JP6159529B2 - 多能性哺乳細胞を分化させる培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、多能性細胞の培養に関し、特に、多能性哺乳細胞を分化させる培養方法に関する。

組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。

近年、胚性幹細胞（Embryonic stem cells:ES細胞）や誘導多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells:iPS細胞）など、多能性細胞の研究がすすめられている。多能性細胞は、生態を形成する組織・器官・臓器を構成する全ての細胞種に分化しうる砂防である。ＥＳ細胞は、多能性細胞の生物学的性質および初期胚内での分化の根底にあるメカニズムを研究するための強力なモデル系になり、哺乳動物の遺伝的操作ならびに結果として生じる商業、医学および農学応用のための機会を提供している。さらに、ＥＳ細胞の適切な増殖および分化を使用して、疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定を行う手法が開発されている。

単離した多能性細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿や試験管のなかで細胞を増殖及び分化させる操作が行われる。この培養細胞を用いて、種々の検査が行われる。単離した多能性細胞は、分化した、生体内での試験いわゆるｉｎ ｖｉｖｏ試験と同様の薬剤感受性、毒性反応を示すことが要求されると同時に、目的とする細胞に高効率に分化していることが要求される。

しかしながら、多能性細胞の多能性および分化を調節している生化学的メカニズムはほとんど理解されていないのが現状である。例えば、多能性細胞から分化させる手段として、特許文献１には、分化した哺乳動物細胞を産出するための組成物および方法が開示されている。詳細には、細胞培養においてフィーダ層上または無フィーダ条件で細胞を培養すること、ならびに多能性哺乳動物幹細胞から分化した哺乳動物細胞を生成させるために、それらの細胞をＰＩ３−キナーゼ経路の阻害剤及びＴＧＦｂファミリーのメンバーとさらに接触させること、とを採用した細胞分化方法が開示されている。

上記方法に加えて、非特許文献1では、胚葉体（Embryoid Body）の凝集体の大きさに応じて、多能性細胞の分化効率が変わることが示されている。このように、該凝集体の大きさを制御することは、均一な内胚葉系列の細胞、またはこの細胞から分化した、例えば肝細胞、β細胞を得るためには、非常に重要な要素の一つとなっている。非特許文献１に記載の方法では、細胞接着性を有するマトリゲルを、直径数十μｍ〜数百μｍの大きさで培養底面に一定間隔に配置させ、細胞接着領域とする。細胞接着領域の周囲には、細胞非接着性ポリマーをコートすることで、この細胞接着領域に選択的に細胞を接着させ、胚葉体の凝集体の大きさを制御している。

特表２００８−５０９６７６号公報

Celine Liu Bauwens, Raheem Peerani, Sylvia Niebruegge, kimberly a. Woodhouse, Eugenia Kumacheva, Mansoor Husain, Peter W. Zandstra 著、"Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories", STEM CELLS 2008;26, pp 2300-2310.

しかしながら、非特許文献に開示された培養方法では、操作が煩雑で高コストという問題があった。また、培養期間中に、細胞非接着部分に一部細胞が接着することもあり、高効率に細胞を分化させるには問題が残っている。これは、胚葉体の凝集塊のサイズの制御を困難にしている。

そこで本発明は、表面に複数のマイクロ容器を有する細胞培養容器であって、当該マイクロ容器の底部面積が１００μｍ^２〜１ｍｍ^２であり、深さが１０〜５００μｍの空間から構成される培養表面を有する細胞培養容器を用いて、胚葉体サイズの制御を実現し、胚葉体サイズを制御した状態で分化誘導可能な方法を提供することを目的とする。

本発明に係る多能性哺乳細胞を分化させる培養方法の一態様は、培養表面に複数のマイクロ容器を有する細胞培養容器を用いる。細胞培養容器は、マイクロ容器の空間構造の高さが１０μｍ〜５００μｍ、底部面積が１００μｍ^２〜１ｍｍ^２の空間から構成される培養表面を有する。多能性哺乳細胞を分化させる培養方法は、この細胞培養容器を用いて、多能性哺乳細胞を培養し、少なくとも部分的に内胚葉系列の細胞に分化した細胞集団を得る。当該マイクロ容器を用い、培養する胚葉体サイズを制御する。そして、胚葉体サイズを制御した状態を用いて、細胞の分化を誘導する。これにより、多能性哺乳細胞を分化させる効率を改善する。

また、本発明に係る多能性哺乳細胞を分化させる培養方法の一態様において、多能性哺乳細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、奇形癌腫細胞・精子幹細胞のいずれかから選択されることが好ましい。多能性哺乳細胞を、１つのマイクロ容器に１個〜３×１０^５個播種し、培養して前記細胞集団を得ることが好ましい。

