KR101792380B1 - 세포 배양 방법 및 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

생체 내 기능을 장기간 유지할 수 있으며 또한, 필요 최소 세포수에서의 배양이 가능한 세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 관련된 세포 배양 방법은 구획된 미소 공간 내에 있어서, 미분화 세포를 중층화한 상태에서 배양하여, 분화 세포를 얻는 것이다. 의약품을 스크리닝하는 경우, 간 세포, 장 상피 세포, 신경 세포, 심근 세포, 혈관 내피 세포로 분화되는 미분화 세포가 바람직하다. 특히, 약물 동태 등의 인간에 대한 예측을 실시하는 경우, 인간 세포인 것이 바람직하다.

Description

세포 배양 방법 및 스크리닝 방법{CELL CULTURE METHOD AND SCREENING METHOD}

본 발명은 세포 배양 방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

조직으로부터 단리한 세포를 시험, 검사에 사용하는 수법은 바이오 테크놀러지 관련 분야에서는 빠뜨릴 수 없는 방법이 되고 있다. 질병, 병태 (病態) 의 진단, 신약의 탐색 및 약효의 판정, 혹은 동물 검사, 식물 검사, 환경오염 물질의 시험 등에 폭넓게 사용되고 있다. 그 때문에, 바이오 테크놀러지 분야에서 사용되는 세포류는 매우 다양화되고 있다.

단리한 세포는 바로 부유 상태로 시험에 사용되는 경우도 있지만, 대부분의 경우, 배양 접시에 접착시킨 상태에서 배양하여 여러 가지의 시험, 검사에 사용된다. 세포 배양에 사용되는 초대 세포, 주화 (株化) 세포에는, 생체 내에서의 시험 이른바 in vivo 시험과 동일한 약제 감수성, 독성 반응 등을 나타낼 것이 요구된다. 즉, 세포 배양 용기 상에서 생체 내 유사의 세포 기능이 필요하게 된다. 또, 초대 세포를 얻기 위한 단리 조작이 번잡한 것, 세포 배양 시험에 사용되는 세포 배양주는 고가라는 점에서, 적은 세포수에서의 시험 방법이 요망되고 있다.

최근, 창약 (創藥) 개발에서는, 임상시험 단계에서의 개발 중단이 문제가 되고 있다. 이것은 약물 동태 시험 단계에서의 동물종 차에서 기인한다. 지금까지 전 (前) 임상 단계에 있어서의 약물 동태 시험에서는, 래트, 개, 원숭이 등의 동물을 사용하여 약물의 체내 동태를 예측해 왔다. 그러나, 인간을 사용하는 임상 시험에서는, 그 예측이 사실상 성립되지 않음이 분명해지고 있다. 따라서, 약물 동태 등의 인간에 대한 예측은 인간 시료를 사용하는 것이 가장 유효하고 간편한 방법이며, 효율적인 의약품 개발이나 안전한 임상시험의 실시를 위해서 중요하다.

약물의 체내 동태를 조사하는 약물 동태 시험에서는, 주로 간장에서의 흡수, 대사, 배설이고, 사용되는 인간 시료는 간장 슬라이스, 간 세포, 간 마이크로솜 등이다. 이 중에서 간장 슬라이스는 입수가 곤란하고, 간 마이크로솜은 한정된 대사 효소만에 의한 대사 시험 밖에 실시할 수 없다. 그 때문에, 간 세포의 사용이 가장 효과적이라고 생각되고 있다.

스크리닝에 있어서, 사용되는 배양 접시는 수지제 샬레나, 6 웰, 12 웰, 48 웰, 96 웰의 각 플레이트이다. 이들은, 일반적으로 플레이트 전체의 크기는 거의 동일하여, 웰수가 커질수록 1 웰의 사이즈가 작아진다. 이 1 웰이 1 배양 접시에 상당한다. 또, 최근의 미량화로의 흐름에서, 더욱 소구경이며 다수의 배양 접시로 이루어지는 384 웰 플레이트도 사용되기 시작하고 있고, 목적으로 하는 스크리닝 방법에 적응하는 것이 사용되고 있다. 이들 배양 접시의 저부는 평탄한 평판 형상이고, 이 바닥면을 배양면으로서 사용하고 있다.

