基材が細胞接着性の表面領域を有する場合には、各表面領域 で形成された組織体を当該各表面領域に接着させた状態で保持することができる。 また、本キットに含まれる基材が細胞非接着性の表面領域を有する場合には、各表 面領域で形成された組織体は溶液中に浮遊するため、容易に回収することができる
[0063] [実施例 1]
次に、本方法を用いて組織体を形成した第一の実施例について説明する。この実 施例 1では、ガラス製の平板（24mm X 24mm、厚さ 200 μ m)を基材として用い、図 1に示すような基材表面 2を作製した。すなわち、図 3に示すような、特定領域の中心 点の位置力 6つの隣接領域の中心点を結んで形成される正六角形の重心点の位 置と一致する領域セット（以下、「六角セット」という）が複数形成された基材表面と、図 7に示すような、特定領域の中心点の位置力 4つの隣接領域の中心点を結んで形 成される正方形の重心点の位置と一致する領域セット（以下、「四角セット」という）が 複数形成された基材表面と、を作製した。
[0064] 具体的に、まず、この基材の表面に、スパッタリング装置 (E— 1030、日立株式会 社)を用いて、厚さ 9nmのプラチナ（Pt)の薄膜を形成した。一方、直径が 100 /z mで あって、長さが 200 μ mの円筒状突起を複数有するポリジメチルシロキサン（Poly (D imethyl Siloxane)： PDMS)製のスタンプをモールド成形により作製した。すなわ ち、 10mm X 10mmの矩形範囲に、六角セットの各表面領域の位置に対応して、そ の先端の直径 100 μ mの円形断面の中心点間の距離が、それぞれ 150 μ m、 200 μ m、 250 μ m、 300 μ m、 350 μ m、 400 μ m、 500 μ m、又 ίま 600 μ m< ヽずれ 力となるよう、複数の円筒状突起が形成された 8種類のスタンプと、四角セットの各表 面領域の位置に対応して、その先端の直径 100 mの円形断面の中心点間の距離 力 S400 mとなるよう、複数の円筒状突起が形成されたスタンプと、を作製した。
[0065] そして、各スタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングにより、次のようにして、 複数種類の基材表面を作製した。すなわち、各表面領域に固定する細胞接着性物 質として準備したコラーゲン（Cellmatrix、新田ゼラチン株式会社)を 1. 5mg/mLの 濃度で含むコラーゲン溶液を調製し、上記作製した各スタンプの各円筒状突起の先 端を当該コラーゲン溶液に浸すことにより、当該各円筒状突起の円形先端面に当該 コラーゲン溶液を塗布した。そして、各スタンプの各円筒状突起の先端を、上記ブラ チナが蒸着された基材表面に押し当てることにより、当該各円筒状突起の先端に塗 布されていたコラーゲン溶液を、当該基材表面に塗布した。さら〖こ、この基材表面に 塗布したコラーゲン溶液を窒素雰囲気下において乾燥させることにより、スタンプの 各円筒状突起の先端に対応した位置に、コラーゲンが固定された表面領域を形成し た。
[0066] また、基材表面のうち、表面領域以外の部分には、次のようにして細胞非接着性物 質を固定した。すなわち、各表面領域を囲む表面に固定する細胞非接着性物質とし て、分子量 30000のポリエチレングリコール（PEG)鎖とチオール基とを有する合成 高分子 (化学式: CH 0 (CH CH O) -CH CH SH、 日本油脂株式会社)を準備し
3 2 2 η 2 2
た。そして、上述のように表面領域を形成した基材表面を、この細胞非接着性物質を 5mMの濃度で含むエタノール溶液中に浸漬し、窒素雰囲気下において当該細胞 非接着性物質のチオール基と、基材表面に形成したプラチナ薄膜のうち露出してい る部分 (すなわち、基材表面のうち表面領域以外の部分)と、の間に特異的な化学結 合を形成させることにより、当該プラチナ薄膜表面に当該細胞非接着性物質を固定 した。その後、窒素雰囲気下において、この細胞非接着性物質を固定した基材表面 を十分に乾燥させ、次いで、当該基材表面を、 70%エタノール中に浸漬することによ り、余剰の細胞非接着性物質を当該基材表面力 除去するとともに、当該基材表面 を滅菌した。
[0067] このようにして、基材表面のうち lOmm X 10mmの矩形範囲内で、細胞非接着性 表面の中に直径 100 /z mの複数の表面領域力 150 ^ m, 200 μ m, 250 ^ m, 30 0 m、 350 μ m、 400 μ m、 500 μ m又は 600 μ mのいずれ力の中心間隔で規貝 lj 的に配置された六角セットを複数含む 8種類の基材表面と、細胞非接着性表面の中 に直径 100 mの表面領域が中心間隔 400 mで配置された四角セットを複数含 む基材表面と、を作製した。
[0068] 次に、上述のように作製した 8種類の基材表面のうち各表面領域で、増殖性の細胞 を培養した。この実施例 1においては、増殖性の細胞として、ヒト肝臓癌由来の細胞 株である HepG2細胞 (RCB1648、理ィ匕学研究所セルバンク）を用いた。また、培養 液としては、ウイリアムズ E培地（Williams 's Medium E、シグマ社） 10. 8gZLに 、 58. 8mgZLのペニシリン（明治製菓株式会社）、 lOOmgZLのストレプトマイシン（ 明治製菓株式会社)、 2. 2gZLの炭酸水素ナトリウム (和光純薬工業株式会社)、 1 0%のゥシ胎児血清 (FBS、インビトロジヱン株式会社)、を加えた血清添加培養液を 調製して用いた。