本発明に係る多能性哺乳細胞を分化させる培養方法の一態様において、多能性哺乳細胞を、ＴＧＦ−βファミリー、ＦＧＦファミリー、及びＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物を含む培地で培養することが好ましい。上述したＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、Ｎｏｄａｌ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、及びＢＭＰ４からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物であることが好ましい。上述したＦＧＦファミリーのメンバーは、ｂ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物であることが好ましい。上述したＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物であることが好ましい。

また、本発明に係る多能性哺乳細胞を分化させる培養方法の一態様において、（１）少なくとも部分的にＳＯＸ１７を発現しておりＡＦＰを発現していない細胞集団を得ること、（２）少なくとも部分的にＳＯＸ１７を発現しておりＰｄｘ−１を発現していない細胞集団を得ること、（３）少なくとも部分的にＦｏｘＡ１またはＦｏｘＡ２を発現しておりＡＦＰを発現していない細胞集団を得ること、（４）少なくとも部分的にＦｏｘＡ１またはＦｏｘＡ２を発現しておりＰｄｘ−１を発現していない細胞集団を得ること、のいずれかであることを特徴とする。

さらに、本発明に係る多能性哺乳細胞を分化させる培養方法の一態様において、上述した培養方法によって得られた内胚葉系列の細胞に分化した細胞集団を、ＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＤＭＳＯ、デキサメタゾン、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、インスリンからなる群から選択される、１種類または２種類以上の物質を含む培地で培養する。そして、少なくとも、アルブミン（ＡＬＢ）と、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）とのいずれかを発現する細胞が部分的に存在する第２の細胞集団を得る。

本発明に係る多能性哺乳細胞を分化させる培養方法の一態様において、酸素濃度が４％以下の大気中で培養することが好ましい。

上述した細胞培養容器は、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうち１つまたはそれ以上の組み合わせからなる、樹脂成型品であることが好ましい。

上述したマイクロ容器は、前記マイクロ容器の空間構造の高さ方向に形成された側壁の上部５０％以上の部分において、前記底部と該側壁の各側面がなす角度が８０°〜９０°であることが好ましい。

上述したマイクロ容器底部の長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることが好ましい。

上述したマイクロ容器が設けられた領域に、表面処理が行われていることが好ましい。また、表面処理は、無機物でコートされたものであること、コラーゲン、ラミニンなどの細胞外マトリクスでコートされたものであること、合成物質でコートされたものであること、プラズマ処理されたものであること、マイクロ容器底面に、細胞接着斑に相当する直径である１ｎｍから細胞１個に相当する直径である２０μｍの凹凸を有するものであること、のいずれかであることが好ましい。

表面に複数のマイクロ容器を有する細胞培養容器であって、当該マイクロ容器の底部面積が１００μｍ^２〜１ｍｍ^２であり、深さが１０〜５００μｍの空間から構成される培養表面を有する細胞培養容器を用いて、胚葉体サイズの制御を実現し、胚葉体サイズを制御した状態で分化誘導可能な、多能性哺乳細胞を分化させる培養方法を提供する。

本発明の実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面図である。 図１の細胞培養容器のＩＩ−ＩＩ断面図である。 図１の細胞培養容器を用いて細胞を培養する状態を示す模式図である。 本発明の実施の形態に係る細胞培養容器の他の構成を示す平面図である。 図４の細胞培養容器のＶ−Ｖ断面図である。 本発明の実施の形態に係る細胞培養容器のさらに他の構成を示す平面図である。 図６の細胞培養容器のＶＩＩ−ＶＩＩ断面図である。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。

実施の形態
まず、実施の形態に係る細胞培養容器について説明し、その後、細胞培養方法について説明する。
１．細胞培養容器
図１は、本実施の形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図２は図１のＩＩ−ＩＩ断面図である。図１に示すように、細胞培養容器１０はマイクロ容器１１、側壁１２を備える。細胞培養容器１０の培養面には、複数の側壁１２が網目状に形成されており、この側壁１２に四方を囲われた空間（マイクロ空間）がマイクロ容器１１となる。

図１において、マイクロ容器１１の底部の幅ａ、マイクロ容器１１を区画するための側壁１２の幅ｂ、高さｃを示した。本発明における底部面積とは、マイクロ容器開口水平面（側壁１２上面と同一面）に垂直方向に上方から容器底へ平行光を照射した際の投影面積のことをいい、その面積は、１００μｍ^２〜１ｍｍ^２である。例えば、マイクロ容器の底がＵ字形状である場合、その開口面に垂直方向な上方より底に入射した平行光が投影する形状が底部面積となる。投影底部の長径及び短径とは、円及び楕円の場合、その重心を通る長軸及び短軸と円周との交点の各軸上の距離を長径及び短径といい、多角形の場合、その多角形の面積との差が最小となり各頂点を通る外挿円又は外挿楕円の長径および短径をいい、各頂点を通る外挿円又は外挿楕円を描けない場合は、最も多くの頂点を通る近似円又は楕円の長径および短径をいう。底部の大きさを、幅と奥行きとを用いて表す場合、幅と奥行きとは、底部上において垂直関係となる。

