JP5784266B2 - 規定細胞培養表面及び使用方法 - Google Patents

Description

本発明は規定細胞培養表面に関するものである。より詳細には、本願発明は胚性幹細胞やその他の成体幹細胞の規定培養表面における培養方法および材料を提供する。

一般的にヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は無限の自己再生と多能性を維持するため、基質や培養液を要する。ｈＥＳ細胞の培養のための最も一般的な基質は、不活性化繊維芽のフィーダー細胞の単層で、該細胞は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で被覆した組織培養（ＴＣ）用ポリスチレン表面、またはＴＣ培養容器、例えばＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭで被覆したＴＣ培養容器上にて培養される。

Ｊ．Ｂｉｏｍｅｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．，５：１−１１（１９９３） Ｋｌｅｉｎｍａｎ ｅｔ．ａｌ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｉ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）Ｓｐｏｎ Ｒｏｂｅｒｔｓ

これらの基質は、いずれもその規定が十分ではなく、高度の実験結果のバラツキを生じさせる。ｈＥＳ細胞は、発生生物学および創薬に関する知見を増大させる上で際立った潜在的な意味合いを有し、将来の臨床応用に重要な役割を果たすことができると考えられることから、規定培養表面上でこれらの細胞の培養条件を特定することが重要である。

本発明の一態様として、以下に含まれる該細胞培養基質が提供される。すなわち、薄膜を有する細胞培養表面（その薄膜には、１種若しくはそれ以上のプラズマ重合したモノマーが含まれる）および薄膜被覆面上のコーティングであって、該コーティング溶液は、１種以上の細胞外マトリックス蛋白質と水性溶媒を含む（該コーティング溶液中のコーティング濃度は約１ｎｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである。）

本発明のその他の態様として、細胞培養基質を調製する方法を提供し、以下の工程を含む。すなわち、細胞培養表面を提供する工程と、プラズマ重合して前記表面に薄膜覆表面を形成する工程（プラズマ重合は１種若しくはそれ以上のモノマーを利用する）と、前記薄膜被覆表面にコーティング溶液を導入することによって細胞培養基質を形成する工程とを含む。該コーティング溶液には、１種若しくはそれ以上の細胞外マトリックス蛋白質と水性溶液が含まれ、前記コーティング溶液中の細胞外マトリックス蛋白質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬである。

本発明の他の態様として、幹細胞の培養方法を提供し、以下の工程を含む。すなわち、細胞培養基質を提供する工程と、幹細胞の懸濁液を細胞培養基質に塗布する工程と、幹細胞の懸濁液を細胞培養基質上で５％ＣＯ_２ 湿潤下、３７℃にて培養する工程と、幹細胞を細胞培養基質に接着させる工程とを含む。該接着細胞の大部分は、未分化の状態を示すが、未分化の場合には、特定の分化因子を用いて分化誘導する工程を含む（例として実施例１０）。

本発明に従えば、細胞培養基質を幹細胞の分化の回避に役立つ良好な接着性を有利に提供できる。

多様な基質上に播種されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）のコロニー接着のクリスタルバイオレットによる染色結果の比較を示す。すなわち、細胞外マトリックス蛋白質で被覆、組織培養（ＴＣ）処理されたポリスチレンプレート上での比較である。具体的には、Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ 細胞外基質蛋白質複合体の混合（図１Ａ）、ヒトフィブロネクチンで被覆されたＴＣ用ポリスチレンプレート（図１Ｂ）、及びヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート上で増殖培地を用いた結果（図１Ｃ）の比較を示す図である。 ｈＥＳ細胞コロニーの選択した基質上における典型的な形態の比較を示す。すなわち、細胞外マトリックス（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ ^ＴＭ等）で被覆したＴＣプレート（図２Ａ）及びヒトフィブロネクチンで被覆したプラズマ重合プレート上にて１８回代継代したもの（図２Ｂ）を示す。 未分化ｈＥＳ（Ｈ９株）細胞核内におけるＯＣＴ−３／４マーカー蛋白を発現する免疫細胞染化学色像を示す。細胞は、ヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート上（図３Ｂ）、および細胞外マトリックス蛋白質（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ ^ＴＭ等）で被覆されたＴＣプレート上（陽性対照、図３Ａ）において、増殖培地を用いて培養した。 ヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート上、及び細胞外マトリックス（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ ^ＴＭ等）被覆ＴＣプレート上（陽性対照）において増殖した細胞の未分化ｈＥＳ細胞特異的マーカー蛋白質の発現の定量的蛍光標示式細胞分取器。（ＦＡＣＳ）による解析結果を示す。 ヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート上、および細胞外マトリックス蛋白質（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ ^ＴＭ等）で被覆されたＴＣプレート上（陽性対照）において培養したｈＥＳ細胞由来胚様体における生殖細胞系列特異的マーカー遺伝子の発現の定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）解析を示す。 ｈＥＳ細胞由来の分化細胞における生殖細胞系列特異的マーカー蛋白質の発現の免疫細胞化学染色解析を示す。 コーティング中のｈＦＮ濃度のプレート上のグラフ表示と図式表示を示す。図７Ａは、異なるヒトフィブロネクチン濃度で被覆されたプラズマ重合プレートとＴＣプレート上における結合ヒトフィブロネクチン量の比較を示す。抗ヒトフィブロネクチン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって検出された。図７Ｂは、ヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート上にて、３日間培養後のｈＥＳ細胞（Ｈ９株）のクリスタルバイオレット染色像を示す。 組織培養プレート上において、血清を含むヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）培養液と（図８Ａ）、ヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート上で、無血清ＭＳＣ培地中（図８Ｂ）で培養したヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の接着性と増殖の比較を示す。 ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）の脂肪細胞への分化能の比較を示す。５継代経過のＭＳＣを無被覆組織培養プレート（図９Ａ）あるいは、ヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート（図９Ｂ）上に播種し、脂質生成培地を用いて分化を誘導した。組織培養プレート上に播種された細胞は、血清含有培地であらかじめ培養された細胞であった。ヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレートへ播種された細胞は、無血清ＭＳＣ培地を用い、同じ表面上で培養された細胞を用いた。 神経幹細胞由来ヒトｈＥＳ細胞の組織培養プレート上、およびプラズマ重合プレート上における細胞接着性と増殖性の比較を示す。それぞれ、無被覆プレート細胞培養ＴＣプレート（図１０Ａ）、ポリオルニチン次いでラミニンで被覆されたＴＣプレート（図１０Ｂ）、プラズマ重合無被覆プレート（図１０Ｃ）、そしてヒトフィブロネクチンで被覆されたプラズマ重合プレート上に播種した細胞（図１０Ｄ）を示す。 は、神経幹細胞由来ヒトｈＥＳ細胞の、種々のＥＣＭ蛋白質で被覆化若しくは無被覆のプラズマ重合プレート上における細胞接着性と増殖性の比較を示す。 神経幹細胞由来ヒトｈＥ細胞のＭＴＳアッセイを用いた生存度を示す。

本発明は、幹細胞を未分化の状態で自己増殖性及び、生物学的多能性を長期の培養期間にわたり維持したまま増殖させるための規定培養基質を提供する。本発明の該規定培養基質は、未分化の間葉幹細胞や神経幹細胞は勿論のこと、組織培養処理表面のような標準的な培養基質と比較して、よりヒト胚性幹細胞にとって効率的な接着と増殖を促進する。ある実施態様では、ｈＥＳ細胞、ヒト骨髄由来間葉幹細胞及びｈＥＳＣ由来神経幹細胞が該規定培養面によって増殖可能となる。またある実施態様では、該規定培養表面は異種性がない。

