JP2005333938A

JP2005333938A - 細胞固定用部材、細胞固定方法、および細胞固定用部材作製装置

Info

Publication number: JP2005333938A
Application number: JP2004160492A
Authority: JP
Inventors: Yoshiteru Miyamoto; 巧輝宮本
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2004-05-31
Publication date: 2005-12-08

Abstract

【課題】細胞に損傷を与えることなく容易にかつ良好な精度で所望の位置に細胞を固定することが可能な細胞固定用部材を提供する。
【解決手段】細胞固定用シャーレ１００は、温度応答性ポリマーから構成され細胞固定基材１０１の底面に同一形状で等間隔に形成された複数の独立したポリマースポット１０２と、ポリマースポット１０２の表面に形成された細胞外接着因子から構成される複数の独立したＥＭＣ層１０３とを含む。細胞１０４は、ＥＣＭ層１０３を介して、ポリマースポット１０２の配列パターンに従ってポリマースポット１０２上に固定される。
【選択図】図１

Description

この発明は、細胞固定用部材、細胞固定方法、および細胞固定用部材作製装置に関する。

従来、シャーレやチップ等の細胞固定用部材に細胞を固定する方法として、細胞固定用部材の固定表面に細胞外マトリクスのような細胞接着因子をコーティングする方法がある（例えば、特許文献１参照。）。また、これらの細胞固定用部材の固定表面に微細加工を施して孔や凹部を設けてそこに細胞を配置し、この孔や凹部の反対側から真空ポンプ等で吸引を行って細胞を孔や凹部に固定する方法がある（例えば、特許文献２参照。）。

特開平１０−１６５１６６号公報特開平６−３４３４５１号公報

しかしながら、上記のような細胞接着因子により細胞固定を行う方法では、細胞を整列させて細胞固定用部材の固定表面に固定することが困難である。ここで、細胞固定用部材に固定された細胞の配列状態や密度は、細胞の成長や分裂、および実験で注入される薬液等に対する応答性に影響するため、細胞を適切に整列させて固定しない場合、細胞の適切な成長や分裂が阻害される一因となり得るとともに、薬液等に対する応答を観察する際に着目した細胞の変化を追いにくい。

また、細胞を適切に整列させて固定することができないと、細胞に薬液等を注入する自動インジェクション装置を用いて細胞に薬液等を注入する際に、以下のような不利益が生じる。まず、自動インジェクション装置では、キャピラリ（インジェクション針）を用いて細胞内に薬液等の注入が行われ、このキャピラリは、自動制御により走査されて細胞の固定位置に合わせて移動する。そして、キャピラリの先端を細胞に刺して細胞中に薬剤を注入（インジェクション）する。

ここで、上記のインジェクションでは、細胞の大きさが直径１０μｍ程度であることから、キャピラリの先端を細胞の中心に対して±１〜２μｍ以内の精度で移動および位置合わせする必要がある。それゆえ、細胞が適切に整列して固定されていないと、薬液注入時に自動制御で配置されたキャピラリの位置と固定されている細胞との位置に大きなずれが生じる。その結果、細胞の特定部位へのインジェクションを行う際にその都度キャピラリの先端位置を微調整する必要があり、装置のスループットが上がらないという問題を引き起こす。

一方、細胞固定用部材の固定表面に孔や凹部を形成する方法では、上記の吸引により、細胞に損傷を与えるおそれがある。また、かかる方法では、固定する細胞の大きさや形状等に応じて、細胞固定用部材の固定表面に形成する孔や凹部の大きさを変える必要があるとともに、吸引速度等を調整する必要がある。したがって、固定する細胞の種類等によって使用する細胞固定用部材や固定操作条件等を適宜設定する必要がある。

この発明は、上述した従来技術による問題点を解消するため、細胞に損傷を与えることなく容易にかつ良好な精度で所望の位置に細胞を固定することが可能な細胞固定用部材および細胞固定方法を提供することを目的の一つとする。

上述した課題を解決し、目的を達成するため、この発明にかかる細胞固定用部材は、基材と、高分子材料から構成され、前記基材の表面に同一の所定形状で同一の所定間隔をあけて形成された複数の独立した細胞支持層と、前記複数の細胞支持層の各表面を覆う複数の細胞接着層と、を含んだことを特徴とする。

また、この発明にかかる細胞固定方法は、細胞固定用部材の表面に細胞を固定する細胞固定方法であって、前記細胞固定用部材は、基材と、高分子材料から構成され前記基材の表面に同一形状で等間隔に形成された複数の独立した細胞支持層と、前記複数の細胞支持層の各々の表面に形成された複数の独立した細胞接着層と、を備え、前記細胞接着層を介して前記細胞支持層にそれぞれ前記細胞が固定されることを特徴とする。