그러나, 조직 세포의 배양에 종래의 배양 용기를 사용하면 본래의 기능을 소실시켜 탈분화되고 마는 경우나, 미분화 세포가 분화되지 않는 경우가 있어, 목적으로 하는 세포 기능을 발현하지 않는 것이 문제가 되고 있다. 예를 들어, 인간 신선 간 세포는 통상적인 평판 플레이트 상에서 배양하면 단리되었을 때의 대사 효소의 기능을 1 일 정도에서 현저하게 저하시키기 때문에, 플레이트에 세포 파종 후 4 시간 이내에 약물의 대사 시험을 실시하는 경우가 있다. 즉, 장시간의 배양을 실시하면서 시험에 사용할 수 없는 문제, 장시간의 대사 안정성을 검토할 수 없는 문제가 있다.

상기 문제를 해결하기 위해, 인간 혹은 동물 유래의 생체 물질 (당 단백질, 단백질 등) 을 배양 용기 표면에 코팅하는 시도 (특허문헌 1 참조) 나, 고분자 겔중에서 배양하는 시도 (특허문헌 2 참조) 나, 마이크로 용기 내에서 간 세포덩어리를 형성시키는 시도 (특허문헌 3 참조) 가 이루어지고 있다.

일본 공개특허공보 평8-319317호 일본 공개특허공보 평8-308562호 국제 공개 제2008/130025호

그러나, 특허문헌 1 에 개시된 방법에서는, 코팅하는 생체 물질이 특수하기 때문에 고비용이 되는 것, 배양 용기 내에 있어서 균일한 세포 집합체의 형성이 곤란한 것, 생체 내 기능을 장기간 유지할 수 없는 것 등의 문제가 있다. 특허문헌 2 에 개시된 방법에서도, 세포 집합체의 크기를 제어할 수 없는 것, 현미경 관찰을 용이하게 할 수 없는 것, 스크리닝 기판으로서 조작성이 번잡한 것 등의 문제가 있다. 또한, 상기한 양 방법도, 시판되는 디쉬나 플레이트를 지지 용기로서 사용하기 때문에, 필요 최소 세포수에서의 효율적인 스크리닝이 곤란하다. 특허문헌 3 에 개시된 방법에서도, 배양 초기의 간 세포 대사 활성의 향상은 가능하지만, 2 주 이상의 대사 활성 유지는 곤란하다.

본 발명은 생체 내 기능을 장기간 유지할 수 있고, 또한 필요 최소 세포수에서의 배양이 가능한 세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 관련된 세포 배양 방법은, 구획된 미소 공간 내에 있어서, 미분화 세포를 중층화한 상태에서 배양하여, 분화 세포를 얻는 것이다. 여기서, 중층화란 2 층 이상으로 세포의 적층화가 일어나는 것을 말한다. 의약품을 스크리닝하는 경우에는, 간 세포, 장 상피 세포, 신경 세포, 심근 세포, 혈관 내피 세포로 분화되는 미분화 세포가 바람직하다. 특히, 약물 동태 등의 인간에 대한 예측을 실시하는 경우에는 미분화 세포는 인간 세포인 것이 바람직하다. 상기 미분화 세포는 간 세포, 전구 세포 등이 바람직하다.

