KR101832004B1

KR101832004B1 - 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법

Info

Publication number: KR101832004B1
Application number: KR1020127027302A
Authority: KR
Inventors: 요코 잇쵸다; 고 다자키; 마사야 호소다; 모토히로 후쿠다; 히데키 다니구치; 윈-웬 정; 게이스케 세키네
Original assignee: 주식회사 쿠라레; 고리츠다이가쿠호진 요코하마시리츠다이가쿠
Priority date: 2010-03-23
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2018-02-23
Also published as: KR20120138815A; EP2551341B1; JP6159529B2; SG10201502242VA; EP2551341A1; JPWO2011118211A1; US10513685B2; US20130071932A1; CN103038336A; SG184204A1; EP2551341A4; CA2793971A1; WO2011118211A1

Abstract

복수의 마이크로 용기가 형성된 세포 배양 용기를 사용하여, 배엽체 사이즈의 제어를 실현, 배엽체 사이즈를 제어한 상태에서 분화 유도 가능한 방법을 제공한다. 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법은 배양 표면에 복수의 마이크로 용기 (11) 를 갖는 세포 배양 용기 (10) 를 사용한다. 세포 배양 용기 (10) 는 마이크로 용기 (11) 의 공간 구조의 높이가 10 ㎛ ∼ 500 ㎛, 저부 면적이 100 μ㎡ ∼ 1 ㎟ 의 공간으로 구성되는 배양 표면을 갖는다. 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법은, 세포 배양 용기 (10) 를 사용하여, 다능성 포유 세포를 배양하고, 적어도 부분적으로 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단을 얻는다.

Description

다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법{CULTURE METHOD FOR CAUSING DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT MAMMALIAN CELLS}

본 발명은 다능성 세포의 배양에 관한 것으로, 특히, 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법에 관한 것이다.

조직으로부터 단리된 세포를 시험, 검사에 사용하는 수법은 바이오 테크놀로지 관련 분야에서는 빠뜨릴 수 없는 방법이 되어 있다. 질병, 병태의 진단, 신약의 탐색 및 약효의 판정, 혹은 동물 검사, 식물 검사, 환경 오염 물질의 시험 등에 폭넓게 사용되고 있다. 그 때문에, 바이오 테크놀로지 분야에서 사용되는 세포류는 매우 다양화되어 왔다.

최근, 배성 간세포 (Embryonic stem cells : ES 세포) 나 유도 다능성 간세포 (Induced pluripotent stem cells : iPS 세포) 등, 다능성 세포의 연구가 진행되고 있다. 다능성 세포는 생태를 형성하는 조직·기관·장기를 구성하는 모든 세포종으로 분화될 수 있는 사방 (砂防) 이다. ES 세포는 다능성 세포의 생물학적 성질 및 초기 배 (胚) 내에서의 분화의 근저에 있는 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 모델계가 되어, 포유 동물의 유전적 조작 그리고 결과적으로 발생되는 상업, 의학 및 농학 응용을 위한 기회를 제공하고 있다. 또한, ES 세포의 적절한 증식 및 분화를 사용하여, 질병, 병태의 진단, 신약의 탐색 및 약효의 판정을 실시하는 수법이 개발되고 있다.

단리된 다능성 세포는 즉시 시험에 사용되는 경우도 있지만, 많은 경우, 배양 접시나 시험관 속에서 세포를 증식 및 분화시키는 조작이 실시된다. 이 배양 세포를 사용하여, 여러 가지의 검사가 실시된다. 단리된 다능성 세포는 분화된, 생체 내에서의 시험 이른바 in vivo 시험과 동일한 약제 감수성, 독성 반응을 나타낼 것이 요구됨과 동시에, 목적으로 하는 세포로 고효율로 분화되고 있을 것이 요구된다.

그러나, 다능성 세포의 다능성 및 분화를 조절하고 있는 생화학적 메커니즘은 거의 이해되고 있지 않은 것이 현상이다. 예를 들어, 다능성 세포로부터 분화시키는 수단으로서, 특허문헌 1 에는, 분화된 포유 동물 세포를 산출하기 위한 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 상세하게는, 세포 배양에 있어서 피더층상 또는 무피더 조건으로 세포를 배양하는 것, 그리고 다능성 포유 동물 간세포로부터 분화된 포유 동물 세포를 생성시키기 위해서, 그들 세포를 PI3-키나아제 경로의 저해제 및 TGFb 패밀리의 멤버와 더욱 접촉시키는 것을 채용한 세포 분화 방법이 개시되어 있다.

상기 방법에 더하여, 비특허문헌 1 에서는, 배엽체 (Embryoid Body) 의 응집체의 크기에 따라, 다능성 세포의 분화 효율이 변하는 것이 나타나 있다. 이와 같이, 그 응집체의 크기를 제어하는 것은, 균일한 내배엽 계열의 세포, 또는 이 세포로부터 분화된, 예를 들어 간세포, β 세포를 얻기 위해서는, 매우 중요한 요소의 하나가 되어 있다. 비특허문헌 1 에 기재된 방법에서는, 세포 접착성을 갖는 매트리겔을, 직경 수 십 ㎛ ∼ 수 백 ㎛ 의 크기로 배양 저면에 일정 간격으로 배치시켜, 세포 접착 영역으로 한다. 세포 접착 영역 주위에는, 세포 비접착성 폴리머를 코트함으로써, 이 세포 접착 영역에 선택적으로 세포를 접착시켜, 배엽체의 응집체 크기를 제어하고 있다.

일본 공표특허공보 2008-509676호

Celine Liu Bauwens, Raheem Peerani, Sylvia Niebruegge, kimberly a. Woodhouse, Eugenia Kumacheva, Mansoor Husain, Peter W. Zandstra 저, "Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories", STEM CELLS 2008 ; 26, pp 2300-2310.

그러나, 비특허문헌에 개시된 배양 방법에서는, 조작이 번잡하며 고비용이라는 문제가 있었다. 또, 배양 기간 중에, 세포 비접착 부분에 일부 세포가 접착되는 경우도 있어, 고효율로 세포를 분화시키기 위해서는 문제가 남아 있다. 이것은 배엽체의 응집 덩어리의 사이즈의 제어를 곤란하게 하고 있다.