かかる構成の細胞固定用部材および細胞固定方法によれば、細胞支持層の配置構成に対応して、この細胞支持層上に細胞接着層を介して細胞を固定することが可能となる。したがって、細胞を容易にかつ良好な精度で等間隔で二次元的に整列配置して固定することが可能となる。このように等間隔で整列配置された細胞は、例えば、キャピラリを介して細胞に薬液等の注入を行うインジェクション装置に好適に供することが可能である。

また、整列された状態の細胞では、細胞密度に偏りがある場合と比べて分裂や成長の阻害が抑制されるとともに、薬液等に対する応答性の劣化が抑制される。したがって、かかる細胞固定用部材および細胞固定方法は、実験や研究等に有用である。さらに、かかる細胞固定用部材および細胞固定方法では、細胞を固定させるために基材に凹部を形成したり吸引等を行う必要がないため、細胞への損傷が抑制されるとともに、細胞固定用部材の基材の劣化が抑制される。また、この場合には細胞の種類に関係なく安定した固定を実現することが可能となる。

また、この発明にかかる細胞固定用部材作製装置は、配置された細胞固定用部材の基材の表面に、高分子材料から構成され同一形状を有する複数の独立した細胞支持層を等間隔で形成する細胞支持層形成部と、前記複数の細胞支持層の各々の表面に細胞接着層を形成する細胞接着層形成部と、を備えたことを特徴とする。

かかる構成によれば、上記効果を奏する細胞固定用部材を容易にかつ効率よく製造することが可能となる。

本発明にかかる細胞固定用部材および細胞固定方法によれば、細胞に損傷を与えることなく容易にかつ良好な精度で所望の位置に細胞を固定することが可能となる。したがって、所望の間隔、所望のパターンで細胞を二次元的に整列配置させて固定することが可能となる。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる細胞固定用部材、細胞固定方法、および細胞固定用部材作製装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１にかかる細胞固定用部材の構成を示す模式的な断面図である。ここでは、本発明にかかる細胞固定用部材として、細胞固定用シャーレを例示する。図１に示すように、細胞固定用部材である細胞固定用シャーレ１００では、細胞固定基材１０１（すなわち細胞固定用シャーレ１００の本体）の底面に、温度応答性ポリマーをスポット状に成形して配置した複数のポリマースポット１０２が、所定の間隔Ｄをあけ等間隔に所定の配列パターン（図４参照）で整列して配設されている。

そしてさらに、このポリマースポット１０２の表面が、細胞外接着因子（ＥＣＭ）で構成される層（以下、これをＥＣＭ層１０３と呼ぶ）で被覆されている。ここでは、ポリマースポット１０２が細胞支持層に相当し、ＥＣＭ層が細胞接着層に相当する。

かかる構成の細胞固定用シャーレ１００では、ＥＣＭ層１０３を介してポリマースポット１０２に細胞１０４が固定される。ここで、前述のようにポリマースポット１０２は所定の間隔Ｄおよび所定の配列パターンで整列して細胞固定基材１０１の底面に配設されているため、固定される細胞１０４は、ポリマースポット１０２の配置にしたがって、等間隔で所定の配列パターンに整列して固定される。

複数のポリマースポット１０２の各々およびその表面を被覆するＥＣＭ層１０３は、細胞１０４の固定に適したスポット径Ｗおよびスポット形状を有する。例えば、細胞１０４の大きさが約１０μｍであることから、ポリマースポット１０２およびその表面のＥＣＭ層１０３は、約１０μｍのスポット径Ｗで形成される。そして、隣接するポリマースポット１０２同士は、少なくとも細胞１０４の一つ分の間隔Ｄをあけて等間隔で配置されている。例えば、ポリマースポット１０２は、少なくとも１０μｍ以上、ここでは１００μｍ程度の間隔Ｄをあけて等間隔で配置されている。

なお、細胞固定用シャーレ１００におけるポリマースポット１０２の数および配列パターン等の配置構成は、図示したものに限定されるものではない。また、ポリマースポット１０２のスポット径Ｗおよび間隔Ｄは、上記に限定されるものではない。ポリマースポット１０２の配置構成、スポット径Ｗおよび間隔Ｄは、細胞固定用シャーレ１００の用途や供される細胞１０４の大きさや性質等に応じて、適宜設定される。例えば、３ｃｍ径のシャーレでは、１ｃｍ²当たり１００〜１０００個のポリマースポット１０２が配置される。

細胞固定用シャーレ１００の細胞固定基材１０１は、例えば、ガラスや、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物や、セラミックスや、金属等から構成される。細胞固定基材１０１の大きさや形状は、特に限定されるものではない。また、ＥＣＭ層１０３は、具体的に、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等から構成される。