本発明は、細胞培養表面を提供する。好ましくは、該培養表面は培養容器に画定される。該細胞培養表面は細胞培養容器又は他の構造内に備えられた培養液上に画定される。細胞培養表面の材質としては、プラスチック（例えば、ポリスチレン、アクリロニトリルーブタジエンースチレン樹脂、ポリカーボネート）、ガラス、微孔質のフィルター（例えば、セルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステルそしてポリカーボネート）、バッチ式又は連続式で細胞培養において、あるいは遺伝子工学（例えばバイオリアクター等）において用いられるバイオリアクター用材料（中空繊維チューブ又はマイクロキャリアビーズを含めてもよい。）及び、ポリエチレンテレフタレート（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））、セラミックと関連ポリマー材料を含めてもよい。上記及び他に適するいずれの材料であっても本発明に用いることができる。細胞培養表面の基質として以下のものから選択できる。すなわち、セルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルペンタン、ポリプロピレン、ポリエチレン及びこれらの組合せである。ポリメチルペンタン、ポリプロピレンとポリエチレンそしてこれらの組合せである。これらの基質は多孔質であってもよいし、無微孔質であってもよい。

説明のため、本発明において細胞培養もしくは培養容器について触れておくべきだろう。本発明は様々な細胞培養表面上で利用できることが理解されるべきである。
該細胞培養表面としては、細胞培養容器備えられた培養液上に含有された培養表面が含まれるが、これに限られない。例えばマイクロビーズ、多孔質フィルター若しくは他のフィルターや結合媒体をも含むものである。好ましくは、該培養表面はポリスチレンから形成されるものであることが望ましい。

接着培養に有用な任意の培養容器を用いることができることが意図されている。好ましくは、本発明において意図される好ましい培養容器の形状には、マルチウェルプレート（例として６ウェル、１２ウェル、２４ウェルプレート等）、培養皿（例としてペトリ皿等）、試験管、培養フラスコ、ローラーボトル、チューブ、振盪培養フラスコ及びこれらに類似するものが含まれる。

該培養表面は、プラズマ重合薄膜により被覆されている。プラズマ重合の材料は１種又はそれ以上のモノマーである。プラズマ重合に有用なモノマーは、オレフィン性アミン、ハロゲン化オレフィン、オレフィン性カルボン酸、カルボキシレート、 オレフィン性ニトリル化合物、酸化オレフィン及びオレフィン性炭化水素のような不飽和有機化合物が含まれる。ある実施態様としては、オレフィンとしてビニル及びアリル型オレフィンを含む。ある実施態様としては例えばシクロヘキサン及びシクロペンタントシクロプロパンを用いることができる。

当業者が認識認めるように、様々なプラズマ重合技術を用いることによって、１種又はそれ以上のモノマーを細胞培養表面上に供給することができる。陽電荷の帯電重合薄膜を表面上に堆積させるのが好ましい。当業者によって理解されるように、プラズマ重合表面は、そこに使われる蛋白質に依存して陰電荷に帯電させることができる。好ましくは、アミンがポリマーのモノマー源として用いられている。ある実施態様では、プラズマ源を用いてガス放電を起こし、これがガス性モノマーの重合の開始に必要なエネルギーを供給することによって、モノマーのプラズマ重合が行われ、培養容器上に薄いポリマー薄膜を堆積させる。環状化合物を用いることもでき、それにはグロー放電法による気体プラズマも含めることができる。例えば１，２−ジアミノシクロヘキサンのような環状化合物誘導体も気体プラズマ中でよく重合に用いられる。

とりわけ、ヒドロキシル基、アミン基又はカルボン酸基のプラズマ重合モノマーが好ましい。アクリル酸、メタアクリル酸、酢酸、ビニル酢酸（重合可能なカルボン酸を含むビニルモノマーを含むがこれに限定されない。）からなるカルボン酸含有モノマーの群からポリマー薄膜を得ることができる。典型的なアミンモノマーの例には、２０炭素原子（より典型例は２〜８炭素原子）までの完全飽和や不飽和のアミン化合物が含まれる。エチレン性不飽和化合物（特に１級、２級又は３級アミン）には、アリルアミン、メチルアミン、プロピルアミン、ヘプチルアミン及びジアミノプロパン等の飽和モノマーが含まれる。それらのうちでもとりわけ、アリルアミンやジアミノプロパンを用いた場合、良好な結果を得ることができた。

重合可能な２種類のモノマーの混合物を用いることができる。加えて、重合可能なモノマーは、それ自体重合できないと考えられる他の気体、例えば、アルゴン、窒素や水素と混合することもできる。

本発明の一態様として、該ポリマーにはアミン（コポリマー体、２種又はそれ以上の重合）が含まれる。該コポリマーは有機アミンを飽和（アルカン）や不飽和（アルケン、ジエン又はアルキン）炭化水素とプラズマ重合することによって調製される。炭化水素は炭素数２０まで（より通常は４〜８個）である。アルカンの例として、ブタン、ペンタンやヘキサンがある。アルケンと例として、ブタンやペンタンがある。ジエンの例としては１−７オクタジエンがある。コモノマーとして芳香環を有するもの、例えばスチレン等を用いることもできる。

プラズマ重合は、任意のアミン：炭化水素構成比の２つの成分の共重合によっても行うことができる。プラズマ共重合に好ましいアミン：炭化水素構成比は、アミン：炭化水素比、１００（アミン）：０（炭化水素）〜２０（アミン）：８０（炭化水素）これらの両端の間の任意の比をとることができる。

コーティング組成物は、細胞培養表面上にプラズマ重合薄膜コーティングを堆積させることによって、コーティング組成物を有する表面上に固定化される。該コーティング組成物は、１種類又はそれ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質や水性溶媒を含んでもよい。「細胞外マトリックス」の用語は当業者に周知である。その構成成分は、１種類又はそれ以上の、以下に記載する蛋白質を含むものである。すなわち、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テナシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゲラチン、コラーゲン、フィブリン、メロシン、アンカリン、コンドロネクチン、リンク蛋白質、骨シアロ酸蛋白質、オステロカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンジュリン、エピリグリンおよびカリニンである。その他の細胞外マトリックス蛋白質については、本明細書に組込まれる非特許文献１に記載されている。「細胞外マトリックス」の用語は、将来発見され得る現在未知の細胞外マトリックス蛋白質を含むことを意図する。細胞外マトリックスとしての類推解析は、当業者にとって容易に推定可能なためである。

本発明のある態様として、該コーティング組成物の総蛋白質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬとできる。ある好ましい実施態様としては、該コーティング組成物の総蛋白質濃度は、約１μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬである。さらに好ましい態様では、該コーティング組成物の総蛋白質濃度は、約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬである。

該コーティングに有用な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質は、天然由来であってもよく、ヒト若しくは動物の組織から精製したものでもよい。あるいは該ＥＣＭ蛋白質は遺伝子工学による組換蛋白質又は本来の合成品でもよい。該ＥＣＭ蛋白質は全蛋白質でもよく、ペプチド断片であってもよい。コーティングに有用となる得るＥＣＭ蛋白質コーティングの一例としては、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンやビトロネクチンがある。

本発明のある実施態様では、該コーティング組成物としては異種蛋白質を含まず、ヒト由来の蛋白質のみ用いる。これはある研究用には望ましいであろう。

本発明のある実施態様では、該コーティング組成物としてフィブロネクチンの合成ペプチド断片又は組換型フィブロネクチンを含む。

さらに本発明のある実施態様では、該コーティング組成物として少なくともフィブロネクチントとビトロネクチンの混合物を含む。

本発明の他の実施態様では、該コーティング組成物としてラミニンを含む。

該コーティング組成物を調製する場合に有益な水性溶媒は、水でも緩衝液でもよく、例としてリン酸緩衝塩溶液、特にダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）、又は細胞培養液がある。本発明のある実施態様として、ＤＭＥＭ、ＫＯ／ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩやその他の当業者間で周知な細胞培養液が、該コーティング溶液の調製の際の水性溶媒として適切である。水性溶媒の希釈用として、いずれの細胞培養液をも用いることができ、それらは胎生細胞培養と両立し得る条件を与え、好ましくは、インビトロにおいて特定の細胞形態に分化させるまで、自己増殖や未分化状態に維持するものである。このような培地は商業的に入手可能であり、例えば、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）又はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等から入手できる。

