WO2016152592A1 - シート状細胞培養物の評価方法 - Google Patents

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WO2016152592A1
WO2016152592A1 PCT/JP2016/057863 JP2016057863W WO2016152592A1 WO 2016152592 A1 WO2016152592 A1 WO 2016152592A1 JP 2016057863 W JP2016057863 W JP 2016057863W WO 2016152592 A1 WO2016152592 A1 WO 2016152592A1
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WO
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sheet
cell culture
cells
shaped cell
culture
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Application number
PCT/JP2016/057863
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English (en)
French (fr)
Inventor
正一 廣瀬
Original Assignee
テルモ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating a sheet-shaped cell culture and a system for evaluating the sheet-shaped cell culture.
  • Severe heart failure that is the subject of such surgical treatment includes those caused by advanced valvular disease and severe myocardial ischemia, acute myocardial infarction and its complications, acute myocarditis, ischemic cardiomyopathy (ICM), dilation
  • ICM ischemic cardiomyopathy
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • valvuloplasty and replacement coronary artery bypass surgery, left ventricular plastic surgery, mechanical assisted circulation, etc. are applied.
  • Patent Document 1 a three-dimensional cell culture that can be applied to the heart including cells derived from parts other than the adult myocardium by using a temperature-responsive culture dish that applies tissue engineering, and its A manufacturing method was provided (Patent Document 1).
  • Patent Documents 2 and 3 attempts have been made to produce sheet-like cell cultures by a method that does not use manufacturing process-derived impurities.
  • a sheet-shaped cell culture not containing impurities from the production process and a production method thereof have been provided by controlling the number of seeded cells, pressurization, etc. (Patent Documents 2 and 3).
  • Patent Document 4 discloses a method of measuring the ratio of cells adhered to a culture vessel among all seeded cells as an adhesion rate, and determining that a sheet-shaped cell culture has been formed when the adhesion rate is equal to or greater than a set value. It is disclosed.
  • a sheet-shaped cell culture produced by these methods When a sheet-shaped cell culture produced by these methods is administered to a subject at a medical site for treatment, information regarding the quality of the sheet-shaped cell culture to be administered may be recorded as an administration record. desirable. However, in order to confirm the quality of the sheet-like cell culture, it is necessary to destroy the sheet-like cell culture with an enzyme treatment or the like to form a single cell, and observe the number of cells and the cell density that can serve as quality indicators. Therefore, the quality of the sheet cell culture actually used could not be evaluated.
  • the object of the present invention is to provide a sheet-like cell culture evaluation method and a sheet-like cell culture production process, in which the quality can be confirmed without destroying the sheet-like cell culture actually used. It is to provide a system for evaluating cell cultures.
  • the present inventor has newly found out that the quality of the sheet-like cell culture depends on the permeability of the sheet-like cell culture, while carrying out earnest research to solve the above problems.
  • the present invention has been completed by finding out what can be done.
  • the present invention relates to the following. (1) irradiating the sheet-shaped cell culture with light; Measuring the transmittance of the sheet-shaped cell culture irradiated with light; Calculating an index relating to the quality of the sheet-shaped cell culture from the permeability, A method for evaluating a sheet-shaped cell culture. (2) The method according to (1) above, wherein the index is 1 or 2 or more selected from the group consisting of cell density, cell number, contraction rate and thickness of the sheet-like cell culture. (3) The method according to (1) or (2) above, wherein the sheet-shaped cell culture is a sheet-shaped cell culture after being detached from the culture substrate. (4) The method according to any one of (1) to (3) above, wherein the light beam is a laser beam.
  • the sheet-shaped cell culture was irradiated with light, the transmittance of the sheet-shaped cell culture irradiated with the light was measured, and an index related to the quality of the sheet-shaped cell culture was calculated from the transmittance.
  • An irradiation unit for irradiating the sheet-shaped cell culture with light, a measurement unit for measuring the transmittance of the sheet-shaped cell culture irradiated with the light, and an index relating to the quality of the sheet-shaped cell culture from the transmittance A system for evaluating a sheet-shaped cell culture, including an analysis unit.
  • the present invention it is possible to easily and nondestructively calculate an index relating to the quality of a sheet-like cell culture. Therefore, it is possible to record information relating to the quality of the sheet-like cell culture administered at the medical site. And by specifying an effective amount from such information and follow-up after administration, it becomes possible to suppress the onset and recurrence of the disease, reduce the symptoms, or delay or stop the progression. Furthermore, the quality of the sheet-shaped cell culture can be determined by comparing such an index with a preset value.
  • FIG. 1 is a diagram showing a plurality of sheet-like cell cultures having different numbers of cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing the correlation between the permeability of the sheet-shaped cell culture and the number of cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the correlation between the transmittance (center) of the sheet-shaped cell culture before and after peeling and the number of cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the correlation between the transmittance (average value) of the sheet-shaped cell culture before and after peeling and the number of cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the correlation between the permeability and the contraction rate of the sheet-like cell culture.
  • FIG. 6 is a diagram showing the transmittance of the sheet-shaped cell culture in which cells are uniformly seeded (left side in the figure) and the transmittance of the sheet-shaped cell culture in which cells are seeded non-uniformly (right side in the figure). is there.
  • One aspect of the present invention relates to a step of irradiating a sheet-shaped cell culture with light, a step of measuring a transmittance of the sheet-shaped cell culture irradiated with the light, and a quality of the sheet-shaped cell culture from the transmittance.
  • the present invention relates to a method for evaluating a sheet-shaped cell culture (hereinafter, sometimes referred to as “the evaluation method of the present invention”) including a step of calculating an index.
  • the evaluation method of the present invention may include a step of forming a sheet-shaped cell culture before the step of irradiating the sheet-shaped cell culture with light.
  • the cells in the evaluation method of the present invention are not particularly limited as long as they can form a sheet-shaped cell culture, and include, for example, adherent cells (adherent cells).
  • Adherent cells include, for example, adherent somatic cells (eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal cells, gingival cells, periosteum cells, skin Cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) Etc.
  • adherent somatic cells eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells
  • Somatic cells may be differentiated from stem cells, particularly iPS cells.