또, 상기 구획된 미소 공간이 표면에 복수의 마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기에 있어서의 당해 마이크로 용기인 것이 특히 바람직하다. 여기에서, 상기 마이크로 용기의 바닥 면적이 9×10^-4 ㎟ ∼ 9×10^-2 ㎟, 측벽의 높이가 15 ㎛ ∼ 300 ㎛, 측벽의 폭이 3 ㎛ ∼ 15 ㎛ 인 것이 바람직하다. 또한, 현미경 관찰을 용이하게 하기 위해, 상기 세포 배양 용기에 있어서의 마이크로 용기가 형성된 영역이 투명성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에 관련된 스크리닝 방법은 상기의 배양 방법으로 배양한 세포를 복수 배치하여 화합물을 스크리닝하는 것이다. 또, 필요 최소 세포수로 배양하기 위해, 상기 세포 배양 용기가 복수의 상기 마이크로 용기로 이루어지는 구획화된 스폿을 복수 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 생체 내 기능을 균일하게 장기간 유지할 수 있으며 또한, 필요 최소 세포수에서의 배양이 가능한 세포 배양 방법을 제공할 수 있다.

도 1 은 실시예 1 에 관련된 세포 배양 방법예 사용하는 세포 배양 용기의 구성을 나타내는 평면도이다.
도 2 는 실시예 1 에 관련된 세포 배양 방법에 사용하는 세포 배양 용기의 구성을 나타내는 단면도이다.
도 3 은 실시형태에 관련된 스크리닝 방법에 사용하는 세포 배양 용기의 구성을 나타내는 평면도이다.
도 4 는 실시형태에 관련된 스크리닝 방법에 사용하는 세포 배양 용기의 구성을 나타내는 단면도이다.

본 발명에서는, 간 줄기 세포 등의 미분화 세포를, 구획된 미소 공간인 마이크로 용기 내에서 균일한 크기로 중층화한 상태에서 배양한다. 본 발명에 있어서 특히 중요한 점은 증식능을 갖는 미분화 세포를 사용하는 것, 구획된 미소 공간 내에서 배양하는 것 및 중층화하여 배양하는 것이다. 이로써, 예를 들어, 분화된 간 실질 세포를 함유하는 세포덩어리를 형성시켜, 기능 향상을 도모할 수 있다. 또한, 간 줄기 세포는 미분화 증식하기 때문에, 세포의 기능 유지가 가능하다. 본 발명은 이와 같은 배양 방법 및 그것을 사용한 스크리닝 방법이다.

본 발명에 관련된 배양 방법 및 스크리닝 방법에서 사용하는 배양 용기의 표면에는, 요철 패턴 즉 복수의 마이크로 용기 즉 배양 공간이 형성되어 있다. 이 마이크로 용기를 구획하는 측벽 (볼록부) 의 폭 및 높이를 최적화함으로써, 마이크로 용기 안에서만 세포를 배양하여, 균일한 분화 상태를 유지시킬 수 있다. 또한, 마이크로 용기 대신에 겔로 이루어지는 구획된 배양 공간을 형성하는 것도 생각된다.

측벽에 의해 둘러싸인 마이크로 용기의 치수는 세포를 배양하기 위해서 최적인 범위로 할 필요가 있다. 마이크로 용기의 바닥면 면적이 너무 크면, 평판 상에서의 배양과 동일하게 부분적으로 세포가 얇게 신장하여, 균일한 중층화 상태를 형성하지 않는다. 한편, 마이크로 용기의 바닥면 면적이 너무 작으면, 세포를 수용할 수 없게 된다. 따라서, 공간의 치수는 배양하는 세포종에 따라, 복수개 ∼ 수십개를 수용할 수 있는 범위로 하는 것이 바람직하다.

또, 마이크로 용기의 측벽도 세포를 배양하기 위해서 최적인 범위로 할 필요가 있다. 측벽의 폭이 너무 넓으면, 측벽의 상면에 세포가 접착되어, 배양에 적합하지 않다. 측벽의 폭이 너무 좁으면, 제작이 곤란해진다. 측벽의 높이는 너무 낮으면, 세포가 측벽을 넘어가 버려, 배양에 적합하지 않다. 측벽의 높이가 너무 높으면, 제작이 곤란할 뿐아니라, 물질 확산을 하기 어려워져 배양 환경이 악화되고 만다.

