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Die
Erfindung betrifft einen Zellkulturträger für
die Kultivierung von humanen Stamm- und Vorläuferzellen,
insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese,
embryonalen Stammzellen, induzierten pluripotenten Stammzellen,
mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen, und ein Verfahren
zur Kultivierung sowie zur Regulierung des Zellzyklus und der Differenzierung
von Stamm- und Vorläuferzellen in vitro.
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Als
Stammzellen werden allgemein Körperzellen bezeichnet, die
sich in verschiedene Zelltypen oder Gewebe ausdifferenzieren können.
Stammzellen sind in der Lage, Tochterzellen zu generieren, die selbst
wiederum Stammzelleneigenschaften besitzen, aber auch solche mit
größerer Ausdifferenzierung. Stammzellen werden
vor allem durch ihr ontogenetisches Alter und ihr Differenzierungspotenzial unterscheiden:
die ontogenetisch frühesten Stammzellen sind die pluripotenten
embryonalen Stammzellen, aus denen später die primitiven
Keimstammzellen, sowie die somatischen Stamm- und Progenitorzellen,
im Folgenden als Vorläuferzellen bezeichnet, hervorgehen.
Außerhalb des Körpers, in vitro, neigen Stammzellen
dazu, spontan zu differenzieren. Dies kann durch Faktoren teilweise
unterbunden werden, die die Selbsterneuerung der Zellen fördern.
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Blutstammzellen
sind eine Art von Stammzellen, die normalerweise vorwiegend im Knochenmark
vorkommen. Sie stellen den Ausgangspunkt für die gesamte
Zellneubildung des Blutes und des Abwehrsystems dar und sind eigentlich
die Zellen aus dem Knochenmark, die bei einer Transplantation wirklich
nötig sind. Da die Blutstammzellen heute auch anders gewonnen
werden können, spricht man meist nicht mehr von Knochenmarktransplantation, sondern
allgemein von Blutstammzelltransplantation.
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Bei
der Aufbewahrung und Untersuchung von Spendermaterial sowie bei
der Diagnostik von Blutstammzellen und ihrer Vervielfältigung
ist es von Nachteil, dass auch Blutstammzellen und abgeleitete Zellen
der Hämatopoiese, insbesondere blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC), nach der Entnahme aus dem natürlichen Umgebung des
Organismus, in den Zellzyklus eintreten, differenzieren und ihre
Stammzelleneigenschaft verlieren können. Es besteht daher ein
Interesse daran, Blutstammzellen und abgeleitete Zellen der Hämatopoiese
im ruhenden und undifferenzierten Zustand zu erhalten. Dabei ist
die Kenntnis der Mechanismen von Nutzen, die im Organismus zur Regulierung
des Zellzyklus und der Differenzierung von Blutstammzellen beitragen.
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Innerhalb
des Knochenmarks unterstützt eine spezialisierte Mikroumgebung,
die „Stammzellennische”, den Erhalt und die Reifung
der blutbildenden Stamm- und Vorläuferzellen (HPC). Wie
dabei bei Schofield R., 1978, Blood Cells 4 (1–2)
7 bis 25, beschrieben wurde, bestehen in vielfältiger
Weise Wechselwirkungen zwischen den blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC) und ihrer Nische. Das schließt das Zusammenwirken
von vielen Faktoren ein, zu denen die Moleküle der extrazellulären
Matrix (ECM), Kontakte zwischen den Zellen sowie Zytokine zählen,
die die Entwicklung der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC)
zwischen Zyklustätigkeit und Ruhezustand in der notwenigen
Balance halten, was entweder zu einer Proliferation oder Apoptose,
Selbsterneuerung oder Differenzierung führt (Wilson
und Trumpp, 2006, Nat. Rev. Immunol. 6 (2), 93–106); Adam
und Scadden, 2006, Nat. Immunol. 7 (4), 333 bis 337; Yin
and Li, 2006, J. Clin. Invest. 116 (5), 1195–1201).