マイクロ容器１１の底部形状は特に制限されるものではなく、正方形、円、多角形以外にも種々の形状を採用することができる。生体内での肝機能を再現する細胞培養には、この底部面積は０．０１ｍｍ^２〜０．１ｍｍ^２が好ましい。また、底部の長径が短径の１〜１．５倍であることが好ましい。さらに、等方的形状が好ましく、正方形であれば、例えば、相当直径１００μｍの胚葉体の凝集塊を形成させる場合、一辺の長さが１００μｍ〜３００μｍが好ましい。また、例えば相当直径５００μｍの胚葉体の凝集塊を形成させる場合、一辺の長さが５００μｍ〜８００μｍが好ましい。

マイクロ容器１１の水平面と側壁１２とがなす角度は、細胞が乗り上げない角度でなければならないため、側面の上部から５０％以上の部分は８０°〜９０°が好ましく、特に、８５°〜９０°であることが好ましい。

側壁１２の高さｃは、マイクロ容器１１で培養する細胞が乗り上げ隣接するマイクロ容器１１へ移動しなければよく、１０μｍ〜５００μｍが好ましい。例えば、側壁１２の高さｃは、相当直径１００μｍの胚葉体の凝集塊を形成させる場合、５０μｍ〜１５０μｍが好ましい。また、例えば相当直径５００μｍの胚葉体の凝集塊を形成させる場合、５０μｍ〜３００μｍが好ましい。

図３は、図１の細胞培養容器を用いて細胞を培養する状態を示す模式図である。図３では、細胞培養容器を側面から透視してみた図である。任意のシャーレもしくはウェルプレート７に細胞培養容器１０を設置し、培地８で細胞培養容器１０を満たす。側壁１２に囲まれて形成されたマイクロ容器１１内で、細胞９が培養される。図３中、図１，２と同様に、マイクロ容器１１の底部の幅ａ、側壁１２の幅ｂ、高さｃを示す。培養表面は、マイクロ容器１１の底部と側壁１２とによって形成される空間の表面である。細胞９は、培養表面を用いて培養される。

なお、図４及び図５に示すように、各マイクロ容器１１の四辺に形成された側壁１２の各辺の中央部に、開口部１３が形成されていてもよい。隣接するマイクロ容器１１を互いに連通するための開口部１３の幅ｄは、培養細胞が最初に播種されたマイクロ容器１１から隣接するマイクロ容器１１に移動できない程度であればよい。例えば、培養細胞の相当直径が２０μｍであれば、５〜１５μｍであることが好ましい。ここで、図４は、本実施の形態に係る他の細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図５は図４のＶ−Ｖ断面図である。

また、図６及び図７に示すように、本実施の形態に係る細胞培養容器は、所定数の複数のマイクロ容器からなる区画されたスポットを有していてもよい。ここで、図６は、本実施の形態に係るさらに他の細胞培養部の構成を示す平面図であり、図７は図６のＶＩＩ−ＶＩＩ断面図である。図６及び図７では、図４及び図５に示すマイクロ容器の構造を用いている例を示す。図６には、複数のマイクロ容器を区画化する側壁２４とその区画化されたスポット２３を示した。側壁２４の高さｅは、培養液や反応液等の上清液が乾燥せず保持できる容量であればよく、適宜設定すればよい。側壁２４を有することにより、各スポット２３で異なる培地を用いることも可能となる。また、図６及び図７において、側壁２４を有する構成例を示したが、側壁２４を備えていない構成であってもよい。

細胞培養容器上の凹凸パターンを作製する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等の方法が挙げられる。細胞培養容器の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。

モールドを用いて転写成形する方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で凹凸パターンを形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で樹脂へ凹凸パターンに再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。

上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択すればよい。

上記で得られた金属構造体を型として用いて樹脂へ凹凸パターンを成形する方法としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができる。生産性及び型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。

細胞培養容器を構成する材料としては、自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞視認性の観点から、透明な合成樹脂を材料とすることが好ましい。透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体、等のアクリル系樹脂、ポリスチレン、アクリル・スチレン系共重合樹脂等のスチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のエステル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。

細胞培養容器は、容器表面の親水性、生体適合性、細胞親和性等を向上させることを目的として、凹凸パターン表面側に表面処理を行い、改質層及び／又はコーティング層が配されていてもよい。上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。またコーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティング等の方法が挙げられる。凹凸パターン上には、気泡の混入することなく培養液を注入するために親水性を付与することが望ましく、均一な親水性膜を形成させる方法として、無機蒸着が好ましい。

また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。コラーゲン水溶液等を均一にコートするために、上述の親水性膜を形成させた後、コートすることが好ましい。生体内環境を模倣して細胞外マトリックス表面での培養が望ましいため、上記のように均一な親水性無機膜を配した後に、培養細胞に適した細胞外マトリックスからなる有機膜を配することが特に好ましい。