이하에, 본 발명의 실시형태에 대해 설명한다. 단, 본 발명이 이하의 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또, 설명을 명확하게 하기 위해, 이하의 기재 및 도면은 적절히 간략화되어 있다.

실시형태

실시형태에 관련된 세포 배양에 사용하는 세포 배양부의 마이크로 용기의 구성에 대해서 도 1, 2 를 사용하여 설명한다. 도 1 은 본 실시의 형태에 관련된 마이크로 용기의 구성을 나타내는 평면도이고, 도 2 는 도 1 의 II-II 단면도이다. 도 1 에 나타내는 바와 같이, 세포 배양부 (10) 는 마이크로 용기 (11), 측벽 (12) 을 구비한다. 세포 배양부 (10) 의 배양면에는, 복수의 측벽 (12) 이 그물망 형상으로 형성되어 있고, 이 측벽 (12) 으로 사방이 둘러싸인 공간이 마이크로 용기 (11) 가 된다.

도 1 에 있어서, 마이크로 용기 (11) 의 바닥면의 폭 (a), 마이크로 용기 (11) 를 구획하기 위한 측벽 (12) 의 폭 (b), 높이 (c) 를 나타냈다. 여기에서, 3 ㎛

b

15 ㎛ , 또한, c/b

2 로 할 필요가 있다. 측벽 (12) 의 폭 (b) 이 15 ㎛ 를 초과하면, 측벽의 상면에 세포가 접착되어, 배양에 적합하지 않다. 한편, 측벽 (12) 의 폭 (b) 이 3 ㎛ 미만에서는, 제작이 곤란해진다. 측벽의 높이는 너무 낮으면, 세포가 측벽을 넘어가 버려, 배양에 적합하지 않다. 측벽 (12) 의 높이 (c) 가 측벽 (12) 의 폭 (b) 의 2 배 미만이면, 마이크로 용기 (11)에서 배양하는 세포가 타고 넘어가, 인접하는 마이크로 용기 (11) 로 이동한다. 또, 구체적으로는, 1 변 100 ㎛ 의 사각형 마이크로 용기 내에서 인간 태아 간 세포를 중층화시키는 경우, 측벽 (12) 의 높이 (c) 는 15 ㎛ ∼ 300 ㎛ 가 바람직하고, 50 ㎛ ∼ 150 ㎛ 가 더욱 바람직하다. 여기에서, 측벽의 높이 (c) 가 너무 높으면, 제작이 곤란할 뿐만 아니라, 물질 확산이 되기 어려워져 배양 환경이 악화되고 만다. 측벽 (12) 은 다단계 형상이어도 된다.

마이크로 용기 (11) 의 바닥면 형상은 특별히 제한되는 것이 아니며, 정방형, 원, 다각형 이외에도 여러 가지 형상을 채용할 수 있다. 이 바닥면 면적은 9×10^-4 ㎟ ∼ 9×10^-2 ㎟ 가 바람직하다. 또, 등방적 형상이 바람직하고, 바닥면이 직사각형 형상인 경우, 장변이 단변의 1 ∼ 1.5 배인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 세포 배양부는, 필요한 세포수를 최소로 하기 위해서, 도 3 및 4 에 나타내는 바와 같이, 1 개의 스크리닝에 필요한 만큼의 복수의 마이크로 용기로 이루어지는 구획된 스폿을 갖고 있어도 된다. 예를 들어, 분화 효율이 높은 1 변 200 ㎛ 의 정방형으로 높이 50 ㎛ 인 마이크로 용기를 사용하여, 스크리닝에 필요한 최소 세포수가 약 1000 개인 경우, 9 개의 마이크로 용기가 필요하기 때문에, 9 개의 마이크로 용기를 구획화하는 스폿을 형성하고, 다시 복수의 스폿을 형성함으로써 동시에 복수의 시약이나 의약품을 검사할 수 있는 하이 스루풋 스크리닝이 가능해진다.