그래서 본 발명은 표면에 복수의 마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기로서, 당해 마이크로 용기의 저부 면적이 100 μ㎡ ∼ 1 ㎟ 이며, 깊이가 10 ∼ 500 ㎛ 의 공간으로 구성되는 배양 표면을 갖는 세포 배양 용기를 사용하여, 배엽체 사이즈의 제어를 실현하고, 배엽체 사이즈를 제어한 상태로 분화 유도 가능한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 관련된 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법의 일 양태는 배양 표면에 복수의 마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기를 사용한다. 세포 배양 용기는 마이크로 용기의 공간 구조의 높이가 10 ㎛ ∼ 500 ㎛, 저부 면적이 100 μ㎡ ∼ 1 ㎟ 인 공간으로 구성되는 배양 표면을 갖는다. 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법은, 이 세포 배양 용기를 사용하여, 다능성 포유 세포를 배양하고, 적어도 부분적으로 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단을 얻는다. 당해 마이크로 용기를 사용하여 배양하는 배엽체 사이즈를 제어한다. 그리고, 배엽체 사이즈를 제어한 상태를 사용하여, 세포의 분화를 유도한다. 이로써, 다능성 포유 세포를 분화시키는 효율을 개선시킨다.

또, 본 발명에 관련된 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법의 일 양태에 있어서, 다능성 포유 세포는 배성 간세포 (ES 세포), 유도 다능성 간세포 (iPS 세포), 기형 암종 세포·정자 간세포 중 어느 것에서 선택되는 것이 바람직하다. 다능성 포유 세포를, 1 개의 마이크로 용기에 1 개 ∼ 3×10⁵ 개 파종하고, 배양하여 상기 세포 집단을 얻는 것이 바람직하다.

본 발명에 관련된 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법의 일 양태에 있어서, 다능성 포유 세포를, TGF-β 패밀리, FGF 패밀리, 및 PI3-키나아제 시그널 전달 경로 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물을 포함하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 상기 서술한 TGF-β 패밀리의 멤버는 Nodal, Activin A, Activin B, TGF-β, BMP2, 및 BMP4 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물인 것이 바람직하다. 상기 서술한 FGF 패밀리의 멤버는 b-FGF, FGF-4, FGF-2 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물인 것이 바람직하다. 상기 서술한 PI3-키나아제 시그널 전달 경로 저해제는 LY294002, 라파마이신, wortmannin, 염화리튬, Akt 저해제 I, Akt 저해제 Ⅱ, Akt 저해제 Ⅲ, NL-71-101 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물인 것이 바람직하다.

또, 본 발명에 관련된 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법의 일 양태에 있어서, (1) 적어도 부분적으로 SOX17 을 발현시키고 있고 AFP 를 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것, (2) 적어도 부분적으로 SOX17 을 발현시키고 있고 Pdx-1 을 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것, (3) 적어도 부분적으로 FoxA1 또는 FoxA2 를 발현시키고 있고 AFP 를 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것, (4) 적어도 부분적으로 FoxA1 또는 FoxA2 를 발현시키고 있고 Pdx-1 을 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것 중 어느 것인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관련된 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법의 일 양태에 있어서, 상기 서술한 배양 방법에 의해 얻어진 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단을, FGF, BMP2, HGF, KGF, EGF, TGF-α, HB-EGF, VEGF, PDGF, DMSO, 덱사메타존, oncostatin M, 인슐린으로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 종류 또는 2 종류 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양한다. 그리고, 적어도 알부민 (ALB) 과, 알파페토프로틴 (AFP) 중 어느 하나를 발현시키는 세포가 부분적으로 존재하는 제 2 세포 집단을 얻는다.

본 발명에 관련된 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법의 일 양태에 있어서, 산소 농도가 4 ％ 이하인 대기 중에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 서술한 세포 배양 용기는 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 및 실리콘 수지 중 1 개 또는 그 이상의 조합으로 이루어지는, 수지 성형품인 것이 바람직하다.

상기 서술한 마이크로 용기는, 상기 마이크로 용기의 공간 구조의 높이 방향에 형성된 측벽의 상부 50 ％ 이상의 부분에서, 상기 저부와 그 측벽의 각 측면이 이루는 각도가 80˚ ∼ 90˚ 인 것이 바람직하다.

상기 서술한 마이크로 용기 저부의 장경이 단경의 1 ∼ 1.5 배의 범위 내인 것이 바람직하다.

상기 서술한 마이크로 용기가 형성된 영역에, 표면 처리가 실시되어 있는 것이 바람직하다. 또, 표면 처리는 무기물로 코트된 것인 것, 콜라겐, 라미닌 등의 세포외 매트릭스로 코트된 것인 것, 합성 물질로 코트된 것인 것, 플라즈마 처리로 코트된 것인 것, 마이크로 용기 저면에, 세포 접착 불균일에 상당하는 직경인 1 ㎚ 로부터 세포 1 개에 상당하는 직경인 20 ㎛ 의 요철을 갖는 것 중 어느 것인 것이 바람직하다.

표면에 복수의 마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기로서, 당해 마이크로 용기의 저부 면적이 100 μ㎡ ∼ 1 ㎟ 이며, 깊이가 10 ∼ 500 ㎛ 의 공간으로 구성되는 배양 표면을 갖는 세포 배양 용기를 사용하여, 배엽체 사이즈의 제어를 실현하고, 배엽체 사이즈를 제어한 상태에서 분화 유도 가능한, 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법을 제공한다.

도 1 은 본 발명의 실시형태에 관련된 세포 배양 용기의 구성을 나타내는 평면도이다.
도 2 는 도 1 의 세포 배양 용기의 Ⅱ-Ⅱ 단면도이다.
도 3 은 도 1 의 세포 배양 용기를 사용하여 세포를 배양하는 상태를 나타내는 모식도이다.
도 4 는 본 발명의 실시형태에 관련된 세포 배양 용기의 다른 구성을 나타내는 평면도이다.
도 5 는 도 4 의 세포 배양 용기의 V-V 단면도이다.
도 6 은 본 발명의 실시형태에 관련된 세포 배양 용기의 또 다른 구성을 나타내는 평면도이다.
도 7 은 도 6 의 세포 배양 용기의 Ⅶ-Ⅶ 단면도이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시형태에 대해 설명한다. 단, 본 발명이 이하의 실시형태에 한정되는 것은 아니다. 설명의 명확화를 위해, 이하의 기재 및 도면은 적절히 생략, 및 간략화가 이루어져 있다. 각 도면에서 동일한 구성 또는 기능을 갖는 구성 요소 및 상당 부분에는, 동일한 부호를 붙이고, 그 설명은 생략한다.

실시형태

먼저, 실시형태에 관련된 세포 배양 용기에 대해 설명하고, 그 후, 세포 배양 방법에 대해 설명한다.

