JP2017522889A - 脂肪前駆細胞及び脂肪細胞のインビトロにおける作製のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
接着培養系において無血清培養培地中で多能性幹細胞を培養するステップと、
該多能性幹細胞を、中胚葉分化培地に、中胚葉前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
該中胚葉前駆細胞を、脂肪細胞分化培地に、脂肪前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
任意的に、このように取得した脂肪前駆細胞を収集するステップとを含む。
本発明の方法によって得られた脂肪細胞を候補分子に接触させるステップと、
脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子を選択するステップとを含む。
接着培養系において無血清培養培地中で多能性幹細胞を培養するステップと、
該多能性幹細胞を中胚葉分化培地に、中胚葉前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
該中胚葉前駆細胞を脂肪細胞分化培地に、脂肪前駆細胞を取得するまで接触させるステップとを含む。
上述のような中胚葉分化培地に存在する1以上の化合物、好ましくはTGF−βスーパーファミリーに属する1以上のモルフォゲン、特に、アクチビンA、アクチビンB、BMP−4タンパク質、BMP−2タンパク質、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される1以上のモルフォゲン、を含有する第1の容器と、
上述のような脂肪細胞分化培地に存在する1以上の化合物、好ましくはインスリン、その類似体のうちの1つ、又はIGF−1、及びグルココルチコイド、及び細胞内環状アデノシン一りん酸(cAMP)を増加させる薬剤、さらに好ましくはインスリン、デキサメタゾン、3−イソブチル−1−メチルキサンチン、及び任意的にインドメタシン、を含有する第2の容器と、
任意的に、上述のような脂肪細胞成熟培地に存在する1以上の化合物、好ましくはインスリンを含有する第3の容器と、を包含する。
アクチビンA及び/又はBMP−4タンパク質、並びに任意的に、好ましくはヒト造血細胞の増殖に適した無血清基本培養培地、を含有する第1の容器と、
インスリン、デキサメタゾン、及びIBMX、並びに任意的に基本培養培地、好ましくは血清を任意的に含む基本合成最小培地、を含有する第2の容器と、
インスリン、及び任意的に基本培養培地、好ましくは血清を任意的に含む基本合成最小培地、を含有する任意的な第3の容器と、を包含する。
本発明の方法により取得された脂肪前駆細胞及び/又は脂肪細胞を、候補分子に接触させるステップと、
所望の活性を有する分子を選択するステップとを含む。
本発明の方法により取得された脂肪細胞を、1以上の候補分子に接触させるステップと、
脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子を選択するステップとを含む。
−ヒト誘導多能性幹(iPS)細胞培養−
ヒト線維芽細胞をiPS細胞に初期化するのに用いられる技術は、ウイルスベクター(センダイウイルス)を用いて改変した、山中他による記載のプロトコル(Takahashi他、2007年)からのものである。対照の対象からのiPS細胞をMatrigel(登録商標)(hESC Matrigel、BD Biosciences社、カタログ番号3542777)で培養し、増殖培地mTESR(登録商標)1(STEMCEL Technologies社、カタログ番号.05850)を毎日取り変えた。細胞を、1mg/mLの濃度のコラゲナーゼタイプIV(Gibco社)に、4日毎に供し(45分、37℃)、800rpmで4分間遠心分離した。そして、細胞をmTESR(登録商標)1に再懸濁し、5mLピペットを用いてクローンを機械的に単離した。約20細胞のクラスターを、Matrigel(登録商標)で事前にインキュベートしたディッシュに播種した。
図1に、本発明の実施形態の概略的図を示す。