また、ポリマースポット１０２を構成する温度応答性ポリマーは、具体的には、所定温度より高い温度では疎水性の性質を有するが、該所定温度以下では親水性の性質を有するポリマーである。ここでは、該所定温度を、下限臨界溶解温度と呼ぶ。このような温度応答性ポリマーの温度による性質変化は、例えば、ポリマーの構造等に起因する。

ポリマースポット１０２を構成する温度応答性ポリマーは、ホモポリマーであってもよく、コポリマーであってもよい。例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（またはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらを単独または二種以上使用してもよい。また、上記以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲であれば、架橋されていてもよい。

ここでは、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＰＩＰＡＡｍと表す）によってポリマースポット１０２が構成されている。ＰＩＰＡＡｍは、上記の下限臨界溶解温度が約３１℃である。したがって、３１℃より高い温度ではポリマーが疎水性を有し、３１℃以下の温度ではポリマーが親水性を有する。

次に、細胞固定用シャーレ１００の作製について説明する。図２は、細胞固定用シャーレ１００の作製方法の概略を示すフローチャートである。また、図３は、細胞固定用シャーレ作製装置の構成を示す機能ブロック図である。また、図４〜図６は、図３の細胞固定用シャーレ作製装置のポリマースポット形成部において実施される図２の細胞固定用シャーレの作製方法における処理工程を示す模式的な断面図である。また、図７は、図３の細胞固定用シャーレ作製装置のＥＣＭ層形成部の構成を示す模式図である。

具体的に、図４は、図２のフローチャートのステップＳ２１における処理工程を示す模式的な断面図である。また、図５は、図２のフローチャートのステップＳ２２における処理工程を示す模式的な断面図である。また、図６は、図２のフローチャートのステップＳ２３における処理工程を示す模式的な断面図である。

図２に示す細胞固定用シャーレの作製方法は、図３に示す細胞固定用シャーレ作製装置により実施される。図３に示すように、細胞固定用シャーレ作製装置３００は、ポリマースポット形成部３０１と、ＥＣＭ層形成部３０２とを備える。なお、細胞固定用シャーレ作製装置３００は、これ以外の構成も備えるが、ここでは図示および説明を省略する。

図１の細胞固定用シャーレ１００の作製時には、まず、図３の細胞固定用シャーレ作製装置３００のポリマースポット形成部３０１において、図４〜図６に示すように細胞固定基材１０１の底面にポリマースポット１０２が形成される。具体的に、まず、図４に示すように、細胞固定基材１０１の底面全体に、ポリマースポット１０２の構成材料である温度応答性ポリマー（ここではＰＩＰＡＡｍ）１０２’が塗布される（図２のステップＳ２１参照）。温度応答性ポリマー１０２’の塗布には、従来のコーティング方法等が用いられる。また、塗布する温度応答性ポリマー１０２’の厚さは適宜設定する。

続いて、図５に示すように、細胞固定基材１０１の底面に塗布された温度応答性ポリマー１０２’の表面に、コーティング用マスク５０１を配設する。このコーティング用マスク５０１には、形成したいポリマースポット１０２（図６参照）の形状や配列パターン等の配置構成に応じた開口５０２が形成されている。

上記のようにしてコーティング用マスク５０１を配設した後、コーティング用マスク５０１の配設側から、このマスク全体にγ線を照射する（以上、図２のステップＳ２２参照）。それにより、図６に示すように、コーティング用マスク５０１の開口５０２を通じて、開口５０２の下部に位置する温度応答性ポリマー１０２’にγ線が照射される。その結果、コーティング用マスク５０１の開口５０２の下部に配置された温度応答性ポリマー１０２’が硬化して細胞固定基材１０１の底面に固着する。

一方、コーティング用マスク５０１の開口５０２の下部以外の領域に配置された温度応答性ポリマー１０２’は、照射されたγ線がコーティング用マスク５０１により遮られるので、この部分ではγ線が温度応答性ポリマー１０２’に照射されない。このため、コーティング用マスク５０１の開口５０２の下部以外の領域の温度応答性ポリマー１０２’は硬化せず、よって、細胞固定基材１０１の底面に固着しない。

上記のようにしてγ線の照射を行った後、図６に示すように、コーティング用マスク５０１を除去するとともに、細胞固定基材１０１を洗浄する。この洗浄により、硬化していない温度応答性ポリマー１０２’が除去され、一方、硬化した温度応答性ポリマー１０２’は、細胞固定基材１０１の底面に固着した状態を保持する。その結果、図５のコーティング用マスク５０１の開口５０２に対応したパターンで、図６のようにポリマースポット１０２が形成される（図２のステップＳ２３参照）。

