CN103038336A - 使多能性哺乳细胞分化的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用形成有多个微容器的细胞培养器，实现胚叶体尺寸的控制，在控制胚叶体尺寸的状态下可分化诱导的方法。使多能性哺乳细胞分化的培养方法使用在培养表面具有多个微容器(11)的细胞培养容器(10)。细胞培养容器(10)具有由微容器(11)的空间结构的高度为10μm～500μm，底部面积为100μm2～1mm2的空间构成的培养表面。使多能性哺乳细胞分化的培养方法使用细胞培养容器(10)，培养多能性哺乳细胞，得到至少部分分化为内胚叶系列的细胞的细胞群体。

Description

使多能性哺乳细胞分化的培养方法
技术领域
本发明涉及多能性细胞的培养，特别是涉及使多能性哺乳细胞分化的培养方法。
背景技术
在对从组织分离的细胞进行试验、检查中使用的方法在生物技术相关领域为不可缺少的方法。广泛用于疾病、病态的诊断、新药的探索及药效的判定或动物检查、植物检查、环境污染物质的试验等。因此，在生物技术领域使用的细胞类极为多样。
近年来，胚胎干细胞(Embryonic stem cells：ES细胞)、诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells：iPS细胞)等多能性细胞的研究得以发展。多能性细胞是可分化为构成形成生态的组织/器官/脏器的全部细胞种类的防沙。ES细胞成为用于研究多能性细胞的生物学性质及在初期胚内的分化基础的机制的强有力的模型体系，提供哺乳动物的遗传性操作以及作为结果产生的用于商业、医学及农业学应用的机会。进一步地，开发了使用ES细胞的适当的增殖及分化，进行疾病、病态的诊断、新药探索及药效判定的方法。
分离的多能性细胞还具有直接用于试验的情况，但大多数情况下进行使细胞在培养皿、试验管中增殖及分化的操作。使用该培养细胞进行各种检查。已分离的多能性细胞要求显示与在分化了的生物体内的试验、所谓in vivo试验一样的药物感受性、毒性反应，同时要求高效地分化为目的细胞。
然而，现状是多能性细胞的多能性及调节分化的生化学机制几乎未被理解。例如，作为由多能性细胞分化的方法，专利文献1中公开有用于产出分化了的哺乳动物细胞的组合物及方法。详细地说，公开有在细胞培养中采用在饲养层上或无饲养的条件下培养细胞，以及为了生成由多能性哺乳动物干细胞分化了的哺乳动物细胞，使这些细胞进而与PI3-激酶通路抑制剂及TGFb家族的成员接触的细胞分化方法。
不仅上述方法，而且在非专利文献1中也公开有根据胚叶体(EmbryoidBody)的凝集体的大小，多能性细胞的分化效率变化。这样，为了得到均一的内胚叶系列的细胞或由该细胞分化的例如肝细胞、β细胞，控制该凝集体的大小是非常重要的一个要素。在非专利文献1记载的方法中，将具有细胞粘着性的基质胶以直径数十μm～数百μm的大小在培养底面以一定间隔配置，形成细胞粘着区域。在细胞粘着区域的周围通过涂敷细胞非粘着性聚合物，使细胞选择性地与该细胞粘着区域粘着，控制胚叶体的凝集体的大小。
专利文献1：日本特表2008-509676号公报
非专利文献1：Celine Liu Bauwens，Raheem Peerani，SylVia Niebruegge，kimberly a.Woodhouse，Eugenia KumacheVa，Mansoor Husain，Peter W.Zandstra著、″Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate SizeHeterogeneity Influences Differentiation Trajectories″，STEM CELLS 2008；26，pp2300-2310。
发明内容
但是，在非专利文献公开的培养方法中具有操作复杂、成本高的问题。另外，培养期间中还具有一部分细胞与细胞非粘着部分相粘着的情况，在高效率地使细胞分化方面具有问题。这将难以控制胚叶体的凝集块的尺寸。
因此，本发明目的在于，提供使用表面具有多个微容器的细胞培养容器，实现胚叶体尺寸的控制，能够以控制胚叶体尺寸的状态进行分化诱导的方法，在所述细胞培养容器中，具有由该微容器的底部面积为100μm2～1mm2，深度为10～500μm的空间构成的培养表面。
使本发明的多能性哺乳细胞分化的培养方法的一种方式是使用培养表面具有多个微容器的细胞培养容器。细胞培养容器具有由微容器的空间结构的高度为10μm～500μm、底部面积为100μm2～1mm2的空间构成的培养表面。使多能性哺乳细胞分化的培养方法使用了该细胞培养容器，培养多能性哺乳细胞，得到至少部分地分化为内胚叶系列细胞的细胞群体。使用该微容器，控制培养的胚叶体尺寸。而且，使用控制了胚叶体尺寸的状态，诱导细胞的分化。由此，改善使多能性哺乳细胞分化的效率。
