DE102009002577B4 - Zellkulturträger für die Kultivierung von humanen Stamm- und Vorläuferzellen sowie ein Verfahren zur Kultivierung - Google Patents

Zellkulturträger für die Kultivierung von humanen Stamm- und Vorläuferzellen sowie ein Verfahren zur Kultivierung Download PDF

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Abstract

Zellkulturträger für die Kultivierung von humanen Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese, induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen, wobei embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, aufweisend – ein Grundsubstrat mit Mikrokavitäten von jeweils definiertem Volumen, wobei die Mikrokavitäten einen Durchmesser im Bereich von 5 µm bis 20 µm aufweisen und deren Tiefe im Bereich von 5 µm bis 40 µm liegt, – eine oder mehrere funktionale Beschichtungen von Polymeren, – eine weitere Beschichtung des Zellkulturträgers durch Kopplung einer oder mehrerer zelladhäsionsvermittelnder Komponenten mit der funktionalen Polymer-Beschichtung.

Description

  • Die Erfindung betrifft einen Zellkulturträger für die Kultivierung von humanen Stamm- und Vorläuferzellen, insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese, induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen, und ein Verfahren zur Kultivierung sowie zur Regulierung des Zellzyklus und der Differenzierung von Stamm- und Vorläuferzellen in vitro.
  • Als Stammzellen werden allgemein Körperzellen bezeichnet, die sich in verschiedene Zelltypen oder Gewebe ausdifferenzieren können. Stammzellen sind in der Lage, Tochterzellen zu generieren, die selbst wiederum Stammzelleneigenschaften besitzen, aber auch solche mit größerer Ausdifferenzierung. Stammzellen werden vor allem durch ihr ontogenetisches Alter und ihr Differenzierungspotenzial unterscheiden: die ontogenetisch frühesten Stammzellen sind die pluripotenten embryonalen Stammzellen, aus denen später die primitiven Keimstammzellen, sowie die somatischen Stamm- und Progenitorzellen, im Folgenden als Vorläuferzellen bezeichnet, hervorgehen. Außerhalb des Körpers, in vitro, neigen Stammzellen dazu, spontan zu differenzieren. Dies kann durch Faktoren teilweise unterbunden werden, die die Selbsterneuerung der Zellen fördern.
  • Blutstammzellen sind eine Art von Stammzellen, die normalerweise vorwiegend im Knochenmark vorkommen. Sie stellen den Ausgangspunkt für die gesamte Zellneubildung des Blutes und des Abwehrsystems dar und sind eigentlich die Zellen aus dem Knochenmark, die bei einer Transplantation wirklich nötig sind. Da die Blutstammzellen heute auch anders gewonnen werden können, spricht man meist nicht mehr von Knochenmarktransplantation, sondern allgemein von Blutstammzelltransplantation.
  • Bei der Aufbewahrung und Untersuchung von Spendermaterial sowie bei der Diagnostik von Blutstammzellen und ihrer Vervielfältigung ist es von Nachteil, dass auch Blutstammzellen und abgeleitete Zellen der Hämatopoiese, insbesondere blutbildenden Vorläuferzellen (HPC), nach der Entnahme aus dem natürlichen Umgebung des Organismus, in den Zellzyklus eintreten, differenzieren und ihre Stammzelleneigenschaft verlieren können. Es besteht daher ein Interesse daran, Blutstammzellen und abgeleitete Zellen der Hämatopoiese im ruhenden und undifferenzierten Zustand zu erhalten. Dabei ist die Kenntnis der Mechanismen von Nutzen, die im Organismus zur Regulierung des Zellzyklus und der Differenzierung von Blutstammzellen beitragen.
  • Innerhalb des Knochenmarks unterstützt eine spezialisierte Mikroumgebung, die „Stammzellennische”, den Erhalt und die Reifung der blutbildenden Stamm- und Vorläuferzellen (HPC). Wie dabei bei Schofield R., 1978, Blood Cells 4 (1–2) 7 bis 25, beschrieben wurde, bestehen in vielfältiger Weise Wechselwirkungen zwischen den blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) und ihrer Nische. Das schließt das Zusammenwirken von vielen Faktoren ein, zu denen die Moleküle der extrazellulären Matrix (ECM), Kontakte zwischen den Zellen sowie Zytokine zählen, die die Entwicklung der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) zwischen Zyklustätigkeit und Ruhezustand in der notwenigen Balance halten, was entweder zu einer Proliferation oder Apoptose, Selbsterneuerung oder Differenzierung führt (Wilson und Trumpp, 2006, Nat. Rev. Immunol. 6 (2), 93–106); Adam und Scadden, 2006, Nat. Immunol. 7 (4), 333 bis 337; Yin and Li, 2006, J. Clin. Invest. 116 (5), 1195–1201). Der Ruhezustand und die Zyklustätigkeit der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) im Knochenmark werden demnach ebenso wie die Selbsterneuerung und die Differenzierung durch ein komplexes Zusammenwirken von exogenen Signalen reguliert, die durch Moleküle der extrazellulären Matrix (ECM), durch Kontakte von Zelle zu Zelle und Zytokine ausgesendet werden.
