WO2022039165A1

WO2022039165A1 - 多能性幹細胞の外胚葉、中胚葉及び内胚葉系細胞への分化誘導方法

Info

Publication number: WO2022039165A1
Application number: PCT/JP2021/030058
Authority: WO
Inventors: 純平門田; 裕今泉
Original assignee: 東ソー株式会社
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2021-08-17
Publication date: 2022-02-24
Also published as: EP4180515A1; CN116368218A; JPWO2022039165A1; US20230332102A1

Abstract

本発明は、多能性幹細胞から外胚葉系細胞を分化誘導する方法であり、以下の（１－１）～（１－４）工程を含むことを特徴とする、分化誘導方法等に関する。（１－１）下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材上に、マトリゲル等の被覆、及び多能性幹細胞の播種を行う工程。（Ａ）細胞接着性等を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性等を有しない領域。（１－２）多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した多能性幹細胞凝集体を形成する工程。（１－３）多能性幹細胞凝集体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、胚様体を形成する工程。（１－４）胚様体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、外胚葉系細胞凝集体を形成する工程。

Description

多能性幹細胞の外胚葉、中胚葉及び内胚葉系細胞への分化誘導方法

　本発明は、分化誘導効率及び培養操作性に優れる、多能性幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導方法及び製造方法、多能性幹細胞から中胚葉系細胞への分化誘導方法、並びに、多能性幹細胞の内胚葉系細胞への分化誘導方法に関する。

筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患に対して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導した神経細胞を用いた創薬への関心が高まっている。また、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導した、肝臓細胞、小腸細胞、膵臓細胞等の内胚葉系細胞、心筋細胞、骨格筋細胞又は血管内皮細胞を用いた創薬への関心も高まっている。疾患患者由来ｉＰＳ細胞を活用することによって、従来困難であった疾患メカニズムの解明、創薬研究及び再生医療の発展が期待される。一般的に神経細胞への分化誘導においては、胚葉体（胚様体）と呼ばれる多能性幹細胞凝集体の形成工程、ニューロスフェアと呼ばれる神経幹細胞凝集体の形成工程をたどって各末梢神経細胞へ分化誘導される。一般的に中胚葉系への分化誘導においては、胚葉体（胚様体）と呼ばれる多能性幹細胞凝集体の形成工程をたどって各中胚葉細胞由来の組織へ分化誘導される。一般的に内胚葉系細胞への分化誘導においては、胚様体と呼ばれる多能性幹細胞の凝集体の形成を経て、各内胚葉系細胞由来の組織へ分化誘導される。また、目的細胞への分化誘導過程における胚葉体（胚様体）の状態は、分化経路等の細胞運命に大きく寄与することが知られており、均質な胚葉体（胚様体）をいかに効率良く作製できるかが課題となっている。

　従来の方法では、Ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ培養（例えば、特許文献１）やＮｏｎ－ａｄｈｅｓｉｖｅ　ｓｕｒｆａｃｅ培養（例えば、特許文献２）等の浮遊培養法によって胚葉体（胚様体）及びニューロスフェアを作製していた（例えば、特許文献３）。

　浮遊培養法を利用した他の方法としては、表面に微細凹凸構造を有する細胞非接着性の基材上に細胞播種し、細胞を沈降させることで凹凸サイズに応じた細胞凝集体の形成を利用するものがある（例えば、特許文献４）。

　特許文献５には、細胞の効率的なスフェロイド形成を可能とすると共に、細胞の生存率が高く、サイズが均質かつ任意の形状のスフェロイドを形成可能な細胞培養基材、及び該細胞培養基材の製造方法、該細胞培養基材を用いたスフェロイド内部の細胞生存率に優れるスフェロイド製造方法が記載されている。

　特許文献６には、ＥＳ細胞を０．１％ヒトリコンビナントＩ型コラーゲンペプチド又はビトロネクチンを被覆した基材に播種して、分化誘導し、腸に類似した蠕動運動をするオルガノイドを作製したことが記載されている。

国際公開第２００８／００１９３８号国際公開第２０１７／１２３７９１号特開２００２－２９１４６９号公報国際公開第２０１８／１２３６６３号特開２０２０－６２００９号公報特開２０１９－１４号公報

　特許文献１～３に記載される培養方法では、形成される凝集体のサイズが不均一であるため、個体間で分化誘導の効率に差異を生じやすいという問題があった。また、サイズの異なる凝集体が三次元的に配置されるため、局所的に栄養不足になる恐れもある。特許文献４に記載される方法では、凝集体が基材表面に固定化されていないことから、培地交換の際に凝集体の一部が培地とともに除去されてしまう等、培養操作に習熟が必要であるという課題があった。また基材の性質上、培地の全量交換が困難であるため分化誘導因子等の栄養不足が起こりやすく、分化誘導効率で劣ることが懸念される。特許文献６に記載される培養方法では、形成されるオルガノイドは分化誘導の開始から約３０日後に基材から自然に剥離をしてしまう。オルガノイドが剥離してしまうと、培養操作や細胞機能評価のための免疫染色時の取り扱いが難しいという課題があった。

　本発明の目的は、分化誘導効率及び培養操作性に優れる、多能性幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導方法及び製造方法を提供することにある。

　本発明の目的はまた、分化誘導効率及び培養操作性に優れる、多能性幹細胞から中胚葉系細胞への分化誘導方法を提供することにある。

　本発明の目的はまた、培地交換及び細胞観察等の培養操作の簡便性に優れ、かつ免疫染色及び分泌物測定試験等の細胞機能評価の際の操作性にも優れる、多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導方法を提供することにある。

　本発明者らは、島状に形成された細胞接着領域を有する細胞培養基材に多能性幹細胞を播種することで細胞培養基材上に接着した胚葉体（胚様体）を形成し、接着状態の胚葉体（胚様体）を分化誘導することで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち本発明の一態様は、多能性幹細胞から外胚葉系細胞を分化誘導する方法及び外胚葉系細胞の製造方法であり、以下の（１－１）～（１－４）工程を含む。
＜１＞多能性幹細胞から外胚葉系細胞を分化誘導する方法であり、以下の（１－１）～（１－４）工程を含むことを特徴とする、分化誘導方法。（１－１）下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び多能性幹細胞の播種を行う工程。（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。（１－２）前記（１－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した多能性幹細胞凝集体を形成する工程。（１－３）前記（１－２）工程で形成された多能性幹細胞凝集体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、胚葉体（胚様体）を形成する工程。（１－４）前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、外胚葉系細胞凝集体を形成する工程。

＜２＞　前記細胞培養基材が親水性高分子による層を表面に含有し、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理、コロナ放電処理のいずれか、またはこれらの組み合わせによって前記親水性高分子による層の一部を分解又は改質した領域であることを特徴とする、＜１＞に記載の分化誘導方法。
＜３＞前記（１－３）工程における分化誘導因子が、外胚葉誘導因子、中胚葉誘導因子及び内胚葉誘導因子を含有することを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載の分化誘導方法。
＜４＞前記（１－４）工程で形成された外胚葉系細胞凝集体が、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１を有していることを特徴とする、＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
＜５＞外胚葉系細胞が、神経幹細胞又は神経細胞であることを特徴とする、＜１＞～＜４＞のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
＜６＞外胚葉系細胞が、運動神経細胞であることを特徴とする、＜１＞～＜５＞のいずれか一項に記載の分化誘導方法。

＜７＞多能性幹細胞から外胚葉系細胞に分化誘導された細胞の製造方法であり、以下の（１－１）～（１－４）工程を含むことを特徴とする、細胞の製造方法。（１－１）下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び多能性幹細胞の播種を行う工程。（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。（１－２）前記（１－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した多能性幹細胞凝集体を形成する工程。（１－３）前記（１－２）工程で形成された多能性幹細胞凝集体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、胚葉体（胚様体）を形成する工程。（１－４）前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、外胚葉系細胞凝集体を形成する工程。

　本発明は以下に示す［１］～［８］の各態様を含む。

［１］　多能性幹細胞から中胚葉系細胞を分化誘導する方法であり、以下の（２－１）～（２－３）工程を含むことを特徴とする、分化誘導方法。（２－１）下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び、多能性幹細胞の播種を行う工程。

　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。

　（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。（２－２）前記（２－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した胚葉体（胚様体）を形成する工程。（２－３）前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、中胚葉系細胞凝集体を形成する工程。
［２］　前記細胞培養基材が親水性高分子を含む層を表面に有し、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理及び／又はコロナ放電処理によって前記親水性高分子を含む層を分解又は改質した領域であることを特徴とする［１］に記載の分化誘導方法。
［３］　前記（２－１）工程の細胞播種密度が、１．０×１０^２～１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の分化誘導方法。
［４］　前記（２－２）工程において、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上となるまで胚葉体（胚様体）を培養することを特徴とする、［１］～［３］のいずれかに記載の分化誘導方法。
［５］　前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）の形状が、島状であることを特徴とする、［１］～［４］のいずれかに記載の分化誘導方法。
［６］　前記（２－３）工程における分化誘導因子が、中胚葉誘導因子を含有することを特徴とする、［１］～［５］のいずれかに記載の分化誘導方法。
［７］　中胚葉誘導因子が、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）およびアクチビンからなる群より選択される単一又は複数の分化誘導因子であることを特徴とする、［６］に記載の分化誘導方法。
［８］　前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）が、中胚葉マーカーを有していることを特徴とする、［１］～［７］のいずれかに記載の分化誘導方法。

　本発明の一態様は、多能性幹細胞の内胚葉系細胞への分化誘導方法であって、
　（３－１）下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材に、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物を、前記細胞培養基材の培養面の面積を基準として、ラミニン及びその断片の総量が１～１００μｇ／ｃｍ^２となるように添加すること、及び多能性幹細胞を播種することを実施する工程、
　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域
　（Ｂ）（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域
　（３－２）工程（３－１）で播種された多能性幹細胞を、未分化性維持培地の存在下で、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材の培養面上に接着した胚様体を形成する工程、及び
　（３－３）工程（３－２）で形成された胚様体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下で、細胞培養基材の培養面上に接着した状態で培養し、分化誘導して内胚葉系細胞の凝集体を形成する工程
を含む、方法に関する。

　本発明の一態様は、下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材を備える、三胚葉系細胞への分化誘導キットである。
　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域
　（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域

　本発明によって、分化誘導効率及び培養操作性に優れる、多能性幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導方法及び分化誘導キットを提供することができる。前述の（Ａ）、及び（Ｂ）領域を有する細胞培養基材上に固定した培養系で分化誘導される胚葉体（胚様体）は、任意の形状（胚葉体（胚様体）の直径、胚葉体（胚様体）のアスペクト比）を維持でき、また分化誘導因子の濃度勾配の影響も低いため、各細胞の分化進行を同期させることができる。また、細胞凝集体がフィーダーフリー、及び細胞培養基材に固定した培養系で分化誘導することで、夾雑物の混入を低減することができる。

　本発明によって、分化誘導効率及び培養操作性に優れる、多能性幹細胞から中胚葉系細胞への分化誘導方法及び分化誘導キットを提供することができる。

　本発明によって、培地交換及び細胞観察等の培養操作の簡便性に優れ、かつ免疫染色及び分泌物測定試験等の細胞機能評価の際の操作性にも優れる、多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導方法及び分化誘導キットを提供することができる。本発明に係る分化誘導方法及び分化誘導キットによれば、多能性幹細胞の凝集体を効率的に形成することができると共に、内胚葉系細胞への分化誘導から細胞機能評価まで一貫して接着させた状態で培養することができるため、培養操作の簡便性、及び細胞機能評価の際の操作性が優れたものとなる。

細胞培養基材の模式図（断面図）である。本発明に係る外胚葉系細胞の分化誘導方法の模式図。実施例１における細胞培養基材上の胚葉体（胚様体）の位相差顕微鏡写真。実施例１における胚葉体（胚様体）の直径とアスペクト比の経時的変化を示すグラフ。実施例１及び比較例１における胚葉体（胚様体）外縁部の仮足伸展の様子を示す位相差顕微鏡写真。比較例２，３における胚葉体（胚様体）の位相差顕微鏡写真。本発明に係る中胚葉系細胞の分化誘導方法を示した模式図である。実施例２における胚葉体（胚様体）の位相差顕微鏡写真を示す。比較例４，５における位相差顕微鏡写真を示す。実施例２及び比較例４，５における中胚葉マーカー（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）に関する遺伝子発現量評価結果を示す。実施例２及び比較例４，５における未分化マーカー（ＮＡＮＯＧ）に関する遺伝子発現量評価結果を示す。実施例３における培養方法の概要を示す図である。実施例３における胚様体の位相差顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍを示す。比較例６及び７における胚様体の位相差顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍを示す。実施例３並びに比較例６及び７における未分化マーカー（ＮＡＮＯＧ）及び内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７）の遺伝子発現量の評価結果を示すグラフである。実施例４において分化誘導した細胞を経時的に撮影した位相差顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍを示す。実施例４及び実施例５において分化誘導した細胞の位相差顕微鏡写真及び免疫染色後の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍを示す。比較例８及び実施例４において分化誘導した細胞の位相差顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍを示す。比較例９において分化誘導した細胞の位相差顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍを示す。矢印は基材から剥離した細胞塊を示す。