另外，在使本发明的多能性哺乳细胞分化的培养方法的一种方式中，优选多能性哺乳细胞选自胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、畸形癌细胞/精原干细胞的任一种。优选在一个微容器中播种1个～3×105个多能性哺乳细胞，培养并得到所述细胞群体。
在使本发明的多能性哺乳细胞分化的培养方法的一种方式中，优选利用包含选自TGF-β家族、FGF家族、及PI3-激酶信号传导通路抑制剂中的一种物质或两种以上的混合物的培养基培养多能性哺乳细胞。优选所述的TGF-β家族的成员为选自Nodal、活化素A、活化素B、TGF-β、BMP2、及BMP4中的一种物质或两种以上的混合物。优选所述的FGF家族的成员为选自b-FGF、FGF-4、FGF-2中的一种物质或两种以上的混合物。优选所述PI3-激酶信号传导通路抑制剂为选自LY294002、雷帕酶素、渥曼青霉素、氯化锂、Akt抑制剂I、Akt抑制剂Ⅱ、Akt抑制剂Ⅲ、NL-71-101中的一种物质或两种以上的混合物。
另外，在使本发明的多能性哺乳细胞分化的培养方法的一种方式中，其特征在于，为下述任一种情况：(1)得到至少部分表达SOX17，未表达AFP的细胞群体；(2)得到至少部分表达SOX17，未表达Pdx-1的细胞群体；(3)得到至少部分表达FoxA1或FoxA2，未表达AFP的细胞群体；(4)得到至少部分表达FoxA1或FoxA2，未表达Pdx-1的细胞群体。
进一步地，在使本发明的多能性哺乳细胞分化的培养方法的一种方式中，利用包含选自FGF、BMP2、HGF、KGF、EGF、TGF-α、HB-EGF、VEGF、PDGF、DMSO、地塞米松、制瘤素M、胰岛素中的一种或两种以上的物质的培养基培养通过所述培养方法得到的分化为内胚叶系列细胞的细胞群体。而且，得到至少部分存在表达白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)的任一种的细胞的第二细胞群体。
在使本发明的多能性哺乳细胞分化的培养方法的一种方式中，优选在氧浓度为4％以下的大气中培养。
优选所述的细胞培养容器为包含丙烯酸系树脂、聚乳酸、聚乙二醇酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸/苯乙烯系共聚树脂、聚碳酸酯树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯-乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树脂、及硅树脂中一种或其以上的组合的树脂成型品。
所述微容器优选在沿所述微容器的空间结构的高度方向形成的侧壁的上部50％以上的部分，所述底部与该侧壁的各侧面形成的角度为80°～90°。
优选所述微容器底部的长径为短径的1～1.5倍的范围内。
优选在设有所述微容器的区域进行表面处理。另外，优选表面处理为下述任一种：用无机物涂层的处理；用胶原质、层粘连蛋白等细胞外基质涂层的处理；用合成物质涂层的处理；利用等离子体处理涂层的处理；在微容器底面具有从相当于细胞桥粒的直径即1nm至相当于1个细胞的直径即20μm的凹凸的处理。
提供使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其中，使用表面具有多个微容器的细胞培养容器，实现胚叶体尺寸的控制，能够以控制胚叶体尺寸的状态进行分化诱导，在所述细胞培养容器中，具有由该微容器的底部面积为100μm2～1mm2，深度为10～500μm的空间构成的培养表面。
附图说明
图1是表示本发明实施方式的细胞培养容器的构成的平面图。
图2是图1的细胞培养容器的II-II剖面图。
图3是表示使用图1的细胞培养容器培养细胞的状态的示意图。
图4是表示本发明实施方式的细胞培养容器的其它构成的平面图。
图5是图4的细胞培养容器的V-V剖面图。
图6是表示本发明实施方式的细胞培养容器进而其它构成的平面图。
图7是图6的细胞培养容器的VII-VII剖面图。
符号说明
7浅底盘或孔板
8培养基
9细胞
10细胞培养容器
11微容器
12侧壁
13开口部
23区
24区的侧壁
具体实施方式
下面，参照附图，对本发明的实施方式进行说明。但是，本发明不限于下面的实施方式。为了明确说明，下面的记载及附图适当地进行省略、及简化。在各附图中具有相同的构成或功能的构成要素及相当部分附加相同的符号，其说明省略。
实施方式
首先，对实施方式的细胞培养容器进行说明，之后，对细胞培养方法进行说明。
1.细胞培养容器
图1是表示本实施方式的细胞培养容器的构成的平面图，图2是图1的II-II剖面图。如图1所示，细胞培养容器10具备微容器11、侧壁12。在细胞培养容器10的培养面上，多个侧壁12形成网状，由该侧壁12包围四方的空间(微空间)为微容器11。