該コーティング組成物は、単一タイプの細胞外マトリックス蛋白質を含むことが望ましい。本発明のある好ましい実施態様として、該コーティング組成物はフィブロネクチン（特に幹細胞培養用）を含む。たとえば、適切なコーティング組成物は、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．ｏｆ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ社によって販売されている希釈ヒトフィブロネクチンＮＪ（ＢＤ）（Ｃａｔ＃３５４００８）を、ダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）で約５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬを用いて希釈することによって調製できる。

本発明のその他の態様としては、該コーティング組成物は好ましくはラミニンを含む。例としてのラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔ＃Ｌ６２７４，Ｌ２０２０）をダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）を用いて約５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬに希釈することによって調製できる。

ある実施態様としては、該コーティング組成物は、約７．０〜約８．５の範囲のｐＨを有する。該ｐＨは、該組成物を約７．０〜約８．５のｐＨの範囲内に維持できる任意の緩衝成分を用いて維持できる。このｐＨ範囲に緩衝能を持つ可能性のある緩衝液としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、（１，３−ビス［トリス（ハイドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ハイドロキシエチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ハイドロキシル）ピペラジン−Ｎ’−（−４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、Ｎ−［−（２−ハイドロキシエチル）］１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリノ）ブタンスルホン酸（ＭＯＢＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ハイドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３−（Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ハイドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、Ｎ−エチルモルホリン、ジメチルロイシルグリシン、５，５−ジエチルバルビテート及び２アミノ，２メチル１，３プロパンジオール。

本発明における培養システムの調製に用いるコーティング組成物には、種々の構成成分を含むことができ、これらは、該コーティング中において、増殖因子の細胞への接近能に影響を及ぼし得る種々の、そして／あるいは細胞接着を助け、そして／あるいは該コーティング中における蛋白質の構造に影響しうる。このような構成成分には塩、希釈剤、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含むが、これらに限定されるものではない。

前記基質のコーティング中には、より広範に多様な他の材料を含むことができる。これらには、細胞、抗体、酵素、受容体、増殖因子、細胞外マトリックスの付加的成分、サイトカイン、ホルモンや薬剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、細胞外マトリックス蛋白質はこれらの材料に結合しうる。このような生理活性物質には、存在するのであれば、培養細胞の性質や挙動を加減、制御するために容易に入手しうる。

本発明は、安定ですぐに使用可能な細胞培養システムを調製する方法を提供する。本方法には、プラズマ重合薄膜で被覆された細胞培養表面に細胞外マトリックスを塗布する工程が含まれ、該コーティング組成物中の総蛋白質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬである。本発明にはまた、これらの被覆された容器上において、ある期間にわたり該コーティング組成物中の蛋白質を固定化する工程を含み、過剰量のコーティング組成物を該薄膜被覆プレートから除去する工程をも含む。

該コーティング組成物は、一般的には以下の容量で被覆に用いられる。すなわち、６ウェルマルチウェルプレートでは、約０．５〜約２．０ｍＬ塗布することができ、１２あるいは２４ウェルマルチウェルプレートでは、約０．２５〜約１．０ｍＬ塗布することができ、９６ウェルマルチウェルプレートでは、約５０μＬ〜約１００μＬ添加することができ、３５ｍｍ培養皿では約
０．５ｍＬ〜約２．０ｍＬ塗布することができ、６０ｍｍ培養皿では約０．５ｍＬ〜約４．０ｍＬ塗布することができ、１００ｍｍ培養皿では約２．０ｍＬ〜約１２．０ｍＬ塗布することができ、Ｔ２５培養フラスコ（細胞接着面積が２５ｃｍ^２）では約０．５ｍＬ〜約４．０ｍＬ塗布することができ、Ｔ７５培養フラスコ（細胞接着面積が７５ｃｍ^２）では約２．０ｍＬ〜約１２．０ｍＬ塗布することができ、Ｔ１７５培養フラスコ（細胞接着面積が１７５ｃｍ^２）では約５．０ｍＬ〜約２５．０ｍＬ塗布することができる。

塗布後、該コーティング組成物は薄膜被覆コーティング上に維持され、該組成物中の細胞外マトリックス蛋白質は、プラズマ重合プレートへ吸着されるようにする。該コーティング組成物は、未制御の環境下でも（例えば室温）あるいは制御された環境下（暖冷房下）でも維持できる。具体的には、被覆プラズマ重合プレートは約２２℃〜約３７℃の温度でインンキュベートされ、約３０分〜約４時間、該蛋白質を基質表面に吸着させることが望ましい。若しくは被覆プラズマ重合プレートは４℃で、使用前に一晩から２週間インキュベートすることもできる。過剰量のコーティング組成物は細胞培養のための使用直前に被覆基質から除去することで、未吸着の蛋白質を含有する溶液を除く。

本発明における培養システムは、胚性幹細胞（ＥＳ）、葉質、神経幹細胞を含む多様な用途に用いることができる。好ましい実施態様では、異種物質のない規定細胞培養基質が、未分化ＥＳ細胞細及び生体幹細胞の自己増殖能及び多能性を長期間、維持するのに有用となる。

ある実施態様では、ＥＳ細胞、詳細にはヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞は、本発明による細胞培養容器を用いて培養してもよい。例えば、ｈＥＳ細胞は以下の細胞株、すなわち、Ｈ１、Ｈ９やＨ１４等を含むが、これに限定されるものではない。これらの細胞株は、例えば、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から入手可能である。

本発明の細胞培養表面は、細胞の培養に用いることができる。本方法は胚性幹細胞を培養する工程及び、プラズマ重合面を有する培養容器を含む細胞培養システムを供給する工程と、そしてコーティング組成物を該プラズマ重合面上に被覆する工程を含むことができる。該コーティング組成物は、細胞外マトリックス蛋白質の混合物や、水性溶媒を含み、該コーティング組成物中の総蛋白質濃度は約１ｎｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬである。該培養方法はまた、胚性幹細胞の懸濁液を培養系に添加する工程と、該胚性幹細胞を５％ＣＯ_２、３７℃の湿潤空気条件下においてインキュベートして、胚性幹細の増殖のため未分化のコロニーを調製する工程とを含むことができる。

さらなる実施態様として、培養液を細胞培養に用いることができる。該細胞培養液は、基本培養液及び、幹細胞の該細胞培養基質への接着を助ける添加物を含むものであってもよい。ある実施態様においては、ＴｅＳＲ^ＴＭ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のような培養液を含むものであってもよい。しかしながら、本方法は前記培養液に限られるものではないことを指摘する。

ある実施態様では、成体幹細胞（これは間葉幹細胞でもよい）、本発明によって培養することができる。例えば、間葉幹細胞には、Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（登録商標） ヒト間葉幹細胞のような骨髄由来を含めることができるが、これに限定されない。これらの細胞は、例えば、
Ｌｏｎｚａ （Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手することができる。

さらなる実施態様として、成体幹細胞の培養に用いる該培養液は、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標） ＭＳＣ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）のような無血清培養液でもよい。しかしながら、前記培養液に限られるものではないことを指摘する。

