KR101766372B1 - Cxcr2 자극을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽 분화 방법 - Google Patents

Cxcr2 자극을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽 분화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CXCR2 자극을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽 분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 표면 수용체 CXCR2를 CXCR2 특이적인 리간드인 GRO-α로 자극하여 활성화시킴으로써 외배엽으로 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CXCR2 자극을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽 분화 방법은 특정 세포로 분화를 유도하기 위한 첫 번째 중요한 단계인 목적 세포의 기원이 되는 특정 배엽세포로의 분화를 촉진하므로, 세포 치료제로서 줄기세포의 효율성 및 유용성을 높일 수 있다.

Description

CXCR2 자극을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽 분화 방법 {Method for Inducing Ectodermal Differentiation of Embryoid Bodies Derived from Human Pluripotent Stem Cells by CXCR2 Stimulation}
본 발명은 CXCR2 자극을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽 분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 표면 수용체 CXCR2를 CXCR2 특이적인 리간드인 GRO-α로 자극하여 활성화시킴으로써 외배엽으로 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 최근에는 다양한 세포로 분화가 가능한 줄기세포를 이용하여 다양한 질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있고, 결국 줄기세포 연구의 궁극적인 목적은 원하는 종류의 세포나 조직을 만들어 세포 치료나 조직 공학 등의 기술에 활용하는데 있다.
따라서, 줄기세포를 실제적으로 활용하기 위하여 해결해야 할 당면과제는 원하는 세포로 분화를 유도할 수 있는 기술의 개발이다. 이에 따라 줄기세포를 특정 세포로 분화시키고자 하는 연구들이 시도되고 있으며, 분화가 끝난 세포를 역분화를 통해 줄기세포로 만든 역분화 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPS) 등이 세포분화에 사용되고 있다.
일반적으로 줄기세포의 분화를 유도하는 방법으로는 분화 촉진제를 이용하는 방법들이 사용되고 있다. 대표적으로는 레티온산(retionic acid)을 이용하여 배아줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법(Dev . Dyn. 236:3255-3266, 2007), 액티빈 A(activin A)를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법(Nat. Biotechnol . 23:1534-1541, 2005), 아스코르브산(ascorbic acid)를 이용하여 심근세포로 분화시키는 방법(Circulation 107:1912-1916, 2003) 등이 있다. 그러나 종래의 기술은 사이토카인(cytokine)과 같은 고가의 시약을 사용하기 때문에 비용이 많이 든다는 단점뿐 아니라, 낮은 분화율 등의 한계점을 가지고 있다. 따라서 줄기세포를 다양한 분야에서 효과적으로 이용하기 위해서는, 줄기세포의 분화 효율을 높이고 원하는 특정 조직으로의 분화 (differentiation)를 유도할 수 있는, 저렴하고 용이한 분화 유도 방법을 개발할 필요가 있다.
인간을 포함한 대부분의 척추동물은 초기배아(early embryo)의 장배형성과정(gastrulation)을 거처 초기 삼배엽성 세포, 즉 내배엽, 중배엽 그리고 외배엽을 형성하며, 상기 삼배엽성 세포로부터 인체조직을 구성하는 모든 세포들이 분화된다. 초기배아인 배반포(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 in vitro에서 확립된 배아 줄기세포(embryonic stem cell)의 경우, 이러한 장배형성과정과 유사한 현상이 배상체(embryoid body) 형성과정 동안 관찰된다. 따라서 배아줄기세포로부터 특정세포를 분화해 내기 위한 첫 번째 중요한 단계는, 분화해내고자 하는 목적 세포의 기원이 되는 특정 배엽세포를 증가시키는 것이며, 이로부터 원하는 세포를 분화해 내는 것이 가장 효율적인 분화방법이 될 것이다. 특히, 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술이 필요하다.
최근, 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 mTOR(mammalian target of rapamycin)을 억제하여 분화를 촉진시키는 방법(Zhou J et al., Proc NatlAcad Sci U S A. 106(19):7840-5, 2009)이 보고되었으나, 이는 세포 수용체가 아닌 신호전달 단백질에 작용하는 기술로 배아체의 내배엽 또는 중배엽으로의 특이적 분화를 촉진한다. 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 분화를 조절하기 위해서는 세포수용체에 작용하는 기술을 개발하는 것이 가장 중요하다. 그 이유는 신호전달 단백질 혹은 효소에 작용하는 기술은 세포수용체에 작용하는 기술에 비하여 신호전달 혹은 효소작용에 영향을 미치는 세포 내 다른 인자들에 의해 영향을 받을 가능성이 보다 높을 뿐 아니라, 분화정도의 조절을 위한 조작에 있어서도 상대적으로 어려울 수 있기 때문이다. 하지만, 세포 수용체를 이용한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 분화조절에 관한 것은 아직까지 알려진 바가 없었다.