图1表示微容器11的底部的宽度a、用于划分微容器11的侧壁12的宽度b、高度c。本发明的底部面积是指沿与微容器开口水平面(与侧壁12上面相同的一面)垂直的方向从上方向容器底照射平行光时的投影面积，该面积为100μm2～1mm2。例如，在微容器的底为U字形状的情况下，从与该开口面垂直的方向的上方入射到底的平行光所投影的形状形成底部面积。投影底部的长径及短径在为圆及椭圆的情况下，将通过其重心的长轴及短轴与圆周的交点的各轴上的距离称为长径及短径，在为多边形的情况下，是指与该多边形的面积之差为最小，且通过各顶点的外接圆或外接椭圆的长径及短径，在没有画出通过各顶点的外接圆或外接椭圆的情况下，是指通过最多的顶点的近似圆或椭圆的长径及短径。在将底部的大小使用宽度和深度表示的情况下，宽度和深度在底部上形成垂直关系。
微容器11的底部形状没有特别的限制，除正方形、圆、多边形以外还可以采用各种形状。再现生物体内的肝功能的细胞培养时，该底部面积优选0.01mm2～0.1mm2。另外，优选底部的长径为短径的1～1.5倍。进一步地，优选各向同性的形状，如果是正方形，则例如在形成当量直径100μm的胚叶体的凝集块的情况下，优选一边长度为100μm～300μm。另外，例如，在形成当量直径500μm的胚叶体的凝集块的情况下，优选一边长度为500μm～800μm。
微容器11的水平面与侧壁12形成的角度必须是细胞不触及的角度，因此优选自侧面的上部50％以上的部分为80°～90°，特别优选为85°～90°。
对于侧壁12的高度c，只要微容器11中培养的细胞不触及而向邻接的微容器11移动即可，优选10μm～500μm。例如，侧壁12的高度c在形成当量直径100μm的胚叶体的凝集块的情况下，优选为50μm～150μm。另外，例如，在形成当量直径500μm的胚叶体的凝集块的情况下，优选为50μm～300μm。
图3是表示使用图1的细胞培养容器培养细胞的状态的示意图。图3为从侧面透视细胞培养容器的图。在任意的浅底盘或孔板7中设置细胞培养容器10，用培养基8填满细胞培养容器10。在由侧壁12包围形成的微容器11内培养细胞9。与图1、2一样，图3表示微容器11的底部的宽度a、侧壁12的宽度b、高度c。培养表面为由微容器11的底部和侧壁12形成的空间的表面。使用培养表面培养细胞9。
另外，如图4及图5所示，在形成于各微容器11的四边的侧壁12的各边的中央部也可以形成有开口部13。用于相互连通相邻的微容器11的开口部13的宽度d为不能从最初播种培养细胞的微容器11向相邻的微容器11移动的程度即可。例如，如果培养细胞的当量直径为20μm，则优选为5～15μm。在此，图4是表示本实施方式的其它细胞培养容器的构成的平面图，图5为图4的V-V剖面图。
另外，如图6及图7所示，本实施方式的细胞培养容器也可以具有由规定数量的多个微容器构成的被划分了的区。在此，图6是表示本实施方式的进而其它细胞培养部的构成的平面图，图7为图6的VII-VII剖面图。图6及图7表示使用图4及图5所示的微容器的结构的例子。图6表示划分多个微容器的侧壁24和该被划分了的区23。侧壁24的高度e只要是培养液、反应液等的上清液不干燥而能保持的容量即可，可以适宜设定。因具有侧壁24，从而还可在各区23中使用不同的培养基。另外，图6及图7中，表示具有侧壁24的构成例，但也可以是不具备侧壁24的构成。
制作细胞培养容器上的凹凸图形的方法没有特别地限定，可列举例如，使用了模型的转印成形、三维光造型、精密机械切削、湿法蚀刻、干法蚀刻、激光加工、放电加工等方法。优选考虑到细胞培养容器的用途、要求的加工精度、成本等，而适宜选择这些制造方法。
作为使用模型进行转印成形的方法的具体例，可以列举以金属结构体作为模型，利用树脂成形形成凹凸图案的方法。该方法能够以高转印率在树脂上将金属结构体的形状再现为凹凸图形，另外，通过使用通用的树脂材料，可以降低材料成本，故而优选。使用这种金属结构体的模型的方法在低成本，且可以满足高尺寸精度这方面优异。
上述金属结构体的制造方法可列举例如对通过光刻制作的抗蚀图案或通过三维光造型制作的树脂图案的镀敷处理、精密机械切削、湿法蚀刻、干法蚀刻、激光加工、放电加工等。考虑用途、要求的加工精度、成本等，适宜选择即可。
作为使用由上述得到的金属结构体作为模型，而在树脂上成形凹凸图案的方法，可以列举例如，注射成形、冲压成形、单体浇铸成形、溶剂浇铸成形、热压成形、利用了挤压成形的辊转印等方法。从生产性及模型转印性的观点考虑，优选采用注射成形。
作为构成细胞培养容器的材料，只要具有自身支承性，就没有特别限制，例如，列举出合成树脂、硅、玻璃等。从成本方面、利用了显微镜观察的细胞视认性的观点考虑，优选将透明的合成树脂作为材料。透明的合成树脂，可列举例如，聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酯甲酯-苯乙烯共聚物等丙烯酸系树脂、聚苯乙烯、丙烯酸/苯乙烯系共聚树脂等苯乙烯系树脂、环烯烃等烯烃系树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸、聚乙二醇酸等酯系树脂、聚二甲基硅氧烷等硅氧烷系树脂、聚碳酸酯树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯/乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树脂、硅树脂等。在这种树脂中，在不损害透明性的范围内也可以包含着色剂、扩散剂、增稠剂等各种添加剂。