その他の実施態様として、ｈＥＳ細胞由来神経幹細胞を、本発明によって培養することもできる。

更なる実施態様として、ｈＥＳ細胞由来神経幹細胞の培養に用いる該培養液は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＧｌｕｔａｍａｘ、Ｎ２、Ｂ２７、ｂＦＧＦやペニシリン／ストレプトマイシンを添加した無血清培養液でもよい。

本発明における培養系は、細胞研究において多様な阻害剤や刺激剤の有効性を決定するために用いることができる。刺激剤には当該技術分野において、周知な増殖因子を含めることができる。例えば、１種類またはそれ以上の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ ＡＡ、ＰＤＧＦ ＢＢ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、β−内皮細胞増殖因子、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８ そしてＦＧＦ９）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−Ｐ１、ＴＧＦβ１．２、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５）、骨形成因子（ＢＭＰ）（例えばＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えばＶＥＧＦ、胎盤増殖因子）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）（例えば、ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ベタセルリン、ヘパリン結合ＥＧＦ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えばＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−ＧＭ、ＣＳＦ−Ｍ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、幹細胞因子、肝細胞増殖因子及び毛様体神経栄養因子を含むことができる。付加的な増殖因子について、非特許文献２に記載されており、これは本明細書に関連文献として組み込まれている。ここで「増殖因子」の用語は将来発見される未知の増殖因子を含むものとする。なぜならば、これらの性質は当業者によってすぐさま決定され得るべきものであるからである。

本発明の実施態様として、培養液に血清を添加することができる。しかし、無血清のほうが好ましい。培養液はあらかじめ繊維芽フィーダー層細胞に暴露することによって調整済みのもの（すなわち、フィーダー調製済み培養液）を用いることができる。適切な無血清培養液であるｍＴｅＳＲ^ＴＭ１が、ヒト胚性幹細胞を培養するためにＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手できる。骨髄由来間葉幹細胞の培養のための適切な無血清培養液であるＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ＭＳＣ ＳＦＭ がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手できる。

調製方法
本発明は安全で、使用準備済みの細胞培養基質を調製する方法を提供する。本方法の細胞培養容器のプラズマ重合された薄膜被膜表面に、細胞外マトリックスコーテイング溶液を塗布する工程を含む。該工程において、該コーティング溶液中の総蛋白質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬである。また、該方法は、コーティング溶液を薄膜被覆表面上に維持、もってコーティング溶液から基質表面上に蛋白質を固定する工程、及び過剰量のコーティング溶液を基質から除去する工程をも含む。ある態様では、１種又はそれ以上のコーティング溶液をプラズマ重合薄膜被覆表面に添加することができる。

あるコーティング溶液の実施形態において、同一又は異なるＥＣＭ蛋白質を用いたコーティング溶液を逐次塗布することができる。コーティング塗布工程間に任意選択的に洗浄過程を設けることもできる。また、ある実施形態では、洗浄工程には基質を蒸留水、緩衝塩溶液（例えばＰＢＳ）または培養液にて洗浄する工程含めることができる。またその他の実施態様では、ブロッキング溶液を用いることも可能である。

コーティング溶液（細胞外マトリックス成分を含む）を、細胞培養容器（例えばフラスコや細胞培養プレート等）のような薄膜被覆細胞培養表面の少なくとも一面上に、充分な温度及び／又は時間維持することによって、細胞外マトリックス蛋白質を該被覆表面に吸着させることができる。例えば、該被覆細胞培養容器を室温で約１時間〜４時間維持して、吸着させることができる。あるいは該容器は、４℃にてある一定時間（例えば４時間〜２週間）でインキュベートすることもできる。被覆基質は約２２℃から約３７℃にて、約３０分から約４時間の時間、インキュベートして、蛋白質を該基質表面に吸着させることもできる。どんな過剰量の被覆溶液も、その後、除去（例えば吸引により）し、該被覆基質は水性溶媒（例えば水、緩衝液、脱イオン蒸留水、培養液）にて洗浄し、未結合の蛋白質を除去することができる。上記ブロッキング溶液を用いることによって、被覆基質の安定性を高めることができる。

該コーティング溶液を塗布後、任意選択して滅菌処理することもできる。一つの実施態様として、装置はＵＶ光を用いて滅菌する。

ある実施態様では、細胞培養基質は、コーティング溶液を薄膜被覆表面に塗布後、即座に凍結することもできる。凍結細胞培養基質は、−２０℃にて最長３ヶ月間保存することもでき、次いで使用直前に解凍することができる。例えば、ＥＣＭ蛋白質であるラミニンをコーティング溶液として塗布し、前述にように凍結保存することができる。

以下の例は説明上の実例であって、いずれにせよ、本発明の実施態様や用途はこれに限定することを意図するものではない。

化学的規定プラズマ重合表面のＥＣＭコーティング

化学的規定プラズマ重合培養容器（１２又は６マルチウェルプレート構成）を種々の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質で被覆した。個々のＥＣＭ蛋白質の混合物は、ダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）、又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液にて希釈して、添加し（６ウェルプレートではウェルあたり１ｍＬそして１２あるいは２４ウェルプレートではウェルあたり０．５ｍＬ）、室温または３７℃にて２時間、該プレートを被覆した。ｈＥＳ細胞培養実験の前に直前にコーティング溶液を除去した。以下に記載のＥＣＭを実験に用いた。すなわち、ＥＣＭとしてはヒトフィブロネクチンを含むが、これに限定されるものではない。これらはヒトラミニン、ヒトヴィトロネクチン、ヒトコラーゲンＩＶ、ＢＤＭａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ−ｈＥＳマトリックス、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標） Ｆ Ｐｌｕｓ、Ｓｉｇｍａ社製フィブロネクチン様組換え蛋白質高分子、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ−ＵＳＡ社製のヒトフィブロネクチンの別の組換え断片であるレトロネクチン等を含む。

プラズマ重合６ウェルプレート［ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １（アミン及び陽電荷帯電表面を含む、Ｃａｔ＃３５９２９６）やＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ ２（カルボキシル基及び陰電荷帯電表面を含む、）Ｃａｔ＃３５９２９７］は、化学的に規定されており、これらを種々の動物質を含まないＥＣＭによってコーティングされた。プラズマ重合２４ウェルプレート（ＢＤ ＰｕｒｅＣｏａｔ ａｍｉｎｅ、プラズマ重合陽電荷帯電表面、Ｃａｔ＃３５４７２３又は３５６７２３）は、化学的に規定されており、これらも種々のヒト及び動物由来のＥＣＭによってコーティングされた。

コーティング溶液は、単独のＥＣＭ又はＥＣＭ混合物をダルベッコのリン酸緩衝塩溶液で希釈し、最終濃度５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬとすることで調製した。

該コーティング溶液を、６ウェルプレートでは、ウェルあたり１ｍＬ又は１２ウェルプレートでは、ウェルあたり０．５ｍＬ添加した。該コーティング溶液はプラズマ重合プレート上で室温にて２時間又は４℃にて一晩インキュベートした。

被覆溶液はｈＥＳ細胞の培養実験に使用する直前に除去した。

ＥＣＭ被覆プラズマ重合表面上におけるヒト胚性幹細胞の培養
ＥＣＭ被覆プラズマ重合表面上のｈＥＳ細胞培養

陽性対照プレート（すなわちＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ−ｈＥＳＣ用マトリックス被覆されＴｅＳＲ^ＴＭ培養液中、６ウェルプレート上で培養するｈＥＳＣ細胞）からＨ１、Ｈ９やＨ１４（ ＷｉＣｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）をまずプラズマ重合プレート（ＥＣＭ存在又は非存在下）に播種して培養した。