細胞を、3%PFAで、室温において15分間固定した。非特異的部位を、3%PBS−BSAにおいて細胞をインキュベートすることで遮断した。PBS、0.1%TritonX100又は0.1%サポニン、3%BSAの溶液に希釈した、対象のタンパク質に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体(以下の表1)の存在下で、細胞の調製物をインキュベートした。このように形成されたタンパク質と抗体との複合体を、蛍光色素と共有結合し且つPBS、0.01%TritonX100又はサポニン、3%BSAの溶液に希釈した2次抗体で、光を避けて室温で1時間、細胞をインキュベートすることで検出した。抗ウサギIgG又は抗マウスIgG2次抗体をAlexa488(Invitrogen社、1:1000)に結合させた。調製物を25ng/mLナイルレッド(Molecular Probes、N−1142)と共に15分間インキュベートし、PBSで3回すすいで、DAPI(4′−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、VWR)中で5分間インキュベートした。封入剤(Fluoromount−G、Southern Biotech社)の適用後に、共焦点顕微鏡(Leica社)を使用して細胞を観察した。
細胞を、95%エタノールで、15分間室温で固定した。細胞を、PBSで3回すすいだ後、SigmaFAST BCPI/NBT溶液(カタログ番号B5655)で、5分間、37℃、5%CO2においてインキュベートした。
分化20日後に、脂肪細胞にオイルレッド染色をおこなった。細胞を、1×PBSですすいだ後、4%(w/v)パラホルムアルデヒド中で1時間固定して、イソプロパノールにおいて希釈した「オイルレッドO」(Sigma社)溶液中で2時間インキュベートした。細胞を水道水で4回すすいだ。
NucleoSpin RNAキット(Macherey Nagel)を製造者の推奨に従って使用して、総RNAを抽出した。抽出した総RNAの濃度と、溶媒又は塩によるその汚染とを顕微分光測光法(Nanodrop)によって評価した。高能力cDNA逆転写キット(Applied Biosystems社)を用いて、逆転写をおこなった。そして、10倍希釈のcDNA2μL、SYBR Green I PCR混合物10μL(Roche Diagnostics社、DNAポリメラーゼ、dNTP、3mMのMgCl2、及びSYBR Green蛍光プローブを含む)、0.2μMセンスプライマー、及び0.2μMアンチセンスプライマー(以下の表2)を添加することで、定量PCRをおこなった。対象の遺伝子発現をノーマライズするために、参考遺伝子GAPDHを用いた。
iPSCを機械的に継代し、そしてKnockOut DMEM(Invitrogen社)、20%FCS、1%非必須アミノ酸、1%GlutaMAX(Invitrogen社)、50μMのβ−メルカプトエタノール(Sigma社)、10ng/mLのFGF2(Peprotech社)、1mMのAA2P(Sigma社)からなる分化培地のゼラチン(Sigma社)に播種した(P0)。10〜15日の培養後、細胞をトリプシン(Gibco)で継代し、1/2に希釈した(P1)。90%コンフルエントに達した時、細胞を継代し、1/3に希釈した(P2)。次の継代では、8000細胞/cm2で細胞をゼラチンに播種した。6〜7継代後、均質で安定的なMSC個体群を得た。
脂肪細胞を、任意的に、10−5Mイソプロテレノール(Sigma社)で6時間処理し、タンパク質試料を収集した。より長い刺激では、脂肪細胞を非代謝型cAMP類似体の8−Br−cAMP(Sigma社)で48時間処理した。
分化20日目の生細胞を、1μMミトトラッカーRed CMXRos(Life Technologies社)とともに、37℃、5%CO2において、暗所で45分間インキュベートした。細胞をPBSで2度すすいだ後、3%PFAで、室温において15分間固定した。そして、調製物を、1ng/mLのBODIPY493/503(Molecular Probes(登録商標)、D−3922)とともに15分間インキュベートし、PBSで3回すすいで、その後、DAPI(4’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、VWR)中で5分間インキュベートした。封入剤(Fluoromount−G、Southern Biotech社)適用後、共焦点顕微鏡(Leica社)を用いて細胞を観察した。