上記のようにして図３の細胞固定用シャーレ作製装置３００のポリマースポット形成部３０１において図６のようにポリマースポット１０２が形成されると、続いて、細胞固定用シャーレ作製装置３００のＥＣＭ層形成部３０２において、図１のＥＣＭ層１０３が形成される。細胞固定用シャーレ作製装置３００のＥＣＭ層形成部３０２は、図７に示すように、ＣＣＤカメラ７０１と、制御装置７０４と、キャピラリ７０３の先端からＥＣＭを滴下させるインジェクタ７０２とを備える。

細胞固定用シャーレ作製装置３００のポリマースポット形成部３０１（ともに図３参照）において図６のように底面にポリマースポット１０２が形成された細胞固定基材１０１は、続いて、ポリマースポット形成部３０１からＥＣＭ層形成部３０２に送られる。図７に示すように、ＥＣＭ層形成部３０２では、インジェクタ７０２からキャピラリ７０３に、ＥＣＭが注入される（図２のステップＳ２４参照）。そして、ＣＣＤカメラ７０１により、細胞固定基材１０１の底面に形成された各ポリマースポット１０２の位置が検出され、この検出情報が制御装置７０４に伝達されて各ポリマースポット１０２の位置が認識される（図２のステップＳ２５参照）。

続いて、図７に示すように、認識されたポリマースポット１０２の位置にキャピラリ７０３の先端がくるよう、制御装置７０４の自動制御によりキャピラリ７０３が移動する（図２のステップＳ２６参照）。そして、ポリマースポット１０２の位置に合わせて移動したキャピラリ７０３の先端から、ポリマースポット１０２からはみ出さない程度の所定量のＥＣＭが滴下される。

このようにして、複数のポリマースポット１０２の位置に合わせてキャピラリ７０３が順次移動し、各ポリマースポット１０２上にＥＣＭの滴下が行われる（図２のステップＳ２７参照）。そして、各ポリマースポット１０２上に滴下されたＥＣＭを自然乾燥させる（図２のステップＳ２８参照）。それにより、各ポリマースポット１０２上に、図１のようにＥＣＭ層１０３が形成される。

以上の方法により作製された図１の細胞固定用シャーレ１００では、各ポリマースポット１０２およびその上に形成されたＥＣＭ層１０３が等間隔で二次元的に整列配置されている。したがって、この細胞固定用シャーレ１００を用いて後述のように細胞固定を行うと、ポリマースポット１０２の配置に対応して、容易にかつ良好な精度で等間隔に細胞１０４を二次元的に整列配置させて固定することが可能となる。

この場合、ポリマースポット１０２の配列パターンを変えることにより、容易に固定される細胞の配置状態を調整することが可能であり、かつ、ポリマースポット１０２の配列パターンは、γ線照射時に用いる図５のコーティング用マスク５０１を適宜選択することにより、容易に所望のパターンとすることが可能である。したがって、細胞固定用シャーレ１００によれば、細胞１０４を容易にかつ良好な精度で所望の位置に固定することが可能となる。

なお、ここではコーティング用マスク５０１（図５参照）を用いたγ線照射によりポリマースポット１０２のパターニングを行う場合について説明したが、これ以外の方法によりポリマースポット１０２を形成してもよい。例えば、複数の開口が所定のパターンで形成されたコーティング用フィルタを細胞固定基材１０１の底面に配置し、このコーティング用フィルタ上に温度応答性ポリマー１０２’を塗布するとともにγ線を照射してもよい。

この場合、コーティング用フィルタの開口下部に位置する細胞固定基材１０１の表面に温度応答性ポリマー１０２’が塗布されるとともに該ポリマーがγ線により硬化するため、この部分にポリマースポット１０２が形成される。一方、コーティング用フィルタで覆われた領域下部に位置する細胞固定基材１０１の表面には、コーティング用フィルタによって遮られて温度応答性ポリマー１０２’が塗布されず、よって、この部分にはポリマースポット１０２が形成されない。したがって、コーティング用フィルタの開口パターンに応じて、容易にかつ良好な精度でポリマースポット１０２を形成することが可能となる。

また、図１の細胞固定用シャーレ１００を用いた細胞固定では、細胞１０４を固定するための凹部等を形成する必要がないとともに、細胞１０４を固定するために吸引を行う必要がない。したがって、細胞固定用シャーレ１００では、細胞１０４の形状や大きさや種類に関わりなく、安定した固定を容易に実現することが可能となるとともに、細胞１０４への損傷が防止される。特に、従来のように吸引を行う必要がないことから、細胞１０４への損傷が防止されるとともに、細胞固定用シャーレ１００の強度劣化も防止される。