  • Non-limiting examples of cells in the evaluation method of the present invention include, for example, myoblasts (for example, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (for example, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair root, muscle tissue) , Endometrium, placenta, cord blood, etc.), cardiomyocytes, fibroblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelial cells, retina) Pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells), hepatocytes (eg, liver parenchymal cells), pancreatic cells (eg, islet cells), kidney cells, adrenal cells, tooth roots
  • Examples include membrane cells, gingival cells, perioste
  • sheet-like cell culture refers to a sheet-like culture in which cells are connected to each other.
  • the cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance that can connect cells at least physically (mechanically), and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the intervening substance is preferably derived from cells, particularly derived from cells constituting the sheet-shaped cell culture.
  • the cells are at least physically (mechanically) connected, but may be further functionally, for example, chemically or electrically connected.
  • the sheet-shaped cell culture is composed of one cell layer (single layer) or composed of two or more cell layers (stacked (multilayer), for example, two layers, three layers, four layers) Layer, 5 layers, 6 layers, etc.).
  • the sheet-shaped cell culture of the present invention preferably does not contain a scaffold (support). Scaffolds may be used in the art to attach cells on and / or within its surface and maintain the physical integrity of sheet-like cell cultures, for example, polyvinylidene difluoride ( PVDF) membranes and the like are known, but the sheet-like cell culture of the present invention can maintain its physical integrity without such a scaffold.
  • the sheet-shaped cell culture of the present invention is preferably composed only of cells derived from the cells constituting the sheet-shaped cell culture, and does not contain other substances.
  • the cells in the present invention can be derived from any organism that can be treated with a sheet-like cell culture.
  • organisms include, but are not limited to, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, and the like. Is included.
  • the sheet-shaped cell culture Only one type of cell may be used for forming the sheet-shaped cell culture, but two or more types of cells may be used.
  • the cells often contain multiple types of cells, and it may be difficult to specify all cell types.
  • the sheet-shaped cell culture composed of the cell population may be referred to as “sheet-shaped cell culture composed of cells A”.
  • the most cell ratio is determined at the start of sheet culture or at the end of production of the sheet-shaped cell culture.
  • the cell may be a xenogeneic cell or a homologous cell.
  • heterologous cell as used herein means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the sheet-shaped cell culture is used for transplantation.
  • cells derived from monkeys or pigs correspond to xenogeneic cells.
  • the “same species-derived cell” means a cell derived from an organism of the same species as the recipient.
  • the human cell corresponds to the allogeneic cell.
  • the allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), that is, cells derived from the recipient, and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present invention because no rejection occurs even after transplantation. However, it is also possible to use heterologous cells or allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection.
  • cells other than autologous cells that is, heterologous cells and allogeneic nonautologous cells may be collectively referred to as nonautologous cells.
  • the cells are autologous cells or allogeneic cells.
  • the cell is an autologous cell. In another embodiment of the invention, the cell is an allogeneic cell.
  • the step of forming a sheet-shaped cell culture in the evaluation method of the present invention can be performed by any known technique. Such a technique is not limited and includes, for example, one described in Patent Document 2.
  • the step of forming a sheet cell culture can be performed on a culture substrate.
  • the step of forming the sheet-shaped cell culture may include a step of seeding the cells on a culture substrate and a step of forming the seeded cells into a sheet.
  • the culture substrate is not particularly limited as long as cells can form a cell culture thereon, and includes, for example, containers of various materials, solid or semi-solid surfaces in containers, and the like.
  • the container preferably has a structure / material that does not allow permeation of a liquid such as a culture solution. Examples of such materials include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl. Examples include acrylamide and metals (for example, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass).
  • the container preferably has at least one flat surface.
  • Examples of such containers include, but are not limited to, cell culture dishes and cell culture bottles. Further, the container may have a solid or semi-solid surface therein. Examples of solid surfaces include plates and containers of various materials as described above, and examples of semi-solid surfaces include gels and soft polymer matrices.
  • the culture substrate may be prepared using the above materials, or commercially available materials may be used. Preferable culture substrates include, but are not limited to, substrates having an adhesive surface suitable for the formation of sheet cell cultures.
  • a substrate having a hydrophilic surface for example, a substrate coated with a hydrophilic compound such as polystyrene subjected to corona discharge treatment, collagen gel or hydrophilic polymer, and further, collagen, fibronectin, laminin , Substrates coated with an extracellular matrix such as vitronectin, proteoglycan and glycosaminoglycan, and cell adhesion factors such as cadherin family, selectin family and integrin family.
  • a hydrophilic compound such as polystyrene subjected to corona discharge treatment, collagen gel or hydrophilic polymer, and further, collagen, fibronectin, laminin , Substrates coated with an extracellular matrix such as vitronectin, proteoglycan and glycosaminoglycan, and cell adhesion factors such as cadherin family, selectin family and integrin family.
  • base materials are commercially available (for example, Corning (R) TC-Treated Culture Dish, Corning,
  • the surface of the culture substrate may be coated with a material whose physical properties change in response to stimulation, for example, temperature or light.
  • materials include, but are not limited to, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylate Amide), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethyl
  • the physical properties for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and peeling of the cell culture adhered on the materials can be promoted.
  • Culture dishes coated with a temperature-responsive materials are commercially available (e.g., UpCell of CellSeed Inc. (R)) can be used, these evaluation methods of the present invention.
  • the culture substrate may have various shapes, but is preferably flat.
  • the area is not particularly limited, but is typically about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , preferably about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , more preferably about 3 cm 2 to about 50 cm 2 .
  • the seeding of the cells on the culture substrate can be performed by any known method and condition.
  • the seeding of the cells on the culture substrate may be performed, for example, by injecting a cell suspension obtained by suspending the cells in the culture solution into the culture substrate (culture vessel).
  • a cell suspension obtained by suspending the cells in the culture solution into the culture substrate (culture vessel).
  • an apparatus suitable for the operation of injecting the cell suspension such as a dropper or a pipette, can be used.
  • seeding is performed at a density that allows a sheet-like cell culture to form without substantial growth of the cells.
  • the density at which cells can form a sheet-shaped cell culture without substantial growth means that the sheet-shaped cell culture is expressed when cultured in a non-proliferating medium that does not substantially contain growth factors. It means the cell density that can be formed.
