KR101985311B1 - 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩 및 그의 제조방법 - Google Patents

나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 나노다공성 투과막을 세포 지지체로 사용하여 세포를 3차원적으로 배양할 수 있으며 다수의 마이크로 유체 채널을 이용하여 세포를 주입하거나 약물, 세포분비물질 또는 생리활성물질을 확산을 통해 공급할 수 있는 장점이 있다. 특히 본 발명의 주채널의 용액주입구는 상기 나노다공성 투과막을 포함하고 있어 약물 또는 생리활성물질을 보관하였다가 상기 마이크로 유체 채널을 통해 상기 물질들을 점진적이며 지속적으로 공급하거나 상기 나노다공성 투과막에 직접 세포를 배양하여 세포분비물질을 점진적이며 지속적으로 공급할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩은 나노투과막이 수평적으로 부착되고 세포 배양액 및 생리활성 물질 등의 주입 및 관류가 가능한 마이크로 채널이 확보된 하단부 칩이 접합된 칩으로 세포가 배양될 수 있는 모든 투과막에서 동일한 3차원 배양환경을 제공하기 때문에 에세이를 위해 배양하는 세포의 종류에 제약이 없는 장점이 있다.

Description

나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩 및 그의 제조방법{3 Dimensional Cell Culture Microchip Containing Nano-porous Membrane And Manufacturing Method Thereof}
본 발명은 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는 나노다공성 투과막을 이용하여 3차원 세포배양환경을 제공하고 마이크로 유체 채널을 이용하여 약물, 세포분비물질 또는 생리활성물질의 확산을 통한 세포배양 또는 에세이가 가능하며 나노다공성 투과막을 포함하는 용액주입구를 이용하여 주입한 약물 또는 생리활성물질을 보관하였다가 확산을 통한 점진적인 공급이 가능하며 직접 용액주입구에 세포를 배양할 수 있으므로 세포로부터 분비되는 생리활성물질의 지속적인 공급이 가능한 3차원 세포배양용 마이크로 칩에 관한 것이다.
종래의 세포배양은 유리 혹은 세포 배양 접시(Cell culture dish) 내에서 세포를 배양 및 증식시키는 2차원적 세포 배양 방법이 사용되었다. 그러나 세포의 성장은 세포외 공간을 채우고 있으며 세포의 지지체 역할을 하는 생체고분자의 복잡한 집합체인 세포외 기질(extracellular matrix)을 매개로 3차원적으로 접해 있는 세포들간의 상호작용 및 세포가 분비하는 생리활성 물질들에 의해 조절된다. 따라서 세포외 기질을 포함하는 3차원 세포성장 환경은 세포의 성장 및 주위환경에 대한 세포의 반응을 판단하는데 매우 중요하다. 종래의 3차원 세포배양방법으로 젤-졸(gel-sol) 상변이가 일어나는 물질을 이용하여 생체내 환경과 유사한 환경을 모사하여 배양하는 방법이 있다(한국등록특허 제733914호). 상기 방법은 미세유채 채널에 상기 젤-졸(gel-sol) 상변이가 일어나는 물질을 삽입한 후 세포를 주입하여 배양하는 기술이다. 그러나 상기 젤-졸 상변이를 이용한 3차원 세포배양 방법은 세포를 상변이 물질에 위치시키는 것일 뿐 세포외 기질이 존재하는 환경을 모사 하는데 한계가 있다. 이를 극복하고자 나노미터-마이크로미터 직경의 하이브리드 나노섬유로 형성되는 3차원 구조의 매트 형상의 세포지지체를 이용하여 다층의 세포배양층을 형성하는 방법이 개발되었다(한국등록특허 제1458425호). 상기 나노섬유를 이용한 세포지지체는 다공성을 가져 세포의 지지체인 세포외 기질의 역할을 수행하므로 좀 더 생체내 3차원 환경을 모사할 수 있는 장점이 있다. 그러나 상기 방법은 다층의 적층된 세포지지체들 사이의 배양환경이 상이한 단점이 있어 세포배양접시와 접해 있어 종래의 2차 세포배양환경과 유사한 맨 아래층의 세포지지체에는 생존능력이 월등한 돌연변이 세포가 존재하여야 하고 그 상층의 세포지지체에는 에세이를 위한 일반 세포가 존재하여야 하는 한계가 있다. 또한 상기 방법은 약물의 주입을 통한 에세이(assay)에서 세포에 직접 약물을 뿌려주거나 배양배지에 포함하여 수행하는 방법만이 가능하였다. 따라서 배양하는 모든 세포에 대하여 동일한 3차원 배양환경을 제공하며 주입한 약물의 확산을 통해 점진적인 에세이 방법이 가능한 세포배양방법이 개발된다면 신약개발과정에서 가장 어려운 전 임상 이전의 제2차 스크리닝 단계에 필요한 세포기반 분석기술(cell-based assay)에 널리 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
한국등록특허 제733914호 한국등록특허 제1458425호
