JP2007167006A - 微小物質移送方法および微小物質移送用ピペット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 電極あるいは超音波発振器等を内装した微小物質移送用ピペットの先端を細胞やオルガネラの隔壁に位置決めして局限的な範囲でエレクトロポレーションあるいはキャビテーション,ソノポレーションを実施することで、細胞にダメージを与えずに隔壁の目標箇所のみを穿孔する。更に、直流電圧や交流電圧の印加によって生じる移送力もしくはキャビテーションやソノポレーションで生じるエネルギーを利用して、この穿孔箇所を介して微小物質移送用ピペット内の微小物質のみを目的とする箇所に移送する。
【選択図】図15
Description
しかし、従来のエレクトロポレーション法は、培養液等の液体と共に細胞培養容器中に入れられた細胞の全体を対象として表面積の大きな電極で電圧を印加することで隔壁に穿孔を施すようにしたものであるため、隔壁の任意の選択箇所に穿孔を施すことが困難であり、また、穿孔箇所も複数となってしまうため、細胞に必要以上のダメージを与えてしまう欠点がある。
特に、細胞内の選択箇所、例えば、特定のオルガネラに微小物質を移送する場合には、このオルガネラを最終的な操作対象として隔壁上の穿孔位置を適正化することが重要であるが、前述した通り、従来のエレクトロポレーション法では隔壁上の穿孔位置を特定することが困難である。更に、穿孔箇所が複数となってしまうため、このような手法で穿孔を施してからエレクトロフォレーシス法等を併用して微小物質を細胞内に移送するとしても、微小物質の移送先が全く不確かなものとなってしまい、目標とする箇所に微小物質を移送できなくなる可能性が多分にある。
つまり、所望する細胞内の箇所に微小物質が移送されるかどうかは常に確率的な問題であり、特に、所望する箇所に微小物質を取り込んだ多数の細胞を用意して対照実験を行うような場合には、同一位置に微小物質を入れられた細胞を得るといった段取り作業自体に多大な手間隙を要するといった不都合が生じる。
この挿入方法によれば、隔壁の選択箇所に穿孔を施すことは可能であるが、穿孔の過程で隔壁や細胞に衝撃的な力が作用することになるので、必ずしも、低侵襲の細胞操作が実現されるという保証はなく、また、微小物質の移送に際してはプレッシャーインジェクター等を利用する必要があるので、微小物質のみならずピペット内の媒体等が微小物質と共に細胞内に移送されてしまう問題がある。
この技術によれば、パイプ状の活性電極を利用して局限的な範囲でエレクトロポレーション法による穿孔を実施することが可能となり、隔壁に1つの孔を穿設するといった目的は達成され得るが、その穿孔位置は必ず細胞培養容器の底面と接する位置となるので、隔壁の所望箇所に穿孔を施すためには、細胞を細胞培養容器に載置する段階で的確な位置決めを行う必要があり、仮に、細胞の位置決め操作を行うためのマニュピレータ等があったとしても、細胞の下面側の状況を顕微鏡等で確認することが困難であるため、隔壁の所望箇所に穿孔を施すことは難しい。また、細胞の隔壁にはパイプと接続する孔が定常的に形成されることになるので、細胞の自己修復の妨げとなる弊害がある。
しかも、パイプ状の活性電極は細胞を保持した細胞培養容器の底部に一体的に固着されているため、細胞膜や核膜等の隔壁に穿孔を施すことはできるが、細胞膜や核膜等の内側にあるオルガネラの隔壁に穿孔を施すことは極めて困難であり、オルガネラの内部に微小物質を移送するための穿孔方法としては事実上利用できない。
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として前記隔壁に外部から直流電圧を印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に前記微小物質と同じ極性で直流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした構成を有する。
ピペットは細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作することができるので、細胞培養容器に細胞をどのように載置して対象物保持部で細胞を保持したかに関わりなく、確実にピペットの先端を隔壁の選択箇所に位置決めすることができる。
次いで、ピペット内の電極を作用極として隔壁に外部から直流電圧を印加することで隔壁に細孔を開ける。その作用原理は従来のエレクトロポレーション法と同様であるが、本発明においては、ガラス等の絶縁物から形成されたピペットに内装された電極を作用極として利用することで局限された範囲で電気的な穿孔を行うようにしているので、穿孔箇所が複数となることはなく、ピペット先端の位置決め位置つまり隔壁の選択箇所に対してのみ的確に穿孔を施すことができる。
細胞膜や核膜等の内側にあるオルガネラの内部に微小物質を移送する場合には、細胞膜や核膜等の隔壁に穿孔を施した後、ピペットの先端を進め、細胞膜や核膜等の隔壁の場合と同様にしてオルガネラの隔壁に対しても穿孔を施す。
そして、ピペット内の作用極に微小物質と同じ極性で直流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することでピペットから細胞の内部の領域、つまり、細胞内の選択箇所やオルガネラの内部に微小物質を移送する。直流電圧の印加を利用して微小物質を移送する原理は従来のエレクトロフォレーシス法と同様であるが、本発明においては、隔壁の穿孔過程で隔壁の選択箇所にのみ的確に穿孔が施され、しかも、ピペットの先端が穿孔位置に極めて近接しているので、オルガネラの隔壁の内部を始め、細胞膜や核膜等の内部の選択箇所に微小物質を的確に移送することができる。