次に、図１の細胞固定用シャーレ１００を使用した細胞固定方法について説明する。図８は、細胞固定用シャーレ１００の使用方法の概略を示すフローチャートである。図８に示すように、細胞固定時には、まず、図１の細胞固定用シャーレ１００を用意する。そして、この細胞固定用シャーレ１００に、所定の成分で調整された培地を入れる（ステップＳ８１）。ここでは、液体培地を使用している。続いて、複数の細胞を適量で液体に混濁させた細胞混濁液をさらに加える（ステップＳ８２）。

ここでは、液体培地に細胞１０４を混濁させた細胞混濁液を加えている。また、図１の細胞固定用シャーレ１００へのこのような細胞混濁液の添加は、細胞固定用シャーレ１００配置下の環境温度を、前述の温度応答性ポリマー１０２’（図４参照）の下限臨界溶解温度（約３１℃）よりも高い温度に保持して行う。ここでは、例えば３７℃としている。そして、このように下限臨界溶解温度よりも高い温度に保持した状態を、後述の細胞剥離工程（図８のステップＳ８７）に至るまで保持する。

上記のようにして細胞混濁液を添加した後、図１のように細胞１０４がＥＣＭ層１０３を介してポリマースポット１０２に固定されるまで、所定時間、インキュベーションする（図８のステップＳ８３）。このような細胞１０４の固定は、前述のように環境温度が下限臨界温度よりも高い温度に保持されていることにより、ポリマースポット１０２を構成する温度応答性ポリマー１０２’（図４参照）が疎水性となっているために実現されるものである。

ここで固定された細胞１０４は、前述のように、ポリマースポット１０２の配列パターンに対応して等間隔で二次元整列配置して固定される。また、ポリマースポット１０２のスポット径Ｗが前述のように細胞１０４の一つの大きさに合わせて設定されているため、一つのポリマースポット１０２に一つの細胞１０４が固定される。

上記のようにしてインキュベーションを行った後、図１のポリマースポット１０２に固定された細胞１０４以外の細胞を除くため、培地交換を行う（図８のステップＳ８４）。この培地交換により、ポリマースポット１０２に固定された細胞１０４の固定状態を保持しつつ、ポリマースポット１０２に固定されていない細胞を培地とともに除去することができる。例えば、固定されずに培地中で浮遊していた細胞や、ポリマースポット１０２間で細胞固定基材１０１の表面に沈降していた細胞は、培地とともに除去される。なお、培地交換の他に、例えば、ＰＢＳを用いた洗浄により細胞の除去を行ってもよい。

このようにして固定されていない細胞とともに培地を除去（廃棄）した後、あらたに培地を加え、ポリマースポット１０２に固定された細胞１０４をインキュベーションする（図８のステップＳ８５）。その後、細胞１０４への薬液注入、すなわちインジェクションを実施する（図８のステップＳ８６）。インジェクションは、従来の自動インジェクション装置を用いて従来の方法により行う。

すなわち、自動制御によりキャピラリ（図示せず）を移動させるとともにキャピラリ先端を細胞１０４に刺し、キャピラリを介して、細胞１０４内に薬液を注入する。なお、ここでは、インジェクションを実施する前に、図８のステップＳ８５のインキュベーションを行って細胞１０４の生育能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を高めているが、インキュベーションすることなくインジェクションを実施してもよい。

かかるインジェクションでは、キャピラリ（図示せず）が、図１のように各ポリマースポット１０２に固定された細胞１０４上を順次走査して移動し、各細胞１０４の位置にキャピラリ先端を合わせて薬液注入が行われる。このようなキャピラリの移動および薬液注入は、自動制御で行われる。ここで、細胞固定用シャーレ１００では、前述のように、各ポリマースポット１０２に固定された細胞１０４が等間隔で配置されているため、自動制御により移動するキャピラリの位置を、固定された細胞１０４の位置に精度よく一致させることが容易に可能となる。したがって、良好な精度でインジェクションを実施することが可能となる。

インジェクションの終了後、細胞固定用シャーレ１００配置下の環境温度を、ポリマースポット１０２を構成する温度応答性ポリマーの下限臨界溶解温度以下の温度に下げる。ここでは、温度応答性ポリマー１０２’（図４参照）としてＰＩＰＡＡｍを用いているので、下限臨界溶解温度である３１℃以下の温度に下げる。それにより、温度応答性ポリマー１０２’の性質が疎水性から親水性に変化し、その結果、親水性となった温度応答性ポリマー１０２’で構成されるポリマースポット１０２の表面から、細胞１０４がＥＣＭ層１０３とともに剥離して遊離する（図８のステップＳ８７参照）。