また、マイクロ容器底面に、細胞接着斑〜培養細胞に相当する大きさに相当する１ｎｍ〜２０μｍの凹凸を形成させる方法が挙げられる。このような表面に、上記に記載の親水性処理、細胞親和性たんぱく質をコートする方法と組み合わせる方法が好ましい。

上記の各表面処理はそれぞれ単独で行っても良いし、必要に応じて適宜組み合わせて行ってもよい。

また、上述した細胞培養容器を用いる細胞培養方法は、細胞を培養するマイクロ容器のみに細胞を配置させ、その空間内で生体内に類似した形態や機能を発現させるため、適切な細胞数を播種する必要があり、細胞播種密度１．０×１０^２〜１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２が好ましく、細胞播種密度１．０×１０³〜１．０×１０⁵細胞／ｃｍ^２がより好ましい。例えば、マイクロ容器が正方形で、１辺が１００μｍの場合、５．０×１０³〜５．０×１０^５細胞／ｃｍ^２が好ましい。

用いられる多能性哺乳細胞は、一般的な平坦な培養表面をもつ培養プレート、または、培養ディッシュを用いて増殖させた細胞を用いてもよく、また、上述した細胞培養容器を用いて増殖させてもよい。

また、上述した細胞増殖は一般的にフィーダ細胞を用いられるが、他の細胞の混入を防ぐため、及び操作を簡便にするため、フィーダ細胞を用いないほうがより好ましい。

上述した細胞培養容器を用いる細胞培養方法は、胚葉体の凝集塊を形成させる工程を含むが、その際、フィーダ細胞を用いてもよいが、他の細胞の混入を防ぐ、及び操作を簡便にする観点から、フィーダ細胞を用いないほうがより好ましい。

２．細胞培養方法
本実施形態では、多能性哺乳細胞を培養し、少なくとも部分的に内胚葉系列（Endoderm Lineages）の細胞に分化した細胞集団を得る培養方法を説明する。
本明細書では、細胞培養方法を説明するにあたって、次の用語を用いる。

用語「多能性」は、胚の構造を支える細胞以外の、あらゆる型の細胞を生じさせる細胞の能力を指す。
用語「多能性細胞」は、外胚葉、内胚葉、および中胚葉細胞の１つに少なくとも発達することができる細胞を指す。
用語「全能性細胞」は、全系列の細胞に発達することができる細胞を指す。
用語「胚性幹細胞（ＥＳ細胞）」は、万能細胞の一種であり、さまざまな異なる細胞に分化し、増殖する能力を持つ、発生初期の胚由来の細胞である。ＥＳ細胞は、受精卵の一段階である胚盤胞から取り出した内部細胞塊から樹立される。
用語「誘導多能性幹細胞（iPS細胞）」は、万能細胞の一種であり、ＥＳ細胞と同様に増殖して各種細胞へと分化することが可能な細胞である。ｉＰＳ細胞は皮膚細胞などから作り出すことができる。

用語「多分化能性」は、終末分化していない細胞を指す。同様に、用語「多分化能性」は、操作（すなわち、核移植または脱分化誘導）なしには、３つ全ての胚葉（中胚葉、外胚葉および内胚葉）由来の分化した細胞型を形成できない細胞、また言い換えると部分的に分化した細胞を指す。
用語「多能性ヒト細胞」は、ヒト胚、胎児または成体組織から得られた多能性細胞を包含する。多能性ヒト細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ヒト内部細胞塊（ＩＣＭ）／胚盤葉上層細胞、初期原始外胚葉細胞（ＥＰＬ）などのヒト原始外胚葉細胞、ヒト始原生殖（ＥＧ）細胞、およびヒト奇形癌腫（ＥＣ）細胞からなる群から選択することができる。

用語「内胚葉」には、胚体内胚葉、壁側内胚葉、臓側内胚葉、および中内胚葉細胞が含まれるが、それに限定されるわけではない。本明細書に使用されるように、用語「胚体内胚葉」は胚において内胚葉系列から生成する任意または多数の内胚葉細胞型（すなわち膵臓、肝臓、肺、胃、腸および甲状腺）に分化する能力を有する初期内胚葉細胞を指す。胚体内胚葉細胞は多分化能である。したがって、本発明の関連で用語「胚体内胚葉」の使用は、その細胞が、得られた多能性細胞よりも内胚葉細胞型に向けて少なくともより大きく分化していることを意味する。同様に、本明細書に使用されるように、内胚葉細胞の産生は、内胚葉細胞が集積した細胞培養物の産生を包含する。

「胚体内胚葉」細胞は、ＳＯＸ１７などの特異的マーカ転写体の発現と、それに付随したＡＦＰおよびトロンボモジュリンに関するマーカ転写体の不在とによって特徴付けられる。なお、当該細胞はＭＩＸ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦα、およびＨＮＦ３ｂを発現することがある。