본 발명자들은 종래 2차원 및 3차원 세포배양방법의 문제점을 해결하기 위하여 나노다공성 투과막을 세포지지체로 사용하고; 마이크로 유체 채널을 이용하여 약물, 세포분비물질 또는 생리활성물질을 공급하며; 나노다공성 투과막을 포함한 용액주입구를 이용하여 약물, 세포분비물질 또는 생리활성물질을 보관하였다가 점진적으로 상기 물질들을 공급하거나 상기 용액주입구의 나노다공성 투과막에 직접 세포를 배양하여 세포분비물질을 공급하는 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 개발하여 상기 칩을 이용하면 성공적으로 3차원 세포배양이 가능함을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 a) 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체로 제조된 칩; b) 4개의 채널 및 4개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 주채널(micro-fluidic main channel); c) 2개의 채널과 2개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 부채널(micro fluidic side channel); 및 d) 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널과 연결되며 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널의 주입구 통해 주입된 용액(fluid)이 흘러들어 공존하는 중앙공간, 나노다공성 투과막 및 상기 나노다공성 투과막(nano-porous membrane)을 지지하는 다수의 투과막 지지기둥(membrane supporting column)을 포함하는 마이크로 유체 중앙채널(micro-fluidic central channel);을 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 a) 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체로 제조된 칩; b) 4개의 채널 및 4개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 주채널(micro-fluidic main channel); c) 2개의 채널과 2개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 부채널(micro fluidic side channel); 및 d) 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널과 연결되며 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널의 주입구 통해 주입된 용액(fluid)이 흘러들어 공존하는 중앙공간, 나노다공성 투과막 및 상기 나노다공성 투과막(nano-porous membrane)을 지지하는 다수의 투과막 지지기둥(membrane supporting column)을 포함하는 마이크로 유체 중앙채널(micro-fluidic central channel);을 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마이크로 유체 주채널, 마이크로 유체 부채널 및 마이크로 유체 중앙채널은 Replicating 공정에 의해 형성될 수 있다. 상기 본발명의 Replicating 공정은 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하여 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)상에 양각으로 나노구조체를 형성한 후 경화용액을 부어 경화시킴으로 상기 나노구조제가 음각으로 복제되어 형성되는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 나노다공성 투과막은 생체적합성 고분자 물질을 전기방사(electrospining)하여 제조하며 상기 생체적합성 고분자 물질은 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아세탈(polyacetal), 폴리아미드(polyamide), 폴리아미드 엘라스토머(polyamide elastomer), 폴리에스터(polyester), 폴리에스터 엘라스토머(polyester elastomer), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methymethacrylate)), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리설폰(polysulfone), 폴리비닐클로라이드(poly(vinyl chloride)), 실리콘(silicon), 및 폴리에틸렌(polyethylene)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 나노다공성 투과막은 전압 10-20kV, 방사속도 0.05-0.2㎖/h, 주사바늘의 직경 20-30G, 방사거리 25-45㎝의 조건으로 상기 생체적합성 고분자물질을 포함하는 전기방사용액 8-12㎖을 60-80시간동안 전기 방사하여 제조된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법을 제공한다.