  • cells are seeded on a culture substrate at a density of about 6,500 cells / cm 2 to form a sheet-like cell culture.
  • the seeding density in this embodiment is higher than that in the method using a culture solution containing a growth factor.
  • density is typically about 1.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or more, for example, for skeletal myoblasts.
  • the upper limit of the seeding density is not particularly limited as long as the formation of the sheet-shaped cell culture is not impaired and the cells do not shift to differentiation, but for skeletal myoblasts, the upper limit of seeding density is less than about 3.4 ⁇ 10 6 cells / cm 2 . is there.
  • the “density at which a sheet-like cell culture can be formed without substantially growing” in skeletal myoblasts is about 1.0 ⁇ 10 5 to about 3.4 ⁇ 10 6 cells / cm 2 in some embodiments. In another embodiment, about 3.0 ⁇ 10 5 to about 3.4 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , and in another embodiment about 3.5 ⁇ 10 5 to about 3.4 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , In yet another aspect, from about 1.0 ⁇ 10 6 to about 3.4 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , and in yet another aspect, from about 3.0 ⁇ 10 5 to about 1.7 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , In another embodiment, from about 3.5 ⁇ 10 5 to about 1.7 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , and in another embodiment, from about 1.0 ⁇ 10 6 to about 1.7 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 .
  • the density is, for example, about 3.0 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 or more and less than about 3.4 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 (including the lower limit and not including the upper limit), about 3.5 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 or more and less than about 3.4 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 (including the lower limit, not including the upper limit), about 1.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 or more and about 3.4 ⁇ 10 6 Less than pieces / cm 2 (including lower limit, not including upper limit), more than about 1.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 and less than about 3.4 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 (including neither lower limit nor upper limit), It may be about 1.0 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 or more and about 1.7 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 or less (not including the lower limit but including the upper limit).
  • the “density at which cells can form a sheet-like cell culture without substantial growth” is at or above the density at which the cells reach confluence, or at or above the confluent density.
  • the step of forming the seeded cells into a sheet can also be performed by any known technique and condition.
  • Non-limiting examples of such techniques are described in, for example, Patent Documents 1 and 2. It is considered that the formation of a cell sheet is achieved when cells adhere to each other via an adhesion molecule or an intercellular adhesion mechanism such as an extracellular matrix. Therefore, the step of forming the seeded cells into a sheet can be achieved, for example, by culturing the cells under conditions that form cell-cell adhesion.
  • Such conditions may be any as long as cell-cell adhesion can be formed, but cell-cell adhesion can usually be formed under the same conditions as general cell culture conditions. Examples of such conditions include culture at about 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture can be performed under normal pressure (atmospheric pressure, non-pressurized).
  • normal pressure atmospheric pressure, non-pressurized
  • sheet culture the culture for forming the seeded cells into a sheet.
  • cell culture is performed within a predetermined period, preferably within a period in which cells do not shift to differentiation.
  • the cells are maintained in an undifferentiated state during the culture period.
  • the transition to cell differentiation can be evaluated by any method known to those skilled in the art. For example, in the case of skeletal myoblasts, MHC expression, creatine kinase (CK) activity, cell multinucleation, myotube formation, etc. can be used as indicators of differentiation.
  • the culture period is within about 48 hours, more preferably within about 40 hours, and even more preferably within about 24 hours.
  • Cell culture can be performed under conditions usually used in the art.
  • typical culture conditions include culture at about 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture can be performed under normal pressure (atmospheric pressure, non-pressurized).
  • the culture period is preferably within about 48 hours, more preferably within about 40 hours, and even more preferably within about 24 hours, from the viewpoint of sufficient formation of a sheet-shaped cell culture and prevention of cell differentiation.
  • Culturing can be performed in containers of any size and shape.
  • the size and shape of the sheet-shaped cell culture can be adjusted by adjusting the size and shape of the cell adhesion surface of the culture vessel, or by placing a mold of the desired size and shape on the cell adhesion surface of the culture vessel, It can be arbitrarily adjusted by, for example, culturing cells therein.
  • the cells do not proliferate beyond the measurement error range. Whether or not the cells have proliferated can be evaluated by, for example, comparing the number of cells at the time of seeding with the number of cells after forming the sheet-like cell culture.
  • the number of cells after forming the sheet-shaped cell culture is typically about 300% or less, preferably about 200% or less, more preferably about 150% or less, and still more preferably about the number of cells at the time of seeding. 125% or less, particularly preferably about 100% or less.
  • Cell growth depends on various conditions such as the number of seeded cells (seeded cell density), the culture environment (eg, culture time, culture temperature, etc.), the composition of the medium, etc. By adjusting these conditions, The cells can be substantially not proliferated. Among these conditions, by increasing the seeded cell density, a sheet-like cell culture can be obtained in a relatively short time while suppressing cell growth. In the present invention, growth is controlled by the seeded cell density. It is preferable. The density at which cells can form a sheet-shaped cell culture without substantial growth is as described above.
  • the step of irradiating the sheet-shaped cell culture with light can be performed by any known technique and conditions.
  • a technique include, but are not limited to, irradiating a sheet-shaped cell culture with light, for example, visible light.
  • the light source of the light beam is not particularly limited as long as the wavelength of the generated light beam can be kept constant, and examples thereof include a laser, an LED, a fluorescent lamp, an incandescent lamp, a high-intensity discharge lamp, and a mercury lamp.
  • the wavelength of the light beam is not limited and is, for example, 380 to 430 nm, 380 to 430 nm, 430 to 490 nm, 490 to 550 nm, 550 to 590 nm, 590 to 640 nm, 640 to 770 nm, preferably 640 to 770 nm. it can.
  • the light irradiation may be performed on the whole sheet-shaped cell culture or a plurality of points such as the center, upper, lower, right, and left sides of the sheet-shaped cell culture.
  • the irradiation area of the light beam is not particularly limited, but may be, for example, 100 to 0.01 mm 2 , preferably 10 to 0.01 mm 2 , more preferably 5 to 0.05 mm 2 .
  • the light beam may be a laser beam from the viewpoints of directivity, monochromaticity, coherence, and wavelength uniformity.