原腸形成と名付けられたヒト発生初期の重大な段階は、受精の２〜３週間後に起こる。原腸形成の間に、胚体内胚葉形成過程は、中内胚葉細胞（中胚葉または内胚葉形成に適格な細胞）が原始線条と呼ばれる構造を通過して遊走する細胞遊走イベントと共に開始する。胚体内胚葉は、線条前部および結節（線条最前部での特殊構造）を通過して遊走する細胞に由来する。遊走が起こるとき、胚体内胚葉は最前部腸管を最初占有し、腸管後端の形成と共に最高に達する。

用語「分化する」は、それが得られた細胞型よりもよく分化した細胞型の産生を指す。したがって、本用語は部分的に分化および終末分化した細胞型を包含する。

細胞、細胞系、細胞培養物または細胞集団を指す場合、用語「単離された」は、その細胞、細胞系、細胞培養物、または細胞集団がｉｎ ｖｉｔｒｏ培養できるように、その細胞の天然供給源から実質的に分離されたことを指す。さらに、用語「単離すること」は、２つ以上の細胞の群から１つまたは複数の細胞を物理的に選択することを指し、ここで、これらの細胞は、細胞の形態および／または様々なマーカの発現に基づき選択される。

用語「発現する」は、細胞中のポリヌクレオチドの転写またはポリペプチドの翻訳を指し、それによって、その分子を発現しない細胞中のその分子のレベルよりも、その分子を発現する細胞中のその分子のレベルの方が測定できる程度に高い。分子の発現を測定する方法は当業者に十分に公知であり、それらの方法には、非限定的にノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット、および免疫染色が含まれる。

用語「接着培養」は、細胞を固体表面上で培養し、その固体表面を今度は固体支持体で被覆することができ、今度は下記に挙げたもののような別の支持体の表面被覆で、または細胞を培養物中で増殖または安定化させる任意の他の化学材料または生物学的材料でその支持体を被覆することができる細胞培養系を指す。これらの細胞は固体表面または支持体に堅固に接着できるか、またはできない。

用語「Ｓｏｘ１７」は内胚葉系列の細胞を示すマーカである。これは、ＤＮＡ結合ドメインを含む転写制御因子で、幹細胞の運命決定に深く関わっている、Sry-related high mobility group box (Sox)ファミリーの一つであり、内胚葉の形成と維持に必要であることが知られている。
参考文献：Hudson, C., Clements, D., Friday, R.V., Stott, D., and Woodland, H.R.(1997). Xsox17alpha and -beta mediate endoderm formation in Xenopus. Cell 91, 397-405.

用語「ＦｏｘＡ１」、「ＦｏｘＡ２」は、Human Forkhead-box (FOX)遺伝子ファミリーのひとつであり、膵臓の細胞、肝細胞に分化する前段階で発現するといわれている。すなわち、これら遺伝子が発現している細胞は、内胚葉系列の細胞と成熟した組織細胞の中間の細胞と定義づけられる。
用語「Ｐｄｘ−１」は、膵臓細胞に発現する遺伝子で、膵臓細胞のマーカであることが知られている。
用語「ＡＦＰ」は、肝細胞に発現する遺伝子で、肝細胞のマーカであることが知られている。

［実施例１］
１．マウスｉＰＳ細胞の調整工程
マイクロ容器の高さが５０μｍ、幅が１００μｍ、奥行きが１００μｍの空間が培養底面に規則的に配置された細胞培養容器を用い、０．５×１０^５個／ｃｍ^２になるように、マウスｉＰＳ細胞を播種し、１８％ ＦＢＳ，2-mercaptoethanol（１１０ｍＭ），及び、５００Ｕ／ｍｌ leukemia inhibitory factorを含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地で３日間培養した。培地交換は１回／２４時間の頻度で行った。

２．胚葉体の凝集塊作製工程（ＥＢ培養）
１５％ＦＢＳ，１％ nonessential amino acids，１％ nucleosides，１％ penicillin/streptomycin，及び、１％ glutamic acidを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ社製）培地に交換して２日間培養した。培地交換は１回／１日の頻度で行った。

３．内胚葉系列の細胞の作製工程
１％ ＦＢＳ，１％ nonessential amino acids，１％ nucleosides，１％ penicillin/streptomycin，１％ glutamic acid，３％ ＢＳＡ， １００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２、及び、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ社製）培地に交換して３日間培養した。培地交換は１回／１２時間の頻度で行った。

４．ＡＦＰ、ＡＬＢ陽性細胞の作製工程
１０−１５％ ＦＢＳ，１％ nonessential amino acid，１％ nucleosides，１％ penicillin/streptomycin，１％ glutamic，５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、及び、１％ ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に交換して、８日間培養した。培地交換は１回／１２時間の頻度で行った。さらに、１０−１５％ ＦＢＳ，１％ nonessential amino acid，１％ penicillin/streptomycin，１％ glutamic acid，１００ｎｇ／ｍｌ ｄＨＧＦ、及び、１０^−７Ｍ dexamethasoneを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で、３日間培養した。培地交換は１回／１２時間の頻度で行った。