　以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。

　本明細書において、「多能性幹細胞」とは、様々な細胞へと分化することが可能な特性（未分化性又は分化多能性）を有する細胞を示す。また、本明細書において「外胚葉系細胞」とは、初期胚が形成する外胚葉に含まれる細胞（外胚葉細胞）又は、外胚葉に由来する組織に含まれる細胞（神経幹細胞や神経細胞を含む）の総称を示す。

　さらに、「神経幹細胞」とは、神経外胚葉への分化誘導が進行し、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト）、中枢神経（ドーパミン神経、ＧＡＢＡ神経）、末梢神経（運動神経、感覚神経）への分化誘導が可能な状態の細胞を示す。また、本明細書において「中胚葉系細胞」とは、初期胚が形成する中胚葉に含まれる細胞（中胚葉細胞）又は、中胚葉に由来する組織に含まれる細胞の総称を示す。また、本明細書において「内胚葉系細胞」とは、初期胚が形成する内胚葉に含まれる細胞（内胚葉細胞）、及び内胚葉に由来する組織に含まれる細胞の総称を示す。また、本明細書において、「未分化性維持」とは、培養した細胞が分化多能性を有する状態を示す。未分化性維持の評価方法として特に限定はされないが、例えば、アルカリホスファターゼ染色による細胞表面マーカーの解析、免疫染色及びフローサイトメトリーによる細胞表面／細胞核内マーカーの解析、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現量の解析、多能性幹細胞が形成する特有の構造体である胚葉体（胚様体）形成の確認、Ｉｎ　ｖｉｖｏにおける三胚葉分化を病理切片より判断するテラトーマアッセイ等が挙げられる。

　また、本明細書において、「分化」とは、多能性幹細胞の分化誘導経路において、多能性幹細胞よりも下流に位置する細胞種特有の膜タンパク質、転写因子等の発現が確認される状態を示す。さらに、「分化誘導」とは、特定のタンパク質、遺伝子、天然物又は合成化学物質等の存在下で細胞を培養することにより、細胞の分化を進行させることを示す。また、本明細書において、「細胞凝集体（多能性幹細胞の凝集体）」とは、複数の細胞（多能性幹細胞）が凝集して形成される三次元構造体を示す。さらに、「胚葉体（胚様体）」とは、胚発生の初期に見られる球状の細胞凝集塊（多能性幹細胞の凝集体）であり、初期胚と同様に外胚葉、中胚葉及び内胚葉の性質を示す。

　また、本明細書において、「マーカー」とは、特定の細胞に特有のタンパク質又は遺伝子を示す。多能性幹細胞が有するマーカーを「未分化マーカー」、外胚葉細胞が有するマーカーを「外胚葉マーカー」、中胚葉細胞が有するマーカーを「中胚葉マーカー」、内胚葉細胞が有するマーカーを「内胚葉マーカー」、神経幹細胞が有するマーカーを「神経幹細胞マーカー」、神経細胞が有するマーカーを「神経細胞マーカー」、小腸組織細胞が有するマーカーを「腸上皮細胞マーカー」とそれぞれ表記する。多能性幹細胞は外胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカーを有しない。また、胚葉体（胚様体）は外胚葉マーカー、中胚葉マーカー及び内胚葉マーカーを有する。

　また、本明細書において、「細胞接着性」とは、培養温度における細胞培養基材への接着しやすさを示し、「細胞接着性を有する」とは、細胞が培養温度において細胞培養基材に接着可能であることを示す。また、「細胞接着性を有しない」とは、培養温度において細胞が細胞培養基材に接着できないことを示す。

　また、本明細書において、「細胞増殖性」とは、培養温度における細胞の増殖しやすさを示し、「細胞増殖性を有する」とは、細胞が培養温度において増殖可能であることを示す。また、「細胞増殖性を有しない」とは、培養温度において細胞が増殖できないことを示す。

＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞
　本発明に係る外胚葉系細胞の分化誘導方法は、以下２つの領域を有する細胞培養基材を用いる。（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性を有しない領域。細胞培養基材として前記（Ａ）領域を有する細胞培養基材を用いることで、後述する（１－１）工程において多能性幹細胞を細胞培養基材上で接着培養することができ、また、後述する（１－２）工程において細胞培養基材に接着した胚葉体（胚様体）を形成することができる。前記（Ａ）領域を有しない場合、多能性幹細胞を細胞培養基材上で接着培養することができず、細胞培養基材に接着した胚葉体（胚様体）を形成することができない。また、細胞培養基材として前記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材を用いることで、前期（Ａ）領域のみで多能性幹細胞を増殖させることができ、均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成することができる。均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成することで、分化誘導効率を高めることができる。前記（Ｂ）領域を有しない場合、均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成することができない。

　前記（Ａ）領域の面積としては、外胚葉系細胞への分化誘導に適したサイズの胚葉体（胚様体）を形成するのに好適のため、面積０．００５～３ｍｍ^２がさらに好ましく、面積０．０１～１．０ｍｍ^２が特に好ましく、面積０．０３～０．８ｍｍ^２が最も好ましい。

　前記（Ａ）領域の形状としては特に限定はないが、分化誘導効率を高めるのに好適のため、円又は楕円、正多角形が好ましく、円がさらに好ましい。

　（Ｂ）領域の形状としては、（Ａ）領域に隣接すること以外に限定はないが、均一なサイズ及び形状の凝集体を製造するのに好適であることから、（Ａ）領域との境界線の２０％以上の長さに（Ｂ）領域が隣接していることが好ましく、５０％以上がより好ましく、８０％以上が更に好ましく、（Ａ）領域の周囲が全て（Ｂ）領域であることが最も好ましい。また、細胞培養基材の量産性を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域が島状で（Ｂ）領域が海状の海島構造であることが好ましい。

　（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積比としては、特に限定はないが、細胞培養基材の単位面積当たりに製造可能な細胞凝集体の数量を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域の面積が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積の合計に対して、１０％以上であることが好ましく、３０％以上がより好ましく、５０％以上が更に好ましく、７０％以上が最も好ましい。また、複数の（Ａ）領域の間に充分な距離を設け、複数の（Ａ）領域の凝集体が融合して不均一な形状となることを抑制するのに好適であることから、（Ｂ）領域の面積が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積の合計に対して、２０％以上であることが好ましく、４０％以上がより好ましく、６０％以上が更に好ましく、８０％以上が最も好ましい。

　本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材は、均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成し、分化誘導効率を高めるのに好適のため、親水性高分子による層を表面に含有し、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理、コロナ放電処理のいずれか、またはこれらの組み合わせによって前記親水性高分子による層の一部を分解又は改質した領域であることが好ましい。細胞培養基材が親水性高分子による層を表面に有することにより、（Ｂ）領域における基材－細胞間接着に寄与するタンパク質の吸着を抑制し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域とすることができる。

　また、親水性高分子による層の一部が分解又は改質されていることで、（Ａ）領域に細胞接着性又は細胞増殖性を付与することができる。また、前記（Ａ）領域の細胞接着性及び細胞増殖性を高め、短時間で胚葉体（胚様体）を形成するのに好適のため、（Ａ）領域がプラズマ処理領域であることがさらに好ましい。

　前記親水性高分子による層の層厚は、（Ｂ）領域を細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域とするのに好適のため、１０ｎｍ以上が好ましく、５０ｎｍ以上がさらに好ましく、１００ｎｍ以上が特に好ましく、５００ｎｍ以上が最も好ましい。また、（Ａ）領域を細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域とするのに好適のため、層厚１０００ｎｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましく、１００ｎｍ以下が特に好ましく、５０ｎｍ以下が最も好ましい。

　前記親水性高分子による層の形成方法としては、化学的な結合を形成させる方法、及び物理的な相互作用による方法の内、少なくとも一つを用いて行うことができる。化学的な結合を形成させる方法としては、紫外線照射、電子線照射、ガンマ線照射、プラズマ処理、コロナ処理等の反応性官能基を形成させる手法が挙げられる。また、イオンやラジカルを反応源とした有機反応による基材表面への架橋反応も可能である。物理的な相互作用による方法としては、対象とする親水性高分子との相溶性に優れたマトリクスを塗材とした、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーティング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティング等の手法を用いることが可能である。

　前記親水性高分子の種類としては特に限定はないが、ヒドロキシ基、アミノ基、ポリエチレングリコール基等の極性基を有するもの、ベタイン構造、ホスホリルコリン基等の両性イオン構造を有するものが挙げられる。（Ｂ）領域を細胞接着性及び細胞増殖性を有しない領域とするのに好適のため、ヒドロキシ基、ホスホリルコリン基、又はポリエチレングリコール基が好ましく、ヒドロキシ基又はホスホリルコリン基がさらに好ましく、ホスホリルコリン基が特に好ましい。

　前記親水性高分子は、細胞培養基材から親水性高分子が溶出するのを抑制し、細胞凝集体や胚葉体（胚様体）に高分子が混入することによる品質への影響を抑制するのに好適であることから、親水性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体又はブロック共重合体であることが好ましく、親水性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体であることがさらに好ましい。また、前記共重合体の組成比としては、（Ｂ）領域を細胞接着性及び細胞増殖性を有しない領域とするのに好適のため、親水性の単量体単位が３０ｗｔ％以上であることが好ましく、４０ｗｔ％以上がさらに好ましく、５０ｗｔ％以上が特に好ましく、６０ｗｔ％以上が最も好ましい。さらに、親水性高分子が溶出するのを抑制するのに好適のため、疎水性の単量体単位が２０ｗｔ％以上であることが好ましく、３０ｗｔ％以上がさらに好ましく、４０ｗｔ％以上が特に好ましく、５０ｗｔ％以上が最も好ましい。

　前記親水性の単量体単位としては、親水性であること以外に特に限定はないが、例えば、２－ジメチルアミノエチルアクリレート、２－ジメチルアミノエチルメタクリレート、２－ジエチルアミノエチルアクリレート、２－ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド等のアミノ基を有するもの；Ｎ－（３－スルホプロピル）－Ｎ－メタクロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウム－α－Ｎ－メチルカルボキシベタイン等のベタインを有するもの；ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アクリルアミド、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、ポリプロピレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレート、２－メトキシエチルメタクリレート、２－エトキシエチルアクリレート、２－エトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリレート、３－ブトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリルアミド、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート等のポリエチレングリコール基、メトキシエチル基を有するもの；メトキシメチルアクリレート、メトキシメチルメタクリレート、２－エトキシメチルアクリレート、２－エトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリレート、３－ブトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリルアミド等のアクリレート基を有するもの；２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３－アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４－アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６－アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０－アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等のホスホリルコリン基を有するものを挙げることができる。

　前記疎水性の単量体単位としては、疎水性であること以外に特に限定はないが、例えば、ｎ－ブチルアクリレート、ｎ－ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ－ブチルアクリレート、ｔ－ブチルメタクリレート、ｎ－ヘキシルアクリレート、ｎ－ヘキシルメタクリレート、ｎ－オクチルアクリレート、ｎ－オクチルメタクリレート、ｎ－デシルアクリレート、ｎ－デシルメタクリレート、ｎ－ドデシルアクリレート、ｎ－ドデシルメタクリレート、ｎ－テトラデシルアクリレート、ｎ－テトラデシルメタクリレート等を挙げることができる。

　前記親水性高分子はまた、親水性高分子の溶出を抑制するのに好適であることから、反応性を有する単量体単位を含んでいることが好ましい。反応性を有する単量体単位としては、短時間の処理で親水性高分子を基材に固定化することが可能であることからＵＶ反応性を有する単量体単位が好ましく、例えば、４－アジドフェニルアクリレート、４－アジドフェニルメタクリレート、２－（（４－アジドベンゾイル）オキシ）エチルアクリレート、２－（（４－アジドベンゾイル）オキシ）エチルメタクリレート等を挙げることができる。