1. 세포 배양 용기

도 1 은 본 실시형태에 관련된 세포 배양 용기의 구성을 나타내는 평면도이고, 도 2 는 도 1 의 Ⅱ-Ⅱ 단면도이다. 도 1 에 나타내는 바와 같이, 세포 배양 용기 (10) 는 마이크로 용기 (11), 측벽 (12) 을 구비한다. 세포 배양 용기 (10) 의 배양면에는, 복수의 측벽 (12) 이 그물상으로 형성되어 있고, 이 측벽 (12) 으로 사방을 둘러싸인 공간 (마이크로 공간) 이 마이크로 용기 (11) 가 된다.

도 1 에 있어서, 마이크로 용기 (11) 의 저부의 폭 (a), 마이크로 용기 (11) 를 구획하기 위한 측벽 (12) 의 폭 (b), 높이 (c) 를 나타내었다. 본 발명에 있어서의 저부 면적이란, 마이크로 용기 개구 수평면 (측벽 (12) 상면과 동일면) 에 수직 방향으로 상방으로부터 용기 바닥에 평행광을 조사했을 때의 투영 면적을 말하고, 그 면적은 100 μ㎡ ∼ 1 ㎟ 이다. 예를 들어, 마이크로 용기의 바닥이 U 자 형상인 경우, 그 개구면에 수직 방향인 상방으로부터 바닥에 입사된 평행광이 투영하는 형상이 저부 면적이 된다. 투영 저부의 장경 및 단경이란, 원 및 타원인 경우, 그 중심을 지나는 장축 및 단축과 원주의 교점의 각 축 상의 거리를 장경 및 단경이라고 하고, 다각형인 경우, 그 다각형의 면적과의 차이가 최소가 되어 각 정점을 지나는 외삽원 또는 외삽 타원의 장경 및 단경을 말하고, 각 정점을 지나는 외삽원 또는 외삽 타원을 그릴 수 없는 경우에는, 가장 많은 정점을 지나는 근사원 또는 타원의 장경 및 단경을 말한다. 저부의 크기를, 폭과 안 길이를 사용하여 나타내는 경우, 폭과 안 길이란, 저부 상에서 수직 관계가 된다.

마이크로 용기 (11) 의 저부 형상은 특별히 제한되는 것은 아니고, 정방형, 원, 다각형 이외에도 여러 가지 형상을 채용할 수 있다. 생체 내에서의 간기능을 재현하는 세포 배양에는, 이 저부 면적은 0.01 ㎟ ∼ 0.1 ㎟ 가 바람직하다. 또, 저부의 장경이 단경의 1 ∼ 1.5 배인 것이 바람직하다. 또한, 등방적 형상이 바람직하고, 정방형이면, 예를 들어, 상당 직경 100 ㎛ 의 배엽체의 응집 덩어리를 형성시키는 경우, 한 변의 길이가 100 ㎛ ∼ 300 ㎛ 가 바람직하다. 또, 예를 들어 상당 직경 500 ㎛ 의 배엽체의 응집 덩어리를 형성시키는 경우, 한 변의 길이가 500 ㎛ ∼ 800 ㎛ 가 바람직하다.

마이크로 용기 (11) 의 수평면과 측벽 (12) 이 이루는 각도는, 세포가 올라앉지 않는 각도이어야 하기 때문에, 측면의 상부로부터 50 ％ 이상인 부분은 80˚ ∼ 90˚ 가 바람직하고, 특히 85˚ ∼ 90˚ 인 것이 바람직하다.

측벽 (12) 의 높이 (c) 는, 마이크로 용기 (11) 에서 배양하는 세포가 올라앉아 인접하는 마이크로 용기 (11) 로 이동하지 않으면 되고, 10 ㎛ ∼ 500 ㎛ 가 바람직하다. 예를 들어, 측벽 (12) 의 높이 (c) 는 상당 직경 100 ㎛ 의 배엽체의 응집 덩어리를 형성시키는 경우, 50 ㎛ ∼ 150 ㎛ 가 바람직하다. 또, 예를 들어 상당 직경 500 ㎛ 의 배엽체의 응집 덩어리를 형성시키는 경우, 50 ㎛ ∼ 300 ㎛ 가 바람직하다.

도 3 은 도 1 의 세포 배양 용기를 사용하여 세포를 배양하는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 3 에서는, 세포 배양 용기를 측면에서 투시하여 본 도면이다. 임의의 샬레 혹은 웰 플레이트 (7) 에 세포 배양 용기 (10) 를 설치하고, 배지 (8) 에서 세포 배양 용기 (10) 를 채운다. 측벽 (12) 에 둘러싸여 형성된 마이크로 용기 (11) 내에서, 세포 (9) 가 배양된다. 도 3 중, 도 1, 2 와 동일하게, 마이크로 용기 (11) 의 저부의 폭 (a), 측벽 (12) 의 폭 (b), 높이 (c) 를 나타낸다. 배양 표면은 마이크로 용기 (11) 의 저부와 측벽 (12) 에 의해 형성되는 공간의 표면이다. 세포 (9) 는 배양 표면을 사용하여 배양된다.

또한, 도 4 및 도 5 에 나타내는 바와 같이, 각 마이크로 용기 (11) 의 4 변에 형성된 측벽 (12) 의 각 변의 중앙부에, 개구부 (13) 가 형성되어 있어도 된다. 인접하는 마이크로 용기 (11) 를 서로 연통시키기 위한 개구부 (13) 의 폭 (d) 은 배양 세포가 최초로 파종된 마이크로 용기 (11) 로부터 인접하는 마이크로 용기 (11) 로 이동할 수 없는 정도이면 된다. 예를 들어, 배양 세포의 상당 직경이 20 ㎛ 이면, 5 ∼ 15 ㎛ 인 것이 바람직하다. 여기서, 도 4 는 본 실시형태에 관련된 다른 세포 배양 용기의 구성을 나타내는 평면도이고, 도 5 는 도 4 의 V-V 단면도이다.

또, 도 6 및 도 7 에 나타내는 바와 같이, 본 실시형태에 관련된 세포 배양 용기는 소정 수의 복수의 마이크로 용기로 이루어지는 구획된 스폿을 가지고 있어도 된다. 여기서, 도 6 은 본 실시형태에 관련된 또 다른 세포 배양부의 구성을 나타내는 평면도이고, 도 7 은 도 6 의 Ⅶ-Ⅶ 단면도이다. 도 6 및 도 7 에서는, 도 4 및 도 5 에 나타내는 마이크로 용기의 구조를 사용하고 있는 예를 나타낸다. 도 6 에는, 복수의 마이크로 용기를 구획화하는 측벽 (24) 과 그 구획화된 스폿 (23) 을 나타냈다. 측벽 (24) 의 높이 (e) 는 배양액이나 반응액 등의 상청액이 건조되지 않고 유지할 수 있는 용량이면 되고, 적절히 설정하면 된다. 측벽 (24) 을 가짐으로써, 각 스폿 (23) 에서 상이한 배지를 사용하는 것도 가능해진다. 또, 도 6 및 도 7 에 있어서, 측벽 (24) 을 갖는 구성예를 나타냈는데, 측벽 (24) 을 구비하고 있지 않은 구성이어도 된다.