[0069] そして、ポリスチレン製の培養容器（直径 35mm、日本べタトンディッキンソン株式 会社)の底部に上記滅菌処理後の各基材を載置し、当該培養容器内の当該各基材 の表面に、 HepG2細胞を 2.5 X 105個 ZmLの密度となるように分散した培養液を 2 . OmL加えた。この培養容器内の各基材表面で、 5%炭酸ガス、 95%空気の雰囲気 下、 37°Cにて、静置状態で HepG2細胞の培養を行った。培養開始力も 4時間経過 後、各基材を新鮮培養液 2.0mLを含む新しい培養容器に移すことによって、基材表 面に接着しな力つた細胞を取り除いた。その後、培養容器内の培養液は、 2日毎に 新鮮な培養液に交換した。そして、培養開始後 1、 3、 5、 7、 10、 14、 21及び 28日目 に、各基材表面の各表面領域に形成された組織体を位相差顕微鏡下で観察し、当 該組織体の写真を撮影するとともに、当該顕微鏡写真に基づいて、各組織体の直径 を測定することにより検量データを取得した。
[0070] 図 11は、培養 14日目において、 8種類の基材表面の各々の表面領域に形成され た組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図 11A、図 11B、図 11C、図 11D、図 11E、図 11F、図 11G、及び図 11Hには、それぞれ、中心間隔が 150 m 、 200 μ m、 250 μ m、 300 μ m、 350 μ m、 400 μ m、 500 μ m及び 600 μ mの基 材表面において、直径 100 mの特定領域で形成された組織体 Tl、 Τ2、 Τ3、 Τ4、 Τ5、 Τ6、 Τ7及び Τ8を示す。図 11Α〜Ηに示すように、各基材表面の各表面領域 において、ドーム状又は略球形状の組織体が 1つずつ形成された。各基材表面に形 成された複数の組織体の直径は、互いに略等しかった。また、表面領域の直径が互 いに等しぐ中心間隔が互いに異なる 8種類の基材表面では、当該中心間隔の減少 に伴って、当該表面領域で形成される組織体の直径も減少した。すなわち、中心間 隔を低減させることにより、組織体の直径の増加を抑制できた。このように、各中心間 隔によって規定される均一な直径の複数の組織体が高密度且つ規則的に配置され た 8種類の組織体アレイが得られた。
[0071] 図 12は、中心間隔が互いに異なる 8種類の基材表面の各々の特定領域で形成さ れた組織体の直径と、培養時間と、の関係を示すグラフである。図 12において、横軸 は培養日数（日）、縦軸は組織体の直径 ( μ m)をそれぞれ示す。また、黒塗り三角、 白抜き三角、黒塗り四角、白抜き四角、黒塗り丸、白抜き丸、黒塗り菱形、及び白抜 き菱形のシンポノレは、それぞれ、中'、間隔力 150 μ m、 200 μ m、 250 μ m、 300 μ m、 350 μ m、 400 μ m、 500 μ m及び 600 μ mの基材表面で开成された糸且織体に ついての実測値の平均値を示す。この図 12に示すように、 8種類の中心間隔のいず れについても、組織体の直径は、培養 7日目までは、培養日数の経過に伴って増加 したが、培養 10日目にはそれぞれ中心間隔に応じた互いに異なる一定値に到達し、 その後は増加が抑制されて、少なくとも培養 28日目まで当該一定値に維持できた。
[0072] 図 13は、この実施例 1のデータ取得工程において取得された、 8種類の基材表面 の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量 データの一例である。図 13において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣 接領域との中心間隔 m)、縦軸は組織体の直径 m)をそれぞれ示す。また、各 シンボルは実測値の平均値を示す。図 13に示すように、特定領域で形成される組織 体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち 、中心間隔が少なくとも 150 μ mから 600 μ mまでの範囲においては、特定領域で形 成される組織体の直径は、 108± 10 μ m力ら 267± 25 μ mの範囲で当該中心間隔 の増加に伴って直線的に増加した。このように、本方法によれば、中心間隔を変化さ せることによって、当該中心間隔の変化に比例して組織体の直径を増加させ又は減 少させるよう、当該直径を制御することができた。
[0073] また、図 13に示す検量データにおける、中心間隔 X m)と、組織体の直径 Y ( m)と、の相関関係を定式化すると、 Y=0. 355Χ+64. 898 (相関係数 R2=0. 983 )と表された。したがって、例えば、決定工程において、この関係式の Y値に、所望の 組織体の直径を代入することにより、当該所望の直径の組織体を形成させるための 中心間隔を X値として決定できる。すなわち、この場合、検量データの直線関係を内 挿又は外挿することにより、任意の組織体の直径に関連付けられた中心間隔を決定 できる。そして、この検量データに基づいて、所望の直径 Yに対応して決定された中 心間隔 Xで配置された直径 100 μ mの特定領域で HepG2細胞を培養することにより 、当該特定領域に当該直径 Yの球状組織体を形成できる。