이에, 본 발명자들은 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서 원하는 특정 조직 또는 세포로의 분화를 유도하고자 예의 노력한 결과, CXCR2 수용체의 자극을 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽으로의 선택적 분화가 촉진된다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 (i) 전분화능 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 단계; 및 (ii) 상기 배아체를 CXCR2의 리간드(ligand)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포를 외배엽으로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 CXCR2의 리간드(ligand)를 유효성분으로 함유하는 전분화능 줄기세포의 배아체로부터 외배엽으로의 분화유도용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 전분화능 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 단계; 및 (ii) 상기 배아체를 CXCR2의 리간드(ligand)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포를 외배엽으로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, CXCR2의 리간드(ligand)를 유효성분으로 함유하는 전분화능 줄기세포의 배아체로부터 외배엽으로의 분화유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 CXCR2 자극을 통한 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 외배엽 분화 방법은 특정 세포로 분화를 유도하기 위한 첫 번째 중요한 단계인 목적 세포의 기원이 되는 특정 배엽으로의 분화를 촉진하므로, 세포 치료제로서 줄기세포의 효율성 및 유용성을 높일 수 있다.
도 1은 여러가지 조건에서 배양된 인간 전분화능 줄기세포(hPSCs)를 GRO-α를 이용하여 2주간 분화 유도한 다음, 유전자 발현 변화를 실시간 연쇄중합효소반응을 통하여 분석하는 과정에 대한 모식도 및 2주간 분화유도 후 배아체의 모습을 확인한 결과이다.
도 2는 Nestin, Sox1, Pax6 및 Prox1 등의 외배엽(Ectoderm) 유전자들의 발현을 실시간 중합효소 연쇄 반응으로 확인한 결과이다.
도 3은 T, Snail2, Mixl1, Twist1, Myo 및 Flt1 등의 중배엽(Mesoderm) 유전자들의 발현을 실시간 중합효소 연쇄 반응으로 확인한 결과이다.
도 4는 AFP, GATA4, CXCR4, ZO1, Sox17 및 Foxa2 등의 내배엽(Endoderm) 유전자들의 발현을 실시간 중합효소 연쇄 반응으로 확인한 결과이다.
도 5는 GRO-α 단백질 (7.9kDa)의 구조를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 표면 수용체 CXCR2의 특이적인 리간드인 GRO-α를 이용하여 자극하여 활성화시킨 후, Nestin, Sox1, Pax6 및 Prox1 등의 외배엽 특이 유전자의 발현을 실시간 중합효소 연쇄 반응을 통하여 분석한 결과, 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체 CXCR2의 자극에 의해 외배엽으로의 분화가 현저히 유도되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 (i) 전분화능 줄기세포로부터 배아체를 형성시키는 단계; 및 (ii) 상기 배아체를 CXCR2의 리간드(ligand)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포를 외배엽으로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, CXCR2의 리간드(ligand)를 유효성분으로 함유하는 전분화능 줄기세포의 배아체로부터 외배엽으로의 분화유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 외배엽은 Nestin, Sox1, Pax6 및 Prox1(Kevin A D'Amour et al., nature biotech 23:1534-1541, 2005; AKK Teo et al., Genes & Development 25(3):238-250, 2011; C Verfaillie et al., Hematology 10(S1):293-296, 2005; H Kaspi et al., Stem Cells 31(10):2266-72, 2013; P Noisa et al., PLoS One 7(5);e37129, 2012)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 외배엽 및 외배엽성 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자는 네스틴(Nestin), 베타 튜불린 III, MAP-2, 뉴로필라멘트 헤비체인(Neurofilament Heavy chain), 도파민 베타 하이드록실레이즈(Dopamine beta hydroxylase), 뉴랄 셀 어드히젼 물질(neurla cell adhesion molecule), S-100, Pax-6, 뉴랄 튜불린 및 콜린 아세틸트랜스퍼레이즈(Choline acetyltransferase)등이 있으며, 세포의 종류에 따라 그 외 공지의 유전자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 신경 전구세포인 경우 네스틴, Dcx, Sox1, HuD 등의 유전자의 발현을 확인할 수 있고, 완전 분화된 신경세포인 경우 MAP2, NeuN, NF200, NSE 등을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 GRO-α인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 GRO-α는 5~20ng/ml의 농도인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10ng/ml의 농도인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