Der Ruhezustand und die Zyklustätigkeit der blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC) im Knochenmark werden demnach ebenso wie die Selbsterneuerung
und die Differenzierung durch ein komplexes Zusammenwirken von exogenen
Signalen reguliert, die durch Moleküle der extrazellulären
Matrix (ECM), durch Kontakte von Zelle zu Zelle und Zytokine ausgesendet
werden.
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Das
Verständnis der Wirkung der verschiedenen exogenen Signale
und ihres Zusammenspiels auf die Entscheidung über das
Schicksal der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) ist ebenso
eine Grundvoraussetzung für erfolgreiche Gewebebehandlungsstrategien
wie für die Verbesserung der klinisch angewendeten Zellersatztherapien.
In diesem Zusammenhang wurde in der Literatur bereits diskutiert,
dass spezifische Wechselwirkungen zwischen den blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC) und den Bestandteilen der extrazellulären Matrix
(ECM) die Proliferation und die Differenzierungsentscheidungen einleiten
können (Verfaillie, 1998 Blood 82 (8), 2609–2612; Yin
and Li, 2006, J Clin Invest 116 (5), 1195–1201).
So ist die Adhäsionsrezeptor-Signalisierung nicht nur wichtig
für die Verankerung der Zelle, sondern verändert
auch die Signalisierungswege der Wachstumsfaktoren (Jiang
et al., 2000 Blood 95 (3), 846–854; Levesque
et al., 1996, Blood 88 (4), 1168–1176). Wie von Nilsson
und Simmons, 2004, Curr Opin Hematol 11 (2), 102 bis 106,
beschrieben, steuern a4- und a5-Integrine die Proliferation und
die Differenzierung der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC)
entweder direkt oder durch die Modulation der Zytokininduzierten
Signale. Andererseits ist bekannt, dass nicht nur die Art der Adhäsionsliganden
die Entscheidungen über das Schicksal der Zellen steuert, sondern
dass auch die Stärke der Zelladhäsionskräfte
und deren Verteilung sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung
der Zellen beeinflussen können (Engler et al.,
2006, Cell 126 (4), 677 bis 689, Ingber, 2003,
J Cell Sci 116 (Pt 8), 1397 bis 1408). Darüber
hinaus spielt auch die dreidimensionale Anordnung der Bausteine
der extrazellären Matrix (ECM) eine wichtige Rolle beim
Aufbau der Zellen und beim Auslösen der Entscheidungen über
ihr Schicksal (Geiger, 2001, Science 294 (5547), 1661 bis
1663; Zaman et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA
103 (29), 10889 bis 10894). Deshalb kann auch von einem
Einfluss auf die Entscheidung über das Schicksal der Zellen
in der Knochenmarknische ausgegangen werden.
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Die
Erhaltung der Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese
in ruhendem und undifferenzierten Zustand hat, wie bereits erwähnt, insbesondere
Bedeutung bei der Aufbewahrung und Untersuchung von Spendermaterial
sowie zur Diagnostik und Vervielfältigung von Blutstammzellen.
Des Weiteren kann ein solches Verfahren auch bei gentechnischen
Veränderungen von Blutstammzellen eingesetzt werden, da
bei diesen das Schalten zwischen aktivem Zellzyklus und ruhendem
Zustand essentiell ist. Doch auch die Erhaltung des Stammzellencharakters
anderer Stammzellenarten und Vorläuferzellen bei der Aufbewahrung
und Untersuchung, insbesondere von embryonalen Stammzellen, induzierten
pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen
Stammzellen, ist von Bedeutung.
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Daher
besteht die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe darin, entsprechende
Mittel und Verfahren bereitzustellen, die den Erhalt des Stammzellcharakters,
Verhinderung einer Differenzierung und der Regulierung des Zellzyklus
bei humanen Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere
bei Blutstammzellen, abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese,
embryonalen Stammzellen, induzierten pluripotenten Stammzellen,
mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen in vitro ermöglichen.