[0074] 図 14は、表面領域の直径が 100 μ mであって中心間隔力 00 μ mの六角セット又 は四角セットが形成された基材表面で培養 14日目に形成された組織体の一例につ いての位相差顕微鏡写真である。図 14A及び図 14Bは、それぞれ六角セットの表面 領域で形成された複数の組織体 T9及び四角セットの表面領域で形成された複数の 組織体 T10を示す。図 14A及び図 14Bに示すように、六角セット及び四角セットのい ずれの領域セットにおいても、互いに略等しい直径の略球状であって、規則的に配 置された複数の組織体が形成された。
[0075] 図 15は、表面領域の直径が 100 μ mであって中心間隔力 00 μ mの六角セット又 は四角セットの特定領域で形成された組織体の直径と、培養時間と、の関係を示す グラフである。図 15において、横軸は培養日数（日）、縦軸は組織体の直径 m)を それぞれ示す。また、黒塗り丸及び白抜き丸のシンボルは、それぞれ、六角セットの 特定領域で形成された組織体及び四角セットの特定領域で形成された組織体につ いての実測値の平均値を示す。この図 15に示すように、四角セットで形成された組 織体の直径と、六角セットで形成された組織体の直径と、はいずれも培養 7日目まで 、培養日数の経過に伴って増加した力 培養 10日目には互いに略等しい一定値に 収束し、その後は増加が抑制されて、少なくとも培養 28日目まで当該一定値に維持 できた。すなわち、表面領域の中心間隔が互いに等しい六角セット及び四角セットに おいては、各領域セットに含まれる隣接領域の数及び特定領域と各隣接領域との位 置関係の違いに関わらず、当該中心間隔によって規定される互いに略等しい直径の 球状組織体を形成できた。
[0076] [実施例 2]
次に、本方法において、中心間隔を一定とした場合には、各表面領域の面積を変 化させても、形成される組織体のサイズを略一定に制御できることを確認した第二の 実施例を示す。この実施例 2においては、中心間隔が 600 mであって、表面領域 の直径が 100 μ m、 200 μ m、又は 300 μ mのいずれかである 3種類の基材表面を 作製した。そして、これら 3種類の基材表面の各々の表面領域で HepG2細胞を培養 し、特定領域で形成された組織体の直径を測定した。なお、各基材表面の作製及び 当該各基材表面の表面領域での HepG2細胞の培養は、上述の第一の実施例の場 合と同様に行った。
[0077] 図 16は、 3種類の基材表面の各々の表面領域において形成された組織体の一例 についての位相差顕微鏡写真である。図 16A及び図 16Bには直径 100 mの表面 領域で培養 5日目及び 10日目に形成された略球形状の組織体 SI, S2を示し、図 1 6C及び図 16Dには直径 200 mの表面領域で培養 5日目及び 10日目に形成され た略球形状の組織体 S3, S4を示し、図 16E及び図 16Fには直径 300 /z mの表面領 域で培養 5日目及び 10日目に形成された略球形状の組織体 S5, S6を示す。図 16 A,図 16C及び図 16Eに示すように、培養 5日目においては、表面領域の直径の増 加に伴って、形成される組織体 S1, S3, S5の直径も増加した。これに対し、図 16B, 図 16D及び図 16Fに示すように、培養 10日目においては、直径 100 mの表面領 域で形成された組織体 S2、直径 200 mの表面領域で形成された組織体 S4、及び 直径 300 mの表面領域で形成された組織体 S6、の直径は互いに略等しく制御さ れた。
[0078] 図 17は、直径が 100 μ m、 200 μ m、又は 300 μ mの特定領域で形成された組織 体の直径と、培養時間と、の関係を示すグラフである。図 17において、横軸は培養日 数（日）、縦軸は組織体の直径 ( μ m)をそれぞれ示す。また、丸形、菱形、及び四角 形のシンボルは、それぞれ、直径が 100 μ m、 200 μ m、及び 300 μ mの特定領域 で形成された組織体についての実測値の平均値を示す。この図 17に示すように、直 径が 100 μ m及び 200 μ mの特定領域で形成された組織体の直径は、培養 7日目 までは培養時間の経過に伴って次第に増加し、培養 10日目には 250 μ m〜300 μ mの範囲で略一定値に到達した力 その後は増加が抑制されて、少なくとも培養 28 日目まで当該略一定値に維持された。これに対し、直径が 300 mの特定領域で形 成された組織体の直径は、 28日間の培養期間を通じてほとんど変化せず、略 300 mに維持された。このように、中心間隔を互いに等しい 600 /z mとした場合には、当 該表面領域の直径が少なくとも 100 μ m力 300 μ mの範囲では、当該表面領域の 直径の違いに関わらず、特定領域に形成される組織体の直径は培養 10日目以降、 少なくとも培養 28日目まで互いに略等しい一定値に制御された。 [0079] [実施例 3]