［比較例１］
０．フィーダ細胞の調整工程
φ６ｃｍのプラスチック製の培養底面が平坦な細胞培養ディッシュに、フィーダ細胞（Primary mouse embryo fibroblasts）（大日本製薬社 Ｐ−ＭＥＦ−ＣＦ）を、１０％ＦＢＳ，４５００ｍｇ／L-glucose，２ｍＭ L-glutamine，１％ penicillin/streptomycinを含むＤＭＥＭ培地で８時間培養した。

１．マウスｉＰＳ細胞の調整（２工程）
１．１ 細胞播種工程
上記０の工程で得られた培養ディッシュに、０．５×１０^５個／ｃｍ^２になるように、マウスｉＰＳ細胞を播種し、１８.％ ＦＢＳ，2-mercaptoethanol（１１０ ｍＭ）、及び、５００Ｕ／ｍｌ leukemia inhibitory factorを含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地で３日間培養した。培地交換は１回／２４時間の頻度で行った。
１．２ 細胞回収工程
１．１の培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、フィーダ細胞上からｉＰＳ細胞を剥離した。

２．胚葉体の凝集塊作製工程（ＥＢ培養）
φ６ｃｍのプラスチック製の培養底面が平坦な培養ディッシュに、１．２で得られた細胞を播種した。培地は、１５％ＦＢＳ，１％ nonessential amino acids， １％ nucleosides， １％ penicillin/streptomycin，１％ glutamic acidを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いて２日間培養した。培地交換は１回／１日の頻度で行った。

３．内胚葉系列の細胞の作製工程
１％ ＦＢＳ，１％ nonessential amino acids，１％ nucleosides，１％ penicillin/streptomycin，１％ glutamic acid，３％ ＢＳＡ，１００ ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２、及び、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ社製）培地に交換して３日間培養した。培地交換は１回／１２時間の頻度で行った。

４．ＡＦＰ、ＡＬＢ陽性細胞の作製工程
１０-１５％ ＦＢＳ，１％ nonessential amino acid，１％ nucleosides，１％ penicillin/streptomycin，１％ glutamic acid，５０ ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、及び、１％ ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に交換して、８日間培養した。培地交換は１回／１２時間の頻度で行った。さらに、１０−１５％ ＦＢＳ，１％ nonessential amino acid，１％ penicillin/streptomycin，１％ glutamic acid，１００ｎｇ／ｍｌ ｄＨＧＦ、及び、１０^−７Ｍ dexamethasoneを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に交換して、３日間培養した。培地交換は１回／１２時間の頻度で行った。

［分析］
分析は、リアルタイムＰＣＲ法で行い、上記１の工程に使用する前のｉＰＳ細胞と、上記４の培養工程が終了した後の細胞を回収して、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの定量解析を行った。ＡＬＢとＡＦＰのｍＲＮＡ発現量はＧＡＰＤＨに対する値として算出した。

［結果］
上記１の工程に使用する前のｉＰＳ細胞の各遺伝子発現量を１とした場合の相対値を示す。

実施例１にある方法で内胚葉系列の細胞に分化させた後、肝細胞に分化させることで、肝特異的なマーカであるＡＦＰとＡＬＢの遺伝子発現量が、比較例に対して、それぞれ１．７倍、３３倍と高い値となった。

［実施例２］
マイクロ容器をもつ培養プレートを用いたヒトｉＰＳ細胞の分化誘導
０．フィーダ細胞の調整工程
φ６ｃｍのプラスチック製の培養底面が平坦な細胞培養ディッシュに、フィーダ細胞（Primary mouse embryo fibroblasts）を、１０％ＦＢＳ，４５００ｍｇ／L-glucose，２ｍＭ L-glutamine，１％ penicillin/streptomycinを含むＤＭＥＭ培地で８時間培養した。

１．ヒトｉＰＳ細胞の調整工程
ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（理研ＢＲＣ番号：ＨＰＳ０００１））はマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）上でＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０％ＫＳＲ＋ｂＦＧＦを含む培地を用いて維持した。

２．胚性内胚葉細胞の作製工程
マトリゲルをコートした、マイクロ容器の高さが５０μｍ、幅が１００μｍ、奥行きが１００μｍの空間が培養底面に規則的に配置された細胞培養容器に、単細胞に分散したヒトｉＰＳ細胞を播種し、ＲＰＭＩ１６４０にＢ２７を添加した分化誘導培地を用いて２４時間培養した。２４時間後に、ヒト型アクチビンを分化誘導培地に添加した培地に交換し、６日間培養した。培地交換は１回／２日の頻度で行った。