세포 배양 용기 상의 요철 패턴을 제작하는 방법으로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 몰드를 사용한 전사 성형, 3 차원 광조형, 정밀 기계 절삭, 웨트 에칭, 드라이 에칭, 레이저 가공, 방전 가공 등의 방법을 들 수 있다. 세포 배양 용기의 용도, 요구되는 가공 정밀도, 비용 등을 고려하여 이들의 제조 방법을 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

몰드를 사용하여 전사 성형하는 방법의 구체예로는, 금속 구조체를 형 (型) 으로 하여 수지 성형에 의해 요철 패턴을 형성하는 방법을 들 수 있다. 이 방법은 금속 구조체의 형상을 높은 전사율로 수지에 요철 패턴으로 재현하는 것이 가능하고, 또 범용의 수지 재료를 사용함으로써 재료 비용을 낮게 할 수 있으므로 바람직하다. 이와 같은 금속 구조체의 형을 사용하는 방법은 저비용이며, 높은 치수 정밀도를 만족할 수 있는 점에서 우수하다.

상기 금속 구조체의 제조 방법으로는, 예를 들어, 포토리소그래피에 의해 제작된 레지스트 패턴이나 3 차원 광조형에 의해 제작된 수지 패턴에 대한 도금 처리, 정밀 기계 절삭, 웨트 에칭, 드라이 에칭, 레이저 가공, 방전 가공 등을 들 수 있다. 용도, 요구되는 가공 정밀도, 비용 등을 고려하여 적절히 선택하면 된다.

상기에서 얻어진 금속 구조체를 형으로서 사용하여 수지에 요철 패턴을 성형하는 방법으로는, 예를 들어, 사출 성형, 프레스 성형, 모노머 캐스트 성형, 용제 캐스트 성형, 핫 엠보스 성형, 압출 성형에 의한 롤 전사 등의 방법을 들 수 있다. 생산성 및 형전사성의 관점에서 사출 성형을 채용하는 것이 바람직하다.

세포 배양 용기를 구성하는 재료로는, 자기 지지성을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 합성 수지, 실리콘, 유리 등을 들 수 있다. 비용면이나 현미경 관찰에 의한 세포 시인성의 관점에서, 투명한 합성 수지를 재료로 하는 것이 바람직하다. 투명한 합성 수지로는, 예를 들어, 폴리메타크릴산메틸, 메타크릴산메틸-스티렌 공중합체 등의 아크릴계 수지, 폴리스티렌, 아크릴·스티렌계 공중합 수지 등의 스티렌계 수지, 시클로올레핀 등의 올레핀계 수지, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 에스테르계 수지, 폴리디메틸실록산 등의 실리콘계 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 실리콘 수지 등을 들 수 있다. 이와 같은 수지에는, 투명성을 저해하지 않는 범위에서 착색제, 확산제, 증점제 등의 각종 첨가제를 포함하고 있어도 된다.

세포 배양 용기는, 용기 표면의 친수성, 생체 적합성, 세포 친화성 등을 향상시키는 것을 목적으로 하여, 요철 패턴 표면측에 표면 처리를 실시하고, 개질층 및/또는 코팅층이 배치되어 있어도 된다. 상기 개질층을 형성하는 방법으로는, 자기 지지성을 잃는 방법이나 100 ㎛ 이상의 극단적인 표면 거침을 일으키는 방법이 아니면 특별히 제한은 없는데, 예를 들어, 약품 처리, 용제 처리, 표면 그래프트 중합에 의한 그래프트 폴리머 도입 등의 화학적 처리, 코로나 방전, 오존 처리, 플라즈마 처리 등의 물리적 처리 등의 방법을 들 수 있다. 또 코팅층을 형성하는 방법으로는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 스퍼터, 증착 등의 드라이 코팅, 무기 재료 코팅, 폴리머 코팅 등의 웨트 코팅 등의 방법을 들 수 있다. 요철 패턴 상에는, 기포가 혼입되지 않고 배양액을 주입하기 위해서 친수성을 부여하는 것이 바람직하고, 균일한 친수성막을 형성시키는 방법으로서 무기 증착이 바람직하다.

또, 세포 친화성을 고려한 경우에는, 예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 친화성 단백질을 코팅하는 것이 보다 바람직하다. 콜라겐 수용액 등을 균일하게 코트하기 위해서, 상기 서술한 친수성막을 형성시킨 후, 코트하는 것이 바람직하다. 생체 내 환경을 모방하여 세포외 매트릭스 표면에서의 배양이 바람직하기 때문에, 상기와 같이 균일한 친수성 무기막을 배치한 후에, 배양 세포에 적합한 세포외 매트릭스로 이루어지는 유기막을 배치하는 것이 특히 바람직하다.

또, 마이크로 용기 저면에, 세포 접착 불균일 ∼ 배양 세포에 상당하는 크기에 상당하는 1 ㎚ ∼ 20 ㎛ 의 요철을 형성시키는 방법을 들 수 있다. 이와 같은 표면에, 상기에 기재된 친수성 처리, 세포 친화성 단백질을 코트하는 방법과 조합하는 방법이 바람직하다.

상기의 각 표면 처리는 각각 단독으로 실시해도 되고, 필요에 따라 적절히 조합하여 실시해도 된다.

또, 상기 서술한 세포 배양 용기를 사용하는 세포 배양 방법은, 세포를 배양하는 마이크로 용기에만 세포를 배치시키고, 그 공간 내에서 생체 내에 유사한 형태나 기능을 발현시키기 위해서, 적절한 세포 수를 파종할 필요가 있어, 세포 파종 밀도 1.0×10² ∼ 1.0×10⁶ 세포/㎠ 가 바람직하고, 세포 파종 밀도 1.0×10³ ∼ 1.0×10⁵ 세포/㎠ 가 보다 바람직하다. 예를 들어, 마이크로 용기가 정방형이고, 1 변이 100 ㎛ 인 경우, 5.0×10³ ∼ 5.0×10⁵ 세포/㎠ 가 바람직하다.