実施例 3においては、上述の実施例 1と同様に、細胞非接着性表面の中に直径 10 0 μ mの複数の表面領域が、 200 μ m、 300 μ m、 400 μ m、又は 500 μ mの 、ずれ 力の中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む 4種類の基材表面を作製 し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、ヒト子宫頸部癌由来の細胞 株である HeLa細胞 (RCB0007、理ィ匕学研究所セルバンク）を培養した。すなわち、 上述の実施例 1と同様、底部に 1つの基材 ( 24mm X 24mm)を載置した直径 35m mの培養皿内に、 HeLa細胞を 2.5 X 105個/ mLの密度となるように分散した培養 液を 2. OmLカ卩えることにより、培養を開始した。培養液としては、 DMEM (インビトロ ジェン株式会社） 13. 5gZLに、 58. 8mgZLのペニシリン（明治製菓株式会社)、 1 OOmg/Lのストレプトマイシン（明治製菓株式会社)、 2. 2g/Lの炭酸水素ナトリウ ム (和光純薬工業株式会社)、 10%のゥシ胎児血清 (インビトロジヱン株式会社)をカロ えた血清添加培養液を用いた。
[0080] 図 18は、培養 7日目において、 4種類の基材表面の各々の表面領域に形成された 組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図 18A、図 18B、図 18C、及 び図 18Dには、それぞれ、中'、間隔力 S 200 μ m、 300 μ m、 400 μ m、及び 500 μ mの基材表面において、直径 100 mの特定領域で形成された組織体 T20、 Τ21、 Τ22、及び Τ23を示す。図 18A〜Dに示すように、各基材表面の各表面領域におい て、ドーム状又は略球形状の組織体が 1つずつ形成された。そして、表面領域の中 心間隔が互いに異なる 4種類の基材表面のうち、中心間隔が小さい基材表面では、 中心間隔が大きい基材表面に比べて、より小さい直径の組織体が形成された。
[0081] 図 19は、この実施例 3で取得された、 4種類の基材表面の各々の特定領域で形成 された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図 1 9にお ヽて、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（ μ m) 、縦軸は組織体の直径（ m)をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値 を示す。図 19に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域 と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも 200 μ m力ら 500 μ mまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、 100± 9 /ζ mから 154± 15 μ mの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増 加した。また、図 19に示す検量データにおける、中心間隔 X m)と、組織体の直径 Υ( /ζ πι)と、の相関関係を定式化すると、 Y=0. 178X+67. 914 (相関係数 R2=0 . 970)と表された。
[0082] [実施例 4]
実施例 4においては、上述の実施例 3と同様に、表面領域の中心間隔が互いに異 なる 4種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として 、マウス胚性幹細胞（Embryonic Stem Cell:ES細胞）（129SV系統、大日本住 友製薬株式会社)を培養した。すなわち、上述の実施例 1と同様、底部に 1つの基材 を載置した直径 35mmの培養皿内に、 ES細胞を 2.5 X 105個 ZmLの密度となるよう に分散した培養液を 2. OmL加えることにより、培養を開始した。培養液としては、ノッ クアウト DMEM培地（Knock Out— DMEM medium、インビトロジェン株式会社 ) 500mLに、 250UZmLの白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor: LI F) (ESGRO (登録商標）、インビトロジ ン株式会社)、 1%の非必須アミノ酸 (Non -Essential Amino Acids :NEAA、大日本住友製薬株式会社）、 2mMの L— グルタミン (インビトロジェン株式会社）、 lOOUZmLのペニシリン (インビトロジェン株 式会社）、 100 μ gZmLのストレプトマイシン (インビトロジェン株式会社）、 300 M のモノチォグリセロール（Monothioglycerol、株式会社シグマ）、 25mMの HEPES (同仁化学研究所)、 15%のゥシ胎児血清 (FBS、大日本住友製薬株式会社)をカロ えた血清添加培養液を用いた。