  • the step of measuring the transmittance of the sheet-like cell culture irradiated with light can be performed by any known method. Examples of such a technique include, but are not limited to, for example, measuring a portion of the sheet-like cell culture irradiated with light with a photometer.
  • the “transmittance” is a numerical value related to the amount of light absorbed while the light passes through the substance. For example, the light before entering the sheet-like cell culture and the sheet-like cell culture passed. It can be calculated from the intensity ratio with the later rays.
  • the transmittance measurement may be performed on one or more points on the sheet-like cell culture irradiated with light. When performing with respect to two or more points, you may calculate the average value of a measured value.
  • the step of calculating the index relating to the quality of the sheet-shaped cell culture from the transmittance can be performed by any known method.
  • the “index regarding the quality of the sheet-shaped cell culture” means the cell density, the number of cells, the contraction rate, the thickness, etc. of the sheet-shaped cell culture. Examples of such a technique include, but are not limited to, calculating the cell density of the sheet-like cell culture from the transmittance.
  • the permeability of the sheet cell culture can vary depending on the cell density of the sheet cell culture. That is, if the cell density of the sheet-shaped cell culture is high, the amount of light absorbed by the cells while passing through the sheet-shaped cell culture is large, and thus the transmittance is low. Conversely, if the cell density of the sheet-shaped cell culture is low, the amount of light absorbed by the cells while the light passes through the sheet-shaped cell culture is small, and thus the transmittance is high.
  • the correlation between the transmittance and the cell density of the sheet-shaped cell culture is not limited to this.
  • the transmittance was measured by irradiating each of the plurality of sheet-shaped cell cultures for samples with light. Thereafter, the sheet-shaped cell culture is treated with an enzyme, the number of cells is measured, and a calibration curve is drawn from the obtained transmittance and the number of cells.
  • the number of cells in the sheet-like cell culture means the number of cells contained in the sheet-like cell culture after the formation of the sheet-like cell culture. Thereby, the number of cells can be easily calculated from the permeability of the sheet-like cell culture.
  • the cell density of the sheet cell culture can be easily calculated from the number of cells in the sheet cell culture and the area of the sheet cell culture.
  • the evaluation method of the present invention may include a step of measuring the area of the sheet-shaped cell culture.
  • the contraction rate of the sheet-shaped cell culture can vary depending on the cell density of the sheet-shaped cell culture. That is, when the seeding density of the cells on the culture substrate is small, the adhesion area on the substrate per cell is large, and each cell adheres to other cells in a shape that spreads on the culture substrate. A dendritic cell culture is formed. For example, when the sheet-shaped cell culture is peeled from the culture substrate, each cell in the expanded shape gradually returns to its original shape while maintaining cell-cell adhesion. Shrink gradually. On the contrary, when the seeding density is high, the adhesion area on the base material per cell is small and the degree of spreading of each cell on the culture base material is small. Is small.
  • the correlation between the cell density and the contraction rate of the sheet-shaped cell culture is obtained in advance by measuring the cell density and the contraction rate using a plurality of sheet-shaped cell cultures for the sample as described above. be able to.
  • the shrinkage rate of the sheet-like cell culture can be compared before and after the area of the sheet-like cell culture is detached from the culture substrate, or the change in the area of the detached sheet-like cell culture is observed over time. It can be obtained by doing. From the correlation between the transmittance and the cell density, the correlation between the transmittance and the contraction rate can be easily obtained. Thereby, the size after contraction of the sheet-like cell culture can be estimated from the transmittance of the sheet-like cell culture.
  • the permeability of the sheet cell culture can vary depending on the thickness of the sheet cell culture. That is, if the thickness of the sheet-shaped cell culture is large, the amount of light absorbed by the cells while passing through the sheet-shaped cell culture is large, and thus the transmittance is low. Conversely, if the thickness of the sheet-shaped cell culture is small, the amount of light absorbed by the cells is small, and thus the transmittance is high.
  • the correlation between the transmittance and the thickness can also be obtained by measuring the transmittance and the thickness of the plurality of sheet-like cell cultures for samples as described above.
  • indices relating to the quality of the sheet-shaped cell culture such as the cell density, the number of cells, the contraction rate, and the thickness of the sheet-shaped cell culture can be calculated. In this way, it is possible to estimate an index related to the quality of a sheet-shaped cell culture, which could only be confirmed by destroying or detaching the sheet-shaped cell culture, without destroying or detaching the sheet-shaped cell culture. Is possible.
  • Information on the quality of the sheet-shaped cell culture is important information for determining the transplant site and transplant method, and if these can be grasped in advance, the transplant operation can proceed smoothly. Moreover, since various information regarding the quality of the sheet-like cell culture actually used for transplantation can be recorded, the effective amount can be specified accurately.
  • the quality of the sheet-shaped cell culture can be determined by comparing the calculated index regarding the quality of the sheet-shaped cell culture with a preset setting value.
  • the evaluation method of the present invention determines the quality of the sheet-shaped cell culture by comparing the calculated index with the set value after the step of calculating the index regarding the quality of the sheet-shaped cell culture from the transmittance. Steps may be included.
  • the step of determining the quality of the sheet-shaped cell culture by comparing the calculated index and the set value can be performed by any known technique.
  • the calculation of the index relating to the quality of the sheet-shaped cell culture may be performed on one or more points on the sheet-shaped cell culture. For example, by measuring the transmittance at the five points of the center, top, bottom, right and left of the sheet-shaped cell culture, and calculating the quality-related index, for example, the cell density and the number of cells in the sheet-shaped cell culture Further, uniformity such as shrinkage rate and thickness may be determined.
  • the sheet-like cell culture may be either before being peeled from the culture substrate or after being peeled from the culture substrate.
  • One aspect of the present invention is to irradiate a sheet-shaped cell culture with light, measure the transmittance of the sheet-shaped cell culture irradiated with the light, and calculate an index relating to the quality of the sheet-shaped cell culture from the transmittance.
  • the present invention relates to a method for producing a sheet-shaped cell culture having a quality equal to or higher than a set value, including determining that a calculated index is equal to or higher than a set value.