ここで、従来においては、例えばトリプシン等の蛋白分解酵素を用いて細胞１０４を剥離させるが、細胞固定用シャーレ１００を用いた細胞固定では、ポリマースポット１０２を構成する温度応答性ポリマー１０２’（図４参照）の温度による性質変化を利用して、細胞１０４を剥離させることができる。したがって、トリプシン等の蛋白分解酵素を用いる必要がなく、よって、トリプシン等を用いた場合のような細胞１０４への損傷が防止されるとともに、少ない処理工程数で容易に効率よく細胞を剥離させることが可能となる。

上記のようにして剥離させた細胞１０４を回収して移し替えを行う（図８のステップＳ８８）。細胞１０４の回収方法および移し替え方法は、従来と同様である。そして、移し替えた細胞を、顕微鏡等を用いて観察する（ステップＳ８９）。

以上のように、図１の細胞固定用シャーレ１００を用いた細胞固定では、細胞１０４を等間隔で所望のパターンに整列配列することができるので、自動インジェクション装置による薬液注入に適用すると有効な効果が奏される。また、細胞１０４に損傷を与えることなく容易に剥離させることが可能となるため、実験や研究等の精度や効率の向上が図られる。

なお、上記においては、図８に示すように、インジェクションを実施した後、一旦細胞１０４を剥離させて移し替えてから観察を行っているが（ステップＳ８６〜ステップＳ８９参照）、インジェクションにより薬液が注入された図１の細胞１０４を、引き続き、図１の細胞固定用シャーレ１００でインキュベーションした後、細胞固定用シャーレ１００に固定された状態で細胞１０４の観察を行ってもよい。このように、図１の細胞固定用シャーレ１００は、固定した細胞１０４を該固定状態を保持したままでインキュベーションすることが可能である。

また、細胞固定用シャーレ１００の細胞固定基材１０１を構成する材料、およびポリマースポット１０２を構成する温度応答性ポリマー１０２’（図４参照）とＥＣＭ層１０３を構成する細胞外マトリクス物質が透明性を有する場合には、細胞固定基材１０１の底面側からの観察、例えば、倒立顕微鏡を用いた観察等が可能となる。このように、インキュベーションや観察にそのまま供することが可能であることから、図１の細胞固定用シャーレ１００は、研究や実験等に有用である。

（実施の形態２）
本発明の実施の形態２にかかる細胞固定用シャーレは、図１の実施の形態１の細胞固定用シャーレ１００と同様の構成を有するが、実施の形態１ではポリマースポット１０２を構成する温度応答性ポリマー１０２’（図４参照）が１種類のポリマーから構成されるのに対して、本実施の形態では、異なる下限臨界溶解温度を有する複数種類のポリマーから構成される点が実施の形態１と異なっている。

図９は、本実施の形態にかかる細胞固定用シャーレの構成を示す模式的な断面図である。図９に示すように、細胞固定用シャーレ９００は、細胞固定基材１０１の底面に、温度応答性ポリマーａからなるポリマースポット１０２ａと、温度応答性ポリマーａよりも下限臨界溶解温度が低い温度応答性ポリマーｂからなるポリマースポット１０２ｂとが形成されている。そして、各ポリマースポット１０２ａ，１０２ｂ上に、ＥＣＭ層１０３を介して、細胞１０４が固定されている。

このように複数種類の温度応答性ポリマーａ，ｂからなるポリマースポット１０２ａ，１０２ｂは、例えば、ポリマースポット１０２ａ，１０２ｂを形成する際に使用する図５のコーティング用マスク５０１のマスクパターンを適宜選択することにより、容易に形成することが可能である。そして、本実施の形態では、ポリマースポット１０２ａに固定した細胞１０４にインジェクションを実施して薬液Ａを注入するとともに、ポリマースポット１０２ｂに固定した細胞１０４にインジェクションを実施して薬液Ｂを注入する。

その後、実施の形態１の場合と同様にインキュベーションを実施し、続いて、ポリマースポット１０２ａ，１０２ｂから細胞１０４を剥離させる。ここで、ポリマースポット１０２ａを構成する温度応答性ポリマーａは、前述のようにポリマースポット１０２ｂを構成する温度応答性ポリマーｂに比べて下限臨界溶解温度が高いため、実施の形態１の場合と同様に環境温度を下げていくと、まず、ポリマースポット１０２ａを構成する温度応答性ポリマーａの性質が疎水性から親水性に変化する。そして、この温度応答性ポリマーａの性質変化に伴って、薬液Ａが注入された細胞１０４が、ポリマースポット１０２ａから剥離する。

この時、温度応答性ポリマーｂから構成されるポリマースポット１０２ｂは、下限臨界溶解温度よりも高い温度に保持されているため、疎水性に保持されている。したがって、ポリマースポット１０２ａから細胞１０４が剥離する際、ポリマースポット１０２ｂに固定された細胞１０４の固定状態は保持される。このようにしてポリマースポット１０２ａから細胞１０４を剥離させた後、例えば、剥離した細胞１０４を細胞固定用シャーレ９００から培地とともに除去してこの細胞１０４を移し替え、観察に供する。一方、ポリマースポット１０２ｂに固定されたままの細胞１０４は、再び培地を添加してインキュベーションするとともに、さらに環境温度を下げる。