３．肝細胞系列の細胞の作製工程（ＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ陽性細胞の作製工程）
実施例２に記載の「２．胚性内胚葉細胞の作製工程」の操作を行なった後、分化誘導培地に１０ｎｇ ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ４を添加した培地に交換し、３日間培養した。培地交換は１回／２日の頻度で行なった。

次に、分化誘導培地に４０ｎｇ ｈＨＧＦを含む培地に交換し、さらに４日間培養した。培地交換は１回／２日の頻度で行なった。

［比較例２］
平板の培養プレートを用いたヒトｉＰＳ細胞の分化誘導
０．フィーダ細胞の調整工程
φ６ｃｍのプラスチック製の培養底面が平坦な細胞培養ディッシュに、フィーダ細胞（Primary mouse embryo fibroblasts）を、１０％ＦＢＳ，４５００ｍｇ／L-glucose，２ｍＭ L-glutamine，１％ penicillin/streptomycinを含むＤＭＥＭ培地で８時間培養した。

１．ヒトｉＰＳ細胞の調整工程
ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（理研ＢＲＣ番号：ＨＰＳ０００１）はマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）上でＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０％ＫＳＲ＋ｂＦＧＦを含む培地を用いて維持した。

２．胚性内胚葉細胞の作製工程
マトリゲルをコートした、平らな培養底面を有する細胞培養容器に、単細胞に分散したヒトｉＰＳ細胞を播種し、ＲＰＭＩ１６４０にＢ２７を添加した分化誘導培地を用いて２４時間培養した。２４時間後に、ヒト型アクチビンを分化誘導培地に添加した培地に交換し、６日間培養した。培地交換は１回／２日の頻度で行った。

３．肝細胞系列の細胞の作製工程（ＡＦＰ、ＨＮＦ４Ａ陽性細胞の作製工程）
比較例２に記載の「２．胚性内胚葉細胞の作製工程」の操作を行なった後、分化誘導培地に１０ｎｇ ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ４を添加した培地に交換し、３日間培養した。培地交換は１回／２日の頻度で行なった。

次に、分化誘導培地に４０ｎｇ ｈＨＧＦを含む培地に交換し、さらに４日間培養した。培地交換は１回／２日の頻度で行なった。

［分析］
実施例２の「２．胚性内胚葉細胞の作製工程」及び比較例２の「２．胚性内胚葉細胞の作製工程」の細胞を用いて、胚体内胚葉細胞のマーカＳｏｘ１７およびＣＸＣＲ４の遺伝子発現量を定量ＰＣＲにより解析した。実施例２の「３．肝細胞系列の細胞の作製工程」及び比較例２の「３．肝細胞系列の細胞の作製工程」の細胞を用いて、肝臓細胞系列の細胞のマーカＨＮＦ４ＡおよびＡＦＰの発現を定量ＰＣＲにより解析した。値は、比較例２のマーカの発現量を１とした場合の相対値で示した。

［結果］
胚性内胚葉細胞への分化誘導の有無を解析した結果を、表２に示した。ここで、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４は胚体内胚葉、ＡＦＰは肝細胞系列の細胞のマーカである。実施例２の「２．胚性内胚葉細胞の作製工程」及び比較例２の「２．胚性内胚葉細胞の作製工程」の段階では、胚性内胚葉細胞に分化させる工程であることから、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４が多く発現され、ＡＦＰの発現量が小さいほど、胚性内胚葉細胞に効率的に分化しているといえる。

肝細胞系列の細胞への分化誘導の有無を解析した結果を、表３に示した。ここで、ＳＯＸ１７は胚性内胚葉細胞、ＨＮＦ４Ａ及びＡＦＰは肝細胞系列の細胞に特異的なマーカである。実施例２の「３．肝細胞系列の細胞の作製工程」及び比較例２の「３．肝細胞系列の細胞の作製工程」の段階では、肝細胞系列の細胞に分化させる工程であることから、ＳＯＸ１７の発現量が小さく、ＨＮＦ４Ａ及びＡＦＰの発現量が多いほど、肝細胞に効率的に分化しているといえる。

表４には、表３の肝細胞系列へ分化誘導した後のＳＯＸ１７の遺伝子発現量を、表２の胚性内胚葉細胞分化誘導後のＳＯＸ１７の遺伝子発現量と比較し、それぞれの培養条件における発現低下率を示した。

実施例２は、胚性内胚葉細胞に特異的なマーカＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４の発現量が、比較例２の約５倍及び１．７倍という高い値を示し、肝細胞系列の細胞のマーカがほとんど発現していない。即ち、実施例２（マイクロ容器を有する細胞培養容器）は、効率的に胚性内胚葉細胞に分化させることができる。