  • the step employed in the evaluation method of the present invention is to irradiate the sheet-shaped cell culture with light, measure the transmittance of the sheet-shaped cell culture irradiated with the light, and determine the sheet-shaped cell culture from the transmittance. It is possible to calculate an index related to the quality of the sheet and compare the calculated index with a set value to determine the quality of the sheet-like cell culture. Therefore, one aspect of the present invention is an irradiation unit that irradiates a sheet-like cell culture with light, a measurement unit that measures the transmittance of the sheet-like cell culture irradiated with the light, and the transmittance of the sheet-like cell culture.
  • a system for evaluating a sheet-shaped cell culture is included, including an analysis unit that calculates a quality-related index, and a determination unit that compares the calculated index and a set value to determine the quality of the sheet-shaped cell culture.
  • Example 1 Skeletal myoblasts are cultured on a temperature-responsive culture dish (Cell Cell Upcell 12well, surface area: 3.5 cm 2 / well) for 24 hours while changing the number of seeded cells, and a plurality of sheet-like cell cultures having different cell numbers A product was prepared and peeled from the culture substrate (FIG. 1). The transmittance of each sheet-shaped cell culture was measured by irradiating the center with a laser beam (measuring instrument: laser sensor amplifier LX2-V10 manufactured by Keyence Corporation, laser sensor head LX2-100, wavelength: 670 nm). Thereafter, the sheet-shaped cell culture was treated with an enzyme to measure the number of cells. The results are shown in Table 1 below and FIG.
  • Example 2 Skeletal myoblasts are cultured on a temperature-responsive culture dish (Cell Cell Upcell 12well, surface area: 3.5 cm 2 / well) for 24 hours while changing the number of seeded cells, and a plurality of sheet-like cell cultures having different cell numbers A product was prepared. Before and after peeling the sheet-shaped cell culture from the culture dish, the transmittance was measured at the center and at 5 points (measuring instrument: laser sensor amplifier LX2-V10, laser sensor head LX2-100 manufactured by Keyence Corporation, wavelength: 670 nm). Thereafter, the sheet-shaped cell culture was treated with an enzyme to measure the number of cells. Table 2 and FIG. 3 show the results of measuring the central transmittance and the number of cells of the sheet-shaped cell culture, and the results of measuring the average transmittance and the number of cells at five points of the sheet-shaped cell culture are shown in the following table. 3 and FIG.
  • Example 3 On a temperature-responsive culture dish (Upcell 12well manufactured by Cellseed, surface area: 3.5 cm 2 / well), skeletal myoblasts are cultured for 24 hours while changing the number of seeded cells. Cultures were prepared. Before the sheet-shaped cell culture was peeled from the culture dish, the transmittance was measured at the center and at 5 points (measuring instrument: Laser sensor amplifier LX2-V10, Keyence Corporation, laser sensor head LX2-100, wavelength: 670 nm). . Thereafter, the sheet-like cell culture was peeled and the shrinkage rate was measured. The results are shown in Table 4 below and FIG.
  • Example 4 On a temperature-responsive culture dish (Upcell 3.5 cm, surface area: 8.8 cm 2 manufactured by Cellseed Co., Ltd.), skeletal myoblasts were uniformly seeded and cultured for 24 hours, and non-uniformly seeded. Then, a sheet-shaped cell culture cultured for 24 hours was prepared. Before peeling the sheet-shaped cell culture from the culture dish, the transmittance at 5 points was measured 5 times (measuring instrument: laser sensor amplifier LX2-V10, laser sensor head LX2-100, wavelength: 670 nm, manufactured by Keyence), The average value of the transmittance at each point was calculated. The results are shown in Table 5 below and FIG.
  • the sheet-shaped cell culture in which cells were uniformly seeded had a small variation in permeability, and the sheet-shaped cell culture in which cells were seeded non-uniformly (see FIG. 6). In the middle right), it was confirmed that the variation in transmittance was large.

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Abstract

　本発明は、シート状細胞培養物の評価方法、およびシート状細胞培養物を評価するためのシステムの提供を目的とする。　本発明は、シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップを含む、シート状細胞培養物の評価方法に関する。

Description

シート状細胞培養物の評価方法
　本発明は、シート状細胞培養物の評価方法、およびシート状細胞培養物を評価するためのシステムに関する。
　近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。
　このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
　これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
　この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。