细胞培养容器以提高容器表面的亲水性、生物体适应性、细胞亲和性等为目的，也可在凹凸图形表面侧进行表面处理，且配设改性层和/或涂敷层。设置上述改性层的方法只要不是丧失自身支承性的方法或引起100μm以上的极端的表面粗糙的方法，就没有特别的限制，可列举例如，药品处理、溶剂处理、利用了表面接枝聚合的接枝聚合物的导入等的化学性处理、电晕放电、臭氧处理、等离子体处理等的物理性处理等方法。另外，设置涂敷层的方法没有特别的限制，可列举例如，溅射、蒸镀等于式涂敷、无机材料涂敷、聚合物涂敷等湿式涂敷等方法。为了在凹凸图形上不混入气泡地注入培养液，优选赋予亲水性，作为形成均一的亲水性膜的方法，优选无机蒸镀。
另外，在考虑细胞亲和性的情况下，更优选例如涂敷胶原质、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等细胞亲和性蛋白质。为了均一涂敷胶原质水溶液等，优选在形成上述的亲水性膜后进行涂敷。优选模仿生物体内环境在细胞外基质表面的培养，因此，特别优选如上所述配设均一的亲水性无机膜后，配设由适于培养细胞的细胞外基质构成的有机膜。
另外，列举出在微容器底面形成相当于与细胞桥粒～培养细胞相当大小的1nm～20μm的凹凸的方法。优选与在这种表面上进行上述记载的亲水性处理、涂敷细胞亲和性蛋白质的方法组合的方法。
上述的各表面处理可以各自单独进行，也可以根据需要适当组合进行。
另外，使用上述细胞培养容器的细胞培养方法仅在培养细胞的微容器中配置细胞，在该空间内，为了发现与生物体内类似的形态及功能，需要播种适当的细胞数，优选细胞播种密度为1.0×102～1.0×106细胞/cm2，更优选细胞播种密度为1.0×103～1.0×105细胞/cm2。例如，微容器为正方形，在一边为100μm的情况下，优选为5.0×103～5.0×105细胞/cm2。
所用的多能性哺乳细胞可以使用利用具有一般的平坦的培养表面的培养板或使用培养盘增殖的细胞，也可以使用上述的细胞培养容器增殖。
另外，上述的细胞增殖一般使用饲养细胞，但为了防止其它细胞的混入及使操作简便，更优选不使用饲养细胞。
使用上述的细胞培养容器的细胞培养方法包含形成胚叶体的凝集块的工序，此时也可以使用饲养细胞，但从防止其它细胞的混入及使操作简便的观点考虑，更优选不使用饲养细胞。
2.细胞培养方法
在本实施方式中，对培养多能性哺乳细胞，得到至少部分分化为内胚叶系列(Endoderm Lineages)的细胞的细胞群体的培养方法进行说明。
在本说明书中，在说明细胞培养方法时使用下面的术语。
术语“多能性”指生成除支撑胚的结构的细胞以外的所有类型的细胞的细胞的能力。
术语“多能性细胞”指至少可以发育为外胚叶、内胚叶、及中胚叶细胞的一种的细胞。
术语“全能性细胞”指可以发育为全部系列的细胞的细胞。
术语“胚胎干细胞(ES细胞)”为万能细胞的一种，其是具有分化为各种不同的细胞、并进行增殖的能力的来源于产生初期的胚的细胞。ES细胞由从作为受精卵的一阶段的胚泡取出的内细胞群建立。
术语“诱导多能干细胞(iPS细胞)”为万能细胞的一种，其是可与ES细胞一样增殖，并分化为各种细胞的细胞。iPS细胞可以由皮肤细胞等产生出来。
术语“多分化能性”指未结束分化的细胞。同样地，术语“多分化能性”指在没有操作(即，核移植或去分化诱导)时，不能形成三种全部胚叶(中胚叶、外胚叶及内胚叶)来源的分化了的细胞型的细胞，另外，换句话说，指部分分化了的细胞。
术语“多能性人细胞”包含从人胚胎、胎儿或成体组织得到的多能性细胞。多能性人细胞可以选自ES细胞、iPS细胞、人内细胞群(ICM)/外胚层细胞、初期原始外胚叶细胞(EPL)等人原始外胚叶细胞、人胚胎生殖(EG)细胞、及人畸形癌(EC)细胞。
术语“内胚叶”中包含胚体内胚叶、壁侧内胚叶、脏侧内胚叶、及中内胚叶细胞，但不限定于此。如在本说明书中使用的那样，术语“胚体内胚叶”指具有在胚中分化为由内胚叶系列生成的任意或多数的内胚叶细胞型(即，胰腺、肝脏、肺、胃、肠及甲状腺)的能力的初期内胚叶细胞。胚体内胚叶细胞为多分化能。因此，在本发明的相关中术语“胚体内胚叶”的使用意味着该细胞与得到的多能性细胞相比，朝向内胚叶细胞型至少更大程度地分化。同样，如在本说明书中使用的那样，内胚叶细胞的产生包含内胚叶细胞聚集的细胞培养物的产生。
“胚体内胚叶”细胞通过SOX17等特异的标记转录体的表达、和随之的AFP及血栓调节蛋白相关的标记转录体的不存在而被赋予特征。另外，该细胞具有表达MIX1、GATA4、HNFα、及HNF3b的情况。