[0083] 図 20は、培養 7日目において、 4種類の基材表面の各々の表面領域に形成された 組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図 20A、図 20B、図 20C、及 び図 20Dには、それぞれ、中'、間隔力 200 μ m、 300 μ m、 400 μ m、及び 500 μ mの基材表面において、直径 100 mの特定領域で形成された組織体 T30、 Τ31、 Τ32、及び Τ33を示す。図 20A〜Dに示すように、各基材表面の各表面領域におい て、ドーム状又は略球形状の組織体が 1つずつ形成された。そして、表面領域の中 心間隔が互いに異なる 4種類の基材表面のうち、中心間隔が小さい基材表面では、 中心間隔が大きい基材表面に比べて、より小さい直径の組織体が形成された。 [0084] 図 21は、この実施例 4で取得された、 4種類の基材表面の各々の特定領域で形成 された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図 2 1にお ヽて、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（ μ m) 、縦軸は組織体の直径（ m)をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値 を示す。図 21に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域 と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも 200 μ m力ら 500 μ mまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、 135± 10 m力ら 228± 15 μ mの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に 増加した。また、図 21に示す検量データにおける、中心間隔 X m)と、組織体の直 径 Υ( /ζ πι)と、の相関関係を定式化すると、 Y=0. 311X+ 75. 544 (相関係数 R2 =0. 992)と表された。
[0085] [実施例 5]
この実施例 5では、ポリメチルメタタリレート（PolyMethyl MethAcrylate： PMM A)製の平板（24mm X 24mm、厚さ 400 m)を基材として用い、図 2に示すような 基材表面を作製した。すなわち、キヤビティ 100の底面である表面領域 3bからなる六 角セットが複数形成された基材表面を作製した。
[0086] 具体的に、このポリメチルメタタリレート平板の表面の一部に、 10mm角の矩形範囲 にわたつて、マシユングセンタ (卓上型 NC微細加工機、株式会社ピーェムティー製） を用いた穿孔カ卩ェ処理を施すことにより、直径 300 mの円形状力もなる底面が 33 0 m、 440 μ m、又は 550 μ mのいずれかの中心間隔で規則的に配置されるよう、 深さ 200 μ mのキヤビティ 100を複数形成した。
[0087] 次に、このキヤビティ 100が形成された平板の全体 (すなわち、図 2に示す表面領 域 3b及び周辺表面 4を含む基材表面 2の全体）に、上述の実施例 1と同様にして、厚 さ 9nmのプラチナ (Pt)の薄膜を形成した。そして、細胞非接着性物質として、上述 の実施例 1で用いた分子量 30000のポリエチレングリコール（PEG)鎖とチオール基 とを有する合成高分子を 5mMの濃度で含むエタノール溶液中に、プラチナ薄膜が 形成された平板の全体を浸漬した。そして、窒素雰囲気下において細胞非接着性物 質のチオール基と、基材表面に形成したプラチナ薄膜表面 (すなわち図 2に示す表 面領域 3b及び周辺表面 4を含む基材表面 2)と、の間に特異的な化学結合を形成さ せることにより、当該プラチナ薄膜表面に当該細胞非接着性物質を固定した。その後 、窒素雰囲気下において、この細胞非接着性物質を固定した基材表面を十分に乾 燥させ、次いで、当該基材表面を、 70%エタノール中に浸漬することにより、余剰の 細胞非接着性物質を当該基材表面力 除去するとともに、当該基材表面を滅菌した
[0088] このようにして、基材表面のうち lOmm X 10mmの矩形範囲内で、細胞非接着性 表面の中に形成されたキヤビティの底面として、直径 300 mの複数の表面領域が、 330 μ m、 440 μ m、又は 550 μ mのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六 角セットを複数含む 3種類の基材表面を作製し、上述の実施例 1と同様に、各基材表 面のうち各表面領域で、増殖性の細胞として HepG2細胞を培養した。すなわち、基 材表面のうち、キヤビティが形成されている lOmmX 10mmの矩形範囲あたり、 1. 0 X 105個の HepG2細胞を播種することにより、培養を開始した。培養液は、上述の実 施例 1と同様のものを用 、た。