여기에서, 도 3 은 본 실시의 형태에 관련된 다른 세포 배양부의 구성을 나타내는 평면도이고, 도 4 는 도 3 의 IV-IV 단면도이다. 도 3 에는, 복수의 마이크로 용기를 구획화하는 측벽 (14) 과 그 구획화된 스폿 (13) 을 나타냈다. 측벽 (14) 의 높이 (d) 는 배양액이나 반응액 등의 상청액이 건조되지 않게 유지할 수 있는 용량이면 되고, 적절히 설정하면 된다.

본 발명의 세포 배양부의 요철 패턴을 제작하는 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 몰드를 사용한 전사 성형, 3 차원 광 조형, 정밀 기계 절삭, 웨트 에칭, 드라이 에칭, 레이저 가공, 방전 가공 등의 방법을 들 수 있다. 세포 배양 용기의 용도, 요구되는 가공 정밀도, 비용 등을 고려하여 이러한 제조 방법들을 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

몰드를 사용하여 전사 성형 방법의 구체예로는, 금속 구조체를 형틀로 하여 수지 성형으로 요철 패턴을 형성하는 방법을 들 수 있다. 이 방법은 금속 구조체의 형상을 높은 전사율로 수지에 요철 패턴으로 재현할 수 있고, 또 범용의 수지 재료를 사용함으로써 재료 비용을 낮게 할 수 있으므로 바람직하다. 이와 같은 금속 구조체의 형틀을 사용하는 방법은 저비용이며, 높은 치수 정밀도를 만족할 수 있는 점에서 우수하다.

상기 금속 구조체의 제조 방법으로는, 예를 들어, 포토리소그래피에 의해 제작된 레지스트 패턴이나 3 차원 광 조형에 의해 제작된 수지 패턴에 대한 도금 처리, 정밀 기계 절삭, 웨트 에칭, 드라이 에칭, 레이저 가공, 방전 가공 등을 들 수 있다. 용도, 요구되는 가공 정밀도, 비용 등을 고려하여 적절히 선택하면 된다.

상기에서 얻어진 금속 구조체를 형틀로서 사용하여 수지에 요철 패턴을 성형하는 방법으로는, 예를 들어, 사출 성형, 프레스 성형, 모노머 캐스트 성형, 용제 캐스트 성형, 핫 엠보스 성형, 압출 성형에 의한 롤 전사 등의 방법을 들 수 있다. 생산성 및 형틀 전사성의 관점에서 사출 성형을 채용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 스크리닝 칩을 구성하는 재료로는, 자기 지지성을 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 합성 수지, 실리콘, 유리 등을 들 수 있다. 비용면이나 현미경 관찰에 의한 세포 시인성의 관점에서, 투명한 합성 수지를 재료로 하는 것이 바람직하다.

투명한 합성 수지로는, 예를 들어, 폴리메타크릴산메틸, 메타크릴산메틸-스티렌 공중합체 등의 아크릴계 수지, 폴리스티렌 등의 스티렌계 수지, 시클로올레핀등의 올레핀계 수지, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리락트산 등의 에스테르계 수지, 폴리디메틸실록산 등의 실리콘계 수지, 폴리카보네이트 수지 등을 들 수 있다. 이와 같은 수지에는, 투명성을 손상시키지 않는 범위에서 착색제, 확산제, 증점제 등의 각종 첨가제를 함유하고 있어도 된다.

본 발명의 스크리닝 칩은 표면의 친수성, 생체 적합성, 세포 친화성 등을 향상시키는 것을 목적으로 하며, 요철 패턴 표면측에 표면 처리를 실시하여, 개질층 및/또는 코팅층이 배치되어 있어도 된다.

상기 개질층을 형성하는 방법으로는, 자기 지지성을 상실하는 방법이나 100 ㎛ 이상의 극단적인 표면 거침을 일으키는 방법이 아니면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 약품 처리, 용제 처리, 표면 그래프트 중합에 의한 그래프트 폴리머의 도입 등의 화학적 처리, 코로나 방전, 오존 처리, 플라즈마 처리 등의 물리적 처리 등의 방법을 들 수 있다.