以上に述べたように、隔壁の穿孔過程で細胞に衝撃的な力が作用しないこと、穿孔箇所が1箇所に局限されること、微小物質を移送した後でピペットの先端を細胞の隔壁の外側の領域に退避させることで細胞の自己修復作用による孔の閉鎖が可能になること等により、極めて低侵襲の細胞操作が実現される。
また、細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペットの先端を基準として隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業が行われることになるため、ピペットの先端を顕微鏡等で確認しながら、目的とする箇所に的確にピペットの先端を位置決めして隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業を行うことができる。
特に、細胞内のオルガネラの内部に微小物質を移送するような場合には、細胞膜や核膜等の隔壁とオルガネラの隔壁に対して次々と電気的な穿孔作業を行って微小物質の通り道を形成することができるので、複数層の隔壁を通過して内部領域に微小物質を移送するといった操作にも容易に対処することができる。
しかも、エレクトロフォレーシス法を応用した電気的な移送方法であるため、ピペット内の媒体等を伴わずに微小物質のみを細胞内に移送することも可能である。
このように、作用極として機能する電極を内装したピペットの先端を作業領域としてエレクトロポレーション法の作用原理を応用した穿孔作業とエレクトロフォレーシス法の作用原理を応用した微小物質の移送作業を連続的に行うといった技術思想は従来にないものである。
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として前記隔壁に外部から直流電圧を印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に周波数帯を変化させて不均一な交流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記微小物質の電気双極子を誘起させ、周辺の電界との相互作用によって引力と斥力を発生させて前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした構成を有する。
従って、前記と同様、極めて低侵襲の細胞操作が可能であり、細胞の内部領域の選択箇所に的確に微小物質を移送することができ、複数層の隔壁を通過して内部領域の選択箇所に微小物質を移送するといった操作やピペット内の媒体等を伴わずに微小物質のみを細胞内に移送するといった操作にも容易に対処することができる。
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質と超音波造影材を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された超音波発振器のシグナル印加時間を制御してバブルを生成することで前記隔壁の選択箇所にキャビテーションを発生させ、バブルが破砕する際の衝撃波で前記隔壁を破壊して前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした構成を有する。
ピペットは細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作することができるので、細胞培養容器に細胞をどのように載置して対象物保持部で細胞を保持したかに関わりなく、確実にピペットの先端を隔壁の選択箇所に位置決めすることができる。
次いで、ピペット内の超音波発振器のシグナル印加時間を制御してバブルを生成することで隔壁の選択箇所にキャビテーションを発生させ、バブルが破砕する際の衝撃波で隔壁を破壊することによりピペット先端に位置する隔壁の箇所に局限的に穿孔を施す。
細胞膜や核膜等の内側にあるオルガネラの内部に微小物質を移送する場合には、細胞膜や核膜等の隔壁に穿孔を施した後、ピペットの先端を進め、細胞膜や核膜等の隔壁の場合と同様にしてオルガネラの隔壁に対しても穿孔を施す。
そして、更に、キャビテーションで発生するバブルが破砕する際の衝撃波を利用してピペットから細胞の内部の領域、つまり、細胞内の選択箇所やオルガネラの内部に微小物質を移送する。
超音波振動を利用した隔壁の破壊や微小物質の移送に関わるメカニズムは所謂ソノポレーション法と同様であるが、本発明においては、ピペットに内装された超音波発振器を利用することにより局限された範囲で穿孔を行うようにしているので、穿孔箇所が複数となることはなく、ピペット先端の位置決め位置つまり隔壁の選択箇所に対してのみ穿孔を施して微小物質を的確に移送することができる。
従って、前記と同様、極めて低侵襲の細胞操作が可能であり、細胞の内部領域の選択箇所に的確に微小物質を移送することができ、複数層の隔壁を通過して内部領域の選択箇所に微小物質を移送するといった操作やピペット内の媒体等を伴わずに微小物質のみを細胞内に移送するといった操作にも容易に対処することができる。
この場合は、移送対象となる微小物質がイオン性であっても非イオン性であっても構わない。
このように、超音波発振器をピペットに内装することによってキャビテーションの発生域をピペットの先端付近に局限して穿孔作業を行い、この孔を介して微小物質を移送するといった技術思想は従来のソノポレーション法にはないものである。
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、該ピペットの先端近傍の領域にパルスレーザーを集光してアブレーションを生成することで前記隔壁を局所的に破壊して前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送するといった構成を適用することもできる。