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Die
Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Zellkulturträgern
für humane Stammzellen und Vorläuferzellen, insbesondere
von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese, embryonalen
Stammzellen, induzierten pluripotenten Stammzellen, mesenchymalen
Stammzellen und neuronalen Stammzellen, die zunächst ein
Grundsubstrat mit Mikrokavitäten von jeweils definiertem Volumen
aufweisen. Dabei können Größe und Form der
einzelnen Mikrokavitäten auf einem Zellkulturträger
voneinander variieren, wobei kugel- oder zylinderförmige
oder an eine Kugel- oder Zylinderform angenäherte Mikrokavitäten
besonders vorteilhaft sind, deren Volumen jeweils in der Größenordnung
der einzelnen zu kultivierenden Stamm- und Vorläuferzellen
liegt, jedoch geringfügig größer als
das Volumen einer entsprechenden Stamm- und Vorläuferzelle
ist. Eine vorteilhafte Ausführung der Mikrokavitäten könnte
eine zylinderförmige Vertiefung mit einem flachen oder
halbkugelförmigen Boden darstellen, wobei die Tiefe und
der Durchmesser dieser Mikrokavitäten im Bereich von 5 μm
bis 40 μm liegen würden.
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Das
mit Mikrokavitäten versehene Grundsubstrat erhält
gemäß der Erfindung eine oder mehrere funktionale
Beschichtungen von Polymeren, das heißt, dass die Beschichtungspolymere
funktionelle Gruppen für die Kopplung mit weiteren Beschichtungskomponenten
aufweisen. Eine weitere Beschichtung des Zellkulturträgers
ist erfindungsgemäß durch Kopplung einer oder
mehrerer zelladhäsionsvermittelnder Komponenten mit der
funktionalen Polymer-Beschichtung vorgesehen.
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Die
Mikrokavitäten weisen in einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung, die insbesondere für die Kultivierung von
Blutstammzellen geeignet ist, eine Tiefe von 10 μm auf,
während die Durchmesser im Bereich von 15 μm bis
80 μm liegen können. Als besonders vorteilhaft
erwiesen sich Mikrokavitäten mit einem Durchmesser von
15 μm. Allgemein richten sich die Volumina der Mikrokavitäten
insbesondere nach den Größen der jeweiligen Stamm- und
Vorläuferzellenarten, wodurch beispielweise zylinderförmige
Vertiefungen mit einem Durchmesser und einer Tiefe von 5 μm
bis 40 μm bei embryonalen Stammzellen, induzierten pluripotenten
Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen
vorteilhaft wären.
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Vorzugsweise
weist das Grundsubstrat eine Silikonoberfläche auf. Das
Silikon-Grundsubstrat kann auf folgendem Wege hergestellt werden,
so dass es mit Mikrokavitäten versehen und für
Beschichtungen geeignet ist: Eine Reihe von Silizium-Mustervorlagen
wird unter Anwendung von photolithografischem Ätzen vorzugsweise
mit flächensymmetrisch angeordneten zylinderförmigen
Erhebungen zwischen 15 und 80 μm im Durchmesser und mit
den jeweiligen Entfernungen von 30 bis 160 μm und mit einer
Höhe von 10 μm gestaltet. Nach Fluorsilanisierung
der Mustervorlagen, vorzugsweise mit [(Heptadecafluoro-1, 1,2,2.
Tetrahydrodecyl)-dimethylchlorsilan], werden dünne Silikon-Filme
von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) von der mikrostrukturierten Mustervorlage
durch Abguss und Vernetzung des Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) Zweikomponentensystems
repliziert. Die mikrostrukturierten Silikonfolien werden nun unter
Anwendung einer Vorbehandlung mit Niederdruck-Sauerstoff-Plasma
auf deren Rückseite auf gereinigten Glasträgern
befestigt.
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Alternativ
zur Silikonoberfläche kann das Grundsubstrat auch eine
Oberfläche aus Polystyren, Polypropylen oder synthetischen
polymeren Hydrogelen aufweisen.
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Die
funktionale Beschichtung des Grundsubstrats ist in einer besonders
bevorzugten Ausführungsform das Ergebnis einer kovalenten
Bindung von Polyethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an
die Grundsubstratoberfläche. Vorzugsweise erfolgt diese
kovalente Kopplung von Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid)
(PEMA) an aminosilanisierten Silikon-Mikrostrukturen.