통상적으로, 줄기세포를 내배엽성, 중배엽성 또는 외배엽성 세포로 분화시키기 위해서는 각 배엽 특이적으로 분화를 유도하는 생화학 물질을 이용하는 방법이 사용되고 있다. 즉, 기존의 방법들은 외배엽성 세포로의 분화에는 레티노산(retinoic acid), 염화리튬(lithium chloride), 섬유세포성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF), 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF) 등을 사용하고 있고, 내배엽성 세포로의 분화에는 베타셀류린(betacellulin), 액티빈(activin), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, shh) 등을 사용하고 있으며, 중배엽성 세포로의 분화에는 덱사메타손(dexamethasone), 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide), 섬유세포성장인자, 혈관내피세포성장인자(VEGF) 등을 사용하고 있는 것처럼, 분화의 방향에 따라 매우 다양한 약물을 사용하고 있으며. 이러한 분화유도용 생화학적 물질들의 다양한 조합을 사용하기도 한다. 그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 다양한 생화학적 물질들의 사용에도 불구하고 분화율이 낮은 문제가 있으며, 또한, 종래의 방법에 의한 분화 방법은 대부분 장기간 동안 분화 과정이 진행되므로 분화과정 중 많은 양의 세포가 죽어 세포의 생존율도 큰 문제가 되어왔으며, 상기 bFGF, FGF8, SHH, BDNF 등은 대단히 고가여서 경제적으로도 장점이 존재하지 않는다. 그러나, 본 발명의 CXCR2 자극을 통한 외배엽으로의 분화유도는 인간 전분화능 즐기세포의 배양배지 조성(즉, bFGF 혹은 CXCR2 lignads 존재 여부)에 영향을 받지 않는다.
본 발명에 있어서, 배아체를 CXCR2의 리간드(ligand)를 함유하는 배지에서의 배양은 10~20일간 수행하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 14일간이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 인간 유래 배아줄기세포 또는 인간 유래 iPS(induced pluripotent stem) 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 전분화능 줄기세포는 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3배엽으로 분화가능한 (pluripotency) 줄기세포를 의미하며, 배아줄기세포는 물론 유도만능줄기세포(iPS, induced pluripotent stem cell), 성체줄기세포 중 그런 능력을 가진 세포들까지 포함하는 것이 바람직하다.
줄기세포의 분화 연구과정에서 가장 많은 시간이 걸리는 단계는 특정한 배양 조건이 분화 유도에 미치는 효과를 분석하는 단계이므로, 줄기세포를 특정 배엽성 세포로 분화시킬 수 있는 효과적인 방법이 요구된다. 특히, 분화유도 물질 등의 이용에 따른 타 물질에 의한 오염의 위험성을 배제하여, 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술이 필요하다.
[ 실시예 ]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인간 전분화능 줄기세포의 외배엽으로의 분화유도
인간 전분화능 줄기세포는 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는데, 세포분화를 유도하기 위해서는 일정기간 동안에 배아체를 형성하고 각 수용체들의 자극 및 활성화를 통해 삼배엽으로 분화가 결정지어지는 단계를 거쳐야 한다. 하지만, 아직까지 특이적 분화유도(lineage-specific differentiation)에 대하여 많은 부분이 개발되어야 하는 실정이다.
본 실시예에서는 외배엽 (ectodermal) 특이적 분화를 유도하기 위해 WiCell(http://www.wicell.org/)에서 인간 전분화능 줄기세포(hPSCs)를 구입하여 배양하여, 부착하지 않은 상태 (floating)로 low-attachment 6-well 배양 디쉬(Corning, USA)에서 배아체(Embryoid body) 를 형성하도록 한 후, 분화를 유도하였다. 분화 유도는 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 배아체의 표면 수용체 CXCR2를 CXCR2 특이적 리간드인 GRO-α (human recombinant GROα, R&D systems)를 2주간 10ng/ml의 낮은 농도로 첨가해 지속적으로 수용체를 자극하여 활성화시킴으로써 외배엽으로의 선택적 분화를 촉진시켰다. 본 실시예에서는 인간배아줄기세포주(H1)와 인간유도만능줄기세포(iPSC)의 2가지 줄기세포주를 사용하였다.