또, 코팅층을 형성하는 방법으로는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 스퍼터, 증착 등의 드라이 코팅, 무기 재료 코팅, 폴리머 코팅 등의 웨트 코팅 등의 방법을 들 수 있다.

요철 패턴 상에는, 기포가 혼입되는 일 없이 배양액을 주입하기 위해서 친수성을 부여하는 것이 바람직하고, 균일한 친수성 막을 형성시키는 방법으로서 무기 증착이 바람직하다.

또, 세포 친화성을 고려한 경우에는, 예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴 등의 세포 친화성 단백질을 코팅하는 것이 보다 바람직하다. 콜라겐 수용액 등을 균일하게 코트하기 위해서, 상기 서술한 친수성 막을 형성시킨 후, 코팅하는 것이 바람직하다. 통상적으로 세포 배양에 있어서는, 생체내 환경을 모방하여 세포외 매트릭스 표면에서의 배양이 바람직하기 때문에, 상기와 같이 균일한 친수성 무기막을 배치한 후에, 배양 세포에 적절한 세포외 매트릭스로 이루어지는 유기막을 배치하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 배양 방법 및 스크리닝 방법으로 배양하는 세포는 미분화 세포인 것이 바람직하고, 간 줄기 세포, 간 전구 세포, 장 줄기 세포, 장 상피 전구 세포, 간엽계 줄기 세포, 심근 전구 세포, 배아성 간 세포 등을 들 수 있고, 스크리닝의 목적에 따라 세포종을 적절히 선택하면 된다. 예를 들어, 의약품의 간장에서의 대사 반응을 상정한 스크리닝을 목적으로 하는 경우에는, 간 세포로 분화되는 간 줄기 세포 등을 사용한다. 특히, 인간에서의 의약품의 대사 반응을 목적으로 하는 경우에는 인간 간 줄기 세포를 사용한다.

본 발명의 스크리닝법은 세포를 배양하는 마이크로 용기에만 세포를 배치시키고, 그 공간 내에서 생체 내에 유사한 기능을 발현시키기 위해, 적절한 세포수를 파종할 필요가 있다. 세포 파종 밀도는 1.0×10⁴ ∼ 5.0×10⁶ 세포/㎠ 가 바람직하다. 예를 들어, 마이크로 용기가 정방형이고, 1 변이 100 ㎛ 인 경우, 1.0×10⁴ ∼ 1.0×10⁵ 세포/㎠ 가 바람직하다.

중층화하는 세포가 간 세포 또는 장 상피 세포인 경우, 유전자 발현량, 대사 효소 활성, 트랜스포터 활성 등을 측정하여 스크리닝하는 것이 바람직하다.

또, 중층화하는 세포가 신경 세포 또는 심근 세포인 경우, 유전자 발현량, 효소 활성 활동 전위 등을 측정하여 스크리닝하는 것이 바람직하다.

중층화하는 세포가 혈관 내피 세포인 경우, 혈관 신생을 시인하여 스크리닝하는 것이 바람직하다.

실시예

다음으로 본 발명에 관련된 세포 배양 방법의 실시예에 대해 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<태아 간 세포의 배양 방법>

인간 태아 간 세포의 동결 스톡을 타입 IV 콜라겐 코트 디쉬 (BD 제조) 상에 파종하고, 10 일간 정도 배양하여, 증식시켰다. 그 후, 0.03 % 타입 IV 콜라겐 (닛타 젤라틴 제조) 코트한 요철 패턴 기재 상에, 1 개의 마이크로 용기에 5 세포 들이 비율 (3.8×10⁴ 세포/㎠) 로 간 세포를 파종하고, 5 % CO₂, 37 ℃ 에서 3 주간 배양하였다. 사용한 배양액의 조성은 DMEM/F12 배지에 10 % 소 태아 혈청, 1 ㎍/㎖ 인슐린, 1×10^-7M 덱사메타손, 10 mM 니코틴아미드, 2 mM L-글루타민, 50 ㎛ β-메르캅토에탄올, 5 mM HEPES, 59 ㎍/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가한 것으로서, 파종 후 1 일째부터, 상기 배양액에 다시 25 ng/㎖ HGF, 20 ng/㎖ EGF, 10 ng/㎖ 온코스타틴 M 을 첨가하여 사용하였다. 동 조성의 신선 배지 0.5 ㎖ 를 사용하여 수일마다 배지 교환을 실시하였다.