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In
den bereits erwähnten alternativen Ausführungsformen
mit Polystyren- und Polypropylen-Grundsubstrat erfolgt die kovalente
Kopplung von Poly(ethylenalt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) an
die Polystyren- oder Polypropylen-Mikrostrukturen durch Aminogruppen,
welche durch Ammoniak-Niederdruckplasmafunktionalisierung von Polystyren
oder Polypropylen entstehen.
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Als
weitere Beschichtung ist in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung die Kopplung einer oder mehrerer verschiedener zelladhäsionsvermittelnder,
in der extrazellulären Matrix (ECM) der natürlichen Zell-Mikroumgebung
im Knochenmark vorkommender Komponenten, insbesondere von Proteinen,
Zuckern und Glycosaminoglycanen, mit der funktionalen Beschichtung
der Polymere vorgesehen. Diese Variante ist insbesondere für
Zellkulturträger für die Kultivierung von Blutstammzellen
und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese relevant. Als zelladhäsionsvermittelnde
Komponenten für die Beschichtung können in einer
anderen Ausführungsform auch synthetische Peptide verwendet
werden.
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Anschließend
können die Zellen an den beschichteten Zellkulturträgers
entwickelt werden. Dabei haftet ein Teil der Zellen durch Adhäsion
in den Mikrokavitäten am Zellkulturträger an.
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Eine
besonders bevorzugte zelladhäsionsvermittelnde Komponente
der extrazellulären Matrix (ECM) für die Beschichtung
des funktional beschichteten Zellkulturträgers stellt Fibronektin
(FN) dar. Auf der Grundlage von neueren Untersuchungen über die
Modulation von Art und Morphologie der Adhäsion der blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC) an verschiedenen Komponenten der
extrazellären Matrix (ECM) wird bevorzugt Fibronektin (FN)
als relevanter Ligand der extrazellulären Matrix (ECM)
eingesetzt, weil es eine sehr starke Wechselwirkung von blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC) zu festen Trägern bewirkt.
Außerdem ist Fibronektin (FN) als ein wesentlicher Bestandteil
der extrazellulären Matrix des Knochenmarks anzusehen,
der bereits während der Knochenmark-Bildung ausgeschieden
wird. Bei einer funktionalen Beschichtung des Zellkulturträgers
mit Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) wird Fibronektin
(FN) vorteilhaft über seine Lysin-Seitenkette an den Anhydridgruppen
kovalent angebunden.
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In
der alternativen Ausführung des Grundsubstrats mit einer
Oberfläche aus synthetischen polymeren Hydrogelen ist Fibronektin
(FN) kovalent an Hydrogelstrukturen angebunden.
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Mit
den oben beschriebenen Zellkulturträgern ist die Durchführung
eines Verfahrens zur Kultivierung sowie zur Regulierung des Zellzyklus
und der Differenzierung von humanen Stamm- und Vorläuferzellen,
insbesondere von Blutstammzellen und abgeleiteten Zellen der Hämatopoiese,
embryonalen Stammzellen, induzierten pluripotenten Stammzellen,
mesenchymalen Stammzellen und neuronalen Stammzellen möglich,
in dem die Zellen in vitro an einem solchen Zellkulturträger
entwickelt werden.
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Das
Verfahren beinhaltet die folgenden Verfahrensschritte a–c):
- a) die Zellen werden in einem fluiden Zellkulturmedium
entwickelt,
- b) die Zellen werden direkt auf die mit zelladhäsionsvermittelnden
Komponenten beschichteten Mikrokavitäten plattiert,
- c) die Zellen werden auf den Zellkulturträgern kultiviert,
wobei ein Teil der Zellen in den Mikrokavitäten durch Adhäsion
anhaftet.