a) 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하여 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)에 마이크로 유체 채널용 나노구조체를 형성하는 제 1 단계;
b) 상기 마이크로 유체 채널용 나노구조체가 형성된 실리콘 웨이퍼에 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액을 붓고 경화시켜 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널을 포함하는 칩을 제조하는 제 2 단계;
c) 상기 칩에 마이크로 유체 주채널의 용액주입구 및 마이크로 유체 부채널의 용액주입구를 형성하는 제 3 단계;
d) 생체적합성 고분자 물질을 전기방사하여 나노다공성 투과막을 제조하는 제 4 단계; 및
e) 상기 나노다공성 투과막과 상기 칩을 상기 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액을 이용하여 부착시키는 제 5 단계;를 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 나노다공성 투과막을 세포 지지체로 사용하여 세포를 3차원적으로 배양할 수 있으며 다수의 마이크로 유체 채널을 이용하여 세포를 주입하거나 약물, 세포분비물질 또는 생리활성물질을 확산을 통해 공급할 수 있는 장점이 있다. 특히 본 발명의 주채널의 용액주입구는 상기 나노다공성 투과막을 포함하고 있어 약물 또는 생리활성물질을 보관하였다가 상기 마이크로 유체 채널을 통해 상기 물질들을 점진적이며 지속적으로 공급하거나 상기 나노다공성 투과막에 직접 세포를 배양하여 세포분비물질을 점진적이며 지속적으로 공급할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩은 관류 및 정밀한 유체의 제어가 가능한 다양한 형태의 채널이 확보되어 있어서 다양한 종류의 에세이가 가능한 장점이 있으며 세포가 배양 접시의 바닥으로부터 분리된 나노투과막상에서 배양되며 상기 나노투과막 전체에 걸쳐 균일한 3차원 배양환경이 제공되므로 에세이를 위해 배양하는 세포의 종류에 제약이 없는 장점이 있다.
도 1은 PDMS 칩 및 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 보여준다. 패널 A는 소프트 리소그래피를 통하여 구현된 나노구조체를 포함하는 실리콘 웨이퍼를 이용하여 제조한 PDMS 칩과 채널의 모식도를 보여준다. 패널 B는 나노다공성 투과막이 부착된 3차원 세포배양용 마이크로 칩과 상기 칩에 존재하는 마이크로 유체 주채널의 용액주입구 및 마이크로 유체 중앙채널의 중앙공간에 위치한 나노다공성 투과막을 보여준다.
도 2는 본 발명의 전기방사 장치를 보여준다.
도 3은 본 발명의 PDMS 칩 상에 마이크로 유체 채널을 구현하기 위해 소프트 리소그래피를 이용하여 형성한 나노구조체가 포함된 실리콘 웨이퍼를 보여준다.
도 4는 본 발명의 3차원 세포배양용 마이크로칩의 제조방법을 보여준다. 패널 A는 마이크로 유체 채널의 구현을 위해 형성된 나노구조체를 포함하는 실리콘 웨이퍼 상에 PDMS 경화용액을 부은 모습을 보여준다. 패널 B는 상기 PDMS 경화용액을 열처리하여 경화시킨 모습을 보여준다. 패널 C는 상기 경화된 PDMS 칩을 알맞은 크기로 자른 모습을 보여준다. 상기 나노구조체로 인하여 형성된 마이크로 유체 채널들을 확인할 수 있다. 패널 D는 4π 펀치기를 이용하여 마이크로 유체 주채널의 용액주입구를 형성하는 모습을 보여준다. 패널 E는 일반 주사기를 이용하여 마이크로 유체 부채널의 용액주입구를 형성하는 모습을 보여준다. 패널 F는 마이크로 유체 주채널 및 부채널 용액주입구가 형성된 PDMS 칩상에 PDMS 경화용액을 펴 바르는 과정을 보여준다. 패널 G는 전기방사로 제조한 나노다공성 투과막을 콜렉터의 종이로부터 제거하는 모습을 보여준다. 패널 H는 상기 PDMS 경화용액이 발라진 PDMS 칩에 상기 나노다공성 투과막을 1차 부착시키는 모습을 보여준다. 패널 I는 상기 1차 부착된 나노다공성 투과막과 PDMS 칩 사이의 기포를 제거하는 보습을 보여준다. 패널 J는 상기 부착된 나노다공성 투과막위에 PDMS 경화용액을 펴 발라 2차 부착을 수행하는 모습을 보여준다. 패널 K는 상기 2차 부착을 통해 마이크로 유체 주채널의 용액주입구 및 마이크로 유체 중앙채널의 중앙공간의 나노다공성 투과막을 제외한 모든 투과막의 부분이 PDMS 경화용액에 의해 발라져 다공성이 제거된 것을 보여준다. 패널 L은 열처리를 통해 나노다공성 투과막과 PDMS 칩이 강하게 부착되어 완성된 3차원 세포배양용 마이크로칩을 보여준다.