ピペットは細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作することができるので、細胞培養容器に細胞をどのように載置して対象物保持部で細胞を保持したかに関わりなく、確実にピペットの先端を隔壁の選択箇所に位置決めすることができる。
次いで、ピペットの先端近傍の領域にパルスレーザーを集光してアブレーションを生成することで隔壁を局所的に破壊して穿孔を施す。
細胞膜や核膜等の内側にあるオルガネラの内部に微小物質を移送する場合には、細胞膜や核膜等の隔壁に穿孔を施した後、ピペットの先端を進め、前記と同様にしてピペットの先端近傍の領域にパルスレーザーを集光してアブレーションを生成することでオルガネラの隔壁に対しても穿孔を施す。
そして、更に、アブレーションで発生するエネルギーを利用してピペットから細胞の内部の領域、つまり、細胞内の選択箇所やオルガネラの内部に微小物質を移送する。
パルスレーザーの集光により穿孔箇所を局限することができるので、前記と同様、穿孔箇所が複数となることはなく、隔壁の選択箇所に対してのみ穿孔を施して微小物質を的確に移送することができる。
従って、前記と同様、極めて低侵襲の細胞操作が可能であり、細胞の内部領域の選択箇所に的確に微小物質を移送することができ、複数層の隔壁を通過して内部領域の選択箇所に微小物質を移送するといった操作やピペット内の媒体等を伴わずに微小物質のみを細胞内に移送するといった操作にも容易に対処することができる。
この場合は、移送対象となる微小物質がイオン性であっても非イオン性であっても構わない。
パルスレーザー装置の出力部の小型化が可能な場合、このエンドエフェクタを前述の作用極あるいは超音波発振器と同様にピペットに内装することが可能であり、その場合は、ピペット先端の位置決めとパルスレーザーの集光位置の特定を同時に行えるので、作業性が更に向上する。
ガラス管の先端を狭搾して形成したピペット本体と、前記ピペット本体の基部を圧入する円筒部を先端に備えたピペットホルダーと、前記ピペットホルダーの後端部に接続するチューブコネクタとから成り、
前記ピペットホルダーが、前記ピペット本体とチューブコネクタとの接続に必要とされる最低限度の軸方向長さを有し、
前記ピペット本体の基部もしくは前記ピペットホルダーの円筒部の少なくとも一方に、前記ピペット本体の突入量を規制するストッパを設けたことを特徴とする構成を有する。
そこで、まず、従来は150mm程度であったピペットホルダーの全長を短縮することにより軽量化を図り、電極や超音波発振器等の内装に伴うピペット全体としての重量増加を極力軽減した。
また、ピペット本体の基部もしくはピペットを圧入するピペットホルダーの円筒部の少なくとも一方にピペット本体の突入量を規制するストッパを設けることで、ピペット本体の交換作業を行った場合でも、ピペットホルダーから突出するピペット本体の長さが常に一定となるようにした。
前述した通り、本発明の微小物質移送方法においては、ピペットの先端を細胞膜や核膜等の隔壁あるいはオルガネラの隔壁に位置決めして穿孔および微小物質の移送を行う必要があるが、ピペットホルダーから突出するピペット本体の長さを常に一定とすることで、ピペット本体の目詰まりや欠損等の障害が発生した場合でも全体的な処理速度を低下させずにピペット本体を差し替えて穿孔および微小物質の移送作業を継続することができるようになった。
また、細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペットの先端を基準として隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業が行われるので、ピペットの先端を顕微鏡等で確認しながら、目的とする箇所に的確にピペットの先端を位置決めして隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業を行うことができる。
特に、細胞内のオルガネラの内部に微小物質を移送するような場合には、細胞膜や核膜等の隔壁とオルガネラの隔壁に対して次々と局限的な穿孔作業を行って微小物質の通り道を形成することができるので、複数層の隔壁を通過して内部領域に微小物質を移送するといった操作にも容易に対処することができる。
これにより、オルガネラの内部を含め、細胞膜や核膜等の隔壁の内部領域の任意の選択箇所に低侵襲の細胞操作で微小物質を自由に移送することが可能となり、これまで困難とされていた単一細胞に対する局所的な実験および厳密な定量解析が可能となり、更には、異なる個体に対して均一の条件で細胞操作を行うことができるため、入手が困難である細胞を用いた対照実験等も安心して行えるようになる。
2 細胞操作部
3 コントローラ
4 ジョイスティックコントロールユニット
5 フットペダル群
6 モニタ
7 テーブル
8 マニピュレータ
9 マニピュレータ
10 ステージ
11 顕微鏡
12 キャピラリー
13 微小物質移送用ピペット
13’ 電極を内装した微小物質移送用ピペット
13” 超音波発振器を内装した微小物質移送用ピペット
14 ピペット本体
14a,14b,14c 突起(ストッパ)
15 円筒部
15a 段付きの縮径部(ストッパ)
16 ピペットホルダー
16a ピペットホルダー本体
17 チューブコネクタ
18 キャップ部
18a 円錐部
18b 環状部
19 チューブ
20 電極
20a 電極(作用極)
20b 電極(作用極と対を成す電極)
21 超音波発振器
21a ホーン
22 ステー
23 枢着手段
24 直流電圧印加装置
25 極性反転スイッチ
26 交流電圧印加装置
27 超音波発振器制御装置
28 パルスレーザー制御装置
29 パルスレーザー光源
30 スリット
31 λ/2板
32 ポラライザー
33 コリメーターレンズ
34 ダイクロイックミラー