命名为原肠形成的人产生初期的重大阶段在受精的2～3周后产生。原肠形成期间，胚体内胚叶形成过程与中内胚叶细胞(在中胚叶或内胚叶形成中合格的细胞)通过称为原始线条的结构而游走的细胞游走事件一起开始。胚体内胚叶来源于通过线条前部及结节(在线条最前部的特殊结构)而游走的细胞。产生游走时，胚体内胚叶最初占有最前部肠管，与肠管后端的形成一起达到最高。
术语“分化”指与得到其的细胞型相比，充分分化了的细胞型的产生。因此，本术语包含部分分化及结束分化的细胞型。
在指细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群体的情况下，术语“被分离”指以该细胞、细胞系、细胞培养物、或细胞群体可以in vitro培养的方式从该细胞的天然供给源实质上分离。进一步地，术语“进行分离”指从两个以上的细胞组物理性选择1个或多个细胞，在此，这些细胞基于细胞的形态和/或各种标记的表达选择。
术语“表达”指细胞中的多核苷酸的转录或多肽的翻译，由此，与不表达该分子的细胞中的该分子的水平相比，对于表达该分子的细胞中的该分子的水平，可测定的程度高。测定分子表达的方法对于本领域技术人员而言是充分公知的，在这些方法中非限定地含有Northern杂交、RT-PCR、in situ杂交、蛋白质印迹、及免疫染色。
术语“粘着培养”指在固体表面上培养细胞，本次可以在固体支承体上被覆该固体表面，本次是通过下述列举的另外的支承体的表面被覆，或可以通过在培养物中增殖或稳定细胞的任意其它的化学材料或生物学的材料被覆该支承体的细胞培养体系。这些细胞可以牢固地与固体表面或支承体粘着或不能粘着。
术语“Sox17”是表示内胚叶系列的细胞的标记。其是包含DNA结合区域的转录控制因子，是与干细胞的命运决定深深相关的Sry-related high mobility groupbox(Sox)家族中的一个，已知对于内胚叶的形成和维持是必要的。
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术语“FoxA1”、“FoxA2”为Human Forkhead-box(FOX)基因家族中的一个，在分化为胰腺细胞、肝细胞的前阶段表达。即，这些基因表达的细胞定义为内胚叶系列的细胞与成熟的组织细胞的中间的细胞。
已知术语“Pdx-1”为在胰腺细胞中发现的基因，是胰腺细胞的标记。
已知术语“AFP”为肝细胞中发现的基因，是肝细胞的标记。
实施例
(实施例1)
1.小鼠iPS细胞的调整工序
使用微容器的高度50μm，宽度100μm、深度100μm的空间规则地配置于培养底面的细胞培养容器，播种小鼠iPS细胞，以使其为0.5×105个/cm2，使用包含18％FBS、2-巯基乙醇(110mM)及500U/ml白血病抑制因子的DMEM(GIBCO社制)培养基培养三天。培养基交换以1次/24小时的频率进行。
2.胚叶体的凝集块制作工序(EB培养)
交换成包含15％FBS、1％非必需氨基酸、1％核苷、1％青霉素/链霉素及1％谷氨酸的DMEM-F12(GIBCO社制)培养基并培养2天。培养基交换以1次/1天的频率进行。
3.内胚叶系列的细胞的制作工序
交换成包含1％FBS、1％非必需氨基酸、1％核苷、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酸、3％BSA、100ng/ml FGF-2及100ng/ml活化素-A的DMEM-F12(GIBCO社制)培养基并培养3天。培养基交换以1次/12小时的频率进行。
4.AFP、ALB阳性细胞的制作工序
交换成包含10-15％FBS、1％非必需氨基酸、1％核苷、1％青霉素/链霉素、1％glutamic、50ng/ml HGF及1％DMSO的DMEM-F12培养基，培养8天。培养基交换以1次/12小时的频率进行。进一步地，利用包含10-15％FBS、1％非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酸、100ng/ml dHGF及10-7M地塞米松的DMEM-F12培养基培养3天。培养基交换以1次/12小时的频率进行。
(比较例1)
0.饲养细胞的调整工序
利用包含10％FBS、4500mg/L-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在
Figure BPA00001642074300111
的塑料制的培养底面平坦的细胞培养盘上培养饲养细胞(小鼠原代胚胎成纤维细胞)(大日本制药社P-MEF-CF)8小时。
1.小鼠iPS细胞的调整(2工序)
1.1细胞播种工序
在上述0工序得到的培养盘上播种小鼠iPS细胞，使其为0.5×105个/cm2，利用包含18.％FBS、2-巯基乙醇(110mM)及500U/ml白血病抑制因子的DMEM(GIBCO社制)培养基培养三天。培养基交换以1次/24小时的频率进行。
