JP6301098B2 - シート状細胞培養物の剥離方法および製造方法ならびにこれらに用いる容器 - Google Patents

Description

本発明は、シート状細胞培養物の剥離方法および製造方法ならびにこれらに用いる容器に関する。

近年、心筋梗塞等の重症心不全治療の解決策として再生医療が検討されている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。

近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。

しかしながら、このような細胞培養物は比較的薄いシート状をなすため脆弱である。かかる細胞培養物を培養基材から剥離するには、ピペッティングやスクレーピングなどによる機械的手法や、トリプシンなどによる酵素処理といった通常の付着細胞剥離法では、細胞培養物の構造が壊れたり、細胞が損傷したりする。したがって、上記剥離の方法として、温度応答性材料がコートされた培養皿で細胞を培養し、温度を変化させて同材料の疎水性を変化させることにより細胞培養物を剥離する、などの方法が用いられている（特許文献１）。しかしながら、かかる培養皿は高価であるうえ、培養皿が温度低下するまでの待機時間や細胞による剥離状態の多様性に起因する、剥離時の細胞培養物構造の破壊や、細胞の損傷などの問題を有している。

このような問題を解決するために、凹部と凸部とが秩序的に配置された表面構造を有し、表面が高分子で被覆された細胞培養支持体が検討されている（特許文献２）。このような細胞培養支持体を用いて製造された細胞構造体は、液体の流れなどの流体力学的な力またはピンセットのような器具による機械的な力を用いて細胞培養支持体から剥離することが可能である。

特表２００７−５２８７５５号公報 特開２００９−１７８０５０号公報

しかしながら、特許文献２に記載の方法においては、細胞培養支持体から細胞構造体を剥離する際に、ピペットやスポイトを用いて液流を生じさせるが、液流の強弱の調節が難しく、細胞構造体が折れ曲がったり、皺が生じたり、破れたりして、破損する危険性があった。また、ピンセット等を用いた場合においても部分的に細胞構造体を把持して力を作用させて剥離を行うことから、細胞構造体が破損する危険性があった。

したがって、本発明の目的は、上記課題に鑑み、シート状細胞培養物を破損させることなく基板上から剥離することのできるシート状細胞培養物の剥離方法および製造方法ならびにこれらに用いる培養容器を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を進める中で、慣性力を用いることによりシート状細胞培養物を基板上から、シート状細胞培養物の破損なく剥離できることを見出し、さらに鋭意検討した結果、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は以下に関する。
（１） シート状細胞培養物が主面に付着した第１の基板に対し略平行に、かつ当該主面と対向するように第２の基板を配置するステップと、
シート状細胞培養物に対して第１の基板から第２の基板へ向かう方向に慣性力を作用させることにより、シート状細胞培養物を第１の基板から剥離して第２の基板に坦持させるステップと、
を有する、シート状細胞培養物の剥離方法。
（２） 慣性力が、遠心力である、（１）に記載のシート状細胞培養物の剥離方法。
（３） 慣性力の大きさが、２０〜１０００Ｇである、（１）または（２）に記載のシート状細胞培養物の剥離方法。
（４） 第２の基板を配置後の第１の基板と第２の基板との間の距離が、０．０４〜２０ｍｍである、（１）〜（３）のいずれかに記載のシート状細胞培養物の剥離方法。
（５） 第１の基板上でシート状細胞培養物を形成するステップと、
シート状細胞培養物が主面に付着した第１の基板に対し略平行に、かつ当該主面と対向するように第２の基板を配置するステップと、
シート状細胞培養物に対して第１の基板から第２の基板へ向かう方向に慣性力を作用させることにより、シート状細胞培養物を第１の基板から剥離して第２の基板に坦持させるステップと、
を有する、シート状細胞培養物の製造方法。
（６） 主面上でシート状細胞培養物を形成可能な第１の基板と、
第１の基板に対し略平行に配置されるように構成された第２の基板とを有し、
第２の基板配置時において第１の基板と第２の基板との間の距離が、０．０４〜２０ｍｍとなるように構成されている、培養容器。
（７） 開口を有する容器本体と、当該開口を覆うことのできる蓋とを有し、
第１の基板は、容器本体の底部をなし、
第２の基板は、蓋に支持されて、蓋と第１の基板との間に配置されるように構成されている、（６）に記載の培養容器。
（８） 開口を有する容器本体を有し、
容器本体は、その底部をなす第１の基板と、第１の基板から立設された壁部とを有し、
壁部の内表面の一部が、凹部をなしている、（６）または（７）に記載の培養容器。