35 集光レンズ
36 プレッシャーインジェクター制御装置
37 細胞培養容器
38 ピペット
39 細胞
39a 細胞質
39b 核
40 孔
41 下面板
42 吸引装置
Claims (14)
- 細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域にイオン性の微小物質を移送するための微小物質移送方法であって、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として前記隔壁に外部から直流電圧を印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に前記微小物質と同じ極性で直流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした微小物質移送方法。 - 細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に非イオン性の微小物質を移送するための微小物質移送方法であって、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として前記隔壁に外部から直流電圧を印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に周波数帯を変化させて不均一な交流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記微小物質の電気双極子を誘起させ、周辺の電界との相互作用によって引力と斥力を発生させて前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした微小物質移送方法。 - 前記作用極と対を成す極性の電極を前記作用極と対向させて前記ピペットに内装して電圧を印加することを特徴とした請求項1または請求項2記載の微小物質移送方法。
- 前記作用極と対を成す極性の電極を前記細胞培養容器中に配置して電圧を印加することを特徴とした請求項1または請求項2記載の微小物質移送方法。
- 細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に微小物質を移送するための微小物質移送方法であって、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質と超音波造影材を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された超音波発振器のシグナル印加時間を制御してバブルを生成することで前記隔壁の選択箇所にキャビテーションを発生させ、バブルが破砕する際の衝撃波で前記隔壁を破壊して前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした微小物質移送方法。 - 細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に微小物質を移送するための微小物質移送方法であって、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、該ピペットの先端近傍の領域にパルスレーザーを集光してアブレーションを生成することで前記隔壁を局所的に破壊して前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした微小物質移送方法。 - 前記ピペットの先端を前記隔壁よりも外側に位置させて前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした請求項1,請求項2,請求項3または請求項4記載の微小物質移送方法。
- 前記ピペットの先端を前記隔壁に接触させて前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした請求項1,請求項2,請求項3,請求項4,請求項5または請求項6記載の微小物質移送方法。
- 前記ピペットの先端を前記隔壁よりも内側に位置させて前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした請求項5または請求項6記載の微小物質移送方法。
- 細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に微小物質を移送する際に使用される微小物質移送用ピペットであって、
ガラス管の先端を狭搾して形成したピペット本体と、前記ピペット本体の基部を圧入する円筒部を先端に備えたピペットホルダーと、前記ピペットホルダーの後端部に接続するチューブコネクタとから成り、
前記ピペットホルダーが、前記ピペット本体とチューブコネクタとの接続に必要とされる最低限度の軸方向長さを有し、
前記ピペット本体の基部もしくは前記ピペットホルダーの円筒部の少なくとも一方に、前記ピペット本体の突入量を規制するストッパを設けたことを特徴とする微小物質移送用ピペット。 - 前記ストッパがピペット本体の基部外周面から径方向外側に突出する突起によって形成されていることを特徴とした請求項10記載の微小物質移送用ピペット。
- 前記ストッパが前記ピペットホルダーの円筒部の奥に形成された段付きの縮径部の端面によって形成されていることを特徴とした請求項10記載の微小物質移送用ピペット。
- 前記ピペットホルダー内に電極を内装したことを特徴とする請求項10,請求項11または請求項12記載の微小物質移送用ピペット。
- 前記ピペットホルダー内に超音波発振器を内装したことを特徴とする請求項10,請求項11または請求項12記載の微小物質移送用ピペット。
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