도 5는 본 발명에 사용된 나노다공성 투과막을 주사전자현미경을 이용하여 촬영한 사진을 보여준다.
도 6은 본 발명의 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 이용하여 수행한 3차원 세포배양의 결과를 보여준다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 a) 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체로 제조된 칩; b) 4개의 채널 및 4개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 주채널(micro-fluidic main channel); c) 2개의 채널과 2개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 부채널(micro fluidic side channel); 및 d) 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널과 연결되며 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널의 주입구 통해 주입된 용액(fluid)이 흘러들어 공존하는 중앙공간, 나노다공성 투과막 및 상기 나노다공성 투과막(nano-porous membrane)을 지지하는 다수의 투과막 지지기둥(membrane supporting column)을 포함하는 마이크로 유체 중앙채널(micro-fluidic central channel);을 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 제공한다.
본 발명의 3차원 세포배양용 마이크로 칩은 세포 배양액의 주입이 가능하고 관류가 가능한 채널이 확보되는 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체로 제조된 칩(실리콘 칩)상에 세포를 배양할 수 있는 나노투과막이 부착되므로 세포가 3차원적으로 배양될 수 있는 환경을 제공하는 장점이 있다. 본 발명의 3차원 세포배양용 마이크로 칩은 일반적으로 연구용으로 사용되는 모든 세포에 적용이 가능하며 특히 종래에 배양하는데 한계가 있었던 조직 내에서 3차원적으로 신호를 주고받는 세포들의 배양이 가능한 장점이 있다.
상기 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)는 실리콘의 일종으로 불활성 특성이 있는 고분자물질이며 가격이 낮고 우수한 열안정성 및 생체적합성이 있어서 인체조직공학연구에 많이 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 실리콘 칩에는 마이크로 유체 주채널, 마이크로 유체 부채널, 중앙공간 및 마이크로 유체 중앙채널이 존재한다. 상기 마이크로 유체 주채널은 중앙공간으로 연결된 채널과 나노다공성 투과막이 포함된 용액주입구를 포함한다. 상기 중앙공간으로 연결된 채널은 폭 0.5-1.5mm; 깊이 0.1-0.5mm; 및 길이 2-3cm이다. 바람직하게는 상기 중앙공간으로 연결된 채널은 폭 1mm; 깊이 0.24mm; 및 길이 2.5cm이다. 상기 채널은 마이크로 사이즈의 직경을 가지고 있기 때문에 상기 용액주입구에 주입된 세포, 약물, 세포분비물 또는 생리활성물질이 삼투압 및 확산현상에 의해 중앙공간으로 공급될 수 있다. 상기 채널의 폭이 0.5mm, 깊이가 0.1mm 미만이면 세포 주입시 세포의 뭉침 또는 용액의 점도에 따라 상기 채널이 쉽게 막힐 수 있으며 용액의 확산속도가 쉽게 변화할 수 있다.
상기 나노다공성 투과막이 포함된 용액주입구는 상기 채널의 끝에 위치하며 직경 2.5-3.5mm의 원형으로 상기 실리콘 칩을 관통하되 상기 실리콘 칩의 하부방향에 상기 나노다공성 투과막이 위치하여 주입된 세포 및 용액을 보관하거나 마이크로 유체 중앙채널로 확산할 수 있도록 한다. 바람직하게는 상기 나노다공성 투과막이 포함된 용액주입구는 직경이 3mm의 원형이다.