　その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
　重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
　このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
　近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。
　また、製造工程由来不純物を用いない方法でシート状細胞培養物を製造する試みがなされてきた。例えば、播種細胞数のコントロールや、加圧などによって、製造工程由来不純物を含まないシート状細胞培養物およびその製造方法が提供された（特許文献２および３）。
　一方、シート状細胞培養物を製造する過程において、シート状細胞培養物が正しく形成されたか否かを判定する技術は知られている。例えば特許文献４には、全播種細胞のうち培養容器に接着した細胞の割合を接着率として計測し、接着率が設定値以上である場合にシート状細胞培養物が形成されたと判定する方法が開示されている。
　これらの方法により製造されたシート状細胞培養物を、医療の現場において、対象に投与して治療する場合、投与記録として、投与するシート状細胞培養物の品質に関する情報を記録しておくことが望ましい。しかし、シート状細胞培養物の品質を確認するためには、シート状細胞培養物を酵素処理などで破壊してシングルセルの状態にして、品質の指標となり得る細胞数や細胞密度を観察する必要があるため、実際に使用するシート状細胞培養物の品質を評価することはできなかった。
特表２００７－５２８７５５号公報 特開２０１０－８１８２９号公報 特開２０１０－２２６９６２号公報 特開２０１２－１５２１８９号公報
　本発明の目的は、シート状細胞培養物の評価方法、およびシート状細胞培養物の製造工程において、実際に使用するシート状細胞培養物を破壊することなく品質を確認することができる、シート状細胞培養物を評価するためのシステムを提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、シート状細胞培養物の品質がシート状細胞培養物の透過率に依存していることを新たに見出した。さらに鋭意研究を続ける中で、シート状細胞培養物に光線を照射して透過率を測定するという単純な方法で、シート状細胞培養物の品質に関する指標を簡単かつ非破壊的に算出することができることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下に関する。
（１）シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、
　光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、
　透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップ、
を含む、シート状細胞培養物の評価方法。
（２）指標が、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率および厚さからなる群から選択される１または２以上である、上記（１）に記載の方法。
（３）シート状細胞培養物が、培養基材から剥離された後のシート状細胞培養物である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）光線がレーザー光線である、上記（１）～（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップをさらに含む、上記（１）～（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）シート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標が設定値以上であることを判定することを含む、設定値以上の品質を有するシート状細胞培養物を製造する方法。
（７）シート状細胞培養物に光線を照射する照射部、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定する測定部、および透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出する解析部を含む、シート状細胞培養物を評価するためのシステム。
　本発明によれば、シート状細胞培養物の品質に関する指標を簡単かつ非破壊的に算出することが可能となる。したがって、医療などの現場において投与するシート状細胞培養物の品質に関する情報を記録することが可能となる。そして、かかる情報と投与後の経過観察から有効量を特定することで、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止することが可能となる。さらに、かかる指標と事前設定された設定値とを比較して、シート状細胞培養物の品質を判定することができる。
図１は、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を示す図である。 図２は、シート状細胞培養物の透過率と細胞数との相関性を示す図である。 図３は、剥離前と剥離後のシート状細胞培養物の透過率（中心）と細胞数との相関性を示す図である。 図４は、剥離前と剥離後のシート状細胞培養物の透過率（平均値）と細胞数との相関性を示す図である。 図５は、シート状細胞培養物の透過率と収縮率との相関性を示す図である。 図６は、均一に細胞を播種したシート状細胞培養物の透過率（図中左側）、および、不均一に細胞を播種したシート状細胞培養物の透過率（図中右側）を示す図である。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
　本発明の一側面は、シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、および、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップを含む、シート状細胞培養物の評価方法（以下、「本発明の評価方法」と称することがある）に関する。本発明の評価方法は、シート状細胞培養物に光線を照射するステップの前に、シート状細胞培養物を形成するステップを含んでもよい。
　本発明の評価方法における細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。本発明の評価方法における細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。
　本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。
　本発明のシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本発明のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
　本発明における細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。
　シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。また、生体から単離して得た細胞などにおいては、細胞が複数種の細胞を含むことが多く、全ての細胞種を特定することが困難である場合があるため、細胞種への言及は、ある細胞集団における最も比率の多い細胞のみにとどめることがある。例えば、ある細胞集団が所定の比率の細胞Ａと、細胞Ａ以外の１種または２種以上の細胞を含み、細胞Ａの比率が最も多い場合、当該細胞集団を便宜的に細胞Ａと称し、当該細胞集団で構成されるシート状細胞培養物を、「細胞Ａで構成されるシート状細胞培養物」と称することがある。本発明の好ましい態様において、シート状細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、シート化培養開始時、または、シート状細胞培養物製造終了時において、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上である。
　細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本発明においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本発明の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本発明の一態様において、細胞は自家細胞である。本発明の別の態様において、細胞は他家細胞である。
　本発明の評価方法における、シート状細胞培養物を形成するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、特許文献２に記載されたものが挙げられる。シート状細胞培養物を形成するステップは、培養基材上で行うことができる。また、シート状細胞培養物を形成するステップは、細胞を培養基材上に播種するステップ、および、播種した細胞をシート化するステップを含んでもよい。
　培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。
　培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本発明の評価方法に使用することができる。
　上記培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、約１ｃｍ２～約２００ｃｍ２、好ましくは約２ｃｍ２～約１００ｃｍ２、より好ましくは約３ｃｍ２～約５０ｃｍ２である。
　培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
　本発明の好ましい態様において、播種は、細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で行われる。「細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を実質的に含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。例えば、骨格筋芽細胞の場合、成長因子を含む培養液を用いる方法では、シート状細胞培養物を形成するために、細胞を約６，５００個／ｃｍ２の密度で培養基材に播種するが（例えば、特許文献１参照）、かかる密度の細胞を、成長因子を含まない培養液で培養してもシート状の細胞培養物を形成しない。したがって、本態様における播種密度は、成長因子を含む培養液を用いる手法におけるものよりも高いものである。かかる密度は、具体的には、例えば、骨格筋芽細胞について典型的には約１．０×１０５個／ｃｍ２以上である。播種密度の上限は、シート状細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞については、約３．４×１０６個／ｃｍ２未満である。