사용되는 다능성 포유 세포는 일반적인 평탄한 배양 표면을 가지는 배양 플레이트, 또는, 배양 디쉬를 사용하여 증식시킨 세포를 사용해도 되고, 또, 상기 서술한 세포 배양 용기를 사용하여 증식시켜도 된다.

또, 상기 서술한 세포 증식은 일반적으로 피더 세포가 사용되는데, 다른 세포의 혼입을 방지하기 위해, 및 조작을 간편하게 하기 위해, 피더 세포를 사용하지 않는 것이 보다 바람직하다.

상기 서술한 세포 배양 용기를 사용하는 세포 배양 방법은 배엽체의 응집 덩어리를 형성시키는 공정을 포함하는데, 그 때, 피더 세포를 사용해도 되는데, 다른 세포의 혼입을 방지하는, 및 조작을 간편하게 하는 관점에서, 피더 세포를 사용하지 않는 것이 보다 바람직하다.

2. 세포 배양 방법

본 실시형태에서는, 다능성 포유 세포를 배양하고, 적어도 부분적으로 내배엽 계열 (Endoderm Lineages) 의 세포로 분화된 세포 집단을 얻는 배양 방법을 설명한다.

본 명세서에서는, 세포 배양 방법을 설명하는 데에 있어서, 다음 용어를 사용한다.

용어 「다능성」은, 배의 구조를 지지하는 세포 이외의, 모든 형태의 세포를 발생시키는 세포의 능력을 가리킨다.

용어 「다능성 세포」는 외배엽, 내배엽, 및 중배엽 세포 중 하나로 적어도 발달할 수 있는 세포를 가리킨다.

용어 「전능성 세포」는 전체 계열의 세포로 발달할 수 있는 세포를 가리킨다.

용어 「배성 간세포 (ES 세포)」는 만능 세포의 일종이며, 다양하고 상이한 세포로 분화되고, 증식하는 능력을 갖는, 발생 초기의 배 유래의 세포이다. ES 세포는 수정란의 1 단계인 배반포로부터 취출한 내부 세포 덩어리로부터 수립된다.

용어 「유도 다능성 간세포 (iPS 세포)」는 만능 세포의 일종으로, ES 세포와 동일하게 증식되어 각종 세포로 분화하는 것이 가능한 세포이다. iPS 세포는 피부 세포 등으로 만들어 낼 수 있다.

용어 「다분화능성」은 종말 (終末) 분화되어 있지 않은 세포를 가리킨다. 동일하게, 용어 「다분화능성」은, 조작 (즉, 핵이식 또는 탈분화 유도) 없이는, 3 개의 모든 배엽 (중배엽, 외배엽 및 내배엽) 유래의 분화된 세포형을 형성할 수 없는 세포, 또 바꾸어 말하면 부분적으로 분화된 세포를 가리킨다.

용어 「다능성 인간 세포」는 인간배, 태아 또는 성체 조직에서 얻어진 다능성 세포를 포함한다. 다능성 인간 세포는 ES 세포, iPS 세포, 인간 내부 세포 덩어리 (ICM)/배반엽 상층 세포, 초기 원시 외배엽 세포 (EPL) 등의 인간 원시 외배엽 세포, 인간 시원 생식 (EG) 세포, 및 인간 기형 암종 (EC) 세포로 이루어지는 군에서 선택할 수 있다.

용어 「내배엽」에는, 배체 내배엽, 벽측 내배엽, 장측 내배엽, 및 중내배엽 세포가 포함되는데, 그에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 「배체 내배엽」은 배에 있어서 내배엽 계열로부터 생성되는 임의 또는 다수의 내배엽 세포형 (즉 췌장, 간장, 폐, 위, 장 및 갑상선) 으로 분화되는 능력을 갖는 초기 내배엽 세포를 가리킨다. 배체 내배엽 세포는 다분화능이다. 따라서, 본 발명의 관련된 용어 「배체 내배엽」의 사용은, 그 세포가, 얻어진 다능성 세포보다 내배엽 세포형을 향하여 적어도 보다 크게 분화되어 있는 것을 의미한다. 동일하게, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 내배엽 세포의 산생은 내배엽 세포가 집적된 세포 배양물의 산생을 포함한다.

「배체 내배엽」세포는 SOX17 등의 특이적 마커 전사체의 발현과, 그에 부수된 AFP 및 트롬보모듈린에 관한 마커 전사체의 부재에 의해 특징지어진다. 또한, 당해 세포는 MIX1, GATA4, HNFα, 및 HNF3b 를 발현시키는 경우가 있다.

원장형성이라고 명명된 인간 발생 초기의 중대한 단계는 수정의 2 ∼ 3 주 후에 일어난다. 원장형성 동안에, 배체 내배엽 형성과정은 중내배엽 세포 (중배엽 또는 내배엽 형성에 적격인 세포) 가 원시 선조 (線條) 라고 불리는 구조를 통과하여 유주 (遊走) 하는 세포 유주 이벤트와 함께 개시된다. 배체 내배엽은 선조 전부 및 결절 (結節) (선조 최전부에서의 특수 구조) 을 통과하여 유주하는 세포에서 유래된다. 유주가 일어날 때, 배체 내배엽은 최전부 장관을 최초 점유하고, 장관 후단의 형성과 함께 최고에 달한다.

용어 「분화한다」는 그것이 얻어진 세포형보다 잘 분화된 세포형의 산생을 가리킨다. 따라서, 본 용어는 부분적으로 분화 및 종말 분화된 세포형을 포함한다.

세포, 세포계, 세포 배양물 또는 세포 집단을 가리키는 경우, 용어 「단리 되었다」는, 그 세포, 세포계, 세포 배양물, 또는 세포 집단이 in vitro 배양될 수 있도록, 그 세포의 천연 공급원으로부터 실질적으로 분리된 것을 가리킨다. 또한, 용어 「단리하는 것」은 2 개 이상의 세포의 군에서 1 개 또는 복수의 세포를 물리적으로 선택하는 것을 가리키고, 여기서, 이들 세포는 세포의 형태 및/또는 여러 가지 마커의 발현에 기초하여 선택된다.

용어 「발현시킨다」는 세포 중의 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 폴리펩티드의 번역을 가리키고, 그에 따라, 그 분자를 발현시키지 않는 세포 중의 그 분자의 레벨보다, 그 분자를 발현시키는 세포 중의 그 분자의 레벨을 측정할 수 있을 정도로 높다. 분자의 발현을 측정하는 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있고, 그들 방법에는, 비한정적으로 노던 블롯, RT-PCR, in situ 하이브리다이제이션, 웨스턴 블롯, 및 면역 염색이 포함된다.