  • Das Verständnis der Wirkung der verschiedenen exogenen Signale und ihres Zusammenspiels auf die Entscheidung über das Schicksal der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) ist ebenso eine Grundvoraussetzung für erfolgreiche Gewebebehandlungsstrategien wie für die Verbesserung der klinisch angewendeten Zellersatztherapien. In diesem Zusammenhang wurde in der Literatur bereits diskutiert, dass spezifische Wechselwirkungen zwischen den blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) und den Bestandteilen der extrazellulären Matrix (ECM) die Proliferation und die Differenzierungsentscheidungen einleiten können (Verfaillie, 1998 Blood 82 (8), 2609–2612; Yin and Li, 2006, J Clin Invest 116 (5), 1195–1201). So ist die Adhäsionsrezeptor-Signalisierung nicht nur wichtig für die Verankerung der Zelle, sondern verändert auch die Signalisierungswege der Wachstumsfaktoren (Jiang et al., 2000 Blood 95 (3), 846–854; Levesque et al., 1996, Blood 88 (4), 1168–1176). Wie von Nilsson und Simmons, 2004, Curr Opin Hematol 11 (2), 102 bis 106, beschrieben, steuern a4- und a5-Integrine die Proliferation und die Differenzierung der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) entweder direkt oder durch die Modulation der Zytokin-induzierten Signale. Andererseits ist bekannt, dass nicht nur die Art der Adhäsionsliganden die Entscheidungen über das Schicksal der Zellen steuert, sondern dass auch die Stärke der Zelladhäsionskräfte und deren Verteilung sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung der Zellen beeinflussen können (Engler et al., 2006, Cell 126 (4), 677 bis 689, Ingber, 2003, J Cell Sci 116 (Pt 8), 1397 bis 1408). Darüber hinaus spielt auch die dreidimensionale Anordnung der Bausteine der extrazellären Matrix (ECM) eine wichtige Rolle beim Aufbau der Zellen und beim Auslösen der Entscheidungen über ihr Schicksal (Geiger, 2001, Science 294 (5547), 1661 bis 1663; Zaman et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103 (29), 10889 bis 10894). Deshalb kann auch von einem Einfluss auf die Entscheidung über das Schicksal der Zellen in der Knochenmarknische ausgegangen werden.
  • Die JP 2000-300248 A beschreibt ein Substrat zur Kultivierung von tierischen Gewebezellen. Dabei wird ein Substrat für eine Kultivierung derart mit Vertiefungen vorgesehen, dass durch deren Geometrie die Geschwindigkeit des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung von tierischen Gewebezellen effektiv erhöht wird. Dabei ist das Substrat mit einer Vielzahl von Vertiefungen versehen, deren Durchmesser beziehungsweise Länge in einem Bereich von 30 bis 250 Mikrometer liegt. Bevorzugt wird dabei ein Bereich zwischen 50 und 150 Mikrometer angewendet. Die zu kultivierenden tierischen Zellen weisen im Vergleich dazu eine Größe von 20 bis 40 Mikrometer auf.
  • In der US 2005/0208644 A1 ist ein Verfahren zur Immobilisierung einer chemischen Verbindung mit einer Affinität für die Zellmembran an der festen Oberfläche in einem gewünschten Muster beschrieben. Das Verfahren erfolgt durch die Verwendung einer ersten chemischen Verbindung mit einer Affinität für die Zellmembran und kann einen Schritt zur Abscheidung einer zweiten chemischen Verbindung umfassen, die besser auf der festen Oberfläche anhaftet als die erste chemische Verbindung und eine molekulare Bindungsstelle aufweist, die eine Verbindung zur ersten chemischen Verbindung herstellen kann.
  • Die JP 2005-333938 A beschreibt ein Zell-Fixierungselement, ein Zell-Fixierungsverfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung des Zell-Fixierungselements, wobei das Zell-Fixierungselement die Fixierung der Zellen in der gewünschten Position mit hoher Genauigkeit leicht ermöglichen soll, ohne die Zellen zu schädigen. Dazu weist eine Petrischale zur Zellfixierung eine Vielzahl von Polymerflecken auf, die aus einem temperaturreaktiven Polymer bestehen und unabhängig voneinander in identischer Form in gleichen Abständen auf einer Bodenfläche eines zellfixierenden Basismaterials gebildet sind. Des Weiteren weist die Petrischale eine Vielzahl von Schichten aus der Extrazellulären Matrix (ECM) auf, die aus extrazellulären anbindenden Faktoren bestehen und unabhängig voneinander sind. Die Zellen sind jeweils durch die ECM-Schicht auf einem Polymerfleck in einem festen Arraymuster der Polymerflecken fixiert.
  • Aus der DE 103 15 930 A1 ist ein Verfahren zur Vaskularisierung von künstlichen Zellträgermaterialien bekannt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Oberfläche des künstlichen Materials
    • a) mit hydrophoben und hydrophilen funktionellen Gruppen in einem Verhältnis angereichert wird, so dass die überwiegende Hydrophilie der Oberfläche einen Wasserkontaktwinkel von 40 bis 50° aufweist,
    • b) ein Matrixprotein an dieser modifizierten Oberfläche schwach adsorbiert wird, wonach
    • c) Endothelzellen am Matrixprotein angesiedelt werden und dass die schwache Adsorption der Matrixproteine auf dem Copolymer eine dreidimensionale Selbststrukturierung der Endothelzellen mit dem Matrixprotein zulassen.