[0089] 図 22は、培養 10日目において、 3種類の基材表面の各々の表面領域に形成され た組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図 22A、図 22B、及び図 22 Cに ίま、それぞれ、中'、f¾隔カ 330 μ m、 440 μ m、及び 550 μ mの基材表面にお いて、直径 300 mの特定領域で形成された組織体 T40、 Τ41、及び Τ42を示す。 図 22A〜Cに示すように、各基材表面の各キヤビティ 100内において、略球形状の 組織体が浮遊状態で 1つずつ形成された。各基材表面に形成された複数の組織体 の直径は、互いに略等しかった。また、表面領域の直径が互いに等しぐ中心間隔が 互いに異なる 3種類の基材表面では、当該中心間隔の減少に伴って、当該表面領 域で形成される組織体の直径も減少した。すなわち、中心間隔を低減させることによ り、組織体の直径の増加を抑制できた。このように、各中心間隔によって規定される 均一な直径の複数の組織体が高密度且つ規則的に配置された 3種類の組織体ァレ ィが得られた。
[0090] 図 23は、この実施例 5のデータ取得工程において取得された、 3種類の基材表面 の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量 データの一例である。図 23において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣 接領域との中心間隔 m)、縦軸は組織体の直径 m)をそれぞれ示す。また、各 シンボルは実測値の平均値を示す。図 23に示すように、特定領域で形成される組織 体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち 、中心間隔が少なくとも 330 μ m力ら 550 μ mまでの範囲においては、特定領域で形 成される組織体の直径は、 183±6 m力ら 236±8 mの範囲で当該中心間隔の 増加に伴って直線的に増加した。このように、本方法によれば、中心間隔を変化させ ることによって、当該中心間隔の変化に比例して組織体の直径を増加させ又は減少 させるよう、当該直径を制御することができた。
[0091] また、図 23に示す検量データにおける、中心間隔 X m)と、組織体の直径 Y ( m)と、の相関関係を定式化すると、 Y=0. 243X+ 105. 07 (相関係数 R2=0. 980 )と表された。したがって、例えば、決定工程において、この関係式の Y値に、所望の 組織体の直径を代入することにより、当該所望の直径の組織体を形成させるための 中心間隔を X値として決定できる。すなわち、この場合、検量データの直線関係を内 挿又は外挿することにより、任意の組織体の直径に関連付けられた中心間隔を決定 できる。そして、この検量データに基づいて、所望の直径 Yに対応して決定された中 心間隔 Xで配置された直径 300 μ mの特定領域で HepG2細胞を培養することにより 、当該特定領域に当該直径 Yの球状組織体を形成できる。
[0092] [実施例 6]
実施例 6においては、上述の実施例 5と同様に、キヤビティの底面として直径 300 mの複数の表面領域力 330 μ m、 440 μ m、又は 550 μ mのいずれかの中心間隔 で規則的に配置された六角セットを複数含む 3種類の基材表面を作製し、各基材表 面の各表面領域で、増殖性の細胞として、ラットランゲルノ、ンス島腫瘍由来の細胞株 である RIN— 5F細胞 (ATCC CRL— 2058、大日本住友製薬株式会社)を培養し た。すなわち、上述の実施例 5と同様に、基材表面のうち、キヤビティが形成されてい る 10mm X 10mmの矩形範囲あたり、 1. O X 105個の RIN—5F細胞を播種すること により、培養を開始した。培養液としては、 RIMI 1640培地 (インビトロジェン株式会 社） 500mLに、 2mMの L—グルタミン（インビトロジェン株式会社）、 lOOUZmLの ペニシリン (インビトロジェン株式会社）、 100 μ gZmLのストレプトマイシン (インビトロ ジェン株式会社)、 10%のゥシ胎児血清 (インビトロジェン株式会社)を加えた血清添 加培養液を用いた。
[0093] 図 24は、培養 10日目において、 3種類の基材表面の各々の表面領域に形成され た組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図 24A、図 24B、及び図 24 Cに ίま、それぞれ、中'、f¾隔カ 330 μ m、 440 μ m、及び 550 μ mの基材表面にお いて、直径 300 mの特定領域で形成された組織体 T50、 Τ51、及び Τ52を示す。 図 24A〜Cに示すように、各基材表面の各キヤビティ 100内において、略球形状の 組織体が浮遊状態で 1つずつ形成された。そして、上述の実施例 5と同様に、表面 領域の中心間隔が小さい基材表面では、中心間隔が大きい基材表面に比べて、より 小さ 、直径の組織体が形成された。