以上の本発明によれば、シート状細胞培養物を破損させることなく基板上から剥離することのできるシート状細胞培養物の剥離方法および製造方法ならびにこれらに用いる培養容器を提供することができる。
すなわち、シート状細胞培養物の剥離に慣性力を用いた場合、シート状細胞培養物の全体に慣性力が作用するため、シート状細胞培養物に対し局所的な力が作用せず、シート状細胞培養物が破損しにくい。また、慣性力はシート状細胞培養物の全体に作用するため、シート状細胞培養物に対し、局所的に作用する流体力学的な力または機械的な力と比較して、比較的大きな慣性力を作用させることができ、容易にシート状細胞培養物を剥離することができる。

さらに、慣性力は、例えば遠心分離機等の機器によって遠心力として、容易かつ精度良く発生させることができる力であるため、不本意にシート状細胞培養物に過度の力が作用することも防止され、シート状細胞培養物の破損が防止される。
また、第１の基板から一旦剥離したシート状細胞培養物は、直ちに第１の基板と略平行に配置された第２の基板に坦持されるため、折れ曲がりや皺等の発生も防止される。

図１は、本発明の好適な実施態様に係る培養容器の断面図である。 図２は、図１に示す培養容器の分解図である。 図３は、図１に示す培養容器の断面図である。 図４は、本発明の培養容器の変形態様を示す断面図である。 図４は、本発明の培養容器の変形態様を示す模式図である。 図６は、本発明のシート状細胞培養物の製造方法の好適な態様を示す概要図である。 図７は、本発明のシート状細胞培養物の製造方法の好適な態様を示す概要図である。

以下、本発明を、好適な実施態様に基づき図面を参照しつつ詳細に説明する。
まず、本発明の培養容器について説明する。
図１は、本発明の好適な実施態様に係る培養容器の断面図、図２は、図１に示す培養容器の分解図、図３は、図１に示す培養容器の断面図である。
なお、本願の各図においては説明を容易とするため、各部材の大きさが、適宜強調されており、図示の各部材は、実際の大きさ、比率を示すものではない。また、図中、説明の容易化のため、培養容器１中にシート状細胞培養物１００を記載しているが、当然、シート状細胞培養物１００は本発明を構成するものではない。
図１〜３に示す培養容器１は、細胞を培養してシート状細胞培養物１００を形成するために用いられるものである。

ここで、本明細書中において、「シート状細胞培養物」とは、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１つの細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。

また、シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られている。しかしながら、シート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、シート状細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
なお、シート状細胞培養物の１枚当たりの厚さは、特に限定されないが、例えば、１０μｍ〜３ｍｍ、好ましくは、３０μｍ〜２ｍｍとすることができる。例えば、骨格筋芽細胞によって構成されるシート状細胞培養物の１枚当たりの厚さは、一般に、２０〜４０μｍ程度である。また、例えば、軟骨細胞によって構成されるシート状細胞培養物の１枚当たりの厚さは、一般に、０．７〜１．３ｍｍ程度である。

図１〜図３に示すように、培養容器１は、開口２１を有する容器本体２と、開口２１を覆うことのできる蓋３と、蓋３に脱着可能に構成された受け部材４とを有している。
容器本体２は、容器本体２の底部をなす第１の基板２２と容器本体２の側部を構成する壁部２３とを有し、第１の基板２２と壁部２３とで収納空間２４を形成している。
図２に示すように、第１の基板２２は、円板状をなす基板であり、収納空間２４に面した主面上においてシート状細胞培養物１００が形成可能に構成されている。
壁部２３は、第１の基板２２の縁部に沿って第１の基板２２を囲うように立設された環状の部材であり、壁部２３の第１の基板２２とは接しない縁部は開口２１を形成する。