  • In der DE 103 20 421 A1 sind mikrostrukturierte Polymerträger mit speziellen Formaten für die medizinische, biochemische und molekularbiologische Analytik und Diagnostik beschrieben. Dabei werden mit Hilfe radikalbildender Verfahren dünne, funktionelle Polymerschichten auf mikrostrukturierte Kunststoffsubstrate in Form von Mikrotiterplatten, Folien oder Thermocycler-Behältnissen aufgepfropft, die in der Lage sind, Bioliganden, wie zum Beispiel Proteine, Rezeptoren, Nukleinsäuren und Kohlenwasserstoffe, kovalent zu binden. An diese Bioliganden können Analyten, wie Biomoleküle, phatogene Substanzen, Phagen oder Ribosome, komplementär binden, die auf diese Weise aus einem Gemisch selektiv abgetrennt und analysiert werden können. Die mikrostrukturierten Träger weisen Mikrovertiefungen mit einer Volumenkapazität von 10 bis 1000 µl auf.
  • Aus der Druckschrift Salchert, K. et al., Biomacromolecules 5(4), 2004, S. 1340–50, ist die Anwendung von Fibrillen bildenden Kollagen-Lösungen für die Beschichtung von ebenen, zuvor mit Maleinsäureanhydrid-Copolymer beschichteten Substraten bekannt.
  • Durch Herklotz, M. et al., Microfluid Nanofluid 3, 2007, S. 629, wird die Präparation von Zellkulturträgern mit seitlichen Strukturen von verschiedenen Proteinbindungen an einer reaktiven Oberfläche von Poly-(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) beschrieben. Die Proteinmikrostruktur, die durch die beschriebene Technik erhalten werden konnte, beeinflusste dabei direkt die Eigenschaften von humanen endothialen Zellen.
  • Franke, K. et al., Biomaterials 5, 2007, S. 836–43, beschreiben die Präparation von Matrixbeschichtungen. Um die Rolle der Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) der Nischen-Mikroumgebung zu untersuchen, wurden eine Reihe von gut definierten ECM-Beschichtungen, unter anderem mit Fibronektin, hergestellt und im Hinblick auf die Anlagerung von menschlichen CD133-positiven Blutstammzellen in vitro analysiert.
  • Oswald, J. et al., Stem Cells 24, 2006, 494–500, beschreiben das Gene-Expression-Profiling von Blut bildenden CD34+-Zellen, die in einer Collagen-I-Matrix wachsen. Das Ziel besteht dabei darin, den Einfluss von Collagen-I-Fibrillen auf das in vitro Wachstum von CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut zu untersuchen. Dabei werden Zellen aus verschiedenen Nabelblutspenden in kommerziell erhältlichen 12-Well-Mikrotiter-Platten (TPP der Firma Biochrom Berlin) kultiviert.
  • Die DE 10 2007 055 865 B3 beinhaltet nachveröffentlichten Stand der Technik und betrifft eine modifizierte Multi-Well-Platte für biochemische Analysen und Zellkulturexperimente. Dabei erfolgt eine Mikrostrukturierung nach einer ersten funktionalen Beschichtung eines Grundsubstrates.
  • Die Erhaltung der Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese in ruhendem und undifferenzierten Zustand hat, wie bereits erwähnt, insbesondere Bedeutung bei der Aufbewahrung und Untersuchung von Spendermaterial sowie zur Diagnostik und Vervielfältigung von Blutstammzellen. Des Weiteren kann ein solches Verfahren auch bei gentechnischen Veränderungen von Blutstammzellen eingesetzt werden, da bei diesen das Schalten zwischen aktivem Zellzyklus und ruhendem Zustand essentiell ist. Doch auch die Erhaltung des Stammzellencharakters anderer Stammzellenarten und Vorläuferzellen bei der Aufbewahrung und Untersuchung, insbesondere von induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen, ist von Bedeutung.
  • Daher besteht die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe darin, entsprechende Mittel und Verfahren bereitzustellen, die den Erhalt des Stammzellcharakters, Verhinderung einer Differenzierung und der Regulierung des Zellzyklus bei humanen Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere bei Blutstammzellen, abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese, induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen in vitro ermöglichen.
  • Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Zellkulturträgern für humane Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese, induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen, wobei embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, die zunächst ein Grundsubstrat mit Mikrokavitäten von jeweils definiertem Volumen aufweisen. Dabei können Größe und Form der einzelnen Mikrokavitäten auf einem Zellkulturträger voneinander variieren, wobei kugel- oder zylinderförmige oder an eine Kugel- oder Zylinderform angenäherte Mikrokavitäten besonders vorteilhaft sind, deren Volumen jeweils in der Größenordnung der einzelnen zu kultivierenden Stamm- und Vorläuferzellen liegt, jedoch geringfügig größer als das Volumen einer entsprechenden Stamm- und Vorläuferzelle ist. Erfindungsgemäß weisen die Mikrokavitäten eine Tiefe von 5 µm bis 40 µm auf, während die Durchmesser im Bereich von 5 µm bis 20 µm liegen. Eine vorteilhafte Ausführung der Mikrokavitäten könnte eine zylinderförmige Vertiefung mit einem flachen oder halbkugelförmigen Boden darstellen.