　前記親水性高分子はまた、温度応答性の単量体単位を含んでいてもよく、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－ｔ－ブチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－　ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテル；Ｎ－プロリンメチルエステルアクリルアミド等のプロリン誘導体を挙げることができる。

　また、本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材の別の作製方法としては、フォトリソグラフィー法やインクジェット法により、細胞培養基材上の一部の領域に細胞接着性を促進又は阻害する物質を基材に被覆する方法、細胞培養基材の表面にプラズマ処理、紫外線処理、コロナ放電処理のいずれか、またはこれらの組み合わせによる処理を施した後に、温度応答性高分子を被覆する方法等を挙げることができる。

　また、本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材は、滅菌を施してあってもよい。滅菌の方法に特に限定はないが、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、γ線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌等を用いることができる。ブロック共重合体の変性を抑制するのに好適であることから、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、エチレンオキシドガス滅菌が好ましく、基材の変形を抑制するために好適であることからＵＶ滅菌又はエチレンオキシドガス滅菌がさらに好ましく、細胞培養基材の量産性に優れることからエチレンオキシドガス滅菌が特に好ましい。

　本発明において、細胞培養基材の作製に用いられる基材は特に限定されないが、通常用いられるガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンメタクリレート等の高分子化合物、セラミックス、及び金属類を用いることができる。透明性に優れ、また成型加工及び表面改質が容易であることからポリスチレンが最も好ましい。

　本発明の分化誘導方法及び製造方法は、下記（１－１）～（１－４）工程を経て分化誘導を行うことを特徴とする。（１－１）細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片からなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び、多能性幹細胞の播種を行う工程。（１－２）前記（１－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した多能性幹細胞凝集体を形成する工程。（１－３）前記（１－２）工程で形成された多能性幹細胞凝集体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、胚葉体（胚様体）を形成する工程。（１－４）前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、外胚葉系細胞凝集体を形成する工程。本発明の分化誘導方法における（１－１）工程は、前記細胞培養基材上にマトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片からなる群より選択される単一又は複数の物質を被覆し、多能性幹細胞の播種を行う工程である。前記マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片からなる群より選択される単一又は複数の物質を被覆することにより、（Ａ）領域に細胞接着性及び細胞増殖性を付与することができる。マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片のいずれも被覆しない場合、細胞接着性及び細胞増殖性を付与することができない。細胞接着性及び細胞増殖性を付与するのに好適であることから、少なくともラミニンを含む４種類の組み合わせであることがさらに好ましく、ラミニンとマトリゲル、ラミニンとフィブロネクチン、又はラミニンとコラーゲンのいずれかの組み合わせであることが特に好ましく、ラミニン単独であることが最も好ましい。

　前記マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、制限酵素等で切断した断片や、これら生体由来物質をベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。

　本発明において、前記マトリゲルとしては、入手容易性から、市販品としては例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やＧｅｌｔｒｅｘ（Ｇｉｂｃｏ製）を好適に用いることができる。

　前記ラミニンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞の表面に発現しているα６β１インテグリンに対して高活性を示すことが報告されているラミニン５１１、ラミニン５２１又はラミニン５１１－Ｅ８フラグメントを用いることができる。前記ラミニンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ラミニンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（（株）ニッピ製）を好適に用いることができる。

　前記ビトロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ビトロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ビトロネクチン，ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）（Ｇｉｂｃｏ製）を好適に用いることができる。

　前記フィブロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記フィブロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、フィブロネクチン溶液、ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（タカラバイオ（株）製）を好適に用いることができる。

　前記コラーゲンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ｔｙｐｅＩコラーゲンやｔｙｐｅＩＶコラーゲンを用いることができる。前記コラーゲンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記コラーゲンをベースとした合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、コラーゲンＩ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やコラーゲンＩＶ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を好適に用いることができる。

　前記（１－１）工程における細胞の種類としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の分化多能性を有する幹細胞から適宜選択することができるが、再生医療や創薬へ本発明の分化誘導方法を適用するのに好適のため、ｉＰＳ細胞が好ましい。前記（１－１）工程における細胞播種方法は特に限定されないが、細胞を単分散させた細胞懸濁液を細胞培養基材に添加する、または細胞凝集体を細胞培養基材に添加する方法が挙げられ、前記（Ａ）領域に均一に細胞凝集体が形成するため、単分散させて播種することが好ましい。ヒト由来ｉＰＳ細胞を単分散させて培養する場合、低細胞密度によるアポトーシスを抑制するために、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を播種時に添加することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ（富士フィルム和光純薬（株）製、商品名：Ｙ－２７６３２）等を用いることができる。培地に添加されるＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、ヒトの細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、好ましくは１μＭ～５０μＭであり、より好ましくは３μＭ～２０μＭであり、さらに好ましくは５μＭ～１５μＭであり、最も好ましくは８μＭ～１２μＭである。また、ＲＯＣＫ阻害剤は細胞播種して２４時間後に、ＲＯＣＫ阻害剤を含有しない培地に交換する等の方法により、取り除くことが好ましい。

　細胞の回収方法は特に限定されないが、例えば、トリプシンやコラゲナーゼ等の酵素処理やエチレンジアミン酢酸（ＥＤＴＡ）によるキレート処理、スクレーパ等の物理処理を単体、または組み合わせて用いることができる。酵素処理を用いる場合、動物由来成分フリーであることが好ましい。入手容易性の観点から、市販品としてＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ製）やＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ナカライテスク製）、Ａｃｃｕｍａｘ（ナカライテスク製）を好適に用いることができる。

　前記（１－１）工程における細胞播種密度としては、短時間で均一な細胞凝集体を形成するのに好適のため、１．０×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が好ましく、１．２×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上がさらに好ましく、２．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が特に好ましく、３．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が最も好ましい。また、培地の栄養不足による細胞死を抑制するのに好適のため、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が好ましく、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下がさらに好ましく、２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が特に好ましく、５．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が最も好ましい。

　本発明の分化誘導方法における（１－２）工程は、前記（１－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した多能性幹細胞凝集体を形成する。本発明において「フィーダーフリー」とは、ガンマ線照射等で不活化した細胞（フィーダー細胞）を用いることなく、多能性幹細胞を細胞培養基材上に直接播種して培養する手法を示す。前記（１－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養することで、多能性幹細胞が（Ａ）領域内で増殖し、基材面外方向に重層化した細胞凝集体を形成することができる。　未分化性維持培地を用いない場合、細胞凝集体が分化多能性を失い、外胚葉系細胞への分化誘導効率が低下する。また、フィーダーフリーで培養することにより、培養中の培地の栄養を保ちやすく、細胞生存率や未分化維持を高めることができる。また、接着培養であることにより、浮遊培養と比較して培地交換作業が容易であるため培養作業性に優れ、全量培地交換が可能であることから、細胞から排出される老廃物の濃度を低い状態に保つことができる。また、培養系中での濃度勾配の影響も低いため分化誘導効率に優れる。

　前記未分化性維持培地としては、多能性幹細胞の未分化性維持に働く因子として、例えば塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、アクチビンＡ、Ｗｎｔ、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、２－メルカプトエタノール、セレン酸、オレイン酸、炭酸水素ナトリウムが挙げられ、これらの内少なくとも一つを含有していることが好ましく、高い未分化性維持に働くｂＦＧＦを含むことが最も好ましい。培地の種類は特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２等の基礎培地に前記未分化性維持に働く因子及び非必須アミノ酸等の培養サプリメントを添加した培養培地、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素（株）製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ（株）製）、ＧＳ２－Ｍ（タカラバイオ（株）製）、ｈＰＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（株）製）等の市販の未分化維持性培地が挙げられる。細胞の未分化状態を安定的に維持するのに好適であることから、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３が好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３がさらに好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）が最も好ましい。また、一般的に細胞培養培地に用いられる血清には分化誘導因子も含有されていることから、多能性幹細胞の未分化維持性培地は無血清培地であることが好ましい。

　また、前記（１－２）工程において、多能性幹細胞の生存率を高めるために前記（１－１）工程と同様のＲＯＣＫ阻害剤を添加してもよい。好適なＲＯＣＫ阻害剤の種類や濃度は前述と同様である。

　また、前記（１－２）工程においては、後述する（１－３）～（１－４）工程における分化誘導効率を高めるのに好適のため、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上となるまで培養することが好ましく、２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上がさらに好ましく、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が特に好ましく、７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が最も好ましい。また、培地の栄養を保ち（１－３）～（１－４）工程における細胞の生存率を高めるのに好適のため、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が５．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下で（１－３）工程に進むことが好ましく、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下がさらに好ましく、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が特に好ましく、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が最も好ましい。前記（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数とするためには、（１－２）工程において１～４８時間の培養を行うことが好ましく、６～３６時間がさらに好ましく、１２～３６時間が特に好ましく、１８～３０時間が最も好ましい。

　また、後述する（１－３）～（１－４）工程における分化誘導効率を高めるのに好適のため、前記（１－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）の形状が、半球状であることが好ましい。本発明の分化誘導方法における（１－３）工程は、前記（１－２）工程で形成された多能性幹細胞凝集体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、胚葉体（胚様体）を形成する。

　胚葉体（胚様体）への分化誘導効率を高めるのに好適のため、前記（１－３）工程における分化誘導因子が、外胚葉誘導因子、中胚葉誘導因子及び内胚葉誘導因子を含有することが好ましい。前記外胚葉誘導因子としては、胚葉体（胚様体）への分化誘導効率を高めるのに好適のため、Ｎｏｇｇｉｎ（ＢＭＰ阻害剤）、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＢＭＰ阻害剤）、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－β阻害剤）、アクチビン阻害剤、のいずれかを含有することが好ましく、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤を含有することがさらに好ましい。また、前記中胚葉誘導因子としては、胚葉体（胚様体）への分化誘導効率を高めるのに好適のため、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３β阻害剤）、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）４のいずれかを含有することが好ましく、ＧＳＫ３β阻害剤を含有することがさらに好ましい。さらに、前記内胚葉誘導因子としては、はアクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１等の低分子化合物が挙げられる。

　また、前記分化誘導因子の培地への添加濃度については特に限定されないが、胚葉体（胚様体）への分化誘導効率を高めるのに好適のため、好ましくは０．１～１０μＭであり、より好ましくは１．０～７．５μＭであり、最も好ましくは２．０～５．０μＭである。前記分化誘導因子を含む培地は、十分に分化誘導が進行するために、培養中は２４時ごとに交換することが好ましい。２４時間以内に培地を交換することで、培地中の分化誘導因子が不足することを防ぎ、均一に全ての細胞を分化させることができる。

　前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）が有する外胚葉マーカーとしては、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１０、Ｎｏｔｃｈ１、Ｅ　Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＡＰ２が好ましく、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２がさらに好ましい。また、中胚葉マーカーとしては、Ｔｂｘ１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭＳＸ１、Ｆｌｋ－１が好ましく、Ｔｂｘ１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙがさらに好ましい。また、内胚葉マーカーとしては、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４α、αＦＰが好ましく、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７がさらに好ましい。また、神経幹細胞マーカーとしては、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｏｌｉｇ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＤＣＸが好ましく、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ１、Ｏｌｉｇ２がさらに好ましい。

　本発明の分化誘導方法における（１－４）工程は、前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、外胚葉系細胞凝集体を形成する。前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）を細胞培養基材上に接着した状態で分化誘導することにより、前述した誘導因子の濃度勾配による影響が少ないため、均一に分化進行することが期待される。培地は特に限定はされないが、例えばＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２等の基礎培地に外胚葉誘導に働く因子及び培養サプリメントを添加した培養培地が挙げられる。

　前記（１－４）工程で胚葉体（胚様体）から分化誘導する細胞の種類としては、外胚葉系細胞であること以外に特に限定はないが、例えば表皮外胚葉由来細胞及び神経外胚葉由来細胞が好ましく、再生医療や創薬への利用に適していることから、神経外胚葉由来細胞がさらに好ましい。神経外胚葉由来細胞としては特に限定はないが、例えば、シュワン前駆細胞、ミエリンシュワン細胞、非ミエリンシュワン細胞、放射状グリア細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト及びアストロサイト等の神経膠細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性神経細胞、セロトニン作動性神経細胞、コリン作動性神経細胞、運動神経細胞及び感覚神経細胞等の神経細胞が好ましい。外胚葉由来細胞が神経細胞の場合、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、ＴＧＦ－β阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、レチノイン酸、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅを含有する培地の存在下で５～１４日間培養後、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、ＴＧＦ－β阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、レチノイン酸、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＤＡＰＴを含有する培地の存在下で３～５日間培養することが好ましい。さらに運動神経細胞に分化させる場合、前述した神経細胞の培養後、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、ｒｈＢＤＮＦ、ｒｈＧＤＮＦ、アスコルビン酸、レチノイン酸、ＤＡＰＴを含有する培地の存在下で５～４０日間培養することが好ましい。