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Die
Konzeption der Erfindung besteht in der Ausnutzung von Auswirkungen
der Ligandverteilung und von räumlichen Zwängen
in der Entwicklung der Stammzellen und Vorläuferzellen
(HPC). Überraschenderweise unterstützt die Ausübung
eines räumlichen Zwangs durch Adhäsion von Stammzellen
und Vorläuferzellen, insbesondere von blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC) in den mit Komponenten der extrazellulären Matrix
(ECM) bedeckten Kavitäten den Erhalt der Zellen im ruhenden
und im unreifen Zustand. Als besonders vorteilhaft lassen sich die
Auswirkungen der geometrischen Zwänge und Adhäsions-Wechselwirkungen
auf die Entwicklung der blutbildenden Vorläuferzellen (HPC)
erkennen, bei denen als Kulturträger Substrate mit Mikrokavitäten
mit 15 μm Durchmesser dienten.
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Vorzugsweise
werden die Zellen in einem Serum-freien Zellkulturmedium entwickelt,
dass mit Zytokinen ergänzt wird. In einer weiteren Ausgestaltung
des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Regulierung
des Zellzyklus auch über eine Veränderung der
Zytokinkonzentration erfolgen. So hat die Zytokinkonzentration nachweislich
Auswirkungen auf die Zyklustätigkeit von unter räumlichem
Zwang stehenden blutbildenden Vorläuferzellen. Eine Verringerung
der Zyklusgeschwindigkeit der blutbildenden Vorläuferzellen
mit abnehmender Mikrokavitätengröße bei
niedrigen Zytokin-Konzentrationen kann bei höheren Zytokin-Konzentrationen
unterdrückt werden. Im Gegensatz dazu führt die
Reduzierung der Zytokin-Konzentration zu einem zunehmenden Einfluss
der durch die Adhäsion herbeigeführten Hemmung
der Zyklustätigkeit. Eine Verringerung der Geschwindigkeit
des Zellzyklus erfolgt beispielsweise mit abnehmender Mikrokavitätengröße
bei 10 ng/ml Zytokin jeweils vom Stammzellen-Faktor (SCF), dem Thrombopoietin
(TPO) und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1 L oder auch FL3).
Im Gegensatz dazu wird eine Verringerung der Geschwindigkeit des Zellzyklus
mit abnehmender Mikrokavitätengröße bei 30
ng/ml Zytokin jeweils vom Stammzellen-Faktor (SCF), dem Thrombopoietin
(TPO) und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1L oder auch FL3) unterdrückt.
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Vorzugsweise
werden die Zellen direkt auf mit den zelladhäsionsvermittelnden
Komponenten beschichteten Mikrokavitäten plattiert. Bevorzugt werden
als zelladhäsionsvermittelnden Komponenten solche verwendet,
die in der extrazellulären Matrix (ECM) der natürlichen
Zell-Mikroumgebung im Knochenmark vorkommen, insbesondere Proteine, Zucker
und Glycosaminoglycane. In einer besonders vorteilhaften Ausführung
der Erfindung werden die Zellen direkt auf mit Fibronektin (FN)
beschichteten Mikrokavitäten plattiert, die mit dem Zellkulturmedium
bei 37°C vorinkubiert wurden. Alternativ dazu können
die Zellen auch direkt auf Mikrokavitäten plattiert werden,
die mit synthetischen Peptiden als zelladhäsionsvermittelnde
Komponenten beschichtet sind.
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Weitere
Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus
der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen
mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:
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1: die Proteinimmobilisierung auf einer mikrostrukturierten
Oberfläche,
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2: die Oberflächen-Expression
von den Stammzellenmarkern CD133 und CD34 auf den blutbildenden
Vorläuferzellen,
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3: den proliferativen Zustand der blutbildenden
Vorläuferzellen bei hoher und niedriger Zytokin-Konzentration,
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4:
der Einfluss des Zusammenwirkens von Zytokinkonzentration und Adhäsion
auf den Zellzyklus
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Die 1 zeigt die Protein-Immobilisierung auf
mikrostrukturierten Oberflächen. (1A) Nach der
kovalenten Bindung von Polyethylen-alt-Maleinsäureanhydrid)
(PEMA) an eine Silikon-Oberfläche wurde Fibronektin (FN) über
seine Lysin-Seitenkette der Anhydridsubstanz kovalent beigefügt.