1.2细胞回收工序
去掉1.1的培养基，用PBS洗净后，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液，从饲养细胞上剥离iPS细胞。
2.胚叶体的凝集块制作工序(EB培养)
在
Figure BPA00001642074300121
塑料制的培养底面平坦的培养盘上播种1.2中得到的细胞。培养基使用包含15％FBS、1％非必需氨基酸、1％核苷、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酸的DMEM-F12(GIBCO社制)培养基，培养2天。培养基交换以1次/1天的频率进行。
3.内胚叶系列的细胞的制作工序
交换成包含1％FBS、1％非必需氨基酸、1％核苷、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酸、3％BSA、100ng/ml FGF-2及100ng/ml活化素-A的DMEM-F12(GIBCO社制)培养基，培养3天。培养基交换以1次/12小时的频率进行。
4.AFP、ALB阳性细胞的制作工序
交换成包含10-15％FBS、1％非必需氨基酸、1％核苷、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酸、50ng/ml HGF及1％DMSO的DMEM-F12培养基，培养8天。培养基交换以1次/12小时的频率进行。进一步地，交换成包含10-15％FBS、1％非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酸、100ng/ml dHGF及10-7M地塞米松的DMEM-F12培养基，培养三天。培养基交换以1次/12小时的频率进行。
(分析)
分析以实时PCR法进行，回收在上述1的工序中使用之前的iPS细胞、上述4培养工序完成后的细胞，进行AFP、ALB、GAPDH的mRNA的定量解析。ALB和AFP的mRNA表达量作为相对于GAPDH的值算出。
(结果)
表示将上述1工序中使用前的iPS细胞的各基因表达量设为1的情况下的相对值。
[表1]
  iPS   比较例1   实施例1
  AFP/GAPDH   1   157.54   611.22
  AFP/GAPDH   1   274.15   20170.13
用实施例1中的方法分化为内胚叶系列的细胞后，通过分化为肝细胞，肝特异性标记AFP和ALB的基因表达量相对于比较例，分别为1.7倍、33倍的高值。
(实施例2)
使用了具有微容器的培养板的人iPS细胞的分化诱导
0.饲养细胞的调整工序
在
Figure BPA00001642074300131
的塑料制的培养底面平坦的细胞培养盘内利用包含10％FBS、4500mg/L-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的DMEM培养基培养饲养细胞(小鼠原代胚胎成纤维细胞)8小时。
1.人iPS细胞的调整工序
人iPS细胞株201B7(理研BRC号码：HPS0001))在小鼠纤维芽细胞(MEF)上使用包含DMEM/F12+20％KSR+bFGF的培养基维持。
2.胚性内胚叶细胞的制作工序
在涂敷有基质胶的、微容器的高度50μm、宽度100μm、深度100μm的空间规则地配置于培养底面的细胞培养容器内，播种分散为单细胞的人iPS细胞，使用在RPMI1640中添加了B27的分化诱导培养基培养24小时。24小时后，交换成在分化诱导培养基中添加了人型活化素的培养基，培养6天。培养基交换以1次/2天的频率进行。
3.肝细胞系列的细胞的制作工序(AFP、HNF4A阳性细胞的制作工序)
进行实施例2中记载的“2.胚性内胚叶细胞的制作工序”操作后，交换成在分化诱导培养基中添加了10ng bFGF、20ng/ml hBMP4的培养基，培养3天。培养基交换以1次/2天的频率进行。
接着，交换成在分化诱导培养基中包含40ng hHGF的培养基，进而培养4天。培养基交换以1次/2天的频率进行。
(比较例2)
使用了平板的培养板的人iPS细胞的分化诱导
0.饲养细胞的调整工序
在
Figure BPA00001642074300132
的塑料制的培养底面平坦的细胞培养盘中利用包含10％FBS、4500mg/L-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的DMEM培养基培养饲养细胞(小鼠原代胚胎成纤维细胞)8小时。
1.人iPS细胞的调整工序
人iPS细胞株201B7(理研BRC号码：HPS0001)在小鼠纤维芽细胞(MEF)上使用包含DMEM/F12+20％KSR+bFGF的培养基维持。
2.胚性内胚叶细胞的制作工序