＜中胚葉系細胞の分化誘導方法＞
　以下、本発明に係る中胚葉系細胞の分化誘導方法を実施するための形態について詳細に説明する。

　本発明の分化誘導方法は、下記（Ａ），（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材を用いる。（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。

　細胞培養基材として前記（Ａ）領域を有する細胞培養基材を用いることで、後述する（２－２）工程において多能性幹細胞を細胞培養基材上で接着培養することができ、また、細胞培養基材に接着した胚葉体（胚様体）を形成することができる。前記（Ａ）領域を有しない場合、多能性幹細胞を細胞培養基材上で接着培養することができず、細胞培養基材に接着した胚葉体（胚様体）を形成することができない。また、細胞培養基材として前記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材を用いることで、前期（Ａ）領域のみで多能性幹細胞を増殖させることができ、均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成することができる。均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成することで、分化誘導効率を高めることができる。前記（Ｂ）領域を有しない場合、均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成することができない。

　前記（Ａ）領域の面積としては、中胚葉系細胞への分化誘導に適したサイズの胚葉体（胚様体）を形成するのに好適のため、面積０．００５～３ｍｍ^２がさらに好ましく、面積０．０１～１．０ｍｍ^２が特に好ましく、面積０．０３～０．８ｍｍ^２が最も好ましい。

　前記（Ａ）領域の形状については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　（Ｂ）領域の形状については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積比については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材は、均一サイズの胚葉体（胚様体）を形成し、分化誘導効率を高めるのに好適のため、親水性高分子を含む層を表面に有し、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理及び／又はコロナ放電処理によって前記親水性高分子を含む層を分解又は改質した領域であることが好ましい。細胞培養基材が親水性高分子を含む層を表面に有することにより、（Ｂ）領域における基材－細胞間接着に寄与するタンパク質の吸着を抑制し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域とすることができる。また、親水性高分子を含む層の一部が分解又は改質されていることで、（Ａ）領域に細胞接着性又は細胞増殖性を付与することができる。また、前記（Ａ）領域の細胞接着性及び細胞増殖性を高め、短時間で胚葉体（胚様体）を形成するのに好適のため、（Ａ）領域がプラズマ処理領域であることがさらに好ましい。

　また、本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材は、細胞増殖性を高めるのに好適のため、（Ａ）領域は親水性高分子を有しない領域、（Ｂ）領域は親水性高分子を含む層を有する領域であることが好ましく、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理及び／又はコロナ放電処理によって改質された基材表面が露出した領域であり、（Ａ）領域は親水性高分子を有しない領域、（Ｂ）領域は親水性高分子を含む層を有する領域であることがさらに好ましい。

　前記親水性高分子を含む層の層厚については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記親水性高分子を含む層の形成方法については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記親水性高分子の種類については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記親水性高分子は、細胞培養基材から親水性高分子が溶出するのを抑制し、細胞凝集体や胚葉体（胚様体）に高分子が混入することによる品質への影響を抑制するのに好適であることから、親水性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体又はブロック共重合体であることが好ましく、親水性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体であることがさらに好ましい。また、前記共重合体の組成比については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記親水性の単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記疎水性の単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記親水性高分子はまた、親水性高分子の溶出を抑制するのに好適であることから、反応性を有する単量体単位を含んでいることが好ましい。反応性を有する単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記親水性高分子はまた、温度応答性の単量体単位を含んでいてもよく、温度応答性の単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　また、本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材の別の作製方法については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　また、本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材は、滅菌を施してあってもよい。滅菌の方法については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　本発明において、細胞培養基材の作製に用いられる基材については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　本発明の分化誘導方法は、下記（２－１）～（２－３）工程を経て分化誘導を行うことを特徴とする。（２－１）細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片からなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び、多能性幹細胞の播種を行う工程。（２－２）前記（２－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した胚葉体（胚様体）を形成する工程。（２－３）前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、中胚葉系細胞凝集体を形成する工程。

　本発明の分化誘導方法における（２－１）工程は、前記細胞培養基材上にマトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片からなる群より選択される単一又は複数の物質を被覆し、多能性幹細胞の播種を行う工程である。

　前記マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片からなる群より選択される単一又は複数の物質を被覆することにより、（Ａ）領域に細胞接着性及び細胞増殖性を付与することができる。マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片のいずれも被覆しない場合、細胞接着性及び細胞増殖性を付与することができない。細胞接着性及び細胞増殖性を付与するのに好適であることから、少なくともラミニンを含む４種類の組み合わせであることがさらに好ましく、ラミニンとマトリゲル、ラミニンとフィブロネクチン、又はラミニンとコラーゲンのいずれかの組み合わせであることが特に好ましく、ラミニン単独であることが最も好ましい。

　前記マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記（２－１）工程における細胞の種類としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の分化多能性を有する幹細胞から適宜選択することができるが、再生医療や創薬へ本発明の分化誘導方法を適用するのに好適のため、ｉＰＳ細胞が好ましい。前記（２－１）工程における細胞播種方法は特に限定されないが、細胞を単分散させた細胞懸濁液を細胞培養基材に添加する、または細胞凝集体を細胞培養基材に添加する方法が挙げられ、前記（Ａ）領域に均一に細胞凝集体が形成するため、単分散させて播種することが好ましい。ヒト由来ｉＰＳ細胞を単分散させて培養する場合、低細胞密度によるアポトーシスを抑制するために、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を播種時に添加することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　前記（２－１）工程における細胞播種密度としては、短時間で均一な細胞凝集体を形成するのに好適のため、１．０×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が好ましく、１．２×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上がさらに好ましく、２．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が特に好ましく、３．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が最も好ましい。また、培地の栄養不足による細胞死を抑制するのに好適のため、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が好ましく、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下がさらに好ましく、２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が特に好ましく、５．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が最も好ましい。

　本発明の分化誘導方法における（２－２）工程は、前記（２－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した胚葉体（胚様体）を形成する。本発明において「フィーダーフリー」とは、ガンマ線照射等で不活化した細胞（フィーダー細胞）を用いることなく、多能性幹細胞を細胞培養基材上に直接播種して培養する手法を示す。前記（２－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養することで、多能性幹細胞が（Ａ）領域内で増殖し、基材面外方向に重層化した胚葉体（胚様体）を形成することができる。未分化性維持培地を用いない場合、胚葉体（胚様体）が分化多能性を失い、中胚葉系細胞への分化誘導効率が低下する。また、フィーダーフリーで培養することにより、培養中の培地の栄養を保ちやすく、細胞生存率や未分化維持を高めることができる。また、接着培養であることにより、浮遊培養と比較して培地交換作業が容易であるため培養作業性に優れ、全量培地交換が可能であることから、細胞から排出される老廃物の濃度を低い状態に保つことができる。また、培養系中での濃度勾配の影響も低いため分化誘導効率に優れる。

　前記未分化性維持培地については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　また、前記（２－２）工程において、多能性幹細胞の生存率を高めるために前記（２－１）工程と同様のＲＯＣＫ阻害剤を添加してもよい。好適なＲＯＣＫ阻害剤の種類や濃度は前述と同様である。

　また、前記（２－２）工程においては、後述する（２－３）工程における分化誘導効率を高めるのに好適のため、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上となるまで培養することが好ましく、２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上がさらに好ましく、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が特に好ましく、７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が最も好ましい。また、培地の栄養を保ち（２－３）工程における細胞の生存率を高めるのに好適のため、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が５．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下で（２－３）工程に進むことが好ましく、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下がさらに好ましく、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が特に好ましく、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が最も好ましい。

　前記（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数とするためには、（２－２）工程において１～４８時間の培養を行うことが好ましく、６～３６時間がさらに好ましく、１２～３６時間が特に好ましく、１８～３０時間が最も好ましい。

　また、後述する（２－３）工程における分化誘導効率を高めるのに好適のため、前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）の形状は適宜設定可能であるが、例えば、円や楕円、多角形、不定形の直線又は曲線からなる閉じた形状等を挙げることができる。また、球に近い形状のスフェロイドを製造するのに好適であることから、島状の形状として、円又は楕円、多角形が好ましく、円又は楕円、長方形がさらに好ましく、円又は楕円、正方形が特に好ましく、円又は楕円が最も好ましい。

　また、本発明において、球に近い形状のスフェロイドを製造するのに好適であることから、島状の形状のアスペクト比としては５以下が好ましく、２以下がさらに好ましく、１．５以下が特に好ましく、１．１以下が最も好ましい。ここで、本発明において「アスペクト比」とは、形状の最大径（長径）と最小径（短径）の比である長径／短径を示す。

　本発明の分化誘導方法における（２－３）工程は、前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、中胚葉系細胞を形成する。

　中胚葉系細胞への分化誘導効率を高めるのに好適のため、前記（２－３）工程における分化誘導因子が、中胚葉誘導因子を含有することが好ましい。前記中胚葉誘導因子としては、胚葉体（胚様体）への分化誘導効率を高めるのに好適のため、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）およびアクチビンからなる群より選択される単一又は複数の分化誘導因子であることが好ましく、特にアクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３β阻害剤）、ＢＭＰ４のいずれかを含有することが好ましい。

　また、前記分化誘導因子の培地への添加濃度については特に限定されないが、胚葉体（胚様体）への分化誘導効率を高めるのに好適のため、好ましくは１０００～５００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは５００～１００ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である。

　前記分化誘導因子を含む培地は、十分に分化誘導が進行するために、培養中は２４時ごとに交換することが好ましい。２４時間以内に培地を交換することで、培地中の分化誘導因子が不足することを防ぎ、均一に全ての細胞を分化させることができる。

　前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）が有する中胚葉マーカーとしては、ＦＬＫ－１、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＳＮＡＩ１、ＦＯＸＣ１、ＰＤＧＦＲαが好ましく、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹが最も好ましい。

　本発明の分化誘導方法における（２－３）工程は、前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、中胚葉系細胞凝集体を形成する。前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）を細胞培養基材上に接着した状態で分化誘導することにより、前述した誘導因子の濃度勾配による影響が少ないため、均一に分化進行することが期待される。（２－３）工程で用いる培地は特に限定はされないが、例えばＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２等の基礎培地に中胚葉分化誘導因子及び培養サプリメントを添加した培養培地が挙げられる。

　前記（２－３）工程で胚葉体（胚様体）から分化誘導する細胞の種類としては、中胚葉系細胞であること以外に特に限定はないが、例えば血液細胞、平滑筋細胞、生殖細胞が好ましく、再生医療や創薬への利用に適していることから、骨細胞、心筋細胞、骨格筋細胞及び腎細胞がさらに好ましい。

＜内胚葉系細胞の分化誘導方法＞
　以下、本発明に係る内胚葉系細胞の分化誘導方法を実施するための形態について詳細に説明する。

　本発明の分化誘導方法では、下記（Ａ）領域及び（Ｂ）領域を有する細胞培養基材を用いる。
　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。
　（Ｂ）（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。

　細胞培養基材として（Ａ）領域を有する細胞培養基材を用いることで、後述する工程（３－２）において多能性幹細胞を細胞培養基材上で接着培養することができ、また、細胞培養基材に接着した胚様体を形成することができる。細胞培養基材が（Ａ）領域を有しない場合、多能性幹細胞を細胞培養基材上で接着培養することができず、細胞培養基材に接着した胚様体を形成することができない。また、細胞培養基材として（Ｂ）領域を有する細胞培養基材を用いることで、（Ａ）領域のみで多能性幹細胞を増殖させることができ、均一サイズの胚様体を形成することができる。均一サイズの胚様体を形成することで、分化誘導効率を高めることができる。細胞培養基材が（Ｂ）領域を有しない場合、均一サイズの胚様体を形成することができない。

　（Ａ）領域の面積としては、内胚葉系細胞への分化誘導に適したサイズの胚様体を形成するのに好適のため、０．００５～３ｍｍ^２がより好ましく、０．０２～２．５ｍｍ^２が更に好ましく、０．０３～２．０ｍｍ^２が最も好ましい。