陽性対照プレート上の細胞は、ディスパーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を用いて３７℃、５分間処理し、その後ＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地にて４回迅速に洗浄し、次いで機械的に切離し細胞小集塊にした。ｍＴｅＳＲ^ＴＭ１培養液中、プラスチック製ピペット又はピペット先端を用いて、ｍＴｅＳＲ^ＴＭ１培養液中に再懸濁させた細胞集塊は１：３又は１：６の分割比で、試験培養表面上に播種し５％ＣＯ_２ 湿潤空気中、３７℃にて播種した。培養液は毎日交換し、細胞は最初の４〜６日おきに典型的には解離させた。

重合化ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上における解離
ＢＤ ヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上のｈＥＳ細胞は、継代培養若しくは長期維持のため、定期的にＴｒｙＰＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて１：２（ｖ：ｖ）に希釈）にて解離させた。迅速に使用済みの培養液を除去し、細胞をＤＭＥＭ／

Ｆ１２培養液を用いて１回すすぎ、希釈したＴｒｙＰＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（ウェルあたり１ｍＬ）を用いて室温にて２分間処理した。解離溶液は、その後、迅速に除去し、細胞は３回ＤＭＷＭ／Ｆ１２にて立続けに素早く洗浄した。ｍＴｅＳＲ^ＴＭ１培養液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をその後、処理済の細胞に添加し、コロニーを５ｍＬプラスチックピペット又はピペット先端を用いて機械的に小集塊に切り離した。解離及び平板培養は前述のように行った。

ｈＥＳ細胞コロニー接着性アッセイ
種々のＥＣＭ蛋白質を用いて被覆処理したプラズマ重合表面上へのｈＥＳ細胞の接着性を比較した。

ｈＥＳ細胞は、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温、約２０分で間固定し、その後、ダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）を用いて５分間ずつ２回洗浄した。細胞はその後、クリスタルバイオレット染色液（ＤＰＢＳを用いて１：１０に希釈）にて５分間染色後、ＤＰＢＳにて１回洗浄した。固定化されクリスタルバイオレットで染色された細胞を含むプレートは、レーザー走査装置を用いて走査し、ウェル中の接着性コロニーを可視化した

（図１）。図１Ａは、ｈＥＳＣ細胞用ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭで被覆された（ＴＣ）処理ポリスチレンプレート、図１Ｂは、ＢＤヒトフィブロネクチンで処理されたＴＣプレートであり、図１Ｃは、ＢＤヒトフィブロネクチンで処理されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート（Ｃａｔ＃３５９２９６）上で、ＴｅＳＲ^ＴＭ１培養液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で培養されたものである。

コロニーの接着性や細胞の形態は、位相差顕微鏡を用いて定期的に観察した。図２Ａと図２Ｂに明示されているように、ｈＥＳ細胞（Ｈ９株）を、ＢＤヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート（Ｃａｔ＃３５９２９６）上で増殖させ、１８回継代培養した（図２Ｂ）

フィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上の細胞の形態は、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ 陽性対照基質上、すなわち、ｈＥＳＣマトリックスで被覆処理されたＴＣプレートにおいて増殖したｈＥＳ細胞と近似していた（図２Ａ）。ｈＥＳ細胞は、これらいずれの基質上で培養されたとき、大部分の細胞は未分化の状態を維持した。

結論
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（Ｈ９株）を、ｈＥＳ細胞用ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ、またはヒトフィブロネクチンで被覆された組織培養（ＴＣ）処理ポリスチレンプレート上及び、ヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １上に播種した。細胞は、ＴｅＳＲ^ＴＭ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）培養液を用いて４日間培養し、固定化及び、クリスタルバイオレット染色した。各表面に対する相対細胞接着性を図１に示した。図からわかるように、ヒトフィブロネクチンで被覆したＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １のコロニーの接着性（図１Ｃ）は、陽性対照基質（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ ｈＥＳＣ用マトリックス、図１Ａ）に匹敵するものであった。しかしながら、ヒトフィブロネクチンで被覆したＴＣ表面は、ｍＴｅＳＲ^ＴＭ１培養液中においてのｈＥＳ細胞コロニー検出できるほどの接着性や増殖性を裏付けるものではなかった（図１Ｂ）。 ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １上及びＴＣプレート上において、種々のタイプのヒトフィブロネクチン蛋白質コーティング存在下のｈＥＳ細胞のコロニーの接着性の結果を以下に示す。

コロニー接着指標
０：接着なし
１：低（１から１０）
２：中程度（１０から２０）
３：高（概して２０超コロニーで陽性対照に匹敵する程度）
陽性対照はＴＣ表面Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ−ｈＥＳＣであらかじめコーティング

培養表面は、接着コロニーの概数、コロニー内における細胞形態（すなわち密集集団と単一細胞の対比）、増殖速度及び自発的分化の頻度をもとに陽性対照に匹敵すると評価した。

プラズマ重合ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １上及び、ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ ２プレートにおいて、種々のＥＣＭ蛋白質コーティングの有無によるｈＥＳ細胞のコロニーの接着性の結果を以下に示す。

コロニー接着指標
０：コロニー接着なし
１：低（１から１０）
２：中程度（１０から２０）
３：高（概して２０コロニー超）

培養表面は、接着コロニーの概数、コロニー内における細胞形態（すなわち密集集団と単一細胞の対比）、増殖速度及び自発的分化の頻度をもとに陽性対照に匹敵すると評価した。

未分化３−ｈＥＳＣの特性評価
形態学的解析（図２）は、ｈＥＳ細胞が、ＢＤヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート（Ｃａｔ＃３５９２９６）上において、ＴｅＳＲＴＭ１培養液を用いて培養された場合、大部分は未分化の状態を保ち、陽性対照基質（ｈＥＳ細胞基質であるＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭｈＥＳＣ用マトリックスで被覆処理された ＴＣプレート）の場合に匹敵することを明らかにする。

ＢＤヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上において、
ＴｅＳＲＴＭ１培養液を用いて培養された細胞の未分化マーカーであるＯＣＴ−３／４ の発現は（図３Ｂ）、陽性対照基質（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ ｈＥＳＣ用マトリックスで被覆処理されたＴＣプレート）（図３Ａ）と同程度であった。

定量的ＦＡＣＳ解析（下記実施例５に略述する手順）は、ＢＤヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤＰｒｉｍｅｘ １上で培養した１６代継代培養されたｈＥＳ細胞（Ｈ９株）についての未分化ｈＥＳ細胞のマーカー発現（ＯＣＴ−３／４及びＳＳＥＡ−４）が、陽性対照細胞（ＢＤ
Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ ｈＥＳＣ用マトリックスで被覆されたＴＣ上で培養）と同程度であることを明らかにしている。未分化マーカーの相対的発現率は下記の表３に示した。

胚様体形成による自発性分化誘導
ｈＥＳＣコロニーは、ＴｒｙＰＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて前記実施例２と同様な方法によって解離された。

解離細胞集塊は、ペトリ皿（組織培養無処理）、又は低接着性６ウェルプレート上の分化誘導培養液中、２０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地培養液に播種した。

分化誘導培養液中において培養された細胞集塊は、懸濁状態の胚様体（ＥＢｓ）を形成し、それを４−１５日間増殖した。その後、該ＥＢｓは胚葉マーカー遺伝子の発現のためのＱＲＴ−ＰＣＲ法（手順は当業者に公知）によって解析するか、あるいはゼラチンで被覆処理されたＴＣプレート上に再播種し、さらに、２０％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ培養液中で分化させ、胚葉特異的蛋白質の発現のための免疫組織化学染色を用いて解析した。