구체적으로, 두 가지의 배양조건과 두 가지의 줄기세포주를 이용하여 검증하였으며, 일반적으로 사용하는 배양조건(mTeSR1+Matrigel)에서 배양된 줄기세포주를 대조군으로 사용하고 CXCR2 리간드가 포함된 배양배지에서 배양된 줄기세포주를 실험군으로 사용하여 각 줄기세포주에서 배아체 형성을 유도하고 기본배지(BM)에 2주간 CXCR2 수용체를 자극하는 GRO-α를 첨가해준 배아체와 GRO-α를 첨가하지 않은 배아체 사이에 유전자 발현을 광범위하게 비교하였다. 14일간의 분화유도 기간은 특정 계열(lineage)의 세포로 분화를 유도하기에는 그리 긴 시간이 아니기 때문에 크게 삼배엽 계열(lineage) 발현을 전체적으로 확인한 뒤 특정 세포로의 선택적 분화는 그 이후에 이루어지며 통상 한 달에서 두 달간의 분화 유도 기간이 필요하다.
도 1의 대조군과 실험군은 대조군에서 배양된 인간배아줄기세포: mTeSR1+H1, 대조군에서 배양된 인간유도만능줄기세포: mTeSR1+iPSC, 실험군에서 배양된 인간배아줄기세포: hPCCM+H1, 실험군에서 배양된 인간유도만능줄기세포: hPCCM+iPSC, 대조군에서 배양된 인간배아줄기세포를 배아체를 형성하여 분화 유도 시 CXCR2 자극 리간드 GROα를 첨가해준 그룹: mTeSR1+H1+GROα, 대조군에서 배양된 인간유도만능줄기세포를 배아체를 형성하여 분화 유도 시 CXCR2 자극 리간드 GROα를 첨가해준 그룹: mTeSR1+iPSC+GROα 및 실험군도 이와 동일하다. 그리고 대조군과 실험군에서 배양된 세포에 CXCR2 자극 리간드 GROα를 첨가하지 않고 분화 유도한 그룹은 Control EB(Embryoid body)로 명명하였다. 두 가지 조건에서 배양된 세포를 발명에 사용한 것은 CXCR2 자극 선택적 분화 유도가 비단 한정된 배양환경에서 배양된 세포에만 적용되는 것이 아니라 모든 배양조건에서 배양된 인간 전능성 줄기세포에서 적용된다는 것을 증명하기 위해서이다.
실시예 2: 실시간 연쇄중합효소 반응을 통한 외배엽으로의 분화 확인
외배엽으로 분화를 유도한 다음, 외배엽 특이 발현 마커인 Nestin, Sox1, Pax6 및 Prox1 유전자의 현 변화를 실시간 연쇄중합효소반응을 통하여 분석하였다.
Qiagen RNeasy kit (Qiagen Hilden, Germany)를 이용하여 분화 유도된 세포로부터 RNA를 분리하고, 2㎍의 RNA, oligo(dT) 및 Superscript II reverse transcriptase (Gibco)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 각각의 cDNA에 표적 유전자의 프라이머와 iQ SYBR Green qPCR Master Mix를 넣고 Bio-Rad iCycler iQ system(Bio-Rad Laboratories, USA) 기기를 사용하여 분석하였다. 분석 값은 GAPDH 유전자를 이용하여 normalized 하였으며, 통계적으로 유의함을 나타내기 위하여 P Value 값을 사용하였다 (*P <0.05, **P <0.01, and ***P <0.001).
외배엽, 내배엽 및 중배엽 유전자들의 발현 분석을 위한 프라이머는 다음과 같다.