第１の基板２２の主面２２１の面積は、特に限定されないが、例えば、１〜２００ｃｍ^２、好ましくは２〜１００ｃｍ^２、より好ましくは３〜８０ｃｍ^２である。

また、壁部２３は、その内表面の一部が凹部２３１を形成している。凹部２３１は、後述する慣性力の作用時においてシート状細胞培養物１００が剥離、移動した際に、空気溜めとして機能し、シート状細胞培養物１００の剥離、移動をより確実なものとする。

凹部２３１の容積は、特に限定されないが、例えば、１〜５００ｃｍ^３、好ましくは、２０〜２００ｃｍ^３とすることができる。

また、壁部２３の外壁面には、蓋３を固定するための固定部材２３２が設けられている。本実施態様において、固定部材２３２は、周方向に沿って螺旋状に設けられた凸部である。容器本体２と蓋３とは、固定部材２３２と後述する蓋３に設けられた凹部である固定部材３２１とを介して螺合して、蓋３が容器本体２に固定される。

容器本体２を構成する材料としては、特に限定されず、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコーン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリカーボネート、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂（ＡＢＳ）、塩化ビニルなどを挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。なお、蓋３、受け部材４についても、特段の言及がない限り、上述した材料を１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

また、第１の基板２２のシート状細胞培養物１００を形成することのできる主面２２１は、好ましくは、細胞非接着性の表面である。主面２２１が細胞日接着性を有することにより、シート状細胞培養物１００の剥離に必要な慣性力を比較的小さいものとすることができ、第１の基板２２からのシート状細胞培養物１００の剥離時における損傷をより確実に防止することができる。
ここで、「細胞非接着性」とは、付着細胞が接着しないか、または接着しにくいことを意味する。例えば、付着細胞は、接する表面の疎水性または親水性がある程度以上高いと接着しにくくなることが知られている。したがって、主面２２１は、ある程度以上の疎水性または親水性を有することが好ましい。表面の疎水性または親水性の程度は、例えば、水接触角で表すことができるが、主面２２１の水接触角は、好ましくは７０°以上または５０°以下、特に７５°以上または４０°以下である。

また、主面２２１は、改質されていてもよく、例えば、主面２１１は、改質されて細胞非接着性を有していてもよい。このような改質としては、親水性または疎水性の材料のコーティング、温度変化により疎水性または親水性となる温度応答性材料（特開平２−２１１８６５参照）のコーティングが挙げられる。

温度応答性材料としては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーが挙げられる。

蓋３は、容器本体２の開口２１を覆うように容器本体２に対し脱着可能に構成されており、天板３１と、天板３１に連結された側壁３２とを有している。
天板３１は、その主面が開口２１より大きな面積を有する円板である。天板３１は、開口２１と面する側の主面において、受け部材４を連結する連結部材３１１が設けられている。
連結部材３１１は、受け部材４の内壁面に対応する形状をなすように、主面から突出する壁部をなし、壁面の外表面には、螺旋状の凸部３１２が設けられている。連結部材３１１は、受け部材４の連結部材４２と螺合することにより、蓋３に対し受け部材４を連結する。
また、側壁３２は、その内壁面に固定部材３２１を有している。固定部材３２１は、側壁３２の内壁面に螺旋状に設けられた凹部であり、容器本体２の固定部材２３２とともに螺合して、蓋３と容器本体２とを固定する。

受け部材４は、蓋３に対し脱着自在に構成され、第２の基板４１と、第２の基板４１の縁部に沿って立設された連結部材４２とを有している。
第２の基板４１は、第１の基板２２に対応した形状、本実施態様では第１の基板２２と相似した形状、すなわち円板状をなす板である。
第２の基板４１は、容器本体２、蓋３、受け部材４がすべて連結され、固定された状態において、蓋３に支持されて蓋３と第１の基板２２との間に第１の基板２２に対し略平行に配置されるように構成されている。このように、第２の基板４１が第１の基板２２に対して略平行に配置されることにより、シート状細胞培養物１００に対し慣性力を付与した際に、第１の基板２２から剥離したシート状細胞培養物１００を、これを折れ曲げることなく第２の基板４１が受け取り、坦持することができる。
なお、上述したように第１の基板２２と第２の基板４１とは「略平行」となるように配置されることができるが、具体的には、第１の基板２２と第２の基板４１とは、対向する主面同士のなす角度が、例えば、５°以下、好ましくは３°以下、より好ましくは１°以下となるように配置されるように構成されている。