在涂敷了基质胶的、具有平的培养底面的细胞培养容器中播种分散为单细胞的人iPS细胞，使用在RPMI1640中添加了B27的分化诱导培养基培养24小时。24小时后，交换成在分化诱导培养基中添加了人型活化素的培养基，培养6天。培养基交换以1次/2天的频率进行。
3.肝细胞系列的细胞的制作工序(AFP、HNF4A阳性细胞的制作工序)
进行比较例2中记载的“2.胚性内胚叶细胞的制作工序”的操作后，交换成在分化诱导培养基中添加了10ng bFGF、20ng/mlhBMP4的培养基，培养3天。培养基交换以1次/2天的频率进行。
接着，交换成在分化诱导培养基中包含40ng hHGF的培养基，进而培养4天。培养基交换以1次/2天的频率进行。
(分析)
使用实施例2的“2.胚性内胚叶细胞的制作工序”及比较例2的“2.胚性内胚叶细胞的制作工序”的细胞，通过定量PCR解析胚体内胚叶细胞的标记Sox17及CXCR4的基因表达量。使用实施例2的“3.肝细胞系列的细胞的制作工序”及比较例2的“3.肝细胞系列的细胞的制作工序”的细胞，通过定量PCR解析肝脏细胞系列的细胞的标记HNF4A及AFP的表达。值用将比较例2的标记表达量设为1时的相对值表示。
(结果)
有无向胚性内胚叶细胞的分化诱导的解析结果示于表2。在此，SOX17及CXCR4为胚体内胚叶的标记，AFP为肝细胞系列的细胞的标记。在实施例2的“2.胚性内胚叶细胞的制作工序”及比较例2的“2.胚性内胚叶细胞的制作工序”的阶段，为分化为胚性内胚叶细胞的工序，因此SOX17及CXCR4较多地表达，AFP的表达量越小，越是有效率地分化为胚性内胚叶细胞。
[表2]
Figure BPA00001642074300141
有无向肝细胞系列的细胞的分化诱导的解析结果示于表3。在此，SOX17为胚性内胚叶细胞的标记，HNF4A及AFP是对肝细胞系列的细胞特异性的标记。在实施例2的“3.肝细胞系列的细胞的制作工序”及比较例2的“3.肝细胞系列的细胞的制作工序”的阶段，为分化为肝细胞系列的细胞的工序，因此，越是SOX17的表达量小、HNF4A及AFP的表达量多，则越可以说有效率地分化为肝细胞。
[表3]
Figure BPA00001642074300151
表4中，表示了将向表3的肝细胞系列分化诱导后的SOX17的基因表达量与表2的胚性内胚叶细胞分化诱导后的SOX17的基因表达量比较，各自的培养条件的表达降低率。
[表4]
Figure BPA00001642074300152
实施例2中，在胚性内胚叶细胞特中异性的标记SOX17及CXCR4的表达量显示为比较例2的约5倍及1.7倍的高值，几乎没有表达肝细胞系列的细胞的标记。即，实施例2(具有微容器的细胞培养容器)可以有效率地分化为胚性内胚叶细胞。
实施例2中，在肝细胞系列的细胞中特异性的标记HNF4A及AFP的表达量分别显示为比较例2的约2倍及22倍的高值，胚性内胚叶细胞的标记大量表达。且如表4所示，对于分化为肝细胞系列的细胞后的SOX17的值，实施例2为比较例的十分之一，分化为肝细胞系列的细胞后的细胞中，内胚叶系列的细胞残存的比率少。
即，实施例2(具有微容器的细胞培养容器)可以有效率地分化为作为胚性内胚叶系列的细胞的肝细胞。
另外，本发明不限于上述的实施方式，在不脱离宗旨的范围内可适当变更。
本申请主张以2010年3月23日申请的日本申请特愿2010-066324为基础的优先权，其全部公开内容在这里引用。

Claims (22)

1.使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其中，
使用在培养表面具有多个微容器的细胞培养容器培养多能性哺乳细胞，得到至少部分地分化为内胚叶系列的细胞的细胞群体，在所述细胞培养容器中具有由所述微容器的空间结构的高度为10μm～500μm、底部面积为100μm2～1mm2的空间构成的培养表面。
2.如权利要求1所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述多能性哺乳细胞选自胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、畸形癌细胞/精原干细胞的任一种。
3.如权利要求1或2所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
在一个所述微容器中播种1个～3×105个所述多能性哺乳细胞，得到所述细胞群体。
4.如权利要求1～3中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
利用包含选自TGF-β家族、FGF家族和PI3-激酶言号传导通路抑制剂中的一种物质或两种以上的混合物的培养基培养所述多能性哺乳细胞，得到所述细胞群体。
5.如权利要求4所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述TGF-β家族的成员为选自Nodal、活化素A、活化素B、TGF-β、BMP2和BMP4中的一种物质或两种以上的混合物。