　（Ａ）領域の形状については＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材は、均一サイズの胚様体を形成し、分化誘導効率を高めるのに好適のため、親水性高分子を含む層を表面に有し、（Ａ）領域が、プラズマ処理、紫外線処理及びコロナ放電処理からなる群より選択される少なくとも１種の処理によって親水性高分子を含む層を分解又は改質した領域であることが好ましい。細胞培養基材が親水性高分子を含む層を表面に有することにより、（Ｂ）領域における基材－細胞間接着に寄与するタンパク質の吸着を抑制し、（Ｂ）領域を細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域とすることができる。また、親水性高分子を含む層の一部が分解又は改質されていることで、（Ａ）領域に細胞接着性及び細胞増殖性を付与することができる。また、（Ａ）領域の細胞接着性及び細胞増殖性を高め、短時間で胚様体を形成するのに好適のため、（Ａ）領域がプラズマ処理により分解又は改質した領域であることがさらに好ましい。

　また、本発明の分化誘導方法で用いる細胞培養基材は、細胞増殖性を高めるのに好適のため、（Ａ）領域は親水性高分子を有しない領域、（Ｂ）領域は親水性高分子を含む層を有する領域であることが好ましく、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理及び／又はコロナ放電処理によって改質された基材表面が露出した領域であり、（Ｂ）領域は親水性高分子を含む層を有する領域であることがより好ましい。

　上記親水性高分子を含む層の層厚については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　上記親水性高分子を含む層の形成方法としては、外胚葉系細胞の分化誘導方法に関して例示した形成方法と同じ方法を挙げることができる。

　上記親水性高分子の種類としては、外胚葉系細胞の分化誘導方法に関して例示したものと同じ親水性高分子を挙げることができる。

　上記親水性高分子は、細胞培養基材から親水性高分子が溶出するのを抑制し、細胞凝集体や胚様体に高分子が混入することによる品質への影響を抑制するのに好適であることから、親水性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体又はブロック共重合体であることが好ましく、親水性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体であることがより好ましい。また、上記共重合体の組成比については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　上記親水性の単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　上記疎水性の単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　上記親水性高分子はまた、親水性高分子の溶出を抑制するのに好適であることから、反応性を有する単量体単位を含んでいることが好ましい。反応性を有する単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　上記親水性高分子はまた、温度応答性の単量体単位を含んでいてもよい。温度応答性の単量体単位については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　（Ｂ）領域は、（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない。（Ｂ）領域が、（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域であることにより、細胞を培養した際に、（Ａ）領域のみに細胞の凝集体を形成し、（Ａ）領域の周囲には細胞が存在しない状態を形成することが可能である。また、製造される凝集体のサイズ及び形状を均一化するのに好適であることから、（Ｂ）領域が細胞増殖性だけでなく細胞接着性も有しないものであることが好ましい。

　本発明の分化誘導方法は、下記工程（３－１）、工程（３－２）及び工程（３－３）を含む。
　工程（３－１）：上述した（Ａ）領域及び（Ｂ）領域を有する細胞培養基材に、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物を、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、ラミニン及びその断片の総量が１～１００μｇ／ｃｍ^２となるように添加すること、及び多能性幹細胞の播種することを実施する工程。
　工程（３－２）：工程（３－１）で播種された多能性幹細胞を、未分化性維持培地の存在下で、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材の培養面上に接着した胚様体を形成する工程。
　工程（３－３）：工程（３－２）で形成された胚様体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下で、細胞培養基材の培養面上に接着した状態で培養し、分化誘導して内胚葉系細胞の凝集体を形成する工程。

　工程（３－１）は、上述した細胞培養基材に、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物を、前記細胞培養基材の培養面の面積を基準として、ラミニン及びその断片の総量が１～１００μｇ／ｃｍ^２となるように添加すること、及び多能性幹細胞を播種することを実施する工程である。なお、細胞培養基材の培養面とは、培養時に培地と接する面のうち細胞が付着しうる面（細胞は重力で沈降するので、通常は鉛直方向と直角の面）である。ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物を添加することにより、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種で細胞培養基材の培養面が被覆される。これにより、（Ａ）領域が有する細胞接着性及び細胞増殖性が、分化誘導の際の培養中も維持されるようになる。ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種で被覆しない場合、細胞接着性及び細胞増殖性を維持することができない。分化誘導の際の培養中の細胞接着性を維持するのに好適であることから、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物は、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種のみを含む組成物であることがより好ましい。ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物の添加量は、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、ラミニン及びその断片の総量が、１．２～５０μｇ／ｃｍ^２となる量がより好ましく、１．５～１０μｇ／ｃｍ^２となる量が最も好ましい。上記添加量が１μｇ／ｃｍ^２未満である場合、分化誘導の際の培養中、細胞接着性を維持ができない。

　ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種で細胞培養基材の培養面を被覆する際、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種をＰＢＳ等で希釈した溶液（組成物）を細胞培養基材に添加して、数時間静置させるプレコート法を使用してもよく、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物を、多能性幹細胞を播種する際の細胞懸濁液と混合した状態で細胞培養基材に添加する添加法を使用してもよい。すなわち、工程（３－１）では、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物の添加は、多能性幹細胞の播種よりも前に実施してもよく、同時に実施してもよい。

　ラミニン及びその断片については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　工程（３－１）で播種する多能性幹細胞の種類としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の分化多能性を有する幹細胞から適宜選択することができるが、再生医療や創薬へ適用するのに好適であるため、ｉＰＳ細胞が好ましい。工程（３－１）における多能性幹細胞の播種方法は特に限定されないが、多能性幹細胞を単分散させた細胞懸濁液を細胞培養基材に添加する、又は細胞凝集体を細胞培養基材に添加する方法が挙げられる。これらの方法のうち、（Ａ）領域に均一に細胞凝集体が形成するため、単分散させて播種することが好ましい。ヒト由来ｉＰＳ細胞を単分散させて培養する場合、低細胞密度によるアポトーシスを抑制するために、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を播種時に添加することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　工程（３－１）における細胞播種密度としては、短時間で均一な細胞凝集体を形成するのに好適のため、１．０×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が好ましく、１．２×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上がより好ましく、２．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が更に好ましく、３．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が最も好ましい。また、培地の栄養不足による細胞死を抑制するのに好適のため、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が好ましく、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下がより好ましく、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が更に好ましく、２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が最も好ましい。

　工程（３－２）は、工程（３－１）で播種された多能性幹細胞を、未分化性維持培地の存在下で、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材の培養面上に接着した胚様体を形成する工程である。本明細書において「フィーダーフリー」とは、ガンマ線照射等で不活化した細胞（フィーダー細胞）を用いることなく、多能性幹細胞を細胞培養基材に直接播種して培養する手法を示す。工程（３－１）で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養することで、多能性幹細胞が（Ａ）領域内で増殖し、基材面外方向に重層化した胚様体を形成することができる。未分化性維持培地を用いない場合、胚様体が分化多能性を失い、内胚葉系細胞への分化誘導効率が低下する。また、フィーダーフリーで培養することにより、培養中の培地の栄養を保ちやすく、細胞生存率を高めることができ、未分化性維持が容易になる。また、接着培養であることにより、浮遊培養と比較して培地交換作業が容易であるため培養作業性に優れ、全量培地交換が可能であることから、細胞から排出される老廃物の濃度を低い状態に保つことができる。また、培養系中での濃度勾配の影響も低いため分化誘導効率に優れる。

　上記未分化性維持培地については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　工程（３－２）において、多能性幹細胞の生存率を高めるために工程（３－１）と同様のＲＯＣＫ阻害剤を添加してもよい。好適なＲＯＣＫ阻害剤の種類や濃度は前述と同様である。

　工程（３－２）においては、後述する工程（３－３）における分化誘導効率を高めるのに好適のため、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上となるまで培養することが好ましく、２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上がより好ましく、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が更に好ましく、７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上が最も好ましい。また、培地の栄養を保ち工程（３－３）における細胞の生存率を高めるのに好適のため、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が５．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下で工程（３－３）に進むことが好ましく、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下がより好ましく、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が更に好ましく、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下が最も好ましい。

　（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数を上記範囲内とするためには、工程（３－２）において１～４８時間の培養を行うことが好ましく、６～３６時間がより好ましく、１２～３６時間が更に好ましく、１８～３０時間が最も好ましい。

　工程（３－２）で形成された胚様体の形状は適宜設定可能であるが、例えば、球、楕円体、多面体、並びに不定形の平面及び／又は曲面からなる閉じた形状等を挙げることができる。後述する工程（３－３）における分化誘導効率を高めるのに好適のため、工程（３－２）で形成された胚様体の形状は、球状又は半球状であることが好ましい。胚様体の形状は、細胞培養基材の（Ａ）領域の形状（島状の形状）により制御することができる。

　球に近い形状（例えば、球状、半球状）の胚様体を製造するのに好適であることから、島状の形状として、円又は楕円、多角形が好ましく、円又は楕円、長方形がさらに好ましく、円、楕円又は正方形が特に好ましく、円又は楕円が最も好ましい。

　また、球に近い形状（例えば、球状、半球状）の胚様体を製造するのに好適であることから、島状の形状のアスペクト比としては５以下が好ましく、２以下がさらに好ましく、１．５以下が特に好ましく、１．１以下が最も好ましい。ここで、本明細書において「アスペクト比」とは、形状の最大径（長径）と最小径（短径）の比である長径／短径を示す。

　工程（３－３）は、工程（３－２）で形成された胚様体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下で、細胞培養基材の培養面上に接着した状態で培養し、分化誘導して内胚葉系細胞の凝集体を形成する工程である。

　分化誘導因子としては、例えば、ＴＧＦ－β阻害剤、ＡＴＰ競合阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤が挙げられる。分化誘導因子は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

　内胚葉系細胞への分化誘導効率を高めるのに好適のため、工程（３－３）における分化誘導因子が、内胚葉分化誘導因子を含有することが好ましい。上記内胚葉分化誘導因子としては、分化誘導効率を高めるのに好適のため、Ｗｎｔタンパク質、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子及びアクチビンからなる群より選択される少なくとも１種の分化誘導因子であることが好ましく、特にＷｎｔ３ａ、ＢＭＰ４、ＩＧＦＩ及びアクチビンＡのいずれかを含有することがより好ましい。

　また、上記分化誘導因子の培地への添加濃度については特に限定されないが、分化誘導効率を高めるのに好適のため、好ましくは１０００～５００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは５００～１００ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である。

　上記分化誘導因子を含む培地は、充分に分化誘導が進行するために、培養中は２４時ごとに交換することが好ましい。２４時間以内に培地を交換することで、培地中の分化誘導因子が不足することを防ぎ、均一に全ての細胞を分化させることができる。

　工程（３－３）で形成された内胚葉系細胞が有する内胚葉マーカーとしては、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＮＫＸ２．１、ＡＦＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＳＴ、ＩＳＬ１、ＩＰＦ１、ＩＡＰＰ、ＰＡＸ４、ＴＡＴが好ましく、ＳＯＸ１７が最も好ましい。

　工程（３－３）では、胚様体を、細胞培養基材の培養面上に接着した状態で培養する。工程（３－２）で形成された胚様体を細胞培養基材の培養面上に接着した状態で分化誘導することにより、前述した分化誘導因子の濃度勾配による影響が少ないため、均一に分化進行することが期待される。工程（３－３）で用いる培地は特に限定はされないが、例えば、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２等の基礎培地に内胚葉分化誘導因子及び培養サプリメントを添加した培養培地が挙げられる。

　工程（３－３）で胚様体から分化誘導する細胞の種類としては、内胚葉系細胞であること以外に特に限定はないが、例えば、甲状腺細胞、尿路系細胞が好ましく、再生医療や創薬への利用に適していることから、胃上皮細胞、肝臓細胞、膵臓細胞及び腸上皮細胞がより好ましい。

　上記腸上皮細胞は、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞及び腸上皮幹細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞を有するのが好ましく、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞及び腸上皮幹細胞を全て含むことがより好ましい。腸上皮細胞は特有のマーカーを有する。例えば、腸細胞マーカーとしてＣＤＸ２、吸収上皮細胞マーカーとしてＶＩＬ１、胚細胞マーカーとしてＭＵＣ２、腸管内分泌細胞マーカーとしてＣＧＡ、パネート細胞マーカーとしてＤＥＦＡ６、腸上皮幹細胞マーカーとしてＬＧＲ５が挙げられる。

　工程（３－３）で得られる内胚葉系細胞の凝集体の形状は、通常、工程（３－２）で形成される胚様体の形状と同じである。凝集体の形状として具体的には、例えば、球に近い形状（例えば、球状、半球状）が挙げられる。

＜三胚葉系細胞の分化誘導キット＞
　下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材を備える、三胚葉系細胞への分化誘導キットは、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片からなる群より選択される単一又は複数の物質（基質）を更に備えていてよく、分化誘導因子を含有する培地（分化誘導培地）を更に備えていてよく、基質及び分化誘導培地を更に備えていてもよい。
　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域
　（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域