[0094] 図 25は、この実施例 6で取得された、 3種類の基材表面の各々の特定領域で形成 された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図 2 5にお ヽて、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（ μ m) 、縦軸は組織体の直径（ m)をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値 を示す。図 25に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域 と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも 330 μ m力ら 550 μ mまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、 152± 9 ^ m力ら 192± 7 /z mの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増加 した。また、図 25に示す検量データにおける、中心間隔 X m)と、組織体の直径 Y ( /z m)と、の相関関係を定式化すると、 Y=0. 183X+ 92. 966 (相関係数 R2=0. 981)と表された。
[0095] [実施例 7]
実施例 7においては、上述の実施例 5と同様に、キヤビティの底面として直径 300 mの複数の表面領域力 330 μ m、 440 μ m、又は 550 μ mのいずれかの中心間隔 で規則的に配置された六角セットを複数含む 3種類の基材表面を作製し、各基材表 面の各表面領域で、増殖性の細胞として、上述の実施例 4で用いたものと同様のマ ウス ES細胞（129SV系統、大日本住友製薬株式会社)を培養した。すなわち、上述 の実施例 5と同様に、基材表面のうち、キヤビティが形成されている 10mm X 10mm の矩形範囲あたり、 1. 0 X 105個のマウス ES細胞を播種することにより、培養を開始 した。培養液は、上述の実施例 4と同様のものを用いた。
[0096] 図 26は、培養 10日目において、 3種類の基材表面の各々の表面領域に形成され た組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図 26A、図 26B、及び図 26 Cに ίま、それぞれ、中'、f¾隔カ 330 μ m、 440 μ m、及び 550 μ mの基材表面にお いて、直径 300 mの特定領域で形成された組織体 T60、 Τ61、及び Τ62を示す。 図 26A〜Cに示すように、各基材表面の各キヤビティ 100内において、略球形状の 組織体が浮遊状態で 1つずつ形成された。そして、上述の実施例 5と同様に、表面 領域の中心間隔が小さい基材表面では、中心間隔が大きい基材表面に比べて、より 小さ 、直径の組織体が形成された。
[0097] 図 27は、この実施例 7で取得された、 3種類の基材表面の各々の特定領域で形成 された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図 2 7にお ヽて、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（ μ m) 、縦軸は組織体の直径（ m)をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値 を示す。図 27に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域 と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも 330 μ m力ら 550 μ mまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、 182± 12 /ζ πι力ら 215± 11 mの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に 増加した。また、図 25に示す検量データにおける、中心間隔 X m)と、組織体の直 径 Υ( /ζ πι)と、の相関関係を定式化すると、 Y=0. 151X+ 133. 7 (相関係数 R2= 0. 986)と表された。

Claims

請求の範囲
[1] 増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、
所定面積をもち、前記細胞を保持できる特定表面領域、及び前記特定表面領域に 隣接して配置され、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の隣接表面領 域であって、その各々の重心点から、前記特定表面領域の重心点までの距離が互 いに等しくなるよう配置された複数の隣接表面領域、が形成された基材を少なくとも 一つ準備する準備工程と、
前記基材のうち、前記特定表面領域及び前記各隣接表面領域のそれぞれで前記 細胞を培養することによって、前記特定表面領域及び前記各隣接表面領域のそれ ぞれで前記細胞を含む三次元組織体を形成させる培養工程と、を含み、
前記準備工程で準備する前記基材の前記距離を変化させることによって、前記培 養工程で前記特定表面領域に形成される前記三次元組織体のサイズを、前記距離 に応じて制御する
ことを特徴とする組織体形成方法。
[2] 前記特定表面領域及び前記隣接表面領域は、細胞接着性である
ことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の組織体形成方法。