용어 「접착 배양」은 세포를 고체 표면 상에서 배양하고, 그 고체 표면을 다음은 고체 지지체로 피복할 수 있고, 다음은 하기에 예시한 것과 같은 다른 지지체의 표면 피복으로, 또는 세포를 배양물 중에서 증식 또는 안정화시키는 임의의 다른 화학 재료 또는 생물학적 재료로 그 지지체를 피복할 수 있는 세포 배양계를 가리킨다. 이들 세포는 고체 표면 또는 지지체에 견고하게 접착할 수 있거나, 또는 접착할 수 없다.

용어 「Sox17」은 내배엽 계열의 세포를 나타내는 마커이다. 이것은 DNA 결합 도메인을 포함하는 전사 제어 인자로, 간세포의 운명 결정에 깊게 연관되어 있는, Sry-related high mobility group box (Sox) 패밀리의 하나이며, 내배엽의 형성과 유지에 필요한 것이 알려져 있다.

참고 문헌 : Hudson, C., Clements, D., Friday, R.V., Stott, D., and Woodland, H.R. (1997). Xsox17alpha and -beta mediate endoderm formation in Xenopus. Cell 91, 397-405.

용어 「FoxA1」, 「FoxA2」는 Human Forkhead-box (FOX) 유전자 패밀리의 하나이며, 췌장의 세포, 간세포로 분화되는 전 (前) 단계에서 발현된다고 일컬어지고 있다. 즉, 이들 유전자가 발현되고 있는 세포는 내배엽 계열의 세포와 성숙한 조직 세포의 중간 세포로 정의된다.

용어 「Pdx-1」은 췌장 세포에 발현되는 유전자로, 췌장 세포의 마커인 것이 알려져 있다.

용어 「AFP」는 간세포에 발현되는 유전자로, 간세포의 마커인 것이 알려져 있다.

실시예

[실시예 1]

1. 마우스 iPS 세포의 조정 공정

마이크로 용기의 높이가 50 ㎛, 폭이 100 ㎛, 안 길이가 100 ㎛ 인 공간이 배양 저면에 규칙적으로 배치된 세포 배양 용기를 사용하여, 0.5×10⁵ 개/㎠ 가 되도록, 마우스 iPS 세포를 파종하고, 18 ％ FBS, 2-mercaptoethanol (110 mM), 및 500 U/㎖ leukemia inhibitory factor 를 포함하는 DMEM (GIBCO 사 제조) 배지에서 3 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/24 시간의 빈도로 실시하였다.

2. 배엽체의 응집 덩어리 제작 공정 (EB 배양)

15 ％ FBS, 1 ％ nonessential amino acids, 1 ％ nucleosides, 1 ％ penicillin/streptomycin, 및 1 ％ glutamic acid 를 포함하는 DMEM-F12 (GIBCO 사 제조) 배지로 교환하여 2 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/1 일의 빈도로 실시하였다.

3. 내배엽 계열 세포의 제작 공정

1 ％ FBS, 1 ％ nonessential amino acids, 1 ％ nucleosides, 1 ％ penicillin/streptomycin, 1 ％ glutamic acid, 3 ％ BSA, 100 ng/㎖ FGF-2, 및 100 ng/㎖ Activin-A 를 포함하는 DMEM-F12 (GIBCO 사 제조) 배지로 교환하여 3 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/12 시간의 빈도로 실시하였다.

4. AFP, ALB 양성 세포의 제작 공정

10 - 15 ％ FBS, 1 ％ nonessential amino acid, 1 ％ nucleosides, 1 ％ penicillin/streptomycin, 1 ％ glutamic, 50 ng/㎖ HGF, 및 1 ％ DMSO 를 포함하는 DMEM-F12 배지로 교환하여, 8 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/12 시간의 빈도로 실시하였다. 추가로 10 - 15 ％ FBS, 1 ％ nonessential amino acid, 1 ％ penicillin/streptomycin, 1 ％ glutamic acid, 100 ng/㎖ dHGF, 및 10^-7M dexamethasone 을 포함하는 DMEM-F12 배지에서, 3 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/12 시간의 빈도로 실시하였다.

[비교예 1]

0. 피더 세포의 조정 공정

φ 6 ㎝ 의 플라스틱제의 배양 저면이 평탄한 세포 배양 디쉬에, 피더 세포 (Primary mouse embryo fibroblasts) (다이닛폰 제약사 P-MEF-CF) 를, 10 ％ FBS, 4500 ㎎/L-glucose, 2 mM L-glutamine, 1 ％ penicillin/streptomycin 을 포함하는 DMEM 배지에서 8 시간 배양하였다.

1. 마우스 iPS 세포의 조정 (2 공정)

1.1 세포 파종 공정

상기 0 의 공정에서 얻어진 배양 디쉬에, 0.5×10⁵ 개/㎠ 가 되도록, 마우스 iPS 세포를 파종하고, 18 ％ FBS, 2-mercaptoethanol (110 mM), 및 500 U/㎖ leukemia inhibitory factor 를 포함하는 DMEM (GIBCO 사 제조) 배지에서 3 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/24 시간의 빈도로 실시하였다.

1.2 세포 회수 공정

1.1 의 배지를 제거하고, PBS 로 세정한 후, 0.25 ％ 트립신/EDTA 용액을 사용하여, 피더 세포 상으로부터 iPS 세포를 박리하였다.

2. 배엽체의 응집 덩어리 제작 공정 (EB 배양)

φ 6 ㎝ 의 플라스틱제의 배양 저면이 평탄한 배양 디쉬에, 1.2 에서 얻어진 세포를 파종하였다. 배지는 15 ％ FBS, 1 ％ nonessential amino acids, 1 ％ nucleosides, 1 ％ penicillin/streptomycin, 1 ％ glutamic acid 를 포함하는 DMEM-F12 (GIBCO 사 제조) 배지를 사용하여 2 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/1 일의 빈도로 실시하였다.

3. 내배엽 계열 세포의 제작 공정

4. AFP, ALB 양성 세포의 제작 공정

10 - 15 ％ FBS, 1 ％ nonessential amino acid, 1 ％ nucleosides, 1 ％ penicillin/streptomycin, 1 ％ glutamic acid, 50 ng/㎖ HGF, 및 1 ％ DMSO 를 포함하는 DMEM-F12 배지로 교환하여, 8 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/12 시간의 빈도로 실시하였다. 추가로 10 - 15 ％ FBS, 1 ％ nonessential amino acid, 1 ％ penicillin/streptomycin, 1 ％ glutamic acid, 100 ng/㎖ dHGF, 및 10^-7M dexamethasone 을 포함하는 DMEM-F12 배지로 교환하여, 3 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/12 시간의 빈도로 실시하였다.