第２の基板４１は、容器本体２、蓋３、受け部材４がすべて連結され、固定された状態において、すなわち第２の基板４１の配置時において、第１の基板２２との距離が０．０４〜２０ｍｍとなるように設定されている。第１の基板２２と第２の基板４１との距離が上述した範囲内となることにより、第１の基板２２から第２の基板４１へのシート状細胞培養物１００の受け渡しが容易に行われ、シート状細胞培養物１００の破損や皺の発生が防止される。
第１の基板２２と第２の基板４１との距離は、好ましくは０．０４〜２０ｍｍ、より好ましくは０．０４〜６ｍｍ、更に好ましくは０．０４〜０．０６ｍｍである。

また、シート状細胞培養物１００が第１の基板２２に付着している際において、シート状細胞培養物１００と第２の基板４１との距離は、好ましくは０．０１〜２０ｍｍ、より好ましくは０．０１〜３ｍｍ、更に好ましくは０．０１〜０．０３ｍｍである。

なお、本明細書中において、第１の基板２２と第２の基板４１との距離や、シート状細胞培養物１００と第２の基板４１との距離とは、これらの対向する主面同士の平均距離をいう。

また、容器本体２、蓋３、受け部材４がすべて連結され、固定された状態において、第２の基板４１の外周と壁部２３の内表面は、収納空間２４の一部より間隙２４１を形成している。
間隙２４１の平均距離は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍ、好ましくは０．０１〜０．３ｍｍ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｍとすることができる。このように、比較的間隙２４１の距離を小さくすることにより、シート状細胞培養物１００に対し第１の基板２２から第２の基板４１に向かう方向に慣性力を作用させた場合において、剥離したシート状細胞培養物１００が間隙２４１に入り込み、破れが生じたり、シート状細胞培養物１００が取出しにくくなることが防止される。さらに、このように間隙２４１の距離を一定以上とすることにより、受け部材４を連結した蓋３の容器本体２に対する脱着が容易となる。

第２の基板４１を構成する材料としては、特に限定されず、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコーン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリカーボネート、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂（ＡＢＳ）、塩化ビニル、ポリウレタンなどを挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
上述した中でも、第２の基板４１とシート状細胞培養物１００との密着を防止するために、第２の基板４１として、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン、テフロン（登録商標）からなる材料から選択される１種または２種以上を組み合わせて用いることが好ましい。

また、第２の基板４１は、シート状細胞培養物１００を坦持する主面に複数の凹部および／または凸部を有していてもよい。これにより、第２の基板４１にシート状細胞培養物１００が密着することが防止され、第２の基板４１に坦持されたシート状細胞培養物１００の取出しが容易となる。また、慣性力の作用時において、シート状細胞培養物１００に対し、第１の基板２２から第２の基板４１へ向かう方向に対し垂直な慣性力が作用する場合であっても、シート状細胞培養物１００が第２の基板４１上でずれることが防止され、シート状細胞培養物１００に皺が発生することが防止される。

第２の基板４１の主面に複数の凹凸を形成する方法としては、例えば、第２の基板４１の主面を織布（織物、編物）、不織布、特に所定のメッシュを有するメッシュ生地で構成する方法や、第２の基板４１の主面を凹凸を有する樹脂材料で構成する方法が挙げられる。
なお、第２の基板４１の主面を織布または不織布で構成した場合には、第２の基板４１は織布または不織布からなるものであってもよいし、支持体としての硬質な基板上に織布または不織布が配置されたものであってもよい。

連結部材４２は、第２の基板４１と蓋３とを連結する部材である。連結部材４２は、第２の基板４１と連結されるように、第２の基板４１の縁部に渡って設けられている環状部材である。
また、連結部材４２は、その環の外側の面において、螺旋状に形成された凹部４２１を有する。蓋３と受け部材４とは、連結部材３１１の凸部３１２と連結部材４２の凹部との螺合および螺合の解除により、脱着可能となる。

なお、上述した培養容器１の各構成部材の大きさ、厚さ等は、特に言及がない場合であっても、形成するシート状細胞培養物１００の大きさや、操作性等の各種使用条件に合わせて、当業者が適宜設定できることは言うまでもない。