　上記キットを分化誘導に使用する前に、下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材に、上述の基質を含む組成物を、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、基質の総量が１～１００μｇ／ｃｍ^２となるように添加することが想定される。

　マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン及びそれらの断片については、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞と同様である。

　「三胚葉系細胞」とは、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞及び内胚葉系細胞の総称である。分化誘導キットとともに用いられる分化誘導因子又は分化誘導キットが備える分化誘導因子を使い分けることによって、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞及び内胚葉系細胞のいずれかを分化誘導することができる。

　外胚葉系細胞の分化誘導を目的とする場合、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞で例示した外胚葉誘導因子を、＜外胚葉系細胞の分化誘導方法＞で例示した培地への添加濃度で用いることができる。中胚葉系細胞の分化誘導を目的とする場合、＜中胚葉系細胞の分化誘導方法＞で例示した中胚葉誘導因子を、＜中胚葉系細胞の分化誘導方法＞で例示した培地への添加濃度で用いることができる。内胚葉系細胞の分化誘導を目的とする場合、＜内胚葉系細胞の分化誘導方法＞で例示した内胚葉分化誘導因子を、＜内胚葉系細胞の分化誘導方法＞で例示した培地への添加濃度で用いることができる。

　以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明に係る外胚葉系細胞の分化誘導方法について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜胚葉体（胚様体）の径及びアスペクト比＞
　倒立型位相差顕微鏡（オリンパス（株）製、型番：ＩＸ７３）及びデジタルカメラ（オリンパス（株）製、型番：ＤＰ７３）を用いて胚葉体（胚様体）を経時的に観察し、長軸・短軸長さを測定した。求めた長軸及び短軸長さより、アスペクト比（長軸／短軸）を算出して胚葉体（胚様体）形態の評価に用いた。なお、本発明における実施例では円状のパターンを形成しており、アスペクト比は理論上１．０となる。

［実施例１］
　＜分化誘導培地等の組成＞
分化誘導培地１：８０％ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（富士フィルム和光純薬（株））、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ＸｅｎｏＦｒｅｅ（サーモフィッシャー製）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（シグマ・アルドリッチ製）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール（シグマ・アルドリッチ製）、４ｎｇ／ｍＬ　塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、３μＭ　ＳＢ４３１５４２（富士フィルム和光純薬（株）製）、３μＭ　ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（シグマ・アルドリッチ製）、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社製）分化誘導培地２：９８％　ＫＢＭ神経幹細胞培養用無血清培地（富士フィルム和光純薬（株））、２％　Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ　リコンビナントヒト由来ＬＩＦ（ｈＬＩＦ、メルク（株）製）、２μＭ　ＳＢ４３１５４２、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、２μＭ　レチノイン酸（シグマ・アルドリッチ製）、１μＭ　Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（メルク（株）製）　分化誘導培地３：９８％　ＫＢＭ神経幹細胞培養用無血清培地、２％　Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ　ｈＬＩＦ、２μＭ　ＳＢ４３１５４２、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、２μＭ　レチノイン酸、１μＭ　Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、５μＭ　ＤＡＰＴ（“分化１６日目”より添加、シグマ・アルドリッチ製）　細胞剥離液：ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ製）と０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の１：１混合物膜透過処理液：０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（富士フィルム和光純薬（株））、１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（－）（富士フィルム和光純薬（株））溶液ブロッキング液、抗体希釈液、及びフローサイトメトリー解析用バッファー：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）溶液
　［実施例１］
＜多能性幹細胞凝集体の作製＞
　直径３５ｍｍの親水性高分子を表面に被覆したディッシュ（住友ベークライト（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を直径０．２ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスク（三谷マイクロニクス（株）製）で覆い、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名：プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてメタルマスク上部からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行うことで、細胞接着性及び細胞増殖性の領域を有する細胞培養基材を作製した。

　前記パターニングした細胞培養基材に未分化性維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を３９００個／ｃｍ^２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（（株）ニッピ製）を２．５μＬ／ｍＬの濃度で加えた。３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。位相差顕微鏡観察により、細胞培養基材上に接着した複数の半球状の細胞凝集体を確認した。

　＜胚葉体（胚様体）の作製＞
細胞播種から２４時間後、分化誘導培地１を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、分化誘導を開始した。図３は、実施例１における細胞培養基材上の胚葉体（胚様体）の位相差顕微鏡写真である。なお、分化誘導培地１を添加した時点を“分化０日目”とした。その後、“分化５日目”まで培養２４時間おきに分化誘導培地１を交換した。また、培地交換時に位相差顕微鏡を用いて胚葉体（胚様体）の長軸・短軸を前記手順にしたがって計測し、メタルマスクの孔サイズである直径０．２ｍｍの胚葉体（胚様体）を均一に形成していることを確認した。図４は、実施例１における胚葉体（胚様体）の直径とアスペクト比の経時的変化を示すグラフである。図４の縦軸（左）は、胚葉体の直径（μｍ）を示し、縦軸（右）はアスペクト比（形状の最大径（長径）と最小径（短径）の比である長径／短径）を示し、横軸は分化０日目から分化５日目までの日数を示す。なお、図４において中央部とは、ディッシュ内の細胞接着面の中心を含む部分を意味し、外縁部とは、ディッシュ内の、細胞接着面とディッシュ側面との境界を含む部分を意味する。図４からわかるように、分化５日目までアスペクト比は１．０を維持しており、胚葉体（胚様体）の形状も均一であることから、胚葉体（胚様体）を構成する細胞の分化進行が同期していることが示唆された。

　＜外胚葉系細胞凝集体の作製＞
“分化５日目”まで分化誘導させた後、ディッシュから分化誘導培地１を除去し、分化誘導培地２を２．０ｍＬ／ディッシュ加えた。その後、“分化１２日目”まで培養４８時間おきに分化誘導培地２を交換した。“分化１０日目”において、基材表面から胚葉体（胚様体）が遊離する様子が観察された。“分化１２日目”において、ディッシュ内の分化誘導培地２を除去し、分化誘導培地３を２．０ｍＬ／ディッシュ加えた。その後、“分化１９日目”まで培養４８時間おきに分化誘導培地３を交換した。

　＜胚葉体（胚様体）の細胞数計測＞
“分化５日目”において、ディッシュ内の分化誘導培地１を除去し、ＰＢＳ（－）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、洗浄した。洗浄後、ディッシュに細胞剥離液を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で３分間静置させた。所定時間静置させた後に、細胞剥離液を除去し、Ｙ－２７６３２（濃度１０μＭ）を含む分化誘導培地１を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて基材上から胚葉体（胚様体）を剥離及び分散させた。得られた細胞懸濁液を回収し、Ｌｕｎａ自動細胞計数装置（ロゴスバイオシステムズ製）を用いて細胞数を計測した。

　＜外胚葉系細胞凝集体の細胞数計測＞
“分化１９日目”において、ディッシュ内の分化誘導培地３を除去し、ＰＢＳ（－）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、洗浄した。洗浄後、ディッシュに細胞剥離液を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で３分間静置させた。所定時間静置させた後に、細胞剥離液を除去し、Ｙ－２７６３２（濃度１０μＭ）を含む分化誘導培地１を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて基材上から胚葉体（胚様体）を剥離及び分散させた。得られた細胞懸濁液を回収し、Ｌｕｎａ自動細胞計数装置（ロゴスバイオシステムズ製）を用いて細胞数を計測した。

　＜フローサイトメトリー解析＞
　三胚葉体（胚様体）、神経幹細胞及び神経細胞への分化誘導を評価するために、外胚葉マーカー（ＰＡＸ６）、内胚葉マーカー（ＦＯＸＡ２）、中胚葉マーカー（ＴＢＸ１）、神経幹細胞マーカー（ＳＯＸ１）、神経細胞マーカー（ＮＣＡＭ１及びＴＵＢＢ３）について評価した。細胞数計測で回収した“分化５日目”及び“分化１９日目”の細胞を、１．５ｍＬサンプルチューブにそれぞれ１．０×１０^５個／チューブ分取した。４％パラホルムアルデヒド（富士フィルム和光純薬（株）製）を０．５ｍＬ／チューブ加え、分散せた後に室温で２０分間静置して固定化処理を行った。固定化処理後、遠心分離（室温、８００×ｇ、５分）を行い、上澄み液を除去しＰＢＳ（－）を０．５ｍＬ／チューブ加え洗浄した。洗浄操作は３回繰り返した。洗浄後、膜透過処理液を０．５ｍＬ／チューブ加え、分散させた後に室温で１５分間静置して膜透過処理を行った。膜透過処理後、遠心分離を行い、上澄み液を除去しＰＢＳ（－）を０．５ｍＬ／チューブ加え洗浄した。

　洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）を０．５ｍＬ／チューブ加え、分散させた後に室温で１時間静置しブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、遠心分離を行い、上澄み液を除去しＰＢＳ（－）を０．５ｍＬ／チューブ加え洗浄した。洗浄後、希釈した抗体溶液を０．１ｍＬ／チューブ加え、分散した後に室温及び遮光下で１時間反応させた。反応後、遠心分離を行い、染色液を除去しＰＢＳ（－）を０．５ｍＬ／チューブ加え洗浄した。前記抗体反応で蛍光標識されていない抗体を使用した場合は、続けて希釈した蛍光標識２次抗体を０．１ｍＬ／チューブ加え、分散させた後に室温及び遮光下で１時間反応させた。反応後、遠心分離を行い、染色液を除去しＰＢＳ（－）を０．５ｍＬ／チューブ加え洗浄した。洗浄後、抗体希釈液を０．５ｍＬ／チューブ加え、分散させたサンプルをフローサイトメーター（日本ベクトンデッキンソン（株）製、商品名：ＢＤ　Ａｃｃｕｒｉ　Ｃ６　Ｐｌｕｓ）によって解析した。

　“分化誘導５日目”の細胞のフローサイトメトリー解析結果を表１に、“分化誘導１９日目”における細胞のフローサイトメトリー解析結果を表２にそれぞれ示す。“分化誘導５日目”において、２０．０％の細胞が外胚葉マーカーであるＰＡＸ６を有し、また、２６．３％の細胞が中胚葉マーカーであるＴＢＸ１、２８．３％の細胞が内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２、２０．８％の細胞が内胚葉マーカーであるＳＯＸ１を有しており、胚葉体（胚様体）様構造体の作製を確認した。また、“分化誘導１９日目”において、１１．４％の細胞が神経細胞マーカーであるＮＣＡＭ１及び４６．９％の細胞が神経細胞マーカーであるＴＵＢＢ３を有していることを確認し、神経細胞への分化誘導効率に優れることを確認した。

　［比較例１：細胞培養基材上における未分化性維持培養］
　実施例１における培地として、分化誘導培地１～３の代わりに、未分化性維持培地ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を使用し、その他はすべて実施例１と同条件で培養を行い、６日間（実施例１における“分化誘導５日目”まで）培養を行った。培養２日目（実施例における“分化誘導１日目”）では、実施例１で確認された胚葉体（胚様体）外縁部の仮足伸展が確認されず、未分化性維持に働いていることが確認された。

　［比較例２：細胞培養用ポリスチレン基材上における分化誘導］
＜多能性幹細胞凝集体の作製、及び胚葉体（胚様体）の作製＞
　市販の培養基材（Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ処理ポリスチレン、ｅｐｐｅｍｄｏｒｆ社製）、を用いて、実施例１に記載の方法にしたがって胚葉体（胚様体）を作製した。形成された構造体の形態は、全体的に鋭角な形状を示し、大きさも不均一であった（図６）。

　＜外胚葉系細胞凝集体の作製＞
　前記胚葉体（胚様体）を、実施例１に記載の方法にしたがって外胚葉系細胞凝集体へ分化誘導させた。“分化７～１０日目”で、１００％コンフルエントに達したことを確認し、“分化１６日目”では培地交換時に胚葉体（胚様体）がシート状に剥離する現象が確認された（図６）。
＜フローサイトメトリー解析＞
実施例１に記載の方法にしたがってフローサイトメトリー解析を実施した。“分化誘導５日目”の細胞のフローサイトメトリー解析結果を表１に、“分化誘導１９日目”における細胞のフローサイトメトリー解析結果を表２にそれぞれ示す。“分化誘導１９日目”において、神経細胞マーカーであるＮＣＡＭ１を有している細胞は１０．６％、ＴＵＢＢ３を有している細胞は２６．１％であり、神経細胞への分化誘導効率に劣ることが確認された。