脂肪細胞を、適切な量の溶解緩衝液(50mMトリスpH7.4、0.27Mショ糖、1mMオルトバナジン酸ナトリウムpH10、1mMのEDTA、1mMのEGTA、10mMβ−グリセロリン酸、50mMのNaF、5mMピロリン酸、1%(w/v)トリトンX−100、0.1%(w/v)2−β−メルカプトエタノール、及びプロテアーゼ阻害剤)中で溶解した。全溶解物を遠心分離(15,000g、4℃、10分間)し、使用するまで−80℃で保管した。タンパク質濃度を、標準物質としてのウシアルブミンとともに、ブラッドフォード法を用いて測定した。試料を、ポリアクリルアミドゲル上でSDS/PAGE移動に供し、ニトロセルロース膜(Amersham Biosciences社)に移し、5%(w/v)スキムミルク又はBSAで補完したTBS−T緩衝液(50mMのTris−HCl pH7.6、150mMのNaCl、0.1%(v/v)のTween−20)中で、2時間室温で遮断し、目的のタンパク質に特異的な種々の抗体とともにインキュベートした(上記表1)。
Gバンド及びRバンドにより核型分析する標準的方法を用いて核型を作製した。
培養18日目に、TrypLE Express(Life Technologies社、番号12604021)を用いて細胞を収集し、10μg/mLインスリン、500μMのIBMX、1μMデキサメタゾン、及び50μMインドメタシンを含むDMEM/F12/Matrigel培地に再懸濁した。107細胞を、生後6週のFoxn1nuヌードマウス(Taconic)の背部に皮下注入した。またこれらのマウスには、iPS細胞由来の3×107間葉系幹細胞(MSC)、又は対照としてMatrigelのみを、胸骨に注入した。移植30日後にマウスを安楽死させる。
新規形成ヒト脂肪層を切除し、4%PFA中で固定し、パラフィンに包埋し、そして4μm部分に切り分けた。脱パラフィン後に、自動システムにてスライドを染色する。スライドをヘマトキシリン中で5分間インキュベートし、流水ですすぎ、エオシン溶液中で2分間インキュベートし、流水ですすぎ、一連の2回の無水アルコール浴、その後トルエンに浸漬し、樹脂で封入する。
脱パラフィン後に、EDTA緩衝液(pH8若しくはpH9)において水浴中で、又はクエン酸緩衝液(pH6)においてマイクロウェーブで加熱することで(15分、95℃)、抗原部位を1次抗体の官能基としてアンマスクする。過酸化水素(3%)の存在下で5分間インキュベーションすることで、内在性ペルオキシダーゼの阻害が可能になる。非特異的部位阻害は、スライドをDakoユニバーサル血清において20分間インキュベートすることでおこなわれる。
−使用iPS細胞株の多能性特性−
図2は、使用iPS細胞が予期された多能性特性を有することを示す。細胞は、はっきりとした境界を有する、密なコロニーに形成される(図2A、2B)。細胞は、アルカリホスファターゼ染色などの多能性マーカーに陽性であり(図2B)、NANOG、SOX2、OCT4、TRA−1−60、TRA−1−81、及びSSEA3/4タンパク質を発現する(図2C)。さらに、これらの細胞は、H9株胚性幹細胞のものと同様のレベルでOCT4、NANOG、及びSOX2を発現し、多能性特性を示す(図2D)。
図3は、分化時における多能性マーカーOCT4、NANOG、及びSOX2発現の下落(図3A)と、iPS細胞が特定の中胚葉分化培地に供されるときの、初期中胚葉を特徴づける2つの遺伝子ブラキウリとMESP1との遺伝子発現の誘導(図3B)とを示す。ブラキウリ(Tボックス)及びMESP1の遺伝子発現は分化4日後に75倍増加し、中胚葉前駆細胞の効率的作製を示す。これらのマーカーのタンパク質発現を免疫蛍光法によって確認した(図3C)。予期されたように、これらの遺伝子発現は脂肪細胞分化誘導後に(6日目)減少する(図3B)。中胚葉前駆細胞におけるブラキウリ及びMESP1発現の所定の特徴を示すため、これらマーカーの発現をiPS細胞の間葉系幹細胞(MSC)への分化時に分析した(図3D)。これらのマーカーはMSCでは発現されず、本発明の方法により得られた中胚葉前駆細胞はMSCとは異なる。
特定の脂肪細胞遺伝子の発現は分化時に測定される。図4は、脂肪細胞分化時に誘導されたC/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、及びPPARγ転写因子の遺伝子発現が、脂肪生成分化混合物の添加後(4日目)、8〜12日の間に徐々に増加することを示す。この高発現レベルが20日目に維持される。同様に、脂肪細胞特異的アイソフォームPPARγ2とC/EBPα p30/42とのタンパク質発現を分化10日目から観察した(図5B及び図5C)。図5Cにおいて、インスリン受容体(IR)など脂肪細胞に重要な役割を果たすタンパク質、ペリリピン1やカベオリン1など脂肪滴に関連するタンパク質(図5C)、並びにグルコーストランスポーターGLUT4(図5B)の発現が脂肪細胞分化時に誘導されることが示される。