実施例２は、肝細胞系列の細胞に特異的なマーカＨＮＦ４Ａ及びＡＦＰの発現量が、それぞれ、比較例２の約２倍及び２２倍という高い値を示し、肝細胞系列の細胞のマーカが多く発現している。かつ、表４に示したように、肝細胞系列の細胞に分化させた後のＳＯＸ１７の値について、実施例２は比較例の１０分の１であり、肝細胞系列の細胞に分化させた後の細胞のうち、胚性内胚葉細胞の細胞が残存している割合が少ないといえる。
即ち、実施例２（マイクロ容器を有する細胞培養容器）は、効率的に胚性内胚葉系列の細胞である肝細胞に分化させることができる。

なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。

この出願は、２０１０年３月２３日に出願された日本出願特願２０１０−０６６３２４を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

７ シャーレもしくはウェルプレート
８ 培地
９ 細胞
１０ 細胞培養容器
１１ マイクロ容器
１２ 側壁
１３ 開口部
２３ スポット
２４ スポットの側壁

Claims (21)

1. 培養表面に複数のマイクロ容器を有する細胞培養容器であって、前記マイクロ容器の空間構造の高さが１０μｍ〜５００μｍ、底部面積が１００μｍ^２〜０．１ｍｍ^２の空間から構成される培養表面を有する細胞培養容器を用いて、多能性哺乳細胞を分化させる培養方法であって、
   多能性哺乳細胞を前記マイクロ容器に播種し、
   前記多能性哺乳細胞を培養して胚様体の凝集塊を形成し、
   前記凝集塊より少なくとも部分的に内胚葉系列の細胞に分化した細胞集団を得るところ、
   前記少なくとも部分的に内胚葉系列の細胞に分化した細胞集団とは、内胚葉系列の細胞に部分的に分化した細胞集団、又は内胚葉系列の細胞に終末分化した細胞集団であり、
   前記マイクロ容器内において、前記凝集塊を、ＴＧＦ−βファミリー、ＦＧＦファミリー、及びＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物を含む培地で培養して前記細胞集団を得ることを特徴とする、
   多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
2. 前記多能性哺乳細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、奇形癌腫細胞・精子幹細胞のいずれかから選択されることを特徴とする請求項１記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
3. 前記多能性哺乳細胞を、１つの前記マイクロ容器に１個〜３×１０^５個播種して前記細胞集団を得ることを特徴とする請求項１または２記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
4. 前記多能性哺乳細胞を、少なくともＴＧＦ−βファミリー、及びＦＧＦファミリーからなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物を含む培地で培養して前記細胞集団を得ることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
5. 前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、Ｎｏｄａｌ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、及びＢＭＰ４からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
6. 前記ＦＧＦファミリーのメンバーは、ｂ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
7. 前記ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、塩化リチウム、Ａｋｔ阻害剤Ｉ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩ、Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、ＮＬ−７１−１０１からなる群から選択される１種類の物質または２種類以上の混合物であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
8. 少なくとも部分的にＳＯＸ１７を発現しておりＡＦＰを発現していない細胞集団を得ることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
9. 少なくとも部分的にＳＯＸ１７を発現しておりＰｄｘ−１を発現していない細胞集団を得ることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
10. 請求項１乃至９のいずれか一項に記載の培養方法により多能性哺乳細胞を分化させる工程と、
    当該培養方法により得た、前記内胚葉系列の細胞に部分的に分化した細胞集団を、ＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＤＭＳＯ、デキサメタゾン、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、及びインスリンからなる群から選択される、１種類または２種類以上の物質を含む培地で培養し、少なくとも、アルブミン（ＡＬＢ）と、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）とのいずれかを発現する細胞が部分的に存在する第２細胞集団を得る工程と、を有することを特徴とする多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
11. 酸素濃度が４％以下の大気中で培養することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
12. 前記細胞培養容器は、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうち１つまたはそれ以上の組み合わせからなる、樹脂成型品である、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
13. 前記マイクロ容器は、前記マイクロ容器の空間構造の高さ方向に形成された側壁の上部５０％以上の部分において、前記底部と該側壁の各側面がなす角度が８０°〜９０°であることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
14. 前記マイクロ容器底部の長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
15. 前記マイクロ容器が設けられた領域に、表面処理が行われていることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
16. 前記表面処理が無機物でコートされたものであることを特徴とする請求項１５記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
17. 前記表面処理がコラーゲン及びラミニンからなる群から選ばれる一以上の細胞外マトリクスでコートされたものであることを特徴とする請求項１５または１６記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
18. 前記表面処理が合成物質でコートされたものであることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
19. 前記表面処理がプラズマ処理されたものであることを特徴とする請求項１５乃至１８のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
20. 前記表面処理が前記マイクロ容器底面に、細胞接着斑に相当する直径である１ｎｍから、細胞１個に相当する直径である２０μｍの大きさの凹凸を有するものであることを特徴とする請求項１５乃至１９のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。
21. 前記マイクロ容器の底面は平らである、
    請求項１乃至２０のいずれか一項に記載の多能性哺乳細胞を分化させる培養方法。

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