  • Das mit Mikrokavitäten versehene Grundsubstrat erhält gemäß der Erfindung eine oder mehrere funktionale Beschichtungen von Polymeren, das heißt, dass die Beschichtungspolymere funktionelle Gruppen für die Kopplung mit weiteren Beschichtungskomponenten aufweisen. Eine weitere Beschichtung des Zellkulturträgers ist erfindungsgemäß durch Kopplung einer oder mehrerer zelladhäsionsvermittelnder Komponenten mit der funktionalen Polymer-Beschichtung vorgesehen.
  • Die Mikrokavitäten weisen in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, die insbesondere für die Kultivierung von Blutstammzellen geeignet ist, eine Tiefe von 10 µm auf, während die Durchmesser im Bereich von 15 µm bis 20 µm liegen. Als besonders vorteilhaft erwiesen sich Mikrokavitäten mit einem Durchmesser von 15 μm. Allgemein richten sich die Volumina der Mikrokavitäten insbesondere nach den Größen der jeweiligen Stamm- und Vorläuferzellenarten, wodurch beispielweise zylinderförmige Vertiefungen mit einem Durchmesser von 5 µm bis 20 µm und einer Tiefe von 5 µm bis 40 µm bei induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen vorteilhaft wären.
  • Vorzugsweise weist das Grundsubstrat eine Silikonoberfläche auf. Das Silikon-Grundsubstrat kann auf folgendem Wege hergestellt werden, so dass es mit Mikrokavitäten versehen und für Beschichtungen geeignet ist: Eine Reihe von Silizium-Mustervorlagen wird unter Anwendung von photolithografischem Ätzen vorzugsweise mit flächensymmetrisch angeordneten zylinderförmigen Erhebungen zwischen 15 und 80 µm im Durchmesser und mit den jeweiligen Entfernungen von 30 bis 160 µm und mit einer Höhe von 10 μm gestaltet. Nach Fluorsilanisierung der Mustervorlagen, vorzugsweise mit [(Heptadecafluoro-1, 1,2,2. Tetrahydrodecyl)-dimethylchlorsilan], werden dünne Silikon-Filme von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) von der mikrostrukturierten Mustervorlage durch Abguss und Vernetzung des Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) Zweikomponentensystems repliziert. Die mikrostrukturierten Silikonfolien werden nun unter Anwendung einer Vorbehandlung mit Niederdruck-Sauerstoff-Plasma auf deren Rückseite auf gereinigten Glasträgern befestigt.
  • Alternativ zur Silikonoberfläche kann das Grundsubstrat auch eine Oberfläche aus Polystyren, Polypropylen oder synthetischen polymeren Hydrogelen aufweisen.
  • Die funktionale Beschichtung des Grundsubstrats ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform das Ergebnis einer kovalenten Bindung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an die Grundsubstratoberfläche. Vorzugsweise erfolgt diese kovalente Kopplung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an aminosilanisierten Silikon-Mikrostrukturen.
  • In den bereits erwähnten alternativen Ausführungsformen mit Polystyren- und Polypropylen-Grundsubstrat erfolgt die kovalente Kopplung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an die Polystyren- oder Polypropylen-Mikrostrukturen durch Aminogruppen, welche durch Ammoniak-Niederdruckplasmafunktionalisierung von Polystyren oder Polypropylen entstehen.
  • Als weitere Beschichtung ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Kopplung einer oder mehrerer verschiedener zelladhäsionsvermittelnder, in der extrazellulären Matrix (ECM) der natürlichen Zell-Mikroumgebung im Knochenmark vorkommender Komponenten, insbesondere von Proteinen, Zuckern und Glycosaminoglycanen, mit der funktionalen Beschichtung der Polymere vorgesehen. Diese Variante ist insbesondere für Zellkulturträger für die Kultivierung von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese relevant. Als zelladhäsionsvermittelnde Komponenten für die Beschichtung können in einer anderen Ausführungsform auch synthetische Peptide verwendet werden.
  • Anschließend können die Zellen an den beschichteten Zellkulturträgern entwickelt werden. Dabei haftet ein Teil der Zellen durch Adhäsion in den Mikrokavitäten am Zellkulturträger an.
  • Eine besonders bevorzugte zelladhäsionsvermittelnde Komponente der extrazellulären Matrix (ECM) für die Beschichtung des funktional beschichteten Zellkulturträgers stellt Fibronektin (FN) dar. Auf der Grundlage von neueren Untersuchungen über die Modulation von Art und Morphologie der Adhäsion der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) an verschiedenen Komponenten der extrazellären Matrix (ECM) wird bevorzugt Fibronektin (FN) als relevanter Ligand der extrazellulären Matrix (ECM) eingesetzt, weil es eine sehr starke Wechselwirkung von blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) zu festen Trägern bewirkt. Außerdem ist Fibronektin (FN) als ein wesentlicher Bestandteil der extrazellulären Matrix des Knochenmarks anzusehen, der bereits während der Knochenmark-Bildung ausgeschieden wird. Bei einer funktionalen Beschichtung des Zellkulturträgers mit Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) wird Fibronektin (FN) vorteilhaft über seine Lysin-Seitenkette an den Anhydridgruppen kovalent angebunden.