図5Aは、種々の倍率における脂肪細胞のオイルレッド染色を示す。脂質蓄積は培養ディッシュ全体で均質である。細胞はクラスターに形成され、円形を示し、いくつかの脂肪滴を含有する。これらの細胞はインビトロで脂肪細胞の形態特性を有する。
図5Aは、脂肪滴が中性脂質染色で標識された脂肪細胞の広範囲視野を示す。これらの画像により、60%を超えるような分化効率を評価することが可能になる。
図6Aにおいて、得られた脂肪細胞は、PGC1α、PRDM16、及びUCP1などの「従来の褐色」遺伝子を発現するが、MYF5やZIC1などの前駆細胞や成熟褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子を発現しないことが示される。UCP1タンパク質発現は、10日目から検出可能である(図6B)。またこれらの細胞は、TMEM26、CITED1、CD137、及びHOXC9などのベージュ(又は「ブライト」)脂肪細胞に特異的な遺伝子をも発現する(図6C)。CITED1タンパク質発現は分化した脂肪細胞において観察可能である(図6D)。さらに、強力なUCP1タンパク質誘導がβ−アドレナリン刺激後に観察される。この強力な誘導はベージュ脂肪細胞の主要な特徴の1つである(図6E)。この結果に伴って、8−Br−cAMPでの刺激は、48時間後のベージュ脂肪細胞ミトコンドリア数(図6F)と、PGC1α、PRDM16、PPARα、及びDIO2などの熱産生に関わる遺伝子発現(図6G)とにおいて増加を示す。このように、これらすべての結果は、ヒトiPS細胞由来の脂肪細胞はベージュ型表現型を有することを示す。
脂肪細胞分化培地の存在下におけるMatrigel(登録商標)での培養の18日後、生後6週の免疫不全マウスの背中に107細胞を皮下注入する(図7A)。MSC又はMatrigel(登録商標)のみを、対照として、同じマウスの胸骨に注入した(n=3)。30日後、脂肪層が細胞注入部位に現れ、Matrigel(登録商標)注入部位には現れない。ヒトiPS細胞由来の脂肪細胞注入後に形成された脂肪層の組織学的分析は、完全に分化、組織化、及び血管新生化された脂肪組織を示す(図7C、D)。一方で、iPS細胞由来の間葉系幹細胞(MSC)の注入後に形成された組織は、広範囲領域に存在する線維芽細胞型細胞と少数の脂肪細胞とを含む不均質組成を有する(図7C、D)。iPS細胞由来の脂肪細胞又はMSCから形成された脂肪層を構成する細胞は、ペリリピン1標識で示される脂肪滴を有する(図7E)。こうして、これらのすべての結果は、本発明により取得された脂肪細胞がインビボで脂肪組織を形成可能であることを示す。
2次元での多能性幹細胞の分化により、脂肪生成混合物に供したときに脂肪前駆細胞、そして脂肪細胞に分化する能力を有する中胚葉前駆細胞を作製することが可能である。本発明の方法で取得された脂肪細胞は、この細胞型に特徴的な転写因子を発現し、トリグリセリド形態で脂質を蓄積する。これらの脂肪細胞は、一度移植されるとインビボで脂肪層を形成可能である。さらに、今までインビトロでは記載のなかったベージュ型ヒト脂肪細胞作製をこの方法が可能にすることを発明者等は示した。終わりに、この方法では、未分化多能性幹細胞から多くの脂肪細胞がたった20日で作製可能である。
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Claims (18)
- インビトロでの脂肪前駆細胞作製のための方法であって、
多能性幹細胞を接着培養系において無血清培養培地中で培養するステップと、
前記多能性幹細胞を、中胚葉分化培地に、中胚葉前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
前記中胚葉前駆細胞を、脂肪細胞分化培地に、脂肪前駆細胞を取得するまで接触させるステップと、
任意的に、このようにして取得した前記脂肪前駆細胞を収集するステップとを含む、方法。 - 前記多能性幹細胞は誘導多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記中胚葉分化培地は、好ましくはアクチビンA、アクチビンB、BMP−4タンパク質、BMP−2タンパク質、TGF−β1、TGF−β2、及びTGF−β3、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択されるTGF−βスーパーファミリーに属する1以上のモルフォゲンを含む無血清培養培地である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記中胚葉分化培地は、