ｈＥＳＣの多能性の特徴解析
Ｈ９ ｈＥＳ細胞（ＢＤ ヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上にて１３代継代培養後の細胞）は、胚様体（ＥＢｓ）に分化した。ＥＢｓの３種の腫瘍マーカーの発現は、ＱＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した（図５）。３種の全ての胚葉マーカーであるＦｏｘＡ２（内胚葉にて発現するフォークヘッドボックスＡ２）、ＨＡＮＤ１（中胚葉における心臓及び神経堤誘導体発現１）そしてチューブリン３ ＴＵＢＢ３（外胚葉におけるチューブリンβ３）が検出された。

ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ ｈＥＳＣ用マトリックスで被覆されたＴＣプレート上で培養した細胞を陽性対照とした。ＢＤ ヒトフィブロネクチンで（対照）で被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上で培養した未分化細胞に対する胚葉マーカーの相対発現量も示されている。図に示すように、ＢＤ ヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上で培養した細胞から発生したＥＢについての３種の胚葉マーカーのすべてに顕著な発現増加が認められ、該細胞は、陽性対照と同程度である。上記データーは、フィブロネクチンコーテイングを有するＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上において培養した細胞が多能性を維持していることを示唆している。

ＥＢ形成に引続く自発性分化後の胚葉マーカー蛋白質の発現を図６に示す。ｈＥＳ細胞（Ｈ９株）は、ＢＤ ヒトフィブロネクチン被覆したＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上で３代にわたって継代培養された。細胞は１０日間でＥＢに分化し、ゼラチンで被覆されたＴＣプレートに移し、２０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ培地中にて、さらに１０日間培養した。胚葉マーカーの発現は免疫組織化学的手法にて確認した。

免疫組織化学的手法の手順
本実施例は、未分化ｈＥＳ細胞マーカーの発現のための試験に用いられた手順に関する（データーの概要は、実施例３において説明され図３において示されている。）。本手順は、６ウェルプレート上で培養した細胞のためのものである。同じ手順は、分化ｈＥＳ細胞における胚葉特異蛋白質発現の検出の際にも用いた（データー概要は実施例４に説明され、図６において示されている。）。後者の解析のため、細胞は、１２ウェルプレート上で増殖させ、ウェルあたり以下の手順で示される半分の容量を用いた。

培養されたｈＥＳ細胞は、２ｍＬのダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）で洗浄した。その後、該細胞は１ｍＬの４％パラフォルムアルデヒドを用いて２０分間、室温にて固定した。固定した細胞は、２ｍＬのＤＰＢＳにて各５分間、２回洗浄した。引き続いて、該細胞は、１ｍＬの０．１％牛血清（ＢＳＡ）と、１０％の正常ヤギ血清のＤＰＢＳ溶液にてブロッキングした。ブロッキング工程中、１％ＢＳＡと１０％正常ヤギ血清を含むＤＰＢＳ溶液を用いて、抗体希釈標準溶液を所望の最終抗体濃度に調製した。ブロッキング溶液と一次抗体希釈標準溶液の両方について、前記正常血清を宿主動物種に代替して、別の種の正常血清と置換えてもよいことを指摘する。

ブロッキング後、該細胞はウェルあたり、１ｍＬの抗体希釈標準溶液にて２時間、室温又は、２−８℃にて一晩インキュベートした。その後、細胞は１％ＢＳＡを含む２ｍＬのＤＰＢＳにて各５分間、３回洗浄した。

１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中にて二次抗体を１：２０００の割合で希釈した。使用可能な蛍光性標識二次抗体としては、Ａｌｅｘａ ４８８、又はＡｌｅｘａ ５９４にて共役化した適当な二次抗体を含が含まれる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）。該細胞をウェルあたり、１ｍＬの希釈二次抗体を用いて６０分間、室温、暗所にてインキュベートした。続いて、該細胞は、１％ＢＳＡを含む２ｍＬのＤＰＢＳにて各５分間、３回洗浄した。その後、該細胞を、２ｍＬのＤＰＢＳを用いて覆い蛍光顕微鏡を用いて可視化及び撮像した。

ＦＡＣＳ解析手順
６ウェルプレート上にて密集培養されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）（Ｈ９株）細胞を、手早くダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）を用いて洗浄し、ウェルあたり１ｍＬの０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて２−３分間、３７℃にて処理して該細胞を表面から解離させた。トリプシンはウェルあたり２ｍＬの、２０％の牛胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を添加することによって不活性化した。細胞をその後、ピペットを用いて穏やかにピペッテイングすることにより細かくし、５分間、１０００ｒｐｍの遠心操作にて沈殿させた。

細胞内抗原（例えば、ＯＣＴ−３／４）検出のため、細胞の沈殿を再懸濁し、１％パラフォルムアルデヒド（１ｍＬ／チューブ）にて３７℃、１０分間で固定した。固定化細胞は、１ウェルあたり３ｍＬの透過化処理洗浄緩衝液（ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて１回素早く洗浄した。細胞は再度、遠心操作にて沈殿させ、上清を除去し、沈殿させた細胞塊をウェルあたり、１回３ｍＬの透過化処理洗浄緩衝液にて再懸濁し、氷上にて１５分間インキュベートし、該細胞を透過処理した。透過化処理後、遠心操作によって細胞を再度細胞塊とし、１００μＬのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液にて再度懸濁し、適切な一次抗体（〜３×１０^５個の細胞につき５００ｎｇの一次抗体）を用いて検出した。インキュベーションの１時間後、細胞は３ｍＬの透過化処理洗浄緩衝液にて洗浄し、１００μＬの同じ緩衝液中に再懸濁させた。二次抗体を添加し３０分間、室温、暗所にてインキュベートした。インキュベーションに引続き、細胞は上述のように洗浄し、１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍ社製）２００μＬの含む透過化処理洗浄緩衝液にて生細胞を同定するために懸濁した。生存細胞を同定するため、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ社製）を用いて蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）解析にて生存細胞を同定した。試料ごとに３０，０００細胞（３０，０００ｅｖｅｎｔｓ）を解析し、データーは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ３．０ソフトウェアー（ＢＤ社製）にて解析した。

表面抗原（例えばＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等）については、一部例外はあるが、同様の手順にしたがった。解離後、細胞は２５％ＦＢＳを含む０．５ｍＬのＤＰＢＳにて再懸濁した。表面抗原の検出のため、固定は省略した。すべての一次抗体のインキュベーションは、２５％ＦＢＳを含むＤＰＢＳ中、氷上で一反応あたり２００ｎｇの抗体を用いて行われ、二次抗体のインキュベーションは同じ緩衝液中、暗所、室温にて３０分間で行った。その他の工程は、上記の細胞内抗原の検出と同様に行った。

フィブロネクチンＥＬＩＳＡ アッセイ
ＥＣＭで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ プレートの性能は、ヒトフィブロネクチンのＥＬＩＳＡアッセイの結果によってさらに明らかになった。例えば、フィブロネクチンＥＬＩＳＡ法、あるいはラミニンＥＬＩＳＡ法は、基質上に塗布されたＥＣＭ蛋白質の量を決定することができる。ＥＬＩＳＡアッセイは、実施例としてヒトフィブロネクチン被覆容器の性能を評価するのに用いられたが、該方法を例示によって、下記に説明する種々の濃度のヒトフィブロネクチンにより被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １及びＴＣプレートのフィブロネクチンのＥＬＩＳＡによるデーターを図７に示す。