以上のような本実施態様の培養容器１によれば、容器本体２と蓋３と受け部材４とを連結した状態において第１の基板２２から第２の基板４１へ向かう慣性力、例えば遠心力をシート状細胞培養物１００に対し作用させることにより、シート状細胞培養物１００を破損させることなく第１の基板２２上から剥離することができる。剥離されたシート状細胞培養物１００は、第２の基板４１上に坦持されるが、第２の基板４１とシート状細胞培養物１００とは接着細胞等によっては密着していないため、第２の基板４１上のシート状細胞培養物１００をピンセット等により容易に把持、操作、移送することができる。

また、蓋３に対し受け部材４が脱着自在に構成されていることにより、図３に示すようにシート状細胞培養物１００の形成時においては受け部材４を外した状態で培養容器１を従来のシャーレと同様に用いることができ、例えば液体培地１０１中でシート状細胞培養物１００を形成することができる。一方で、シート状細胞培養物１００の形成後においては、受け部材４を蓋３に装着して第１の基板２２からのシート状細胞培養物１００の剥離に供することが可能である。
そして、培養容器１は、本発明のシート状細胞培養物の剥離方法および製造方法に好適に適用可能である。

上述した培養容器１の変形態様としては、例えば、図４（ａ）、（ｂ）に示すような、蓋３ａ、３ｂと受け部材４ａ、４ｂとが、すなわち蓋３ａ、３ｂと第２の基板４１ａ、４１ｂとが一体化した培養容器１ａ、１ｂが挙げられる。このような態様において、培養容器１ａ、１ｂは、それぞれ、好ましくは、蓋３ａ、３ｂに加え、受け部材４ａ、４ｂを有しない蓋をさらに有している。なお受け部材４ａは中空部を有し、一方で受け部材４ｂは、中空部を有さないものである。
なお、類似の変形態様として、受け部材が省略され、蓋の天板が第２の基盤を構成する態様が挙げられる。この場合、第１の基板と第２の基板との距離が比較的小さいことから、培養容器を比較的薄いものとすることができ、同培養容器は、収納性に優れる。

また、培養容器１の他の変形態様としては、螺合以外の機構によって蓋と受け部材とが連結されるものが挙げられる。すなわち、蓋と受け部材との連結には任意の機構を採用することができる。例えば、図５（ａ）に示すような第２の基板４１ｃ上に設けられた複数の柱状体（連結部材）４２ｃを有する受け部材４ｃと、これに嵌合可能な凹部を有する連結部材３１１ｃが設けられた蓋３ｃとを有する培養容器１ｃが挙げられる。

また、培養容器１の他の変形態様としては、複数の第１の基板と複数の第２の基板とを備えた培養容器が挙げられる。このような培養容器としては、例えば、図５（ｂ）に示す培養容器１ｄが挙げられる。
培養容器１ｄの容器本体２ｄは、支持体２５上に複数の、すなわち６個の凹部２６が設けられている。また、凹部２６の底部は、平板状をなして第１の基板２２ｄを形成している。一方で、培養容器１ｄの蓋３ｄは、支持体２５の凹部２６が設けられた面の全体を覆うことができるように、支持体２５の当該面に対応した外形をなしており、支持体２５に対向する面には、凹部２６に対応する位置に、それぞれ第２の基板４１ｄが配置された複数の受け部材４ｄが設けられている。なお、培養容器１ｄは、好ましくは受け部材４ｄを有さない蓋（図示せず）をさらに有し、シート状細胞培養物１００の形成時においては蓋３に代えて当該蓋を用いることができる。

このような培養容器１ｄは、培養容器１と同様の効果を奏するとともに、複数のシート状細胞培養物１００を形成、剥離できるという効果を奏する。
なお、培養容器１ｄは、６個の第１の基板２２ｄと第２の基板４１ｄとを備えるが、第１の基板および第２の基板の数は、その用途に応じて適宜変更することができる。