ポリマースポット１０２ｂを構成する温度応答性ポリマーｂの下限臨界溶解温度よりも温度以下になると、ポリマースポット１０２ｂの性質が疎水性から親水性に変化する。それに伴って、薬液Ｂが注入された細胞１０４がポリマースポット１０２ｂから剥離する。そして、この剥離した細胞１０４を培地とともに細胞固定用シャーレ９００から除去して移し替えを行い観察に供する。

以上のように、下限臨界溶解温度が異なる複数種類の温度応答性ポリマーａ，ｂを用いてポリマースポット１０２ａ，１０２ｂを形成した細胞固定用シャーレ９００を用いれば、細胞１０４を剥離させる際の温度を調整することにより、所望の細胞１０４を選択的に剥離させることが可能となる。それゆえ、実施の形態１と同様の効果が奏される他に、さらに、同一の細胞固定用シャーレ９００上に固定された複数の細胞１０４の各々に、種類の異なる薬剤Ａ，Ｂを注入する処理が実現可能となる。したがって、実験等への有効性が高くなる。

なお、上記の実施の形態１および実施の形態２においては、図１および図９のポリマースポット１０２，１０２ａ，１０２ｂを構成する温度応答性ポリマーの下限臨界溶解温度を利用し、該温度以下に温度を下げることによって細胞１０４を剥離させているが、これ以外に、所定温度（すなわち、上限臨界溶解温度）以上となるとポリマーの性質が疎水性から親水性に変化する温度応答性ポリマーを用いるとともに、環境温度を上限臨界溶解温度以上に上げることによってポリマースポット１０２，１０２ａ，１０２ｂから細胞１０４を剥離させる構成であってもよい。

また、上記の実施の形態１および実施の形態２においては、本発明をシャーレに適用する場合について説明したが、シャーレ以外の基材に本発明を適用してもよい。例えば、ディッシュ、プレート、チップ等の表面にポリマースポットを形成してもよい。さらに、例えば、樹脂等で構成されたシート状のフィルムの表面にポリマースポットを形成し、このフィルムをシャーレ等に配置して細胞固定を行う構成であってもよい。

（付記１）基材と、
高分子材料から構成され、前記基材の表面に同一形状で等間隔に形成された複数の独立した細胞支持層と、
前記複数の細胞支持層の各々の表面に形成された複数の独立した細胞接着層と、
を含んだことを特徴とする細胞固定用部材。

（付記２）前記細胞支持層を構成する前記高分子材料は、所定の臨界温度を境にして性質が変化する温度応答性ポリマーであることを特徴とする付記１に記載の細胞固定用部材。

（付記３）前記細胞支持層を構成する前記温度応答性ポリマーは、前記臨界温度より高い温度において疎水性を示し、前記臨界温度以下の温度において親水性を示すことを特徴とする付記２に記載の細胞固定用部材。

（付記４）前記細胞支持層を構成する前記温度応答性ポリマーは、前記臨界温度以上の温度において親水性を示し、前記臨界温度より低い温度において疎水性を示すことを特徴とする付記２に記載の細胞固定用部材。

（付記５）前記細胞支持層は、少なくとも、第１の臨界温度を有する第１の温度応答性ポリマーから構成された第１の細胞支持層と、前記第１の臨界温度と異なる第２の臨界温度を有する第２の温度応答性ポリマーから構成された第２の細胞支持層と、を含むことを特徴とする付記２に記載の細胞固定用部材。

（付記６）細胞固定用部材の表面に細胞を固定する細胞固定方法であって、
前記細胞固定用部材は、基材と、高分子材料から構成され前記基材の表面に同一形状で等間隔に形成された複数の独立した細胞支持層と、前記複数の細胞支持層の各々の表面に形成された複数の独立した細胞接着層と、を備え、
前記細胞接着層を介して前記細胞支持層にそれぞれ前記細胞が固定されることを特徴とする細胞固定方法。

（付記７）前記細胞支持層が、所定の臨界温度より高い温度において疎水性を示すとともに前記臨界温度以下の温度において親水性を示す温度応答性ポリマーから構成され、
前記固定された前記細胞を剥離させる際に、前記細胞固定用部材が配置された環境温度を前記臨界温度以下とすることを特徴とする付記６に記載の細胞固定方法。

（付記８）前記細胞支持層が、所定の臨界温度以上の温度において親水性を示すとともに前記臨界温度より低い温度において疎水性を示す温度応答性ポリマーから構成され、
前記固定された前記細胞を剥離させる際に、前記細胞固定用部材が配置された環境温度を前記臨界温度以上とすることを特徴とする付記６に記載の細胞固定方法。