[분석]

분석은 리얼타임 PCR 법으로 실시하고, 상기 1 의 공정에 사용하기 전의 iPS 세포와, 상기 4 의 배양 공정이 종료된 후의 세포를 회수하여, AFP, ALB, GAPDH 의 mRNA 의 정량 해석을 실시하였다. ALB 와 AFP 의 mRNA 발현량은 GAPDH 에 대한 값으로서 산출하였다.

[결과]

상기 1 의 공정에 사용하기 전의 iPS 세포의 각 유전자 발현량을 1 로 했을 경우의 상대값을 나타낸다.

실시예 1 에 있는 방법으로 내배엽 계열의 세포로 분화시킨 후, 간세포로 분화시킴으로써, 간 특이적 마커인 AFP 와 ALB 의 유전자 발현량이, 비교예에 대해, 각각 1.7 배, 33 배로 높은 값이 되었다.

[실시예 2]

마이크로 용기를 가지는 배양 플레이트를 사용한 인간 iPS 세포의 분화 유도

0. 피더 세포의 조정 공정

φ 6 ㎝ 의 플라스틱제의 배양 저면이 평탄한 세포 배양 디쉬에, 피더 세포 (Primary mouse embryo fibroblasts) 를, 10 ％ FBS, 4500 ㎎/L-glucose, 2 mM L-glutamine, 1 ％ penicillin/streptomycin 을 포함하는 DMEM 배지에서 8 시간 배양하였다.

1. 인간 iPS 세포의 조정 공정

인간 iPS 세포주 201B7 (리켄 BRC 번호 : HPS0001) 은 마우스 선유아세포 (MEF) 상에서 DMEM/F12＋20 ％ KSR＋bFGF 를 포함하는 배지를 사용하여 유지하였다.

2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정

매트리겔을 코트한, 마이크로 용기의 높이가 50 ㎛, 폭이 100 ㎛, 안 길이가 100 ㎛ 인 공간이 배양 저면에 규칙적으로 배치된 세포 배양 용기에, 단세포로 분산된 인간 iPS 세포를 파종하여, RPMI1640 에 B27 을 첨가한 분화 유도 배지를 사용하여 24 시간 배양하였다. 24 시간 후에, 인간형 액티빈을 분화 유도 배지에 첨가한 배지로 교환하여, 6 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/2 일의 빈도로 실시하였다.

3. 간세포 계열 세포의 제작 공정 (AFP, HNF4A 양성 세포의 제작 공정)

실시예 2 에 기재된 「2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정」의 조작을 실시한 후, 분화 유도 배지에 10 ng bFGF, 20 ng/㎖ hBMP4 를 첨가한 배지로 교환하여, 3 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/2 일의 빈도로 실시하였다.

다음으로, 분화 유도 배지에 40 ng hHGF 를 포함하는 배지로 교환하여, 추가로 4 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/2 일의 빈도로 실시하였다.

[비교예 2]

평판의 배양 플레이트를 사용한 인간 iPS 세포의 분화 유도

0. 피더 세포의 조정 공정

1. 인간 iPS 세포의 조정 공정

2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정

매트리겔을 코트한, 평평한 배양 저면을 갖는 세포 배양 용기에, 단세포로 분산된 인간 iPS 세포를 파종하여, RPMI1640 에 B27 을 첨가한 분화 유도 배지를 사용하여 24 시간 배양하였다. 24 시간 후에, 인간형 액티빈을 분화 유도 배지에 첨가한 배지로 교환하여, 6 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/2 일의 빈도로 실시하였다.

비교예 2 에 기재된 「2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정」의 조작을 실시한 후, 분화 유도 배지에 10 ng bFGF, 20 ng/㎖ hBMP4 를 첨가한 배지로 교환하여, 3 일간 배양하였다. 배지 교환은 1 회/2 일의 빈도로 실시하였다.

[분석]

실시예 2 의 「2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정」및 비교예 2 의 「2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정」의 세포를 사용하여, 배체 내배엽 세포의 마커 Sox17 및 CXCR4 의 유전자 발현량을 정량 PCR 에 의해 해석하였다. 실시예 2 의 「3. 간세포 계열 세포의 제작 공정」및 비교예 2 의 「3. 간세포 계열 세포의 제작 공정」의 세포를 사용하여, 간장 세포 계열 세포의 마커 HNF4A 및 AFP 의 발현을 정량 PCR 에 의해 해석하였다. 값은 비교예 2 의 마커의 발현량을 1 로 했을 경우의 상대값으로 나타내었다.

[결과]

배성 내배엽 세포에 대한 분화 유도의 유무를 해석한 결과를, 표 2 에 나타내었다. 여기서, SOX17 및 CXCR4 는 배체 내배엽, AFP 는 간세포 계열 세포의 마커이다. 실시예 2 의 「2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정」및 비교예 2 의 「2. 배성 내배엽 세포의 제작 공정」단계에서는, 배성 내배엽 세포로 분화시키는 공정인 점에서, SOX17 및 CXCR4 가 많이 발현되고, AFP 의 발현량이 작을수록, 배성 내배엽 세포로 효율적으로 분화되어 있다고 할 수 있다.

간세포 계열의 세포에 대한 분화 유도의 유무를 해석한 결과를, 표 3 에 나타내었다. 여기서, SOX17 은 배성 내배엽 세포, HNF4A 및 AFP 는 간세포 계열의 세포에 특이적 마커이다. 실시예 2 의 「3. 간세포 계열 세포의 제작 공정」및 비교예 2 의 「3. 간세포 계열 세포의 제작 공정」단계에서는, 간세포 계열의 세포로 분화시키는 공정인 점에서, SOX17 의 발현량이 작고, HNF4A 및 AFP 의 발현량이 많을수록, 간세포로 효율적으로 분화되어 있다고 할 수 있다.

표 4 에는, 표 3 의 간세포 계열에 분화 유도된 후의 SOX17 의 유전자 발현량을, 표 2 의 배성 내배엽 세포 분화 유도 후의 SOX17 의 유전자 발현량과 비교하여, 각각의 배양 조건에 있어서의 발현 저하율을 나타내었다.