  • In der alternativen Ausführung des Grundsubstrats mit einer Oberfläche aus synthetischen polymeren Hydrogelen ist Fibronektin (FN) kovalent an Hydrogelstrukturen angebunden.
  • Mit den oben beschriebenen Zellkulturträgern ist die Durchführung eines Verfahrens zur Kultivierung von humanen Stamm- und Vorläuferzellen, insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen möglich, in dem die Zellen in vitro an einem solchen Zellkulturträger entwickelt werden.
  • Das Verfahren beinhaltet die folgenden Verfahrensschritte a–c):
    • a) die Zellen werden in einem fluiden Zellkulturmedium entwickelt,
    • b) die Zellen werden direkt auf die mit zelladhäsionsvermittelnden Komponenten beschichteten Mikrokavitäten plattiert,
    • c) die Zellen werden auf den Zellkulturträgern kultiviert, wobei ein Teil der Zellen in den Mikrokavitäten durch Adhäsion anhaftet.
  • Die Konzeption der Erfindung besteht in der Ausnutzung von Auswirkungen der Ligandverteilung und von räumlichen Zwängen in der Entwicklung der Stammzellen und Vorläuferzellen (HPC). Überraschenderweise unterstützt die Ausübung eines räumlichen Zwangs durch Adhäsion von Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere von blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) in den mit Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) bedeckten Kavitäten den Erhalt der Zellen im ruhenden und im unreifen Zustand. Als besonders vorteilhaft lassen sich die Auswirkungen der geometrischen Zwänge und Adhäsions-Wechselwirkungen auf die Entwicklung der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) erkennen, bei denen als Kulturträger Substrate mit Mikrokavitäten mit 15 µm Durchmesser dienten.
  • Vorzugsweise werden die Zellen in einem Serum-freien Zellkulturmedium entwickelt, dass mit Zytokinen ergänzt wird. In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Regulierung des Zellzyklus auch über eine Veränderung der Zytokinkonzentration erfolgen. So hat die Zytokinkonzentration nachweislich Auswirkungen auf die Zyklustätigkeit von unter räumlichem Zwang stehenden blutbildenden Vorläuferzellen. Eine Verringerung der Zyklusgeschwindigkeit der blutbildenden Vorläuferzellen mit abnehmender Mikrokavitätengröße bei niedrigen Zytokin-Konzentrationen kann bei höheren Zytokin-Konzentrationen unterdrückt werden. Im Gegensatz dazu führt die Reduzierung der Zytokin-Konzentration zu einem zunehmenden Einfluss der durch die Adhäsion herbeigeführten Hemmung der Zyklustätigkeit. Eine Verringerung der Geschwindigkeit des Zellzyklus erfolgt beispielsweise mit abnehmender Mikrokavitätengröße bei 10 ng/ml Zytokin jeweils vom Stammzellen-Faktor (SCF), dem Thrombopoietin (TPO) und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1L oder auch FL3). Im Gegensatz dazu wird eine Verringerung der Geschwindigkeit des Zellzyklus mit abnehmender Mikrokavitätengröße bei 30 ng/ml Zytokin jeweils vom Stammzellen-Faktor (SCF), dem Thrombopoietin (TPO) und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1L oder auch FL3) unterdrückt.
  • Vorzugsweise werden die Zellen direkt auf mit den zelladhäsionsvermittelnden Komponenten beschichteten Mikrokavitäten plattiert. Bevorzugt werden als zelladhäsionsvermittelnden Komponenten solche verwendet, die in der extrazellulären Matrix (ECM) der natürlichen Zell-Mikroumgebung im Knochenmark vorkommen, insbesondere Proteine, Zucker und Glycosaminoglycane. In einer besonders vorteilhaften Ausführung der Erfindung werden die Zellen direkt auf mit Fibronektin (FN) beschichteten Mikrokavitäten plattiert, die mit dem Zellkulturmedium bei 37 °C vorinkubiert wurden. Alternativ dazu können die Zellen auch direkt auf Mikrokavitäten plattiert werden, die mit synthetischen Peptiden als zelladhäsionsvermittelnde Komponenten beschichtet sind.
  • Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:
  • 1: die Proteinimmobilisierung auf einer mikrostrukturierten Oberfläche,
  • 2: die Oberflächen-Expression von den Stammzellenmarkern CD133 und CD34 auf den blutbildenden Vorläuferzellen,
  • 3: den proliferativen Zustand der blutbildenden Vorläuferzellen bei hoher und niedriger Zytokin-Konzentration,
  • 4: der Einfluss des Zusammenwirkens von Zytokinkonzentration und Adhäsion auf den Zellzyklus
  • Die 1 zeigt die Protein-Immobilisierung auf mikrostrukturierten Oberflächen. (1A) Nach der kovalenten Bindung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an eine Silikon-Oberfläche wurde Fibronektin (FN) über seine Lysin-Seitenkette der Anhydridsubstanz kovalent beigefügt. Die Oberfläche wurde geprüft unter Nutzung von 3D-Darstellungen von fluoreszenzmarkiertem Fibronektin durch konfokale Laserscanningmikroskopie (1B, Maßstab 40 μm) und Raster-Elektronenmikroskopie (1C, Maßstab 50 und 5 μm).