상기 용액주입구에 포함된 나노다공성 투과막은 생체적합성 고분자 물질을 전기방사(electrospining)하여 제조한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자 물질은 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아세탈(polyacetal), 폴리아미드(polyamide), 폴리아미드 엘라스토머(polyamide elastomer), 폴리에스터(polyester), 폴리에스터 엘라스토머(polyester elastomer), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methymethacrylate)), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리설폰(polysulfone), 폴리비닐클로라이드(poly(vinyl chloride)), 실리콘(silicon), 및 폴리에틸렌(polyethylene)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물이다. 바람직하게는 상기 생체적합성 고분자 물질은 폴리우레탄(polyurethane)이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 나노다공성 투과막은 적층된 직경 5-30㎛의 나노섬유의 간극으로 인한 직경이 5-60㎛인 다수의 공극(pore)을 포함하며 두께가 30-200㎛인 막(membrane)이다. 상기 공극은 방사시간을 조절하는 방법으로 기공의 크기를 조절할 수 있다. 바람직하게는 상기의 전기방사조건으로 제조된 나노다공성 투과막은 적층된 직경 10-20㎛의 나노섬유의 간극으로 인한 직경이 20-40㎛인 다수의 공극을 포함하며 두께가 30~100㎛인 막(membrane)이다. 상기 공극의 직경이 5㎛미만이면 상기 나노다공성 투과막에 보관된 물질의 확산이 어렵고 세포가 성장할 수 있는 공간이 부족할 수 있으며 상기 공극의 직경이 60㎛을 초과하면 주입된 물질의 확산이 너무 빨라 상기 투과막의 물질에 대한 보관성이 저하된다. 또한 상기 나노다공성 투과막의 두께가 30㎛ 미만이면 공극의 개수가 너무 적어 세포를 배양할 공간 또는 주입된 약물, 세포분비물질, 또는 생리활성물질의 보관성이 저하되며 두께가 200㎛을 초과하면 투과막의 두께가 너무 두꺼워 상기 투과막과 실리콘 칩의 부착을 위한 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액(실리콘 경화용액)의 양을 많이 사용하게 되므로 부착과정에서 상기 실리콘 경화용액이 상기 투과막에 침투하여 상기 공극을 제거할 수 있는 위험이 있다.
상기 공극을 가지는 나노다공성 투과막은 전기방사를 통해 제조된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노다공성 투과막은 전압 10-20kV, 방사속도 0.05-0.2㎖/h, 주사바늘의 직경 20-30G, 방사거리 25-45㎝의 조건으로 상기 생체적합성 고분자물질을 포함하는 전기방사용액 8-12㎖을 60-80시간 동안 전기 방사하여 제조한다. 바람직하게는 상기 나노다공성 투과막은 전압 15kV, 방사속도 0.1㎖/h, 주사바늘의 직경 25G, 방사거리 35㎝의 조건으로 상기 생체적합성 고분자물질을 포함하는 전기방사용액 10㎖을 70시간 동안 전기 방사하여 제조한다. 상기 조건을 벗어나 전기방사를 수행하면 나노섬유가 과도하게 적층되거나 부족하게 적층되어 상기 나노섬유의 간극에 의해 형성되는 공극의 직경이 상기 제시된 크기를 벗어날 수 있다.
상기 마이크로 유체 부채널은 폭 0.15-0.45mm; 깊이 0.1-0.5mm; 및 길이 2-3cm이며 상기 마이크로 유체 부채널의 용액주입구는 상기 채널의 끝에 위치하며 직경 0.5-1.5mm의 원형으로 상기 PDMS 칩을 관통하되 상기 PDMS 칩의 하부방향에 다공성이 제거된 상기 나노다공성 투과막이 위치하여 마이크로 유체 중앙채널에 용액을 주입하거나 배출한다. 바람직하게는, 상기 마이크로 유체 부채널은 폭 0.3mm; 깊이 0.24mm; 및 길이 2.5cm이며 상기 마이크로 유체 부채널의 용액주입구는 상기 채널의 끝에 위치하며 직경 1mm의 원형으로 상기 PDMS 칩을 관통하되 상기 PDMS 칩의 하부방향에 다공성이 제거된 상기 나노다공성 투과막이 위치하여 마이크로 유체 중앙채널에 용액을 주입하거나 배출한다. 상기 채널의 폭이 0.15mm, 깊이 0.1mm 미만이면 일반적인 주사기로 용액을 주입하기 어렵다. 상기 마이크로 유체 부채널의 용액주입구의 직경인 0.5-1.5mm은 약물 또는 배지를 주입할 수 있는 주사기의 직경과 동일하므로 주사기를 이용하여 손쉽게 배지를 교환하거나 에세이용 약물을 주입할 수 있는 장점이 있다.