（付記９）前記細胞支持層は、少なくとも、第１の臨界温度を有する第１の温度応答性ポリマーから構成された第１の細胞支持層と、前記第１の臨界温度よりも低い第２の臨界温度を有する第２の温度応答性ポリマーから構成された第２の細胞支持層と、を含み、
前記第１の細胞支持層を構成する前記第１の温度応答性ポリマーと前記第２の細胞支持層を構成する前記第２の温度応答性ポリマーとの温度応答性の違いを利用して、前記第１の細胞支持層に固定された前記細胞および前記第２の細胞支持層に固定された前記細胞のいずれかを選択的に剥離させることを特徴とする付記６に記載の細胞固定方法。

（付記１０）配置された細胞固定用部材の基材の表面に、高分子材料から構成され同一形状を有する複数の独立した細胞支持層を等間隔で形成する細胞支持層形成部と、
前記複数の細胞支持層の各々の表面に細胞接着層を形成する細胞接着層形成部と、
を備えたことを特徴とする細胞固定用部材作製装置。

（付記１１）前記細胞支持層形成部では、所定のパターンで開口が形成されたマスクを用いて前記マスクの前記開口パターンに対応して前記細胞支持層が形成され、
前記細胞接着層形成部では、前記細胞支持層形成部で形成された前記細胞支持層の表面に選択的に細胞接着物質を滴下して前記細胞接着層を形成することを特徴とする付記１０に記載の細胞固定用部材作製装置。

以上のように、本発明にかかる細胞固定用部材および細胞固定方法は、細胞を所望の配列パターンで配置することが可能な細胞固定用部材および細胞固定方法として有用であり、特に、細胞が等間隔で整列配置されていることを要件とする自動インジェクション装置等への適用において有用である。

本発明の実施の形態１にかかる細胞固定用シャーレの構成を示す模式的な断面図である。図１の細胞固定用シャーレの作製方法の概略を示すフローチャートである。細胞固定用シャーレ作製装置の構成を示す機能ブロック図である。図２の細胞固定用シャーレの作製方法における処理工程の詳細を示す模式的な断面図である。図２の細胞固定用シャーレの作製方法における処理工程の詳細を示す模式的な断面図である。図２の細胞固定用シャーレの作製方法における処理工程の詳細を示す模式的な断面図である。図３の細胞固定用シャーレ作製装置のＥＣＭ層形成部の構成を示す模式図である。図１の細胞固定用シャーレの使用方法の概略を示すフローチャートである。本発明の実施の形態２にかかる細胞固定用シャーレの構成を示す模式的な断面図である。

符号の説明

１００細胞固定用シャーレ
１０１細胞固定基材
１０２ポリマースポット
１０２’ 温度応答性ポリマー
１０３ＥＣＭ層
１０４細胞
３００細胞固定用シャーレ作製装置
３０１ポリマースポット形成部
３０２ＥＣＭ層形成部
５０１コーティング用マスク
５０２マスク開口
７０１ＣＣＤカメラ
７０２インジェクタ
７０３キャピラリ
７０４制御装置

Claims

基材と、
高分子材料から構成され、前記基材の表面に同一形状で等間隔に形成された複数の独立した細胞支持層と、
前記複数の細胞支持層の各々の表面に形成された複数の独立した細胞接着層と、
を含んだことを特徴とする細胞固定用部材。
前記細胞支持層を構成する前記高分子材料は、所定の臨界温度を境にして性質が変化する温度応答性ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の細胞固定用部材。
前記細胞支持層は、少なくとも、第１の臨界温度を有する第１の温度応答性ポリマーから構成された第１の細胞支持層と、前記第１の臨界温度と異なる第２の臨界温度を有する第２の温度応答性ポリマーから構成された第２の細胞支持層と、を含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞固定用部材。
細胞固定用部材の表面に細胞を固定する細胞固定方法であって、
前記細胞固定用部材は、基材と、高分子材料から構成され前記基材の表面に同一形状で等間隔に形成された複数の独立した細胞支持層と、前記複数の細胞支持層の各々の表面に形成された複数の独立した細胞接着層と、を備え、
前記細胞接着層を介して前記細胞支持層にそれぞれ前記細胞が固定されることを特徴とする細胞固定方法。
配置された細胞固定用部材の基材の表面に、高分子材料から構成され同一形状を有する複数の独立した細胞支持層を等間隔で形成する細胞支持層形成部と、
前記複数の細胞支持層の各々の表面に細胞接着層を形成する細胞接着層形成部と、
を備えたことを特徴とする細胞固定用部材作製装置。