  • Die Herstellung funktionaler Mikrostrukturen zur Ausübung von räumlichem Zwang auf die Stammzellen und blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) wurde wie nachfolgend beschrieben realisiert. Eine Reihe von Silikon-Mustervorlagen wurden unter Anwendung von fotolithografischem Ätzen (GeSiM, Rossendorf, Deutschland) mit flächensymmetrisch angeordneten zylinderförmigen Erhebungen zwischen 15 und 80 µm im Durchmesser und mit den jeweiligen Entfernungen von 30 bis 160 µm und mit einer Höhe von 10 μm gestaltet. Nach Fluorsilanisierung [(Heptadecafluoro-1, 1,2,2. Tetrahydrodecyl)-dimethylchlorsilan, ABCR, Karlsruhe, Deutschland] der Druckvorlagen wurden die dünnen Silikon-Filme von Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard® 184 Silikon-Elastomer-Kit, Dow Corning) aus der mikrostrukturierten Mustervorlage repliziert, wobei das Verhältnis Härter zu Prepolymer 10:1 betrug. Die mikrostrukturierten Silikonfolien wurden unter Anwendung einer Vorbehandlung mit Niederdruck- Sauerstoff-Plasma (PDC-002, Harrick Plasma) auf deren Rückseite auf gereinigten Glasträgern (Menzel, Braunschweig, Deutschland) festgehalten. Dünne Schichten aus Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) (Polysciences Inc., Warrington, PA, USA, MW 125000) wurden kovalent auf die aminosilanisierten Silikon-Mikrostrukturen aufgebracht, wie bei Pompe T. et al., 2003b, Biomacromolecules 4 (4), 1072 bis 1079 berichtet. Vor der Fibronektin (FN)-Immobilisierung wurden die Anhydridsubstanzen regeneriert, um die kovalente Bindung von Fibronektin (FN) sicherzustellen (Pompe et al., 2003a, J Biomed Mater Res A 67 (2), 647 bis 657). Fibronektin (FN), aufbereitet aus adultem menschlichen Plasma nach einer Vorschrift von (Poulouin et al. 1999, Prot Expr Purif 17 (1), 146 bis 152), wurde auf eine Konzentration von 20 μg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt (Dulbecco's PBS, Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland). Die Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) beschichteten Mikrostrukturen wurden dann mit Fibronektin (FN)-Lösung 1 Stunde lang inkubiert und anschließend mehrfach mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Die Qualität und die Stabilität der Schichten wurden unter Nutzung von Fibronektin(FN)-Fluoreszenzmarkierung mit Carboxytetramethylrhodamine [(Tamra) FluoReporter (Invitrogen, Molecular Probes)] überprüft. Die Intensität der Fluoreszenz wurde sieben Tage lang mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop (TCS SP1, Leica, Wetzlar, Deutschland) überwacht, während die Oberflächen in 10% fetalem Rinderserum in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert wurden, um die Stabilität des immobilisierten Fibronektins (FN) gegen Verdrängung durch andere Proteine zu prüfen.
  • Ausgewählte menschliche CD133-positive blutbildende Vorläuferzellen aus peripherem Blut, die Vertreter der frühen Vorläuferzellen mit Multilineage und repopulativer Kapazität sind, wurden auf diesen Fibronektin(FN)-beschichteten mikrostrukturierten Substraten entwickelt. Durch die Analyse der Proliferation der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) und Differenzierung der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) auf der Ebene der Population und der Einzelzelle konnte das Zusammenwirken von räumlichen Zwängen, Adhäsions-Wechselwirkungen und Zytokin-Konzentrationen auf die Entscheidungen über das Schicksal der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) in vitro aufgeklärt werden.