ＥＬＩＳＡ用の一次抗体の希釈標準溶液を調製するため、１：１００（ｖ／ｖ）希釈のウサギ抗ヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．Ｆ３６４８）原液０．５ｍＬを、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）４０ｍＬに添加した。ＥＬＩＳＡ用の二次抗体の希釈標準溶液を調製するため、１：１００（ｖ／ｖ）希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．５５４０２１）原液０．４ｍＬを、０．５％ＢＳＡのＤＰＢＳ ４０ｍＬに添加した。ＥＬＩＳＡは、本発明による６ウェルのＥＣＭ被覆ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート（テストプレート）、ＢＤ−Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ ｈＥＳＣ用マトリックスで被覆されたＴＣプレート（陽性対照）または無被覆Ｆａｌｃｏｎ６ウェルプレート（ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．３５３０４６；陰性対象）を用いて行った。プレートは、まずウェルあたり２ｍＬの洗浄緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＤＰＢＳ）にて３回洗浄した。次いで、１ｍＬの０．５％ＢＳＡを含むＤＰＢＳをブロッキング溶液として添加し、室温にて１時間インキュベートした。次いでＢＳＡ溶液を除去し、プレートは上記のように洗浄緩衝液にて洗浄した。次いで、ウェルあたり１ｍＬの一次抗体希釈使用液を添加し、室温にて２時間、該プレートをインキュベートした。一次抗体希釈標準溶液を除去後、該プレートは、上記のようにして再び洗浄した。引き続き、ウェルあたり１ｍＬの二次抗体希釈標準溶液を添加し、該プレートを室温にて１時間インキュベートした。二次抗体希釈標準溶液を除去後、該プレートは再度、上記方法のようにして洗浄した。次いで、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質であるＴＭＢ（ＫＰＬ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．５３−００−０２）を添加し、８分間、青色に発色させた。引き続き、１ｍＬの反応停止液（ＫＰＬ；ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．５０−８５−０５）を添加し、混合促進のため、穏やかに振盪した。該６ウェルプレートから２００μＬの分割量を、９６ウェルプレートに移し、室温で４５０ｎｍにおける吸光度を吸光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標） Ｐｌｕｓ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。該プレートは反応停止液を添加後、５分以内に測定した。吸光度はテストプレートおよび陽性対照ＴＣプレートのウェルについて平均値を算出した。

フィブロネクチンＥＬＩＳＡ アッセイ結果
プラズマ重合ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート間において、ＴＣプレートのものと比較してフィブロネクチンの付着量に顕著な差を認めなかった（図 ７Ａ）。しかしながら、ＢＤ ヒトフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上において、ｈＥＳ細胞の接着と増殖はサポートされたが（図１Ｃ及び７Ｂ）、ＢＤ ヒトフィブロネクチンで被覆されたＴＣ表面上では至適ではなかった（図 １Ｂ）。したがって、ＥＬＩＳＡで検出されたフィブロネクチン量と、ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレートにおけるｈＥＳ細胞の接着性、増殖性との間には、明らかな相関は認められない。

ヒトフィブロネクチン濃度５〜５０μｇ／ｍＬにおいて、Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上で良好な細胞接着と増殖が認められた（図７Ｂ）。しかしながら、詳細に細胞集団の形態を検証すると、１０〜５０μｇ／ｍＬが、これらの細胞を培養する上で最適な濃度範囲であることが示唆された。

総合的にデーターからは、プラズマ重合ＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ１プレート上についての、
ｈＥＳ細胞の接着性及び増殖性に利点を与えているのは、結合するフィブロネクチンの量ではなくて、むしろこのＥＣＭ蛋白質の立体配置であることが示唆される。

ＥＣＭ被覆プラズマ重合表面上における間葉幹細胞（ＭＳＣ）の、無血清培地条件下での接着性と増殖性
骨髄由来ＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ社製）を解凍し、組織培養フラスコ中において、ＭＳＣ １０％血清を含む完全ＭＳＣ増殖培養液（ＭＳＣＧＭ^ＴＭ、Ｌｏｎｚａ社製）を用いて増殖させた。継代５代目において、細胞を０．５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにて解離し、血清を含むＭＳＣ増殖培養液を有する無被覆組織培養プレート（Ｌｏｎｚａ社製、陽性対照、図９Ａ）中、またはフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ１プレート上において、無血清ＳＴＥＭＰＲ（登録商標） ＭＳＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に播種した（図．９Ｂ）。培養５日後、細胞の形態と増殖を顕微鏡下で観察した。概して無血清培地下、ＭＳＣ培養液における細胞の接着性と増殖は乏しい。本実施例では、ＢＤ フィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １プレート上におけるＭＳＣの接着性は、陽性対照（血清を有する組織培養表面上で増殖した細胞）と同程度である。

ＥＣＭ被覆プラズマ重合表面上におけるＭＳＣの脂肪細胞への分化
脂肪生成培養手順
脂肪生成誘導培養液と、脂肪生成維持培養液はＬｏｎｚａ社から購入し、製造業者の作業手順に従った。培養液２ｍＬ中のウェルあたり、２００，０００個の間葉細胞を、血清含有増殖培養液（ＭＳＣＧＭ^TM、Ｌｏｎｚａ社製）を有する６ウェル培養プレート中に、又は無血清ＳＴＥＭＰＲ^TM ＭＳＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を有するフィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ１プレート上に播種した。細胞は５％ＣＯ_２ 湿潤環境下、３７℃にて培養した。培地は２〜３日おきに密集状態になるまで細胞上で交換した（７日間まで）。１００％密集状態となった後、３回サイクルで誘導／維持工程を繰り返し、脂肪細胞分化誘導刺激を促した。各サイクルは、脂肪細胞誘導培地を有するＭＳＣ培地を与えて３日間培養（３７℃、５％ＣＯ_２ ）し、その後、１〜３日間の脂肪細胞維持培養液中で培養する工程から成る。３回の誘導／維持工程の全サイクル終了後、ＭＳＣはさらに７日間、脂肪細胞維持培養液にて培養し、培養液は２〜３日おきに交換した。脂肪細胞への分化の程度は、顕微鏡下で視覚的に観察し、誘導細胞中の脂質胞の存在を検証した。

脂肪細胞へのＭＳＣの分化結果
フィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ１プレート上における脂質生成の程度（図９Ｂ）は、陽性対照組織培養プレート上で誘導されるものと同様であった（図９Ａ）。本実施例は、無血清培地下で、フィブロネクチンで被覆されたＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ１プレート上において培養されたＭＳＣは脂肪細胞への分化能を維持し、かつ、その分化能は陽性対象で観察されたものと同程度である。

ＥＣＭ被覆プラズマ重合表面上におけるＮＳＣ増殖性と接着性
ヒト胚性幹細胞由来神経幹細胞（ｈＮＳＣ）を、２．５ｍＭのＬ−グルタミン、１％Ｎ２、２％ Ｂ２７、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１％ ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１：１）中、ポリオルニチン、次いでラミニンで被覆した組織培養フラスコ上にて培養した。

Ｔ−７５組織培養フラスコを被覆するために、５ｍＬのポリオルニチン蒸留水溶液（２０μｇ／ｍＬ）を添加し、フラスコを平らに置き、フラスコ底面が、確実にコーティング溶液が均一に覆われるようにした。フラスコを室温にて一晩インキュベートした。２４時間後、ポリオルニチン溶液を除去し、蒸留水にて該フラスコを１回蒸留水にて一回洗浄後、５ｍＬのダルベッコのリン酸緩衝塩溶液に溶解したラミニン溶液（５μｇ／ｍＬ）を添加した。該フラスコの底面をラミニンで覆い、３７℃、２時間インキュベートした。該コーティングをｈＮＳＣ播種のために使用直前に除去した。