6.如权利要求4或5所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述FGF家族的成员为选自b-FGF、FGF-4、FGF-2中的一种物质或两种以上的混合物。
7.如权利要求4～6中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述PI3-激酶信号传导通路抑制剂为选自LY294002、雷帕酶素、渥曼青霉素、氯化锂、Akt抑制剂Ⅰ、Akt抑制剂Ⅱ、Akt抑制剂Ⅲ、NL-71-101中的一种物质或两种以上的混合物。
8.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
得到至少部分表达SOX17、未表达AFP的细胞群体。
9.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
得到至少部分表达SOX17、未表达Pdx-1的细胞群体。
10.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
得到至少部分表达FoxA1或FoxA2、未表达AFP的细胞群体。
11.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
得到至少部分表达FoxA1或FoxA2、未表达Pdx-1的细胞群体。
12.使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
利用包含选自FGF、BMP2、HGF、KGF、EGF、TGF-α、HB-EGF、VEGF、PDGF、DMSO、地塞米松、制瘤素M和胰岛素中的一种或两种以上的物质的培养基培养权利要求1～11中任一项所述的分化为内胚叶系列的细胞的细胞群体，得到至少部分地存在表达白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)的任一种的细胞的第二细胞群体。
13.如权利要求1～12中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
在氧浓度为4％以下的大气中培养。
14.如权利要求1～13中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述细胞培养容器为包含丙烯酸系树脂、聚乳酸、聚乙二醇酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸/苯乙烯系共聚树脂、聚碳酸酯树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯/乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树脂和硅树脂中的一种或其以上的组合的树脂成型品。
15.如权利要求1～14中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述微容器在沿所述微容器的空间结构的高度方向形成的侧壁的上部50％以上的部分，所述底部和该侧壁的各侧面形成的角度为80°～90°。
16.如权利要求1～15中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述微容器底部的长径为短径的1～1.5倍的范围内。
17.如权利要求1～16中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
在设置有所述微容器的区域进行表面处理。
18.如权利要求17所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述表面处理为利用无机物进行涂层的处理。
19.如权利要求17或18所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述表面处理为利用胶原质、层粘连蛋白等细胞外基质进行涂层的处理。
20.如权利要求17～19中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述表面处理为利用合成物质进行涂层的处理。
21.如权利要求17～20中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述表面处理为利用等离子体处理进行涂层的处理。
22.如权利要求17～21中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，
所述表面处理为使在所述微容器底面具有从作为相当于细胞桥粒的直径的1nm至作为相当于1个细胞的直径的20μm的大小的凹凸的处理。
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