Die Oberfläche wurde geprüft unter Nutzung von
3D-Darstellungen von fluoreszenzmarkiertem Fibronektin durch konfokale
Laserscanningmikroskopie (1B, Maßstab
40 μm) und Raster-Elektronenmikroskopie (1C,
Maßstab 50 und 5 μm).
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Die
Herstellung funktionaler Mikrostrukturen zur Ausübung von
räumlichem Zwang auf die Stammzellen und blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC) wurde wie nachfolgend beschrieben
realisiert. Eine Reihe von Silikon-Mustervorlagen wurden unter Anwendung
von fotolithografischem Ätzen (GeSiM, Rossendorf, Deutschland)
mit flächensymmetrisch angeordneten zylinderförmigen
Erhebungen zwischen 15 und 80 μm im Durchmesser und mit
den jeweiligen Entfernungen von 30 bis 160 μm und mit einer
Höhe von 10 μm gestaltet. Nach Fluorsilanisierung
[(Heptadecafluoro-1, 1,2,2. Tetrahydrodecyl)-dimethylchlorsilan,
ABCR, Karlsruhe, Deutschland] der Druckvorlagen wurden die dünnen
Silikon-Filme von Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard® 184 Silikon-Elastomer-Kit, Dow
Corning) aus der mikrostrukturierten Mustervorlage repliziert, wobei
das Verhältnis Härter zu Prepolymer 10:1 betrug.
Die mikrostrukturierten Silikonfolien wurden unter Anwendung einer Vorbehandlung
mit Niederdruck-Sauerstoff-Plasma (PDC-002, Harrick Plasma) auf
deren Rückseite auf gereinigten Glasträgern (Menzel,
Braunschweig, Deutschland) festgehalten. Dünne Schichten
aus Polyethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) (Polysciences
Inc., Warrington, PA, USA, MW 125000) wurden kovalent auf die aminosilanisierten
Silikon-Mikrostrukturen aufgebracht, wie bei Pompe T. et
al., 2003b, Biomacromolecules 4 (4), 1072 bis 1079 berichtet.
Vor der Fibronektin(FN)-Immobilisierung wurden die Anhydridsubstanzen
regeneriert, um die kovalente Bindung von Fibronektin (FN) sicherzustellen (Pompe
et al., 2003a, J Biomed Mater Res A 67 (2), 647 bis 657).
Fibronektin (FN), aufbereitet aus adultem menschlichen Plasma nach
einer Vorschrift von (Poulouin et al. 1999, Prot Expr Purif
17 (1), 146 bis 152), wurde auf eine Konzentration von
20 μg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS) verdünnt (Dulbecco's PBS, Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland).
Die Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid) (PEMA) beschichteten
Mikrostrukturen wurden dann mit Fibronektin(FN)-Lösung
1 Stunde lang inkubiert und anschließend mehrfach mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung (PBS) gespült. Die Qualität
und die Stabilität der Schichten wurden unter Nutzung von
Fibronektin(FN)-Fluoreszenzmarkierung mit Carboxytetramethylrhodamine
[(Tamra) FluoReporter (Invitrogen, Molecular Probes)] überprüft. Die
Intensität der Fluoreszenz wurde sieben Tage lang mit einem
konfokalen Laserscanningmikroskop (TCS SP1, Leica, Wetzlar, Deutschland) überwacht, während
die Oberflächen in 10% fetalem Rinderserum in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung (PBS) inkubiert wurden, um die Stabilität
des immobilisierten Fibronektins (FN) gegen Verdrängung
durch andere Proteine zu prüfen.
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Ausgewählte
menschliche CD133-positive blutbildende Vorläuferzellen
aus peripherem Blut, die Vertreter der frühen Vorläuferzellen
mit Multilineage und repopulativer Kapazität sind, wurden
auf diesen Fibronektin(FN)-beschichteten mikrostrukturierten Substraten
entwickelt. Durch die Analyse der Proliferation der blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC) und Differenzierung der blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC) auf der Ebene der Population und
der Einzelzelle konnte das Zusammenwirken von räumlichen Zwängen,
Adhäsions-Wechselwirkungen und Zytokin-Konzentrationen
auf die Entscheidungen über das Schicksal der blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC) in vitro aufgeklärt werden.