상기 마이크로 유체 중앙채널은 폭 4-5mm; 깊이 0.1-0.5mm; 및 길이 0.5-1.5cm이며 나노다공성 투과막을 이용한 3차원 세포배양이 가능하다. 바람직하게는 상기 마이크로 유체 중앙채널은 폭 4.5mm; 깊이 0.24mm; 및 길이 1cm이다. 상기 마이크로 유체 중앙채널은 4개의 상기 마이크로 유체 주채널과 2개의 상기 마이크로 유체 부채널이 연결된 중앙공간; 3차원 세포배양이 가능한 나노다공성 투과막; 및 상기 중앙공간을 3등분하여 가로지르며 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널로부터 유입된 용액이 자유롭게 혼합될 수 있도록 독립적으로 존재하는 다수의 투과막 지지기둥을 포함한다. 상기 중앙공간은 상기 나노다공성 투과막을 포함하고 있어서 3차원 세포배양이 가능하다. 상기 마이크로 유체 주채널 또는 부채널을 통하여 세포를 포함하고 있는 세포배양액이 상기 마이크로 유체 중앙채널으로 주입되면 상기 세포배양액은 삼투압에 의해 상기 중앙공간의 나노다공성 투과막에 흡수되며 상기 흡수된 세포배양액에 존재하는 세포는 생체적합성이 뛰어난 나노섬유를 지지체로 삼아 성장하게 된다. 상기 중앙공간은 폭 4-5mm; 깊이 0.1-0.5mm; 및 길이 0.5-1.5cm이기 때문에 나노다공성 투과막이 부착되면 중앙공간의 내부로 쳐질 수 있다. 이를 방지하기 위하여 상기 중앙공간은 다수의 투과막 지지기둥을 구비한다. 상기 투과막 지지기둥은 상기 나노다공성 투과막에 부착되어 중앙공간 내부로 쳐지지 않고 팽팽한 형태를 유지하도록 한다. 상기 중앙공간에 포함된 상기 나노다공성 투과막의 형태는 상기 마이크로 유체 주채널의 용액주입구에 존재하는 나노다공성 투과막에 의해서도 유지된다. 상기 마이크로 유체 주채널의 용액주입구에 존재하는 나노다공성 투과막과 상기 중앙공간에 존재하는 나노다공성 투과막은 하나의 나노다공성 투과막이 PDMS 칩에 부착되어 형성된다. 상기 중앙공간 및 상기 마이크로 유체 주채널의 용액주입구에 존재하는 나노다공성 투과막은 PDMS 경화용액을 바르지 않음으로 다공성을 유지하며 상기 다공성으로 인하여 투과막의 탄력이 유지된다. 상기 중앙공간 및 상기 마이크로 유체 주채널의 용액주입구의 나노다공성 투과막은 상기 다공성으로 인한 탄력 때문에 PDMS 경화용액을 이용한 부착시 서로의 뒤틀림을 방지하는 효과가 있으며 상기 효과는 상기 중앙공간 및 상기 마이크로 유체 주채널의 용액주입구의 나노다공성 투과막 중 어느 하나가 없는 경우 반감된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 3차원 세포배양용 마이크로 칩은 상기 PDMS 칩의 바닥 모서리에 상기 PDMS칩을 배양접시의 바닥으로부터 분리시키는 네 개의 다리를 구비한다. 2차원 세포배양의 경우 배양접시의 바닥에 세포가 붙어서 자라므로 3차원적인 생체환경을 모방할 수 없으며 생체적합성이 떨어지고 배양액의 교환과정 중에 세포에 스트레스를 주어 세포의 손실이 발생하는 단점이 있다. 본 발명의 3차원 세포배양용 마이크로 칩은 모서리에 다리를 구비하여 배양접시의 바닥으로부터 세포가 배양되는 상기 나노다공성 투과막을 분리하여 3차원적인 생체환경과 유사한 세포배양 환경을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다리가 구비된 3차원 세포배양용 마이크로 칩과 다리가 구비되지 않은 3차원 세포배양용 마이크로 칩 모두에서 세포성장이 가능한 것이 확인되었으나 다리가 구비되지 않은 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 이용한 세포배양은 배양접시의 생체부적합성에 의해 배양접시와 접하는 나노다공성 투과막 부분의 세포성장이 저하되므로 상기 나노다공성 투과막 전체의 균일한 3차원 생체환경 모사가 불가능한 단점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법을 제공한다.