(1) 외배엽 (Ectoderm) 유전자
NESTIN: GCGTTGGAA CAGAGGTTGGA (서열번호 1)/ TGGGAGCAAAGATCCAAGAC (서열번호 2)
SOX1: CACAACTCG GAG ATC AGCAA (서열번호 3)/ GGTACTTGTAATCCGGGTGC (서열번호 4)
PAX6: CTGGCTAGCGAAAAGCAACAG (서열번호 5)/ CCCGTTCAACATCCTTAGTTTATCA (서열번호 6)
PROX1: GCTCCAATATGCTGAAGACC (서열번호 7)/ ATCGTTGATGGCTTGACGTG (서열번호 8)
(2) 중배엽 (Mesoderm) 유전자
T(Brachyury): AATTGGTCC AGCCTTGGAAT (서열번호 9)/ CGTTGCTCACAGACCACA (서열번호 10)
SNAIL2: ACAGCGAACTGGACACACAT (서열번호 11)/ GATGGGGCTGTATGCTCCT (서열번호 12)
MIXL1: GGTACCCCGACATCCACTT (서열번호 13)/ GCCTGTTCTGGAACCATACCT (서열번호 14)
TWIST1: AGCTACGCCTTCTCGGTCT (서열번호 15)/ CCTTCTCTGGAAACAATGACATC (서열번호 16)
MYOCARDIN: TCACTTTCTGCCCTCATCCT (서열번호 17)/ TCGTGTGCTCCTGAGTTCTG (서열번호 18)
Flt1: TCATGAATGTTTCCCTGCAA (서열번호 19)/ GGAGGTATGGTGCTTCCTGA (서열번호 20)
(3) 내배엽 (Endoderm) 유전자
AFP: AGAACCTGTCACAAGCTGTG (서열번호 21)/ GACAGCAAGCTGAGGATGTC (서열번호 22)
GATA4: TCCCTCTTCCCTCCTCAAAT (서열번호 23)/ TCAGCGTGTAAAGGCATCTG (서열번호 24)
CXCR4: CCTGCCTGGTATTGTCATCC (서열번호 25)/ AGGATGACTGTGGTCTTGAGG (서열번호 26)
ZO1: GGTCAGAGCCTTCTGATCATTC (서열번호 27)/ CATCTCTACTCCGGAGACTGC (서열번호 28)
SOX17: CAGACTCCTGGGTTTTTGTTGTTGCTG (서열번호 29)/ GAAATGGAGGAAGCTGTTTTGGGACAC (서열번호 30)
Foxa2: TTCTCCATCAACAACCTCATGTCC (서열번호 31)/ GTAGTGCATCACCTGTTCGTAGG (서열번호 32)
그 결과, GRO-α를 첨가하지 않은 대조군 세포에 비해 GRO-α를 처리하여 CXCR2를 자극한 실험군의 Nestin, Sox1, Pax6 및 Prox1 유전자 발현이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 2). 이러한 결과는 배양배지의 조성 차이와 관계없이 모든 조건에서 동일하게 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Method for Inducing Ectodermal Differentiation of Embryoid Bodies Derived from Human Pluripotent Stem Cells by CXCR2 Stimulation <130> P15-B220 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NESTIN-F <400> 1 gcgttggaac agaggttgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NESTIN-R <400> 2 tgggagcaaa gatccaagac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1-F <400> 3 cacaactcgg agatcagcaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1-R <400> 4 ggtacttgta atccgggtgc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6-F <400> 5 ctggctagcg aaaagcaaca g 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6-R <400> 6 cccgttcaac atccttagtt tatca 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PROX1-F <400> 7 gctccaatat gctgaagacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PROX1-R <400> 8 atcgttgatg gcttgacgtg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-F <400> 9 aattggtcca gccttggaat 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-R <400> 10 cgttgctcac agaccaca 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAIL2-R <400> 11 acagcgaact ggacacacat 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAIL2-R <400> 12 gatggggctg tatgctcct 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIXL1-F <400> 13 ggtaccccga catccactt 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIXL1-R <400> 14 gcctgttctg gaaccatacc t 21 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TWIST1-F <400> 15 agctacgcct tctcggtct 19 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TWIST1-R <400> 16 ccttctctgg aaacaatgac atc 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOCARDIN-F <400> 17 tcactttctg ccctcatcct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOCARDIN-R <400> 18 tcgtgtgctc ctgagttctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flt1-F <400> 19 tcatgaatgt ttccctgcaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flt1-R <400> 20 ggaggtatgg tgcttcctga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP-F <400> 21 agaacctgtc acaagctgtg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP-R <400> 22 gacagcaagc tgaggatgtc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4-F <400> 23 tccctcttcc ctcctcaaat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4-R <400> 24 tcagcgtgta aaggcatctg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4-F <400> 25 cctgcctggt attgtcatcc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4-R <400> 26 aggatgactg tggtcttgag g 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZO1-F <400> 27 ggtcagagcc ttctgatcat tc 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZO1-R <400> 28 catctctact ccggagactg c 21 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17-F <400> 29 cagactcctg ggtttttgtt gttgctg 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17-R <400> 30 gaaatggagg aagctgtttt gggacac 27 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxa2-F <400> 31 ttctccatca acaacctcat gtcc 24 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxa2-R <400> 32 gtagtgcatc acctgttcgt agg 23

Claims (10)

  1. (i) 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell)로부터 배아체를 형성시키는 단계; 및 (ii) 상기 배아체를 CXCR2의 리간드(ligand)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포 (iPSC)를 외배엽세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 외배엽세포는 Nestin, Sox1, Pax6 및 Prox1로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 배양은 10~20일간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 GRO-α는 5~20ng/ml의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.

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