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Für
die Untersuchung wurden Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor(G-CSF)-mobilisierte
menschliche blutbildende Vorläuferzellen (HPC) aus peripherem
Blut von gesunden Spendern nach Anleitung des Herstellers (CD133
indirekte Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland)
immunomagnetisch für CD133-positive Zellen isoliert: Die
Zellen wurden in Serum-freien CellGro Medium (CellGenix, Freiburg,
Deutschland) aufwachsen gelassen, ergänzt mit entweder
10 ng/ml Zytokin (niedrige Zytokin-Konzentration) oder 30 ng/ml
Zytokin (hohe Zytokin-Konzentration) jeweils vom Stammzellen-Faktor
(SCF) (Strathmann Biotech AG, Hannover, Deutschland), dem Thrombopoietin (TPO)
und Stammzell-Tyrosin-Kinase 1 Ligand (STK-1L oder auch FL3) (beide
R & D, Mannheim, Deutschland).
Frisch isolierte Zellen wurden direkt auf Fibronektin beschichtete
Mikrokavitäten plattiert, die mit dem Medium bei 37°C
vorinkubiert wurden. Für die Proliferations- und Differenzierungsuntersuchungen
wurden die blutbildenden Vorläuferzellen sieben Tage lang
auf Fibronektinformen kultiviert. Nicht anhaftende und anhaftende
Zellen wurden nach 4 min Trypsin-Behandlung gesammelt, gezählt (Casy
Cell Counter Schärfe Systems, Reutlingen, Deutschland),
gewaschen und für die Durchflusszytometrie-Analyse (FACS
Calibur, BD, Deutschland) unter Nutzung von Anti-CD133-Phycoerythrin
(PE) und Anti-CD34-Allophycocyanin (APC, die Miltenyi Biotech) markiert.
Für die Immunfluoreszenz-Laserscanning-Mikroskopie (SP5,
Leica, Wetzlar, Deutschland) der anhaftenden Zellen wurden nach sieben
Tagen die blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) zusätzlich
sekundär mit Isotypspezifischen AlexaFluor546 und AlexaFluor647
Ziege-Anti-Maus (Invitrogen) markiert, da PE und APC schnell bleichende
Fluorochrome sind. Die Isotyp-Spezifität der AlexaFluor-Antikörper
wurde zytometrisch überprüft. Die Zyklustätigkeit
von Zellen wurde mit der Aufnahme von 20 μM Bromodeoxyuridin
(BrdU, Invitrogen) in die sich reduplizierende DNA während
der vorangegangenen 24 Stunden vor der Fixierung in 70% eiskaltem
Ethanol zum Zeitpunkt von 24 Stunden, drei Tagen und sieben Tagen
der Zell-Kultivierung festgestellt. Die Bromodeoxyuridin(BrdU)-Aufnahme wurde
mittels Durchflusszytometrie (FACS) für anhaftende Zellen
auf planaren Oberflächen und nicht anhaftende Zellen gemessen.
Für Haftung der blutbildenden Vorläuferzellen
auf Fibronektin beschichteten Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)-Formen
wurde Bromodeoxyuridin (BrdU) nach der Markierung mit Anti-BrdU
und sekundären AlexaFluor488 Ziege-Anti-Maus (beide Invitrogen,
Molecular Probes) durch ein Fluoreszenzmikroskop (Leica, Wetzlar,
Deutschland) visualisiert und mit Propidiumjodid gegengefärbt.
Zyklisierende Zellen wurden unter Anwendung von ImageJ Software
gegenüber nicht zyklisierenden Zellen gezählt.