　［比較例３：細胞培養用ポリスチレン基材上における未分化性維持培養］
実施例１における分化誘導操作を全て行わず、実施例１の播種で使用したヒトｉＰＳ細胞をそのまま、実施例１と同様の方法にてフローサイトメトリー解析した。

　以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明に係る中胚葉系細胞の分化誘導方法について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜胚葉体（胚様体）の撮像＞
　倒立型位相差顕微鏡（オリンパス（株）製、型番：ＩＸ７３）及びデジタルカメラ（オリンパス（株）製、型番：ＤＰ７３）を用いて胚葉体（胚様体）を観察した。
＜分化誘導培地等の組成＞
　分化誘導培地１：ＳＴＥＭｄｉｆｆ　Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｍｅｓｏｄｅｒｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）細胞剥離液：ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）と０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の１：１混合物
［実施例２］
＜多能性幹細胞凝集体の作製＞
　直径３５ｍｍの親水性高分子を表面に被覆したディッシュ（住友ベークライト（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を直径０．
２ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスク（ミタニマイクロニクス（株）製）で覆い、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてメタルマスク上部からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行うことで、細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域（Ａ）を有する細胞培養基材を作製した。

　前記細胞培養基材に未分化性維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を３９００個／ｃｍ^２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（（株）ニッピ製）を２．５μＬ／ｍＬの濃度で加えた。３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。位相差顕微鏡観察により、細胞培養基材上に接着した複数の円形の胚葉体（胚様体）を確認した（図８）。
＜中胚葉系細胞凝集体の作製＞
　細胞播種から２４時間後、分化誘導培地１を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、分化誘導を開始した。なお、分化誘導培地１を添加した時点を“分化０日目”とした。その後、“分化６日目”まで培養２４時間おきに分化誘導培地１を交換した。
＜中胚葉系細胞凝集体の細胞数計測＞
　“分化６日目”において、ディッシュ内の分化誘導培地１を除去し、ＰＢＳ（－）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、洗浄した。洗浄後、ディッシュに細胞剥離液を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で５分間静置させた。所定時間静置させた後に、細胞剥離液を除去し、分化誘導培地１を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて基材上から胚葉体（胚様体）を剥離及び分散させた。得られた細胞懸濁液を回収し、Ｌｕｎａ自動細胞計数装置（ロゴスバイオシステムズ製）を用いて細胞数を計測した。
＜遺伝子発現解析＞
　中胚葉系細胞への分化誘導を評価するために、中胚葉マーカー（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）、未分化マーカー（ＮＡＮＯＧ）について評価した。細胞数計測で回収した“分化６日目”の細胞を、１．５ｍＬサンプルチューブにそれぞれ１．０×１０^６個／チューブ分取した。遠心分離（室温、８００×ｇ、５分）を行い、上澄み液を除去した。ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔ４　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで測定し、１μｇ／６μＬになるようにＲＮａｓｅ―ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ（タカラバイオ（株）製）で濃度調製した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡（株）製）を使用した。１μＬの５倍希釈ｃＤＮＡ（逆転写産物の１／１００に相当）について下記表３の遺伝子配列（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ：配列番号４、ＮＡＮＯＧ：配列番号２、ＧＡＰＤＨ：配列番号３）を有するオリゴｄＴプライマー（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ　ＤＮＡ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）およびＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡（株）製）を用いてリアルタイムＰＣＲ解析をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）で解析した。

　“分化誘導６日目”の細胞の遺伝子発現解析結果を図１０、１１に示す。図１０の縦軸はＧＡＰＤＨに対するＢＲＡＣＨＹＵＲＹの相対遺伝子発現量を示し、図１１の縦軸はＧＡＰＤＨに対するＮＡＮＯＧの相対遺伝子発現量を示す。いずれのグラフも、横軸は実施例２、比較例４又は比較例５である。図１０，１１から、“分化誘導６日目”において、胚葉体（胚様体）様構造体の作製を確認し、細胞が未分化マーカーであるＮＡＮＯＧを失い、中胚葉マーカーであるＢＲＡＣＨＹＵＲＹを有することを確認した。また、細胞をパターニングすることで、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹの発現量が増大したことから、パターニングでの接着培養が有意に分化を進行させることを確認した。

［比較例４：細胞培養用ポリスチレン基材上における分化誘導］
＜多能性幹細胞凝集体の単層培養＞
　市販の培養基材（Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ処理ポリスチレン、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に未分化性維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を５０００個／ｃｍ^２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（（株）ニッピ製）を２．５μＬ／ｍＬの濃度で加えた。３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。
＜中胚葉系分化誘導＞
　前記単層培養した細胞に対して分化培地１を用いて、６日間中胚葉系細胞へ分化誘導させた。図９（左図）は、分化誘導６日目の様子である。図９からわかるように、細胞は基材全体に接着し、球形状の胚様体を形成しなかった。
＜遺伝子発現解析＞
　実施例２に記載の方法にしたがって遺伝子発現解析を実施した。
［比較例５：細胞培養用ポリスチレン基材上における未分化維持培養］
＜多能性幹細胞凝集体の作製、及び胚葉体（胚様体）の作製＞
　実施例２と同等の基材を用いて、実施例２に記載の方法にしたがって胚葉体（胚様体）を作製した。
＜未分化維持培養＞
　前記胚葉体（胚様体）に対して、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎを用いて６日間未分化維持培養させた。図９（右図）は、未分化維持培養６日目の様子である。
＜遺伝子発現解析＞
　実施例２に記載の方法にしたがって遺伝子発現解析を実施した。

　以下、実施例に基づいて本発明に係る内胚葉系細胞の分化誘導方法をより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。

＜（Ａ）領域の面積の測定＞
　レーザー顕微鏡（キーエンス（株）製、製品名ＶＫ－Ｘ２００）を用いて、細胞培養基材の表面の画像を取得した。得られた画像を使用して、解析ソフト（ＶＫ－Ｘ　Ｖｉｅｗｅｒ）上で２０点の（Ａ）領域の面積を求め、それらの面積を平均して（Ａ）領域の面積とした。

＜細胞、及び細胞の凝集体の撮像＞
　倒立型位相差顕微鏡（オリンパス（株）製、型番：ＩＸ７３）、デジタルカメラ（オリンパス（株）製、型番：ＤＰ７３）を用いて、細胞、及び細胞の凝集体の位相差顕微鏡画像及び傾向顕微鏡画像を撮像した。

＜分化誘導培地等の組成＞
　分化誘導培地１：ＳＴＥＭｄｉｆｆ　Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　Ｍｅｓｏｄｅｒｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）
　分化誘導培地２：８５％　ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）、１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ＸｅｎｏＦｒｅｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸（シグマ・アルドリッチ製）、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａ　Ｍａｘ－Ｉ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）、２０ｎｇ／ｍＬ　塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＰＥＰＲＯ　ＴＥＣＨ製）、５０μｇ／ｍＬ　Ｌ（＋）－アスコルビン酸（富士フィルム和光純薬（株））、１０ｎｇ／ｍＬ　ヘレグリン－β－１（富士フィルム和光純薬（株））、２００ｎｇ／ｍＬ　Ｌｏｎｇ（Ｒ）Ｒ３ＩＧＦ－Ｉ（シグマ・アルドリッチ製）、１％　ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（×１００）（富士フィルム和光純薬（株））
　細胞剥離液：ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）と０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の１：１混合物

［実施例３］
　図１２は、培養方法の概要を示す図である。図１は、細胞培養基材の模式図（断面図）である。以下、必要に応じて図１及び図１２を参照しながら説明する。

＜多能性幹細胞の凝集体の作製＞
　親水性高分子で表面を被覆した直径３５ｍｍのディッシュ（住友ベークライト（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を直径０．２ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスク（ミタニマイクロニクス（株）製）で覆い、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてメタルマスク上部からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行うことで、プラズマ処理した部分に細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域（（Ａ）領域）を形成した。また、メタルマスクでマスクした部分（プラズマ処理していない部分）に（Ｂ）領域を形成した。得られた細胞培養基材の概略は、図１の模式図に示すとおりである。すなわち、図１に示す細胞培養基材３０は、親水性高分子２０で基材２１の表面が被覆され、更にプラズマ処理した部分では、親水性高分子２０が分解されて、Ａで示す（Ａ）領域が形成されている。またプラズマ処理していない部分では、親水性高分子２０がそのまま残っており、Ｂで示す（Ｂ）領域が形成されている。これを細胞培養基材として用いた。

　上記細胞培養基材に未分化性維持培地（図１２中、符号１０で示す。）であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を３９００個／ｃｍ^２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（ラミニンフラグメント溶液、（株）ニッピ製）を、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、１．５μｇ／ｃｍ^２となるように加えた（図１２に示す工程（３－１））。図１２の工程（３－１）に示すとおり、播種したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（図１２中、符号１で示す。）は、Ａで示す（Ａ）領域に接着し、Ｂで示す（Ｂ）領域には接着しない。次いで、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞の播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。位相差顕微鏡観察により、細胞培養基材上に接着した複数の円形の胚様体（図１２中、符号３で示す。）を確認した（図１２に示す工程（３－２））。

＜内胚葉系細胞の凝集体の作製＞
　細胞の播種から２４時間後、分化誘導培地１（図１２中、符号１１で示す。）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、分化誘導を開始した。なお、分化誘導培地１を添加した時点を“分化０日目”とした。その後、“分化６日目”まで培養２４時間おきに分化誘導培地１を交換した（図１２に示す工程（３－３））。“分化６日目”に内胚葉系細胞の凝集体（図１２中、符号７で示す。）が得られた（図１３）。

＜内胚葉系細胞の凝集体の細胞数計測＞
　“分化６日目”において、ディッシュ内の分化誘導培地１を除去し、ＰＢＳ（－）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、洗浄した。洗浄後、ディッシュに細胞剥離液を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で５分間静置させた。静置後、細胞剥離液を除去し、分化誘導培地１を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ製）を用いて細胞培養基材から内胚葉系細胞の凝集体を剥離し、細胞を分散させた。得られた細胞懸濁液を回収し、Ｌｕｎａ自動細胞計数装置（ロゴスバイオシステムズ製）を用いて細胞数を計測した。

＜遺伝子発現解析＞
　内胚葉系細胞への分化誘導を評価するために、ハウスキーピング遺伝子マーカー（ＧＡＰＤＨ）、未分化マーカー（ＮＡＮＯＧ）、内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７）を採用し、未分化マーカー及び内胚葉マーカーのｍＲＮＡの相対発現レベルを定量した。細胞数計測で回収した“分化６日目”の細胞を１．５ｍＬサンプルチューブに１．０×１０^６個／チューブ分取した。遠心分離（室温、８００×ｇ、５分）を行い、上澄み液を除去した。ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔ４　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで測定し、１μｇ／６μＬになるようにＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ（タカラバイオ（株）製）で濃度調製した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡（株）製）を使用した。１μＬの５倍希釈ｃＤＮＡ（逆転写産物の１／１００に相当）に対して、オリゴｄＴプライマー、下記表４に示す塩基配列を有するプライマー（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ　ＤＮＡ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）及びＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡（株）製）を用いてリアルタイムＰＣＲ解析をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）で解析した。

　図１５は、未分化マーカー（ＮＡＮＯＧ）及び内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７）の遺伝子発現量の評価結果を示すグラフである。図１５の縦軸は、ＧＡＰＤＨに対するＮＡＮＯＧ又はＳＯＸ１７の相対遺伝子発現量を示し、横軸は、実施例３、比較例６又は比較例７である。実施例３では、胚様体の形成が確認され、また、図１５から、“分化誘導６日目”の細胞における遺伝子発現量の評価の結果、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７の発現を確認した。

［比較例６：細胞培養用ポリスチレン基材上における分化誘導］
＜多能性幹細胞の凝集体の単層培養＞
　市販の細胞培養基材（Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ処理ポリスチレン、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に未分化性維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を３９００個／ｃｍ^２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（ラミニンフラグメント溶液、（株）ニッピ製）を、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、１．５μｇ／ｃｍ^２の濃度で加えた。３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞の播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。

＜内胚葉系細胞への分化誘導＞
　このように単層培養した細胞に対して、分化誘導培地１を添加し、６日間内胚葉系細胞への分化誘導を行った。図１４（左図）に、分化誘導６日目の様子を示す。図１４（左図）からわかるように、細胞はアグリゲーションを起した。

＜遺伝子発現解析＞
　実施例３に記載の方法にしたがって遺伝子発現解析を実施した。結果は図１５に示す。比較例６では、遺伝子発現量の評価の結果、内胚葉マーカーの発現は確認されず、未分化マーカーのみの発現を確認した。

