JP6574165B2 - シート状細胞培養物を製造するための細胞培養器具およびそれを用いたシート状細胞培養物の製造方法 - Google Patents
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Description
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
[1]シート状細胞培養物の製造方法であって、細胞非接着性領域と細胞接着性領域とがパターン形状を形成する、略平面状の表面を有する培養基材上に、細胞を播種し、インキュベートすることを含む、前記方法。
[2]さらに、培養基材上で形成されたシート状細胞培養物を該基材から剥離することを含む、[1]の方法。
[3]1つの細胞接着領域と、該細胞接着領域に隣接する他の細胞接着領域との間の少なくとも一部における間隔が、播種される細胞の長径よりも大きい、[1]または[2]の方法。
[4]細胞が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種される、[1]〜[3]の方法。
[5]細胞が、骨格筋芽細胞である、[1]〜[4]の方法。
[6]パターン形状が、細胞非接着領域または細胞接着領域のいずれか一方を島とし、他方を海とする海島構造である、[1]〜[5]の方法。
[7]細胞接着性領域が島であり、細胞非接着性領域が海である、[6]の方法。
[8]細胞接着性領域の割合が、表面全体の4%〜65%である、[1]〜[7]の方法。
[9]シート状細胞培養物を製造するための細胞培養器具であって、シート状細胞培養物を形成するための略平面状の細胞非接着性の培養基材表面を有し、該培養基材表面は細胞接着性処理された領域を複数有し、該領域が前記培養基材表面に均一に分散して存在している、前記細胞培養器具。
[10]細胞接着性処理が、紫外線照射、プラズマ放電またはコロナ放電により行われる、[9]の細胞培養器具。
[11]細胞接着性処理が、紫外線照射により行われる、[10]の細胞培養器具。
[12]細胞接着性処理された領域が、2〜4mm間隔で存在する直径1〜4mmの点状の領域である、[9]〜[11]の細胞培養器具。
[13]細胞接着性処理された領域が、培養基材表面全体の4%〜65%である、[9]〜[12]の細胞培養器具。
[14]シート状細胞培養物の製造方法であって、[9]〜[13]の細胞培養器具の培養基材表面に細胞を播種し、インキュベートすることを含む、前記方法。
[15]さらに、培養基材上で形成されたシート状細胞培養物を該基材から剥離することを含む、[14]の方法。
[16]細胞が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種される、[14]または[15]の方法。
[17]細胞が、骨格筋芽細胞である、[14]〜[16]の方法。
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には1つの細胞層からなるものであるが、2以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および/または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
接着細胞は、接する表面の疎水性または親水性がある程度以上高いと接着しにくくなることが知られている。したがって、本発明の一態様において、細胞非接着性表面は、ある程度以上の疎水性または親水性を有している。表面の疎水性または親水性の程度は、例えば、水接触角で表すことができるが、本発明において、細胞非接着性表面の水接触角は、好ましくは80°以上または50°以下、特に70°以上または40°以下である。
「細胞接着性成分」とは、細胞が接着可能なあらゆる成分を意味する。逆に「細胞非接着性成分」とは、細胞が接着できないか、またはしづらいあらゆる成分を意味する。細胞接着性成分としては、これに限定するものではないが、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラメニン、コラーゲン、プロテオグリカンなどの血清・細胞外マトリクス成分、RGD、CS−1などの細胞接着ペプチド、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンなどのポリマー化合物などが挙げられる。細胞非接着性成分としては、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル(ポリHEMA)、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン(MPC)などのハイドロゲルなどが挙げられる。
したがって、特に好ましい一態様において、細胞接着性処理された領域は、2〜4mm程度の間隔で存在する直径1〜4mm程度の点状の領域であり、さらに好ましくは格子点状に配置されている。