실시예 2 는, 배성 내배엽 세포에 특이적 마커 SOX17 및 CXCR4 의 발현량이 비교예 2 의 약 5 배 및 1.7 배라는 높은 값을 나타내고, 간세포 계열 세포의 마커가 거의 발현되어 있지 않다. 즉, 실시예 2 (마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기) 는 효율적으로 배성 내배엽 세포로 분화시킬 수 있다.

실시예 2 는, 간세포 계열의 세포에 특이적 마커 HNF4A 및 AFP 의 발현량이, 각각, 비교예 2 의 약 2 배 및 22 배라는 높은 값을 나타내고, 간세포 계열 세포의 마커가 많이 발현되어 있다. 또한, 표 4 에 나타낸 바와 같이, 간세포 계열의 세포로 분화시킨 후의 SOX17 의 값에 대해, 실시예 2 는 비교예의 10 분의 1 이며, 간세포 계열의 세포로 분화시킨 후의 세포 중, 배성 내배엽 계열의 세포가 잔존되어 있는 비율이 적다고 할 수 있다.

즉, 실시예 2 (마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기) 는 효율적으로 배성 내배엽 계열의 세포인 간세포로 분화시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 실시형태에 한정된 것은 아니고, 취지를 일탈하지 않는 범위에서 적절히 변경하는 것이 가능하다.

이 출원은 2010년 3월 23일에 출원된 일본 특허출원 2010-066324를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전부를 여기에 받아들인다.

7 : 샬레 혹은 웰 플레이트
8 : 배지
9 : 세포
10 : 세포 배양 용기
11 : 마이크로 용기
12 : 측벽
13 : 개구부
23 : 스폿
24 : 스폿의 측벽

Claims

배양 표면에 복수의 마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기로서, 상기 마이크로 용기의 공간 구조의 높이가 10 ㎛ ∼ 500 ㎛, 저부 면적이 100 μ㎡ ∼ 1 ㎟ 인 공간으로 구성되는 배양 표면을 갖는 세포 배양 용기를 사용하여, 다능성 포유 세포를 배양하고, 적어도 부분적으로 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단을 얻는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법으로서,
다능성 포유 세포를 상기 마이크로 용기에 파종하고,
상기 다능성 포유 세포를 배양하여 배양체의 응집 덩어리를 형성하고,
상기 응집 덩어리로부터 적어도 부분적으로 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단을 얻는 바,
상기 적어도 부분적으로 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단이란, 내배엽 계열의 세포로 부분적으로 분화된 세포 집단, 또는 내배엽 계열의 세포로 종말 분화된 세포 집단이고,
상기 마이크로 용기 내에 있어서, 상기 응집 덩어리를, TGF-β 패밀리, FGF 패밀리, 및 PI3-키나아제 시그널 전달 경로 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물을 포함하는 배지에서 배양하여 상기 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는,
다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 포유 세포는 배성 간세포 (ES 세포), 유도 다능성 간세포 (iPS 세포), 기형 암종 세포 및 정자 간세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 포유 세포를 1 개의 상기 마이크로 용기에 1 개 ∼ 3×10⁵ 개 파종하여 상기 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 저부 면적이 100 μ㎡ ∼ 0.1 ㎟ 인 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 TGF-β 패밀리의 멤버는 Nodal, Activin A, Activin B, TGF-β, BMP2, 및 BMP4 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 FGF 패밀리의 멤버는 b-FGF, FGF-4, FGF-2 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 PI3-키나아제 시그널 전달 경로 저해제는 LY294002, 라파마이신, wortmannin, 염화리튬, Akt 저해제 I, Akt 저해제 Ⅱ, Akt 저해제 Ⅲ, NL-71-101 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질 또는 2 종류 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
적어도 부분적으로 SOX17 을 발현시키고 있고 AFP 를 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
적어도 부분적으로 SOX17 을 발현시키고 있고 Pdx-1 을 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
적어도 부분적으로 FoxA1 또는 FoxA2 를 발현시키고 있고 AFP 를 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
적어도 부분적으로 FoxA1 또는 FoxA2 를 발현시키고 있고 Pdx-1 을 발현시키고 있지 않은 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 기재된 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단을, FGF, BMP2, HGF, KGF, EGF, TGF-α, HB-EGF, VEGF, PDGF, DMSO, 덱사메타존, oncostatin M, 및 인슐린으로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 종류 또는 2 종류 이상의 물질을 포함하는 배지에서 배양하고, 적어도, 알부민 (ALB) 과, 알파페토프로틴 (AFP) 중 어느 하나를 발현시키는 세포가 부분적으로 존재하는 제 2 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
산소 농도가 4 ％ 이하인 대기 중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 세포 배양 용기는 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 및 실리콘 수지 중 1 개 또는 그 이상의 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 마이크로 용기는 상기 마이크로 용기의 공간 구조의 높이 방향에 형성된 측벽의 상부 50 ％ 이상의 부분에서, 상기 저부와 그 측벽의 각 측면이 이루는 각도가 80˚ ∼ 90˚ 인 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 마이크로 용기 저부의 장경이 단경의 1 ∼ 1.5 배의 범위 내인 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 마이크로 용기가 형성된 영역에, 표면 처리가 실시되어 있는 것을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 표면 처리가 무기물로 코트된 것임을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 표면 처리가 콜라겐, 라미닌 등의 세포외 매트릭스로 코트된 것임을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 표면 처리가 합성 물질로 코트된 것임을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 표면 처리가 플라즈마 처리된 것임을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 표면 처리가 상기 마이크로 용기 저면에, 세포 접착 불균일에 상당하는 직경인 1 ㎚ 로부터, 세포 1 개에 상당하는 직경인 20 ㎛ 크기의 요철을 갖는 것임을 특징으로 하는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법.
배양 표면에 복수의 마이크로 용기를 갖는 세포 배양 용기로서, 상기 마이크로 용기의 공간 구조의 높이가 10 ㎛ ~ 500 ㎛, 저부 면적이 100 μ㎡ ~ 1 ㎟ 인 공간으로 구성되는 배양 표면을 갖는 세포 배양 용기를 사용하여, 다능성 포유 세포를 배양하고, 적어도 부분적으로 내배엽 계열의 세포로 분화된 세포 집단을 얻는 다능성 포유 세포를 분화시키는 배양 방법으로서,
각 마이크로 용기는 4 변형의 개구면을 갖고,
세포 파종 밀도는 5.0×10³ ∼ 5.0×10⁵ 세포/㎠ 인,
배양 방법.
제 23 항에 있어서,
각 마이크로 용기는 정방형의 개구면을 갖고,
상기 정방형의 1 변의 길이가 100 ㎛ ~ 300 ㎛ 인,
배양 방법.