［比較例７：細胞培養用ポリスチレン基材上における未分化維持培養］
＜多能性幹細胞の凝集体の作製＞
　実施例３と同等の基材を用いて、実施例３に記載の方法にしたがって胚様体を作製した。

＜未分化維持培養＞
　得られた胚様体に対して、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎを添加して６日間未分化維持培養させた。図１４（右図）に、分化誘導６日目の様子を示す。

＜遺伝子発現解析＞
　実施例３に記載の方法にしたがって遺伝子発現解析を実施した。結果は図１５に示す。比較例７では、遺伝子発現量の評価の結果、内胚葉マーカーの発現は確認されず、未分化マーカーのみの発現を確認した。

［実施例４］
＜多能性幹細胞の凝集体の作製＞
　親水性高分子で表面を被覆した直径３５ｍｍのディッシュ（住友ベークライト（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を直径０．８ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスク（ミタニマイクロニクス（株）製）で覆い、実施例３と同様の条件でプラズマ処理を行い、細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域（（Ａ）領域）及び（Ｂ）領域を形成した。これを細胞培養基材として用いた。

　得られた細胞培養基材にＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を２４０００個／ｃｍ^２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（ラミニンフラグメント溶液、（株）ニッピ製）を、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、１．５μｇ／ｃｍ^２となるように加え、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞の播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。位相差顕微鏡観察により、細胞培養基材上に接着した複数の円形の胚様体を確認した。

＜多能性幹細胞の腸上皮細胞への分化誘導＞
　細胞播種から２４時間後、分化誘導培地２を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、分化誘導を開始した。なお、分化誘導培地２を添加した時点を“分化０日目”とした。その後、“分化６４日目”まで培養７２時間おきに分化誘導培地２を交換した。図１６は、分化誘導した細胞を経時的に撮影した位相差顕微鏡写真である。なお、スケールバーは２００μｍを示す。図１６に示すとおり、分化０日目から６４日目まで細胞培養基材に接着させた状態で細胞培養が可能であることを確認した。

＜免疫染色解析＞
　腸上皮細胞への分化を評価するために、吸収上皮細胞マーカー（ＶＩＬＬＩＮ）を採用し、蛍光標識抗体としてＶｉｌｌｉｎ　Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（１μｇ／μＬ，Ｂｉｏｓｓ製）を使用した。分化６４日目の培養細胞に対して４％パラホルムアルデヒド（富士フィルム和光純薬（株）製）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、室温で２０分間静置して固定化処理を行った。固定化処理後、溶液をすべて除去し、ＰＢＳ（－）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え洗浄した。洗浄操作は３回繰り返した。洗浄後、膜透過処理液を０．５ｍＬ／ディッシュ加え、分散させた後に室温で１５分間静置して膜透過処理を行った。膜透過処理後、溶液を除去しＰＢＳ（－）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え洗浄した。洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、室温で１時間静置しブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、溶液を除去しＰＢＳ（－）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え洗浄した。洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）にて２００倍希釈した抗体溶液を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、分散した後に室温及び遮光下で２時間反応させた（抗体量：５．０μｇ）。反応後、染色液を除去しＰＢＳ（－）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え洗浄した。洗浄後、抗体希釈液を１．０ｍＬ／ディッシュ加えたサンプルを蛍光顕微鏡で撮像した。取得した蛍光画像を図１７に示す。図１７は、分化誘導した細胞（分化６４日目）の位相差顕微鏡写真及び免疫染色後の蛍光顕微鏡写真である。図１７には、後述する実施例５で分化誘導した細胞の位相差顕微鏡写真及び免疫染色後の蛍光顕微鏡写真も示す。なお、スケールバーは２００μｍを示す。分化誘導を６４日間実施した細胞からは吸収上皮細胞マーカーのＶＩＬＬＩＮの陽性を示した。すなわち、細胞を細胞培養基材に接着させた状態で、多能性幹細胞の腸上皮細胞への分化誘導が可能であることを確認した。

［実施例５］
　直径０．８ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスクに代えて、直径１．５ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクを使用したこと以外は実施例４と同様にして細胞培養基材を作製した。また得られた細胞培養基材を使用して、実施例４と同様にして多能性幹細胞の凝集体の作製、及び多能性幹細胞の腸上皮細胞への分化誘導を行った。

　分化誘導６４日目の細胞に対して、実施例４と同様にして免疫染色解析を実施した。その結果、実施例４と同様、分化誘導６４日目の細胞は基材との接着状態を保ったまま、吸収上皮細胞マーカーのＶＩＬＬＩＮの陽性を示した（図１７）。この結果から、（Ａ）領域の直径を１．５ｍｍに拡大しても細胞を細胞培養基材に接着させた状態で、多能性幹細胞の腸上皮細胞への分化誘導が可能であることを確認した。

［比較例８：ラミニン５１１－Ｅ８フラグメント被覆条件検討］
　実施例５と同じ細胞培養基材に未分化性維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を２４０００個／ｃｍ^２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（ラミニンフラグメント溶液、（株）ニッピ製）を、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、０．９μｇ／ｃｍ^２となるように加えた。３７℃、ＣＯ_２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞の播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。細胞の播種をした日を“培養０日目”とし、２４時間後を“培養１日目”として、細胞の様子を位相差顕微鏡で撮像した。

　図１８は、比較例８及び実施例４において分化誘導した細胞の位相差顕微鏡写真である。なお、スケールバーは２００μｍを示す。ラミニンフラグメント（ラミニン５１１－Ｅ８）を、細胞培養基材の培養面の面積を基準として、０．９μｇ／ｃｍ^２の条件で被覆した比較例８の細胞培養基材では、播種直後には多能性幹細胞の接着が見られたが、２４時間後には細胞の接着領域からの細胞剥離を確認した。比較例８の被覆条件では、細胞を細胞培養基材に接着維持させた状態での培養が困難であることを確認した。

［比較例９：ビトロネクチンを用いた被覆条件検討］
　実施例５と同じ細胞培養基材に１％　Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ溶液（Ｇｉｂｃｏ製）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、１時間２５℃下で静置した。１時間後１％ＶＴＮ－Ｎ溶液を除去し、未分化性維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、さらにヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を２４０００個／ｃｍ^２となるように加え、実施例４と同様にして分化誘導培養を実施した。分化誘導５５日目の細胞の様子（位相差顕微鏡写真）を図１９に示す。分化誘導５５日目において、細胞培養基材から細胞が剥離していることを確認した。比較例９の培養条件では、分化誘導中の細胞を細胞培養基材に接着維持させることができないことを確認した。

　Ａ…（Ａ）領域（細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域）、Ｂ…（Ｂ）領域（細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域）、１…多能性幹細胞、２…多能性幹細胞凝集体、３…胚様体、４…外胚葉系細胞凝集体、５…神経細胞凝集体、６：中胚葉系細胞凝集体、７…内胚葉系細胞の凝集体、１０…未分化性維持培地、１１…分化誘導培地１、１２…分化誘導培地２、１３…分化誘導培地３、２０…親水性高分子、２１…基材、３０…細胞培養基材。

Claims

　多能性幹細胞から外胚葉系細胞を分化誘導する方法であり、以下の（１－１）～（１－４）工程を含むことを特徴とする、分化誘導方法。（１－１）下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び多能性幹細胞の播種を行う工程。（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。（１－２）前記（１－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した多能性幹細胞凝集体を形成する工程。（１－３）前記（１－２）工程で形成された多能性幹細胞凝集体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、胚葉体（胚様体）を形成する工程。（１－４）前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、外胚葉系細胞凝集体を形成する工程。
　前記細胞培養基材が親水性高分子による層を表面に含有し、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理、コロナ放電処理のいずれか、またはこれらの組み合わせによって前記親水性高分子による層の一部を分解又は改質した領域であることを特徴とする、請求項１に記載の分化誘導方法。
　前記（１－３）工程における分化誘導因子が、外胚葉誘導因子、中胚葉誘導因子及び内胚葉誘導因子を含有することを特徴とする、請求項１または２に記載の分化誘導方法。
　前記（１－４）工程で形成された外胚葉系細胞凝集体が、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１を有していることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　外胚葉系細胞が、神経幹細胞又は神経細胞であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　外胚葉系細胞が、運動神経細胞であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　多能性幹細胞から外胚葉系細胞に分化誘導された細胞の製造方法であり、以下の（１－１）～（１－４）工程を含むことを特徴とする、細胞の製造方法。（１－１）下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び多能性幹細胞の播種を行う工程。（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。（１－２）前記（１－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した多能性幹細胞凝集体を形成する工程。（１－３）前記（１－２）工程で形成された多能性幹細胞凝集体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、胚葉体（胚様体）を形成する工程。（１－４）前記（１－３）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、外胚葉系細胞凝集体を形成する工程。
　多能性幹細胞から中胚葉系細胞を分化誘導する方法であり、以下の（２－１）～（２－３）工程を含むことを特徴とする、分化誘導方法。（２－１）下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材上に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群より選択される単一又は複数の物質の被覆、及び、多能性幹細胞の播種を行う工程。
　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域。
　（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域。（２－２）前記（２－１）工程で播種された多能性幹細胞を未分化性維持培地の存在下、フィーダーフリーで接着培養し、細胞培養基材上に接着した胚葉体（胚様体）を形成する工程。（２－３）前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）を、分化誘導因子を含有する培地の存在下、細胞培養基材上に接着した状態で培養し、中胚葉系細胞凝集体を形成する工程。
　前記細胞培養基材が親水性高分子を含む層を表面に有し、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理及び／又はコロナ放電処理によって前記親水性高分子を含む層を分解又は改質した領域であることを特徴とする請求項８に記載の分化誘導方法。
　前記（２－１）工程の細胞播種密度が、１．０×１０^２～１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であることを特徴とする、請求項８又は請求項９に記載の分化誘導方法。
　前記（２－２）工程において、（Ａ）領域の単位面積当たりの細胞数が１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上となるまで胚葉体（胚様体）を培養することを特徴とする、請求項８～請求項１０のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）の形状が、島状であることを特徴とする、請求項８～請求項１１のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　前記（２－３）工程における分化誘導因子が、中胚葉誘導因子を含有することを特徴とする、請求項８～請求項１２のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　中胚葉誘導因子が、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎおよびアクチビンからなる群より選択される単一又は複数の分化誘導因子であることを特徴とする、請求項１３に記載の分化誘導方法。
　前記（２－２）工程で形成された胚葉体（胚様体）が、中胚葉マーカーを有していることを特徴とする、請求項８～請求項１４のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　多能性幹細胞の内胚葉系細胞への分化誘導方法であって、
　（３－１）下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材に、ラミニン及びその断片から選択される少なくとも１種を含む組成物を、前記細胞培養基材の培養面の面積を基準として、ラミニン及びその断片の総量が１～１００μｇ／ｃｍ^２となるように添加すること、及び多能性幹細胞を播種することを実施する工程、
　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域
　（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域
　（３－２）工程（３－１）で播種された多能性幹細胞を、未分化性維持培地の存在下で、フィーダーフリーで接着培養し、前記細胞培養基材の培養面上に接着した胚様体を形成する工程、及び
　（３－３）工程（３－２）で形成された胚様体を、分化誘導因子を含有する培地の存在下で、細胞培養基材の培養面上に接着した状態で培養し、分化誘導して内胚葉系細胞の凝集体を形成する工程
を含む、方法。
　工程（３－３）で分化誘導した内胚葉系細胞が、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７を発現している、請求項１６に記載の分化誘導方法。
　工程（３－３）で分化誘導した内胚葉系細胞が、腸上皮細胞である、請求項１６又は１７に記載の分化誘導方法。
　工程（３－３）で分化誘導した腸上皮細胞が、吸収上皮細胞マーカーであるＶＩＬ１を有する、請求項１８に記載の分化誘導方法。
　前記細胞培養基材が、親水性高分子を含有する層を表面に有し、
　前記（Ａ）領域が、プラズマ処理、紫外線処理及びコロナ放電処理からなる群より選択される少なくとも１種の処理により、前記親水性高分子を含有する層の一部を分解又は改質した領域である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　工程（３－１）において、多能性幹細胞を播種する際の細胞密度が、前記細胞培養基材の培養面の面積を基準として、１．０×１０^２～５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　前記凝集体の形状が、半球状である、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　前記分化誘導因子が、ＴＧＦ－β阻害剤、ＡＴＰ競合阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
　下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有する細胞培養基材を備える、三胚葉系細胞への分化誘導キット。
　（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ^２の島状の領域
　（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域