また、培養容器１の他の変形態様としては、第１の基板および第２の基板の形状を方形等の多角形、楕円形等の任意の形状に変更したものが挙げられる。

次に、本発明のシート状細胞培養物の剥離方法および製造方法について説明する。図６、図７は、本発明のシート状細胞培養物の製造方法の好適な態様を示す概要図である。

本発明のシート状細胞培養物の剥離方法は、シート状細胞培養物が主面に付着した第１の基板に対し略平行に、かつ当該主面と対向するように第２の基板を配置するステップ（配置ステップ）と、
シート状細胞培養物に対して第１の基板から第２の基板へ向かう方向に慣性力を作用させることにより、シート状細胞培養物を第１の基板から剥離して第２の基板に坦持させるステップ（剥離ステップ）と、
を有する。

また、本発明のシート状細胞培養物の製造方法は、第１の基板上でシート状細胞培養物を形成するステップ（形成ステップ）と、
シート状細胞培養物が主面に付着した第１の基板に対し略平行に、かつ当該主面と対向するように第２の基板を配置するステップ（配置ステップ）と、
シート状細胞培養物に対して第１の基板から第２の基板へ向かう方向に慣性力を作用させることにより、シート状細胞培養物を第１の基板から剥離して第２の基板に坦持させるステップ（剥離ステップ）と、
を有する。
このように、本発明のシート状細胞培養物の製造方法は、シート状細胞培養物の剥離方法の各ステップに加え、上記形成ステップを有するものである。したがって、以下に、本発明のシート状細胞培養物の製造方法の好適な実施態様を説明しつつ、併せて本発明のシート状細胞培養物の剥離方法の好適な実施態様を説明する。

まず、形成ステップにおいては、第１の基板２２上でシート状細胞培養物１００を形成する（図６（ａ））。シート状細胞培養物１００の形成は、第１の基板２２上に細胞を播種し、培養することにより行うことができる。
シート状細胞培養物１００を形成する培養容器としては特に限定されず、例えば、図１〜図５に示すものを用いることができるが、本実施態様においては、図１〜図３に示す培養容器１を用いる。本ステップにおいては、受け部材４を取り外した状態で、蓋３で容器本体２を覆い、容器本体２中の収納空間２４内で細胞の播種、培養を行うことができる。

本実施態様において用いることのできる細胞には、細胞培養物、特にシート状の細胞培養物を形成し得る任意の細胞が含まれる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、内皮細胞、軟骨細胞などが含まれる。細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、本実施態様に係る方法に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。特に、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、例えば、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。

第１の基材２２上への細胞の播種は、例えば、公知の液体培地１０１を第１の基材２２上へ供給した後に当該培地上に均一に細胞を播種することにより行うことできる。

なお、細胞は、最終細胞密度が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度となるように播種されることが好ましい。
ここで、「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。

具体的には、例えば、骨格筋芽細胞については、かかる密度は典型的には３００，０００個／ｃｍ^２以上である。細胞密度の上限は、細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞の播種密度は、３．０×１０^５〜３．４×１０^６個／ｃｍ^２、３．５×１０^５〜３．４×１０^６個／ｃｍ^２、１．０×１０^６〜３．４×１０^６個／ｃｍ^２、３．０×１０^５〜１．７×１０^６個／ｃｍ^２、３．５×１０^５〜１．７×１０^６個／ｃｍ^２、１．０×１０^６〜１．７×１０^６個／ｃｍ^２から選択される密度である。上記範囲は、上限が３．４×１０^６個／ｃｍ^２未満である限り、上限および下限の両方、または、そのいずれか一方を含んでもよい。

当業者であれば、本発明に適した細胞密度を、実験により適宜決定することができる。培養期間中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエントになると分化を開始するが、本実施態様においては、好ましくは、骨格筋芽細胞は、細胞培養物は形成するが、分化に移行しない密度で播種される。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、細胞培養物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本実施態様において、細胞培養物形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、さらに好ましくは１２５％以下、特に好ましくは１００％以下である。

細胞の培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃の、５％ＣＯ_２の雰囲気下での培養が挙げられる。培養期間は、細胞培養物の十分な形成、および、細胞分化防止の観点から、好ましくは４８時間以内、より好ましくは４０時間以内、さらに好ましくは２４時間以内である。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。上述した期間内である場合、細胞の分化への移行が防止され、細胞が培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ＭＨＣの発現や、細胞の多核化を分化の指標とすることができる。