  • Für die Untersuchung wurden Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor(G-CSF)-mobilisierte menschliche blutbildende Vorläuferzellen (HPC) aus peripherem Blut von gesunden Spendern nach Anleitung des Herstellers (CD133 indirekte Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) immunomagnetisch für CD133-positive Zellen isoliert: Die Zellen wurden in Serum-freien CellGro Medium (CellGenix, Freiburg, Deutschland) aufwachsen gelassen, ergänzt mit entweder 10 ng/ml Zytokin (niedrige Zytokin-Konzentration) oder 30 ng/ml Zytokin (hohe Zytokin-Konzentration) jeweils vom Stammzellen-Faktor (SCF) (Strathmann Biotech AG, Hannover, Deutschland), dem Thrombopoietin (TPO) und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1L oder auch FL3) (beide R & D, Mannheim, Deutschland). Frisch isolierte Zellen wurden direkt auf Fibronektin beschichtete Mikrokavitäten plattiert, die mit dem Medium bei 37 °C vorinkubiert wurden. Für die Proliferations- und Differenzierungsuntersuchungen wurden die blutbildenden Vorläuferzellen sieben Tage lang auf Fibronektinformen kultiviert. Nicht anhaftende und anhaftende Zellen wurden nach 4 min Trypsin-Behandlung gesammelt, gezählt (Casy Cell Counter Schärfe Systems, Reutlingen, Deutschland), gewaschen und für die Durchflusszytometrie-Analyse (FACS Calibur, BD, Deutschland) unter Nutzung von Anti-CD133-Phycoerythrin (PE) und Anti-CD34-Allophycocyanin (APC, die Miltenyi Biotech) markiert. Für die Immunfluoreszenz-Laserscanning-Mikroskopie (SP5, Leica, Wetzlar, Deutschland) der anhaftenden Zellen wurden nach sieben Tagen die blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) zusätzlich sekundär mit Isotyp-spezifischen AlexaFluor546 und AlexaFluor647 Ziege-Anti-Maus (Invitrogen) markiert, da PE und APC schnell bleichende Fluorochrome sind. Die Isotyp-Spezifität der AlexaFluor-Antikörper wurde zytometrisch überprüft. Die Zyklustätigkeit von Zellen wurde mit der Aufnahme von 20 μM Bromodeoxyuridin (BrdU, Invitrogen) in die sich reduplizierende DNA während der vorangegangenen 24 Stunden vor der Fixierung in 70% eiskaltem Ethanol zum Zeitpunkt von 24 Stunden, drei Tagen und sieben Tagen der Zell-Kultivierung festgestellt. Die Bromodeoxyuridin (BrdU)-Aufnahme wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) für anhaftende Zellen auf planaren Oberflächen und nicht anhaftende Zellen gemessen. Für Haftung der blutbildenden Vorläuferzellen auf Fibronektin beschichteten Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)-Formen wurde Bromodeoxyuridin (BrdU) nach der Markierung mit Anti-BrdU und sekundären AlexaFluor488 Ziege-Anti-Maus (beide Invitrogen, Molecular Probes) durch ein Fluoreszenzmikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland) visualisiert und mit Propidiumjodid gegengefärbt. Zyklisierende Zellen wurden unter Anwendung von ImageJ Software gegenüber nicht zyklisierenden Zellen gezählt.
  • Die 2 zeigt die Oberflächen-Expression von CD34- und CD133-Stammzellenmarkern auf den blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) (2B). Die Proliferation von blutbildenden Vorläuferzellen (HPC), die auf mikrostrukturierten Oberflächen kultiviert wurden, war im Vergleich zu Kontrollzellen nach 7 Tagen und zumindest in den 15 μm großen Kavitäten reduziert (2D). Die Stammzellenmarker-Expression nutzende Durchflusszytometrie (2B, 2C) zeigte einen höheren Anteil an undifferenzierten blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) auf den Zellkulturträgern mit 15 μm großen Mikrokavitäten. Eine Einzelzellen-Immunfluoreszenzanalyse von anhaftenden Zellen (2E) zeigte eine höhere Expression des jeweiligen Stammzellenmarkers von blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) innerhalb der Mikrokavitäten im Vergleich zu Zellen außerhalb der Mikrokavitäten. Die Daten werden als Mittelwert + Standardabweichung; bei einer Anzahl unabhängiger Experimente n = 3 bis 8 dargestellt.
  • Die 3 zeigt den proliferativen Zustand der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) einerseits unter niedrigen und andererseits unter hohen Zytokin-Konzentrationen. Die Zellzyklustätigkeit wurde durch die Aufnahme von Bromodeoxyuridine (BrdU) während der vorhergehenden 24 Stunden und die Zytometrie- (3A, 3B) oder Immunfluoreszenz-Analyse (3C, 3D) bestimmt. Die Adhäsion von blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) an Fibronektin (FN) förderte den Eintritt des Zellzyklus nach einem Tag und wurde noch beschleunigt durch die Erhöhung der Zytokin [Thrombopoietin (TPO), Stammzellen-Faktor (SCF) und Stammzell-Tyrosin-Kinase-1 Ligand (STK-1L/FL3)]-Konzentration von jeweils 10 auf 30 ng/ml. Der prozentuale Anteil der zyklisierenden Zellen erreicht nach drei Tagen einen Gleichgewichtszustand. Eine Verringerung der Zyklusgeschwindigkeit der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) mit abnehmender Mikrokavitätengröße bei niedrigen Zytokin-Konzentrationen wurde bei höheren Zytokin-Konzentrationen unterdrückt. Die Daten werden in 3 als Mittelwert + Standardabweichung (SEM) dargestellt.
  • Die 4 zeigt schematisch den Einfluss des Zusammenwirkens der Zytokin-Konzentration und der Adhäsion auf die Zellzyklustätigkeit. (t = 0 – 1d) In den frühen Phasen synergieren die Adhäsion- und Zytokin-Aktivierung, um zunächst die Zyklustätigkeit zu starten. (t > 1d) Für spätere Zeitpunkte ist die mit der Adhäsion verbundene Aktivierung durch die verstärkte Zytokin-Aktivierung überschrieben, die zur Stimulation der Zellzyklustätigkeit führt. Im Gegensatz dazu führt die Reduzierung der Zytokin-Konzentration zu einem zunehmenden Einfluss der durch die Adhäsion herbeigeführten Hemmung der Zyklustätigkeit.