[3] 前記基材の表面のうち、前記特定表面領域を囲む部分は、細胞非接着性である ことを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の組織体形成方法。
[4] 前記特定表面領域及び前記隣接表面領域は、前記基材に形成された有底孔の底 面であって、細胞非接着性である
ことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の組織体形成方法。
[5] 前記準備工程において、前記距離が互いに異なる複数の前記基材を準備し、 前記培養工程において、前記複数の基材の前記特定表面領域に、前記距離に応 じて、前記複数の基材間で互いに異なるサイズの前記三次元組織体を形成させる ことを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の組織体形 成方法。
[6] 前記準備工程において、前記距離が前記複数の基材間で規則的に変化するよう、 前記複数の基材を準備し、 前記培養工程において、前記複数の基材の前記特定表面領域に、前記複数の基 材間で前記距離に応じてサイズが規則的に変化した三次元組織体を形成させる ことを特徴とする請求の範囲第 5項に記載の組織体形成方法。
[7] 前記培養工程にお!、て、前記特定表面領域に、前記距離に応じた径の略球形状 の三次元組織体を形成させる
ことを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の組織体形 成方法。
[8] 前記特定表面領域と前記複数の隣接表面領域とは、前記特定表面領域の重心点 力 前記複数の隣接表面領域の各々の重心点を結んで形成される多角形の中に位 置するよう配置される
ことを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の組織体形 成方法。
[9] 前記準備工程で準備する前記基材の前記距離と、前記培養工程で形成される前 記三次元組織体のサイズと、の相関関係を示す検量データを取得する工程をさらに 含む
ことを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の組織体形 成方法。
[10] 基材表面に互いに離間して配置された所定面積をもつ複数の表面領域のうち、第 一の表面領域と、前記第一の表面領域に隣接して配置された複数の第二の表面領 域であって、その各々の重心点から、前記第一の表面領域の重心点までの距離が 互いに等しくなるよう配置された複数の第二の表面領域と、のそれぞれで増殖性の 細胞を含む三次元組織体を形成させる場合における、前記第一の表面領域で形成 される三次元組織体のサイズと、前記距離と、の相関関係を示す検量データに基づ Vヽて、所望のサイズの三次元組織体を形成させるための前記距離を決定する決定ェ 程と、
前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる特定表面領域、及び前記特定表面領 域に隣接して配置され、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の隣接表 面領域であって、その各々の重心点から、前記特定表面領域の重心点までの距離 力 前記決定工程で決定された距離となるよう配置された複数の隣接表面領域、が 形成された基材を準備する工程と、
前記特定表面領域及び前記各隣接表面領域のそれぞれで前記細胞を培養するこ とにより、前記特定表面領域に、前記細胞を含む、前記所望のサイズの三次元組織 体を形成させる工程と、を含む
ことを特徴とする組織体形成方法。
[11] 前記検量データは、請求の範囲第 9項に記載の組織体形成方法を用いて取得さ れた検量データである
ことを特徴とする請求の範囲第 10項に記載の組織体形成方法。
[12] 増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成するための組織体形成キットであって、 所定面積をもち、前記細胞を保持できる第一特定表面領域、及び前記第一特定表 面領域に隣接して配置された、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の 第一隣接表面領域であって、その各々の重心点から、前記第一特定表面領域の重 心点までの距離が互いに等しい第一距離となるよう配置された複数の第一隣接表面 領域、が形成された第一基材と、
前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる第二特定表面領域、及び前記第二特 定表面領域に隣接して配置された、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複 数の第二隣接表面領域であって、その各々の重心点から、前記第二特定表面領域 の重心点までの距離が互いに等しぐ且つ前記第一距離と異なる第二距離となるよう 配置された複数の第二隣接表面領域、が形成された第二基材と、を含む
ことを特徴とする組織体形成キット。
[13] 前記第一基材と前記第二基材とは、一つの基材のうち互いに異なる部分である ことを特徴とする請求の範囲第 12項に記載の組織体形成キット。
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