　したがって、骨格筋芽細胞における「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」は、ある態様では約１．０×１０５～約３．４×１０６個／ｃｍ２、別の態様では約３．０×１０５～約３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約３．５×１０５～約３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約１．０×１０６～約３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約３．０×１０５～約１．７×１０６個／ｃｍ２、別の態様では約３．５×１０５～約１．７×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約１．０×１０６～約１．７×１０６個／ｃｍ２である。上記範囲は、上限が約３．４×１０６個／ｃｍ２未満である限り、上限および下限の両方、または、そのいずれか一方を含んでもよい。したがって、上記密度は、例えば、約３．０×１０５個／ｃｍ２以上かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、約３．５×１０５個／ｃｍ２以上かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、約１．０×１０６個／ｃｍ２以上かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、約１．０×１０６個／ｃｍ２超かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限も上限も含まない）、約１．０×１０６個／ｃｍ２超かつ約１．７×１０６個／ｃｍ２以下（下限は含まないが、上限は含む）であってもよい。当業者であれば、骨格筋芽細胞以外の細胞について、本発明に適した細胞密度を、本明細書の教示に従い、実験により適宜決定することができる。一態様において、「細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」は、細胞がコンフルエントに達する密度もしくはそれ以上、または、コンフルエント密度以上である。
　播種した細胞をシート化するステップも、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、２などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。当業者であれば、播種する細胞の種類に応じて最適な条件を選択することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と称することもある。
　本発明の一態様において、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、細胞が分化に移行しない期間内に行われる。したがって、この態様において、細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ＭＨＣの発現、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、細胞の多核化、筋管の形成などを分化の指標とすることができる。本発明の好ましい態様において、培養期間は約４８時間以内、より好ましくは約４０時間以内、さらに好ましくは約２４時間以内である。
　細胞の培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養期間は、シート状細胞培養物の十分な形成、および、細胞分化防止の観点から、好ましくは約４８時間以内、より好ましくは約４０時間以内、さらに好ましくは約２４時間以内である。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。
　本発明の好ましい態様において、細胞は計測誤差の範囲を超えて増殖しない。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、シート状細胞培養物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本発明において、シート状細胞培養物形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の約３００％以下、好ましくは約２００％以下、より好ましくは約１５０％以下、さらに好ましくは約１２５％以下、特に好ましくは約１００％以下である。
　細胞の増殖は、様々な条件、例えば播種細胞数（播種細胞密度）、培養環境（例えば、培養時間、培養温度など）、培地の組成などにより左右されるため、これらの条件を調節することにより、細胞を実質的に増殖させないことができる。これらの条件のうち、播種細胞密度を高めることにより、細胞の増殖を抑えながら、比較的短時間でシート状細胞培養物を得ることができるため、本発明においては播種細胞密度により増殖をコントロールすることが好ましい。細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度については、すでに上記したとおりである。
　本発明の評価方法における、シート状細胞培養物に光線を照射するステップは、既知の任意の手法および条件により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物に、光線、例えば、可視光線を照射することなどが挙げられる。光線の光源としては、発生する光線の波長を一定に保つことができるものであれば特に限定されないが、例えば、レーザー、ＬＥＤ、蛍光灯、白熱灯、高輝度放電灯、水銀灯などが挙げられる。光線の波長としては、限定されずに、例えば、３８０～４３０ｎｍ、３８０～４３０ｎｍ、４３０～４９０ｎｍ、４９０～５５０ｎｍ、５５０～５９０ｎｍ、５９０～６４０ｎｍ、６４０～７７０ｎｍ、好ましくは６４０～７７０ｎｍとすることができる。光線の照射は、シート状細胞培養物の全体、または、シート状細胞培養物の中心部、上部、下部、右側、左側など、複数の点に対して行われてもよい。また、光線の照射面積は、特に限定されないが、例えば、１００～０．０１ｍｍ２、好ましくは、１０～０．０１ｍｍ２、より好ましくは５～０．０５ｍｍ２とすることができる。本発明の好ましい態様において、光線は、指向性、単色性、コヒーレンス、波長の一定性の観点から、レーザー光線を使用してもよい。
　本発明の評価方法における、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物の光線が照射された部分を、光度計で計測することなどが挙げられる。ここで、「透過率」とは、光線が物質を通過する間に吸収された光量に関する数値であり、例えば、シート状細胞培養物に入射する前の光線と、シート状細胞培養物を通過した後の光線との強度比から算出することができる。透過率の測定は、光線が照射されたシート状細胞培養物上の１または２以上の点に対して行ってもよい。２以上の点に対して行う場合は、測定値の平均値を算出してもよい。
　本発明の評価方法における、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。ここで、「シート状細胞培養物の品質に関する指標」とは、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率、厚さなどを意味する。かかる手法としては、限定されずに、例えば、透過率からシート状細胞培養物の細胞密度を算出することなどが挙げられる。
　シート状細胞培養物の透過率は、シート状細胞培養物の細胞密度に依存して変化し得る。すなわち、シート状細胞培養物の細胞密度が高ければ、光線がシート状細胞培養物を通過する間に細胞に吸収される光量が大きいため、透過率が低くなる。逆に、シート状細胞培養物の細胞密度が低ければ、光線がシート状細胞培養物を通過する間に細胞に吸収される光量が小さいため、透過率が高くなる。
　シート状細胞培養物の透過率と細胞密度との相関性は、これに限定するものではないが、例えば、サンプル用の複数のシート状細胞培養物にそれぞれ光線を照射して透過率を測定した後、シート状細胞培養物をそれぞれ酵素処理して細胞数を計測し、得られた透過率、細胞数から検量線を描くことで、事前に求めておくことが挙げられる。本発明において、シート状細胞培養物の細胞数とは、シート状細胞培養物形成後のシート状細胞培養物に含まれる細胞数を意味する。これにより、シート状細胞培養物の透過率から、細胞数を簡単に算出することができる。シート状細胞培養物の細胞密度は、シート状細胞培養物の細胞数とシート状細胞培養物の面積から簡単に算出することができる。一態様において、本発明の評価方法は、シート状細胞培養物の面積を測定するステップを含んでもよい。
　また、シート状細胞培養物の収縮率は、シート状細胞培養物の細胞密度に依存して変化し得る。すなわち、培養基材上への細胞の播種密度が小さい場合は、１細胞当たりの基材上への接着面積が大きく、各細胞は培養基材上で広がった形状で他の細胞と接着しシート状細胞培養物を形成する。そして、例えば、シート状細胞培養物を培養基材から剥離すると、広がった形状の各細胞が細胞間接着を維持しながら徐々に元の形状に戻ろうとするため、シート状細胞培養物も全体的に徐々に収縮する。逆に、播種密度が大きい場合は、１細胞当たりの基材上への接着面積が小さく、各細胞が培養基材上で広がる度合いが小さいため、剥離後のシート状細胞培養物の収縮する度合いは小さい。
　シート状細胞培養物の細胞密度と収縮率との相関性は、上記のようにサンプル用の複数のシート状細胞培養物を使用して細胞密度と収縮率を計測することにより、予め求めておくことができる。シート状細胞培養物の収縮率は、シート状細胞培養物の面積を培養基材から剥離する前と後とで比較したり、剥離したシート状細胞培養物の面積の変化を経時的に観察したりすることで求めることができる。そして、上述の透過率と細胞密度との相関性から、透過率と収縮率との相関性も簡単に求めることができる。これにより、シート状細胞培養物の透過率から、シート状細胞培養物の収縮後の大きさを推定することができる。
　さらに、シート状細胞培養物の透過率は、シート状細胞培養物の厚さに依存して変化し得る。すなわち、シート状細胞培養物の厚さが大きければ、光線がシート状細胞培養物を通過する間に細胞に吸収される光量が大きいため、透過率が低くなる。逆に、シート状細胞培養物の厚さが小さければ、光線が細胞に吸収される光量が小さいため、透過率が高くなる。この透過率と厚さとの相関性も、上記のようにサンプル用の複数のシート状細胞培養物の透過率と厚さを測定することにより求めることができる。