以上のようにして形成されるシート状細胞培養物１００は、通常細胞接着分子等の作用により、第１の基板２２の主面に付着している。

次に、配置ステップにおいては、シート状細胞培養物１００が主面に付着した第１の基板２２に対し略平行に、かつ当該主面と対向するように第２の基板４１を配置する（図６（ｂ））。
なお、第１の基板２２と第２の基板４１との好ましい配置については、培養容器１の説明時において詳述したとおりである。

第２の基板４１の配置は、蓋３と受け部材４とを連結し、さらに受け部材４が連結された蓋３を容器本体２に固定することにより行うことができる。培養容器１は、単に各部材を固定することにより、第１の基板２２に対し第２の基板４１を精度よく略平行に配置することができるとともに、第１の基板２２と第２の基板４１との距離や、第２の基板４１とシート状細胞培養物１００との距離を精度よく設定できる。

次に、剥離ステップにおいては、シート状細胞培養物１００に対して第１の基板２２から第２の基板４１へ向かう方向に慣性力を作用させることにより、シート状細胞培養物１００を第１の基板２２から剥離して第２の基板４１上に坦持させる。これにより、シート状細胞培養物１００が第１の基板４１より剥離し、目的とするシート状細胞培養物１００が得られる。

慣性力は、シート状細胞培養物１００の一部分ではなく、全体に作用する。したがって、従来のようにピンセット等を用いて機械的な力により剥離する場合は局所的にシート状細胞培養物に対し剥離のための力を作用させる場合があったが、本実施態様によれば、このような問題を防止することができ、シート状細胞培養物１００の破断や皺の形成等が防止される。
また、従来のようにスポイト等により流体を付与してシート状細胞培養物を剥離する場合には、液流がシート状細胞培養物の形成する平面と平行に移動し、シート状細胞培養物に皺が生じたり、液流の強弱をうまく制御できない問題があったが、本実施態様においては、シート状細胞培養物１００に対し慣性力を目的とする方向（第１の基板２２からシート状細胞培養物１００が離れる方向）に精度良く作用させてシート状細胞培養物１００を剥離することができるため、このような問題が防止されている。

慣性力は、いかなる方法によって発生させるものであってもよいが、好ましくは回転によって生じさせることが好ましい。すなわち、慣性力は、遠心力であることが好ましい。遠心力は、遠心分離機等によって比較的容易に、精度良く所望の大きさで生じさせることができる。本実施態様においては、慣性力として遠心力を用いる。

本実施態様においては、培養容器１を遠心分離器に配置し、培養容器１を回転させることにより、シート状細胞培養物１００に対して第１の基板２２から第２の基板４１へ向かう方向に遠心力を作用させる。
培養容器１の回転に用いるローターは、アングルローター、スイングローターの何れであってもよいが、スイングローターであることが好ましい。スイングローターを用いることにより、遠心力を精度よく目的とする方向に対し一定に作用させることが可能となる。

本実施態様においては、遠心分離機中においてスイングローターに培養容器１をセットする。
図６（ｃ）において、スイングローター２００は、ローターボティ２０１と、バケット２０２とを有している。バケット２０２は、ピン２０３によってローターボティ２０１に接続されており、ピン２０３を軸としてバケット２０２の底部が遠心力の作用する方向に向くように構成されている。
このようなスイングローター２００において、培養容器１は、第１の基板２２から第２の基板４１へ向けて遠心力が作用するように、すなわち、第１の基板２２に対して第２の基板４１がバケット２０２の底部に近くなるように、すなわち蓋３側が底部に配置されるように、配置される。なお、図示の実施態様においては、バケット２０２毎に１つの培養容器１が配置されているが、バケット２０２毎に複数の培養容器１を配置してもよい。

次に、図７（ａ）、（ｂ）に示すように、遠心分離機によって培養容器１を回転（公転）させることにより、シート状細胞培養物１００に対して第１の基板２２から第２の基板４１へ向かう方向（図中矢印）に遠心力（慣性力）を作用させる。これにより、シート状細胞培養物１００が第１の基板２２から剥離して、第２の基板４１に担持される。
作用させる遠心力（慣性力）の大きさは、特に限定されないが、２０〜１０００Ｇであることが好ましく、８０〜２５０Ｇであることがより好ましい。これにより、シート状細胞培養物１００の破損を防止しつつ、第１の基板２２から好適にシート状細胞培養物１００を剥離できる。
また、遠心力を作用させる時間は、特に限定されないが、例えば、１〜６０分、好ましくは、５〜１０分とすることができる。