<유전자 발현 해석>

간장의 표적인 약물 대사 효소인 시토크롬 P450 (CYP) 의 유전자 발현은 소정 일수 배양한 세포로부터 RNA 를 회수하고, cDNA 합성 후, 리얼타임 PCR 을 실시함으로써 평가하였다.

[실시예 1]

도 1 에 나타내는 요철 패턴 형상으로서, a=100 ㎛ , b=10 ㎛ , c=50 ㎛ 의 패턴을 포토리소그래피에 의해 제작하고, Ni 전해 도금을 실시하여, 대응하는 요철 형상을 갖는 금형을 얻었다. 그 금형을 사용하여 핫 엠보스 성형에 의해 폴리스티렌 상에 패턴 전사를 실시하여, 상기 치수의 수지 기재를 제작하였다. 그 수지 기재 표면에 진공 증착에 의해 이산화규소막을 100 ㎚ 형성시키고, γ 선 멸균을 실시하여, 요철 패턴 기재를 얻었다. 그 요철 기재 상에 IV 형 콜라겐을 코팅 후, 인간 태아 간 세포를 배양하였다.

[비교예 1]

시판 (벡톤·디킨슨 제조, 팔콘 (등록상표)) 의 γ 선 멸균이 완료된 평면 형상 24 웰 배양 플레이트를 사용하고, IV 형 콜라겐을 코팅 후, 인간 태아 간 세포를 배양하였다.

표 1 에는, 실시예 1 및 비교예 1 에 있어서의 배양 3 주일 후의 CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9 의 유전자 발현량을 나타낸다. 표 중, 비교예 1 의 3 주일 후의 각 CYP 발현량을 1 로 한 값을 나타내고 있다. 실시예 1 에서는, 어느 CYP 에 있어서도 비교예 1 보다 발현량이 많고, 3 주간의 배양에 있어서도 그 기능을 유지하고 있었다.

실시예 1 비교예 1

CYP3A4 4.5 1.0 CYP2D6 8.5 1.0 CYP2C9 2.3 1.0

산업상 이용가능성

본 발명은 조직으로부터 단리한 세포를 배양하는 세포 배양 방법에 적용할 수 있다.

10 세포 배양부
11 마이크로 용기
12 마이크로 용기의 측벽
13 스폿
14 스폿의 측벽

Claims (3)

1. 구획된 미소 공간 내에 있어서, 간 실질 세포로 분화되는 분화능을 갖는, 간 줄기 세포 및 간 전구 세포 중 적어도 하나를 중층화한 상태에서 배양하여, 간 실질 세포를 얻는 세포 배양 방법으로서,
   상기 구획된 미소 공간이
   표면에 복수의 마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기에 있어서의 당해 마이크로 용기이고,
   상기 마이크로 용기의 바닥 면적이 9×10^-4 ㎟ ~ 9×10^-2 ㎟, 측벽의 높이가 15 ㎛ ~ 150 ㎛, 측벽의 폭이 3 ㎛ ~ 15 ㎛ 이고,
   상기 마이크로 용기의 바닥면에 구멍이 뚫려 있지 않고,
   상기 세포 배양 용기에 있어서의 마이크로 용기가 형성된 영역이 투명성을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 간 줄기 세포 및 간 전구 세포 중 적어도 하나가 태아 간 조직으로부터 얻어지는 미(未)분화 세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 간 줄기 세포 및 간 전구 세포 중 적어도 하나가 인간 세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.

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