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Die 2 zeigt die Oberflächen-Expression von
CD34- und CD133-Stammzellenmarkern auf den blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC) (2B). Die Proliferation von blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC), die auf mikrostrukturierten Oberflächen
kultiviert wurden, war im Vergleich zu Kontrollzellen nach 7 Tagen
und zumindest in den 15 μm großen Kavitäten
reduziert (2D). Die Stammzellenmarker-Expression
nutzende Durchflusszytometrie (2B, 2C)
zeigte einen höheren Anteil an undifferenzierten blutbildenden
Vorläuferzellen (HPC) auf den Zellkulturträgern
mit 15 μm großen Mikrokavitäten. Eine
Einzelzellen-Immunfluoreszenzanalyse von anhaftenden Zellen (2E)
zeigte eine höhere Expression des jeweiligen Stammzellenmarkers
von blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) innerhalb der Mikrokavitäten
im Vergleich zu Zellen außerhalb der Mikrokavitäten.
Die Daten werden als Mittelwert + Standardabweichung; bei einer
Anzahl unabhängiger Experimente n = 3 bis 8 dargestellt.
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Die 3 zeigt den proliferativen Zustand der
blutbildenden Vorläuferzellen (HPC) einerseits unter niedrigen
und andererseits unter hohen Zytokin-Konzentrationen. Die Zellzyklustätigkeit
wurde durch die Aufnahme von Bromodeoxyuridine (BrdU) während
der vorhergehenden 24 Stunden und die Zytometrie- (3A, 3B)
oder Immunfluoreszenz-Analyse (3C, 3D)
bestimmt. Die Adhäsion von blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC) an Fibronektin (FN) förderte den Eintritt des Zellzyklus
nach einem Tag und wurde noch beschleunigt durch die Erhöhung
der Zytokin [Thrombopoietin (TPO), Stammzellen-Faktor (SCF) und
Stammzell-Tyrosin-Kinase-1 Ligand (STK-1L/FL3)]-Konzentration von
jeweils 10 auf 30 ng/ml. Der prozentuale Anteil der zyklisierenden
Zellen erreicht nach drei Tagen einen Gleichgewichtszustand. Eine
Verringerung der Zyklusgeschwindigkeit der blutbildenden Vorläuferzellen
(HPC) mit abnehmender Mikrokavitätengröße bei
niedrigen Zytokin-Konzentrationen wurde bei höheren Zytokin-Konzentrationen
unterdrückt. Die Daten werden in 3 als
Mittelwert + Standardabweichung (SEM) dargestellt.
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Die 4 zeigt
schematisch den Einfluss des Zusammenwirkens der Zytokin-Konzentration und
der Adhäsion auf die Zellzyklustätigkeit. (t =
0 – 1d) In den frühen Phasen synergieren die Adhäsion- und
Zytokin-Aktivierung, um zunächst die Zyklustätigkeit
zu starten. (t > 1d)
Für spätere Zeitpunkte ist die mit der Adhäsion
verbundene Aktivierung durch die verstärkte Zytokin-Aktivierung überschrieben,
die zur Stimulation der Zellzyklustätigkeit führt.
Im Gegensatz dazu führt die Reduzierung der Zytokin-Konzentration
zu einem zunehmenden Einfluss der durch die Adhäsion herbeigeführten
Hemmung der Zyklustätigkeit.
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LISTE DER BEZUGSZEICHEN UND ABKÜRZUNGEN
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- BrdU
- Bromodeoxyuridine
- ECM
- extrazelluläre
Matrix
- FACS
- „fluorescence
activated cell sorting”, welches häufig synonym
zu Durchflusszytometrie verwendet wird
- STK-1L
- Stammzell-Tyrosin-Kinase
1 Ligand (oder auch FL3)
- FN
- Fibronektin
- G-CSF
- Granulozyten-Kolonie
stimulierender Faktor
- HPC
- blutbildende Vorläuferzellen
- PBS
- phosphatgepufferte
Kochsalzlösung
- PEMA
- Poly(ethylen-alt-Maleinsäureanhydrid)
- PDMS
- Poly(dimethylsiloxan)
- TPO
- Thrombopoietin
- SCF
- Stammzellen-Faktor
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Schofield
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