なお、遠心分離機においては、目的とする回転数となるまで回転数を徐々に増やし、目的とする回転数で一定時間運転後、回転が止まるまで回転数を徐々に減じていく必要がある。回転数（回転速度）の増加、減少時においては、シート状細胞培養物１００に対し遠心力に加え、回転軌道に沿った慣性力が作用するため、回転数の変化は、できる限り少なくなるように遠心分離機を運転することが好ましい。

また、培養容器１の回転中における遠心分離機の温度（周囲環境の温度）は、特に限定されないが、２〜３７℃であることが好ましく、２０〜２５℃であることがより好ましい。

以上のようにして、シート状細胞培養物１００を破損させることなく第１の基板２２上から剥離することができ、皺や破れ等の発生が防止されたシート状細胞培養物１００を得ることができる。なお、第２の基板４１上に担持されたシート状細胞培養物１００は第２の基板４１に対し接着細胞等の作用により密着するものではないため、これをピンセット等の器具により容易に把持、移送することが可能である。

以上、本発明を図示の実施態様について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明においては、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成を付加することもできる。

１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ 培養容器
２、２ｄ 容器本体
２１ 開口
２２、２２ｄ 第１の基板
２３ 壁部
２３１ 凹部
２３２ 固定部材
２４ 収納空間
２４１ 間隙
２５ 支持体
２６ 凹部
３、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ 蓋
３１ 天板
３１１ 主面
３１１、３１１ｃ 連結部材
３１２ 凸部
３２ 側壁
３２１ 固定部材
４、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ 受け部材
４１、４１ａ、４１ｂ、４１ｃ、４１ｄ 第２の基板
４２ 連結部材
４２１ 凹部
１００ シート状細胞培養物
１０１ 液体培地
２００ スイングローター
２０１ ローターボディ
２０２ バケット
２０３ ピン

Claims (8)

1. シート状細胞培養物が主面に付着した第１の基板に対し略平行に、かつ当該主面と対向するように第２の基板を配置するステップと、
   シート状細胞培養物に対して第１の基板から第２の基板へ向かう方向に慣性力を作用させることにより、シート状細胞培養物を第１の基板から剥離して第２の基板に坦持させるステップと、
   を有する、シート状細胞培養物の剥離方法。
2. 慣性力が、遠心力である、請求項１に記載のシート状細胞培養物の剥離方法。
3. 慣性力の大きさが、２０〜１０００Ｇである、請求項１または２に記載のシート状細胞培養物の剥離方法。
4. 第２の基板を配置後の第１の基板と第２の基板との間の距離が、０．０４〜２０ｍｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシート状細胞培養物の剥離方法。
5. 第１の基板上でシート状細胞培養物を形成するステップと、
   シート状細胞培養物が主面に付着した第１の基板に対し略平行に、かつ当該主面と対向するように第２の基板を配置するステップと、
   シート状細胞培養物に対して第１の基板から第２の基板へ向かう方向に慣性力を作用させることにより、シート状細胞培養物を第１の基板から剥離して第２の基板に坦持させるステップと、
   を有する、シート状細胞培養物の製造方法。
6. 主面上でシート状細胞培養物を形成可能な第１の基板と、
   第１の基板に対し略平行に配置されるように構成された第２の基板とを有し、
   第２の基板配置時において第１の基板と第２の基板との間の距離が、０．０４〜６ｍｍとなるように構成されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法に用いるための培養容器。
7. 開口を有する容器本体と、当該開口を覆うことのできる蓋とを有し、
   第１の基板は、容器本体の底部をなし、
   第２の基板は、蓋に支持されて、蓋と第１の基板との間に配置されるように構成されている、請求項６に記載の培養容器。
8. 開口を有する容器本体を有し、
   容器本体は、その底部をなす第１の基板と、第１の基板から立設された壁部とを有し、
   壁部の内表面の一部が、凹部をなしている、請求項６または７に記載の培養容器。