  • Bezugszeichenliste
    • BrdU
    Bromodeoxyuridine
    ECM
    extrazelluläre Matrix
    FACS
    „fluorescence activated cell sorting“, welches häufig synonym zu Durchflusszytometrie verwendet wird
    STK-1L
    Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (oder auch FL3)
    FN
    Fibronektin
    G-CSF
    Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor
    HPC
    blutbildende Vorläuferzellen
    PBS
    phosphatgepufferte Kochsalzlösung
    PEMA
    Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid)
    PDMS
    Poly(dimethylsiloxan)
    TPO
    Thrombopoietin
    SCF
    Stammzellen-Faktor

Claims (23)

  1. Zellkulturträger für die Kultivierung von humanen Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese, induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen, wobei embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, aufweisend – ein Grundsubstrat mit Mikrokavitäten von jeweils definiertem Volumen, wobei die Mikrokavitäten einen Durchmesser im Bereich von 5 µm bis 20 µm aufweisen und deren Tiefe im Bereich von 5 µm bis 40 µm liegt, – eine oder mehrere funktionale Beschichtungen von Polymeren, – eine weitere Beschichtung des Zellkulturträgers durch Kopplung einer oder mehrerer zelladhäsionsvermittelnder Komponenten mit der funktionalen Polymer-Beschichtung.
  2. Zellkulturträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokavitäten kugel- oder zylinderförmig ausgebildet sind oder an die Kugel- oder Zylinderform angenähert sind.
  3. Zellkulturträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der einzelnen Mikrokavität geringfügig größer als das Volumen der entsprechenden Stamm- und Vorläuferzelle ist.
  4. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokavitäten eine zylinderförmige Vertiefung mit einem flachen oder halbkugelförmigen Boden darstellen.
  5. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokavitäten einen Durchmesser von 10 bis 15 µm aufweisen.
  6. Zellkulturträger nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokavitäten einen Durchmesser von 15 µm aufweisen.
  7. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokavitäten eine Tiefe von 10 µm haben.
  8. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Grundsubstrat eine Silikonoberfläche aufweist.
  9. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Grundsubstrat eine Oberfläche aus Polystyren, Polypropylen oder synthetischen polymeren Hydrogelen aufweist.
  10. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionale Beschichtung in einer kovalenten Bindung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an die Grundsubstrat-Oberfläche besteht.
  11. Zellkulturträger nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Kopplung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an aminosilanisierten Silikon-Mikrostrukturen der Grundsubstratoberfläche erfolgt.
  12. Zellkulturträger nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Kopplung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an Polystyren- oder Polypropylen-Mikrostrukturen durch Aminogruppen erfolgt, welche durch Ammoniak-Niederdruckplasmafunktionalisierung von Polystyren oder Polypropylen entstehen.
  13. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als zelladhäsionsvermittelnde Komponenten für die Beschichtung solche verwendet werden, die in der extrazellulären Matrix (ECM) der natürlichen Zell-Mikroumgebung im Knochenmark vorkommen, insbesondere Proteine, Zucker und Glycosaminoglycane.
  14. Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als zelladhäsionsvermittelnde Komponenten für die Beschichtung synthetische Peptide verwendet werden.
  15. Zellkulturträger nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als zelladhäsionsvermittelnde Komponente der extrazellulären Matrix (ECM) für die Beschichtung Fibronektin (FN) dient.
  16. Zellkulturträger nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Fibronektin (FN) über seine Lysin-Seitenkette an den Anhydridgruppen von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) als funktionale Beschichtung kovalent angebunden ist.
  17. Zellkulturträger nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Fibronektin (FN) kovalent an Hydrogelstrukturen angebunden ist.
  18. Verfahren zur Kultivierung von humanen Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese, induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen, wobei embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, in vitro unter Verwendung von Zellkulturträgern nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem in den Verfahrensschritten a–c): a) die Zellen in einem fluiden Zellkulturmedium entwickelt werden, b) die Zellen direkt auf die mit zelladhäsionsvermittelnden Komponenten beschichteten Mikrokavitäten plattiert werden, c) die Zellen auf den Zellkulturträgern kultiviert werden, wobei ein Teil der Zellen in den Mikrokavitäten durch Adhäsion anhaftet.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in Serum-freien Zellkulturmedium entwickelt werden, das mit Zytokin ergänzt wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Regulierung des Zellzyklus über eine Veränderung der Zytokinkonzentration erfolgt.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass im Zellkulturmedium je 10 ng/ml der Zytokine Stammzellen-Faktor (SCF), Thrombopoietin (TPO) und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1L oder auch FL3) vorliegen.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass im Zellkulturmedium je 30 ng/ml der Zytokine Stammzellen-Faktor (SCF), Thrombopoietin (TPO) und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1L oder auch FL3) vorliegen.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen direkt auf mit Fibronektin (FN) beschichteten Mikrokavitäten plattiert werden, die mit dem Zellkulturmedium bei 37 °C vorinkubiert wurden.
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