(i)アクチビンA及びアクチビンBからなる群より選択されるモルフォゲン、好ましくはアクチビンAと、
(ii)BMP−4タンパク質、BMP−2タンパク質、TGF−β1、TGF−β2、及びTGF−β3、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択されるモルフォゲン、好ましくはBMP−4タンパク質と、を含有する無血清培養培地である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記無血清培養培地は造血細胞培養に適した培地である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、細胞が約50%〜約90%コンフルエントに達するときに前記中胚葉分化培地に接触させる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化培地は、インスリン、その類似体の1つ、又はIGF−1と、グルココルチコイドと、細胞内環状アデノシン一りん酸(cAMP)を増加させる薬剤とを含有する培養培地である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化培地は、インスリン、デキサメタゾン、及び3−イソブチル−1−メチルキサンチンを含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脂肪細胞分化培地はインドメタシンをさらに含有する、請求項7又は8に記載の方法。
- 請求項1〜9に記載の方法により取得した前記脂肪前駆細胞を、脂肪細胞成熟培地に、脂肪細胞を取得するまで接触させるステップを含む、インビトロでの脂肪細胞作製のための方法。
- 前記脂肪細胞成熟培地はインスリンを含む培養培地である、請求項10に記載の方法。
- リポジストロフィーの処置に使用するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法により取得した脂肪前駆細胞、又は請求項10若しくは11に記載の方法により取得した脂肪細胞。
- 空腹時高血糖症、耐糖能異常(glucose intolerance)、特に2型糖尿病である糖尿病、及びインスリン抵抗性からなる群より好ましくは選択される血糖コントロール異常の処置、又は肥満若しくはリポジストロフィー症候群と任意的に関連した脂質異常症の処置に使用するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法により取得した脂肪前駆細胞、又は請求項10若しくは11に記載の方法により取得した脂肪細胞。
- インビトロでの前記脂肪前駆細胞又は前記脂肪細胞の作製に用いられる前記多能性幹細胞は、処置される対象の体細胞、好ましくは線維芽細胞から取得した誘導多能性幹細胞である、請求項12又は13に記載の使用のための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法により取得した脂肪前駆細胞、又は請求項10若しくは11に記載の方法により取得した脂肪細胞。
- インビトロでの脂肪前駆細胞又は脂肪細胞の作製のためのキットであって、
TGF−βスーパーファミリーに属する1以上のモルフォゲンを含有する第1の容器と、
(i)インスリン、その類似体のうちの1つ、又はIGF−1、(ii)グルココルチコイド、及び(iii)細胞内環状アデノシン一りん酸(cAMP)を増加させる薬剤を含有する第2の容器と、
任意的に、インスリンを含有する第3の容器と、を含むキット。 - 前記第1の容器はアクチビンA及び/又はBMP−4を含有し、
前記第2の容器はインスリン、デキサメタゾン、及びIBMX、並びに任意的にインドメタシンを含有する、請求項15に記載のキット。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法によるインビトロでの脂肪前駆細胞作製、又は請求項10若しくは11に記載の方法によるインビトロでの脂肪細胞作製のための、請求項15又は16に記載のキットの使用。
- 脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子をスクリーニングするための方法であって、
請求項10又は11に記載の方法により取得した前記脂肪細胞を1以上の候補分子に接触させるステップと、
前記脂肪細胞の熱産生活性を促進する分子を選択するステップと、を含む方法。
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