浮遊細胞培養用ディッシュなどの、接着細胞用の表面処理を施されていない培養基材表面に、細胞接着性処理を施したい領域のみを露出させるようにマスキングを行う。マスキング方法については、当該技術分野において知られた通常の方法を用いることができ、例えばマスキングシールなどを貼付する、フォトマスクを用いるなどの方法で行うことができる。次にマスキングした細胞培養表面に紫外線照射などを行い、露出領域に細胞接着性処理を施す。プラズマ処理やコロナ放電処理で細胞接着性処理を行う場合は、1、2秒で処理が完了するが、紫外線照射で細胞接着性処理を行う場合はある程度の時間露光する必要がある。したがって紫外線照射は、露光時間を変更することで細胞接着性の制御を行うことができる点で好ましい。紫外線照射処理を行う場合の処理時間は不必要に基材を劣化しない程度であればよく、用いる培養基材の材質および照射に用いる水銀ランプの波長、さらに照射高によっても異なるが、例えばポリスチレン製の基材に対して184.9nmの波長を照射高20mmで照射する場合は、少なくとも15秒以上、好ましくは30秒〜100秒程度露光すればよい。一般的には、処理表面に照射される紫外線量(積算光量)を目安とし、照度を上げれば時間が短くなり、照度を下げれば時間が長くなることとなる。さらに、波長によりエネルギー量が変化するため、最適な時間は異なることとなる。一般的に、波長が短いほうがエネルギー量を大きいため、照射時間は短くなる。
細胞非接着性表面を有する浮遊系細胞用のペトリディッシュ(BD製、code:35-1008)の非接着性表面に、4mmの間隔で20%FBS含有MCDB131培地を約1mmの径となるようにプロットし、40時間インキュベートして接着性表面を形成した。全培養表面に対する接着性表面の割合は約10%であった。20%(v/v)FBS含有のMCDB131培地で懸濁した細胞を9.3×106個/枚となるようにディッシュに播種した。細胞を37℃、5%CO2で6時間培養後、ピペッティングによりシート状になった細胞培養物をプレートから剥離させた。
図1に示す通り、6時間培養したものは、ピペッティングにより容易に剥離可能であり、そのためよれ、しわの少ない上質のシート状細胞培養物が得られた。また同様の条件で15時間培養した場合は、シート状細胞培養物を形成後ピペッティングすることなく自然に剥離したが、よれやしわができてしまっていた。
細胞培養用マルチウェルプレート(BD製、code: 353046)の接着性表面に、4mmの間隔で非接着性ポリマー(ポリHEMA)を約3mmの径となるように格子点状にプロットし、室温で1時間ほど乾燥させた。全培養表面に対する接着性表面の割合は60%以下であった。20%(v/v)FBS含有のMCDB131培地で懸濁した細胞を、9.3×106個/枚となるようにディッシュに播種した。細胞を37℃、5%CO2で6時間培養後、ピペッティングによりシート状になった細胞培養物をプレートから剥離させた。
図2に示す通り、6時間培養したものは、ピペッティングにより容易に剥離可能であり、そのためよれ、しわの少ない上質のシート状細胞培養物が得られた。
上記実施例1の方法を以下のとおり改変して行った。培養基材は、浮遊系細胞用のペトリディッシュ(BD製、code:35-1008)に代えてIWAKIペトリディッシュ(AGCテクノグラス製、3.5cm径)を用いた。培養基材表面の細胞接着性領域の形成は、以下の手順で行った。
(1)シリコンシートを35mm径に打ち抜いて円状のシリコンシートを作製し、この円状シリコンシートに4mm径の穴を4mm間隔で格子点状に開けた。
(2)(1)により得たシリコンシートを上記ペトリディッシュの培養表面上に置き、UV照射装置(センエンジニアリング製:PL16-110)内に設置した。
(3)照射高を15mm、照射紫外線波長を184.9nmに設定し、紫外線を15秒間照射して、島状に親水化処理をしたディッシュを得た。
図3に示す通り、6時間の培養によりシート状細胞培養物の形成が確認され、約1分間のピペッティングにより容易に剥離可能であり、よれ、しわの少ない上質のシート状細胞培養物が得られた。
Claims (7)
- パターニングされていないシート状細胞培養物を製造するための細胞培養器具であって、シート状細胞培養物を形成するための略平面状の細胞非接着性の培養基材表面を有し、該培養基材表面は細胞接着性処理された領域を複数有し、該領域が前記培養基材表面に均一に分散して存在し、かつ、該領域が2〜4mm間隔で存在する直径1〜4mmの点状の領域である、前記細胞培養器具。
- 細胞接着性処理が、紫外線照射、プラズマ放電またはコロナ放電により行われる、請求項1に記載の細胞培養器具。
- 細胞接着性処理が、紫外線照射により行われる、請求項2に記載の細胞培養器具。
- 細胞接着性処理された領域が、培養基材表面全体の4%〜65%である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞培養器具。
- パターニングされていないシート状細胞培養物の製造方法であって、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞培養器具の培養基材表面に細胞を実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種し、インキュベートすることを含む、前記方法。
- さらに、培養基材上で形成されたシート状細胞培養物を該基材から剥離することを含む、請求項5に記載の方法。
- 細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項5または6に記載の方法。
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