　以上のように、シート状細胞培養物の透過率から、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率、厚さなどのシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出することができる。これにより、これまではシート状細胞培養物を破壊または剥離することでしか確認できなかった、シート状細胞培養物の品質に関する指標を、シート状細胞培養物を破壊または剥離することなく推定することが可能になる。シート状細胞培養物の品質に関する情報は、移植部位や移植方法を決定するために重要な情報であり、事前にこれらが把握できれば、移植手術をスムーズに進めることができる。また、実際に移植に使用するシート状細胞培養物の品質に関する様々な情報を記録することができるため、有効量の特定などを正確に行うことができる。
　また、シート状細胞培養物の製造工程において、算出されたシート状細胞培養物の品質に関する指標と、事前設定された設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定することもできる。これにより、例えば、剥離前のシート状細胞培養物の品質を判定して、その後の剥離工程を行うかどうかを選択したり、剥離後のシート状細胞培養物の品質を判定して、移植部位や移植方法を決定したりすることもできる。したがって、本発明の評価方法は、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップの後に、算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップを含んでもよい。算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。
　シート状細胞培養物の品質に関する指標の算出は、シート状細胞培養物上の１または２以上の点を対象にして行われてもよい。例えば、シート状細胞培養物の中心、上、下、右、左の５点の透過率をそれぞれ測定して品質に関する指標を算出することで、例えば、シート状細胞培養物における細胞密度、細胞数、収縮率、厚さなどの均一性を判定してもよい。本発明において、シート状細胞培養物は、培養基材から剥離される前のものでも、培養基材から剥離された後のものでもよい。
　本発明の一側面は、シート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標が設定値以上であることを判定することを含む、設定値以上の品質を有するシート状細胞培養物を製造する方法に関する。
　本発明の評価方法において採用されているステップは、特にシート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定することを可能にする。
　したがって、本発明の一側面は、シート状細胞培養物に光線を照射する照射部、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定する測定部、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出する解析部、算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定する判定部を含む、シート状細胞培養物を評価するためのシステムが包含される。
　本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
例１
　温度応答性培養皿（セルシード社製　Ｕｐｃｅｌｌ　１２ｗｅｌｌ、表面積：３．５ｃｍ２／ｗｅｌｌ）上に、骨格筋芽細胞を播種細胞数を変えて２４時間培養し、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を調製して培養基材から剥離した（図１）。中心部にレーザー光線を照射して各シート状細胞培養物の透過率を測定した（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２－Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２－１００、波長：６７０ｎｍ）。その後、シート状細胞培養物を酵素処理して細胞数を測定した。結果を下表１および図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１および図２から明らかなように、透過率は、細胞数が多いシート状細胞培養物よりも細胞数が少ないシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の透過率と細胞数との相関性が高いことを示すものである。
例２
　温度応答性培養皿（セルシード社製　Ｕｐｃｅｌｌ　１２ｗｅｌｌ、表面積：３．５ｃｍ２／ｗｅｌｌ）上に、骨格筋芽細胞を播種細胞数を変えて２４時間培養し、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を調製した。シート状細胞培養物を培養皿から剥離する前と後で、中心と５点とで透過率を測定した（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２－Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２－１００、波長：６７０ｎｍ）。その後、シート状細胞培養物を酵素処理して細胞数を測定した。シート状細胞培養物の中心の透過率と細胞数を測定した結果を下表２および図３に、シート状細胞培養物の５点の透過率の平均値と細胞数を測定した結果を下表３および図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２および図３から明らかなように、透過率は、細胞数が多いシート状細胞培養物よりも細胞数が少ないシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、剥離前でも、剥離後でも、シート状細胞培養物の透過率と細胞数との相関性が高いことを示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３および図４から明らかなように、透過率は、細胞数が多いシート状細胞培養物よりも細胞数が少ないシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の透過率の測定は、シートの中心に対して行っても、シートの複数の点に対して行っても良いことを示すものである。
例３
　温度応答性培養皿（セルシード社製　Ｕｐｃｅｌｌ　１２ｗｅｌｌ、表面積：３．５ｃｍ２／ｗｅｌｌ）上に、骨格筋芽細胞を播種細胞数を変えて２４時間培養して、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を調製した。シート状細胞培養物を培養皿から剥離する前に、中心と５点とで透過率を測定した（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２－Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２－１００、波長：６７０ｎｍ）。その後、シート状細胞培養物を剥離して収縮率を測定した。結果を下表４および図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４および図５から明らかなように、透過率は、収縮率が大きいシート状細胞培養物よりも収縮率が小さいシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の透過率と収縮率との相関性が高いこと、また、剥離前のシート状細胞培養物の透過率から収縮率を算出し、剥離後のシート状細胞培養物の大きさを推定できることを示すものである。
例４
　温度応答性培養皿（セルシード社製　Ｕｐｃｅｌｌ　３．５ｃｍ、表面積：８．８ｃｍ２）上に、骨格筋芽細胞を均一に播種して２４時間培養したシート状細胞培養物と、不均一に播種して２４時間培養したシート状細胞培養物を調製した。シート状細胞培養物を培養皿から剥離する前に５点の透過率をそれぞれ５回測定し（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２－Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２－１００、波長：６７０ｎｍ）、各点の透過率の平均値を算出した。結果を下表５および図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５および図６から明らかなように、均一に細胞を播種したシート状細胞培養物（図中左側）は、透過率のバラツキが小さく、不均一に細胞を播種したシート状細胞培養物（図中右側）は、透過率のバラツキが大きいことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の厚さの均一性を、シート状細胞培養物の複数の点の透過率を測定することで確認できることを示すものである。
　本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。

Claims (7)

  1. 　シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、
    　光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、
    　透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップ、
    を含む、シート状細胞培養物の評価方法。
  2. 　指標が、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率および厚さからなる群から選択される１または２以上である、請求項１に記載の方法。
  3. 　シート状細胞培養物が、培養基材から剥離された後のシート状細胞培養物である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　光線がレーザー光線である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　シート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標が設定値以上であることを判定することを含む、設定値以上の品質を有するシート状細胞培養物を製造する方法。
  7. 　シート状細胞培養物に光線を照射する照射部、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定する測定部、および透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出する解析部を含む、シート状細胞培養物を評価するためのシステム。
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