本実施例では、プラズマ重合ＥＣＭ被覆表面上における、ｈＮＳＣの接着性と増殖性について試験した。６ウェルの組織培養プレート及びＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ１プレートを室温、２時間にて、ＢＤヒトフィブロネクチン（２５μｇ／ｍＬ）で被覆、またはポリオルニチン（２０μｇ／ｍＬ）とラミニン溶液（５μｇ／ｍＬ）の組合せにて、上記と同様に被覆した。組織培養プレート及びＢＤ ＰｕｒｅＣｏａｔ Ａｍｉｎｅ プレート（２４ウェル）は、ポリオルニチン（２０μｇ／ｍＬ）、ラミニン（５μｇ／ｍＬ）、または、ポリオルニチン２０μｇ／ｍＬ及びラミニン（５μｇ／ｍＬ）の組合せのいずれかを用いて、上記と同様に被覆した。

図１０は、フィブロネクチンで被覆したＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ １上におけるｈＮＳＣの接着性と増殖性（図１０Ｄ）が、ポリオルニチンとラミニンの組合せを用いて被覆した組織培養表面（陽性対照、図１０Ｂ）と等価であることを示す。これに対して、無被覆の組織培養表面上、またはＢＤ Ｐｒｉｍｅｘ１プレート上におけるｈＮＳＣの接着性と増殖性は非常に低かった（それぞれ図１０Ａ 及び１０Ｃ）。

図１１は、ラミニンにより被覆（５μｇ／ｍＬ）、またはポリオルニチンとラミニンの組合せを用いて被覆したＢＤ ＰｕｒｅＣｏａｔ ＡｍｉｎｅにおけるｈＮＳＣの接着と増殖が、同じＥＣＭにより被覆した組織培養表面よりも良好であることを示す。

ＭＴＳアッセイによるＮＳＣ の生存の検出
テトラゾリウムをベースにしたアッセイを、細胞生存度の定量化に利用した。手早く、使用済みの培地を除去し、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含む培養液に置換し、３７℃にて２時間インキュベートした。ＭＴＳはテトラゾリウム化合物であり、代謝活性を有する体細胞中において還元され、可溶性の生成物であり、青紫を呈するフォルマザンとなる。次いで、この４９０ｎｍにおけるフォルマザンの吸光度を、Ｔｅｃａｎ（登録商標） Ｓａｆｉｒｅ２^TMマイクロプレートリダーにて測定した。

無被覆又はポリオルニチン、ラミニン若しくはポリオルニチン及びラミニンの組合せで被覆した２４ウェルＢＤ ＰｕｒｅＣｏａｔ Ａｍｉｎｅ プレート中に、ウェルあたり２０，０００の細胞密度でｈＮＳＣを播種した。３日後、使用済培養液は穏やかに吸引除去し、４００μＬの新しいｂＦＧＦ不含の増殖培養液に交換した。各ウェルに８０μＬのＭＴＳ試薬を添加して、３７℃にて１．５時間、細胞をインキュベートした。４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。

本試験結果は、実施例８記載の視覚的観察をサポートする（図１２）。ｈＮＳＣのＢＤ ＰｕｒｅＣｏａｔ Ａｍｉｎｅ表面上における生存度は、ラミニンのみあるいはポリオルニチン及びラミニンの組合せで被覆した組織培養表面と比較して、およそ２０〜３０％高かった。本実施例は、単一のＥＣＭ（ラミニン）を有するＢＤ ＰｕｒｅＣｏａｔ Ａｍｉｎｅ表面上において、ｈＮＳＣが接着と増殖及び生存することが可能であること、及びそれは２種類のＥＣＭの有する組織培養プレート上の細胞の増殖を凌ぐことを示す（ポリオルニチンとラミニンは陽性対照）。

Claims (19)

1. 薄膜を有する細胞培養表面と、該薄膜被覆表面上のコーティングと、を含む細胞培養基質であって、
   前記薄膜は、前記細胞培養表面に接着され、
   前記薄膜は、アリルアミン、メチルアミン、プロピルアミン、へプチルアミン及びジアミノプロパンからなる群から選択される1種以上のプラズマ重合されたアミンモノマーから成り、
   前記コーティングは、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン様組換え蛋白質高分子、レトロネクチン、エンタクチン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンからなる群より選択される1種以上の細胞外マトリックス蛋白質と水性溶媒とを含むコーティング溶液から堆積され、
   前記コーティング溶液中の細胞外マトリックス蛋白質の全濃度は、1ng/mL〜1mg/mLであることを特徴とする、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉幹細胞又はヒト神経幹細胞の培養に適切な細胞培養基質。
2. 請求項１に記載の細胞培養基質であって、前記コーティング溶液中の総細胞外マトリックス蛋白質濃度が1μg/mL〜300μg/mLであることを特徴とする細胞培養基質。
3. 請求項１に記載の細胞培養基質であって、前記コーティング溶液の総細胞外マトリックス蛋白質濃度は、5μg/mL〜200μg/mLであることを特徴とする細胞培養基質。
4. 請求項１に記載の細胞培養基質であって、前記コーティング溶液は、全細胞外マトリックス蛋白質または細胞外マトリックス蛋白質断片を含むことを特徴とする細胞培養基質。
5. 請求項１に記載の細胞培養基質であって、前記コーティング溶液はさらにエンタクチン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカン（HSPG）、増殖因子およびこれらの組合せからなる群から選択される成分を含むことを特徴とする細胞培養基質。
6. 請求項１に記載の細胞培養基質であって、水性溶媒が緩衝液、細胞培養液およびこれらの組合せよりなる群から選択されることを特徴とする細胞培養基質。
7. 細胞培養基質の調製方法であって、
   細胞培養面を提供する工程と、
   プラズマ重合によって、前記表面上に被覆を形成することにより、薄膜被覆表面を形成する工程と、
   コーティング溶液を前記薄膜被覆表面に導入して、細胞培養基質を形成する工程と、
   を含み、
   前記プラズマ重合が、アリルアミン、メチルアミン、プロピルアミン、へプチルアミン及びジアミノプロパンからなる群から選択される1種以上のアミンモノマーを利用するものであり、
   前記コーティング溶液は、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン様組換え蛋白質高分子、レトロネクチン、エンタクチン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンからなる群より選択される1種以上の細胞外マトリックス蛋白質と水性溶液を含み、該コーティング溶液中の総細胞外マトリックス蛋白質濃度が、1ng/mL〜1ｍg/mLである、
   ことを特徴とする、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉幹細胞又はヒト神経幹細胞の培養に適切な細胞培養基質の調製方法。
8. さらに、前記細胞培養基質をインキュベートする方法であって、前記一またはそれ以上の細胞外マトリックス蛋白質を前記薄膜被覆表面に固定する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. さらに、前記細胞培養基質を一定期間凍結し、その後、前記細胞培養基質をインキュベートして、前記1種以上の細胞外マトリックス蛋白質を前記薄膜被覆表面に固定化する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. 幹細胞培養方法であって、
    請求項１に記載の細胞培養基質を提供する工程と
    前記細胞培養基質に幹細胞懸濁液を塗布する工程と、
    前記幹細胞懸濁液を前記細胞の細胞培養基質上において、5％CO₂ 湿潤空気下、37℃にてインキュベートする工程と、
    前記幹細胞を前記細胞培養基質に接着させ、該接着した細胞が大部分未分化の状態にとどまるものである工程と、
    を含むことを特徴とする幹細胞培養方法。
11. さらに、真核生物幹細胞の前記懸濁液を塗布する前に、細胞培養培地を前記細胞培養基質に導入することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 前記細胞培養培地が、増殖培地を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
13. 前記幹細胞が、真核生物幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
14. 前記幹細胞は胚性幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
15. 前記幹細胞はヒト胚性幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
16. 前記幹細胞はヒト間葉細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
17. 前記幹細胞はヒト神経幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
18. 前記1種以上の細胞外マトリックス蛋白質が、単一タイプの細胞外マトリックス蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基質。
19. 前記1種以上の細胞外マトリックス蛋白質が、ヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基質。

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