a) 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하여 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)에 마이크로 유체 채널용 나노구조체를 형성하는 제 1 단계;
b) 상기 마이크로 유체 채널용 나노구조체가 형성된 실리콘 웨이퍼에 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액(실리콘 경화용액)을 붓고 경화시켜 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널을 포함하는 칩(실리콘 칩)을 제조하는 제 2 단계;
c) 상기 실리콘 칩에 마이크로 유체 주채널의 용액주입구 및 마이크로 유체 부채널의 용액주입구를 형성하는 제 3 단계;
d) 생체적합성 고분자 물질을 전기방사하여 나노다공성 투과막을 제조하는 제 4 단계; 및
e) 상기 나노다공성 투과막과 상기 실리콘 칩을 상기 실리콘 경화용액을 이용하여 부착시키는 제 5 단계.
제 1 단계: 마이크로 유체 채널용 나노구조체의 형성단계
본 발명의 실리콘 칩에 구현된 마이크로 유체 채널은 실리콘 웨이퍼에 형성된 나노구조체를 이용하여 복제하는 방법(Replicating 공정)을 이용하여 제조한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마이크로 유체 주채널, 마이크로 유체 부채널, 및 마이크로 유체 중앙채널은 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하여 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)상에 양각으로 형성한 나노구조체에 의해 음각으로 복제되어 형성된다. 상기 소프트 리소그래피는 유연한 유기물질을 사용하여 종래의 포토리소그래피에서 사용하는 복잡한 장치를 사용하지 않고 패턴이나 구조물을 만드는 전사법을 의미한다. 상기 소프트 리소그래피는 미세접촉프린팅(microcontact printing) 방법과 미세몰딩(micromolding) 방법이 있다. 상기 미세접촉프린팅방법은 원하는 구조로 형상화된 탄성체 스탬프에 자기조립 단분자막을 형성할 수 있는 잉크를 묻혀 고체기질의 표면에 접촉에 의해 전사한 후 선택적 에칭을 통하여 기질을 패터닝하는 기술을 의미하며 상기 미세몰딩 방법은 유연한 고분자로 도장을 만들어 원본의 정보를 복제한 후 다량의 다차원 구조체를 제조하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 PDMS 칩에 구현된 마이크로 유체 채널용 나노구조체는 미세몰딩방법을 이용한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 마이크로 유체 채널용 나노구조체는 높이 0.1-0.5nm 이며 폭 0.15-5mm인 양각의 형태이다. 바람직하게는 상기 마이크로 유체 채널용 나노구조체는 높이 0.24mm 이며 폭 0.3-4.5mm인 양각의 형태이다.
제 2 단계: 실리콘 칩의 제조
본 발명의 실리콘 칩은 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액(실리콘 경화용액)을 제조하고 기포를 제거한 후 상기 소프트 리소그래피를 이용하여 제조한 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)에 부어 경화시킴으로 제조한다. 상기 실리콘 경화용액은 PDMS 또는 PMMA 용액 10중량부에 경화제 1중량부를 혼합하여 제조하며 기포를 제거하여 공극의 발생을 최소화한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 실리콘 칩은 상기 나노구조체가 형성된 실리콘 웨이퍼에 상기 실리콘 경화용액을 붓고 70-90℃ 오븐에서 20-40분간 열처리를 수행하여 제조한다. 바람직하게는 상기 실리콘 칩은 상기 나노구조체가 형성된 실리콘 웨이퍼에 상기 실리콘 경화용액을 붓고 80℃ 오븐에서 30분간 열처리를 수행하여 제조한다. 상기 실리콘 경화용액의 경화에 있어서 오븐을 이용하여 열처리를 수행하면 상온에서 자연적으로 경화시키는 방법(free standing)에 대비하여 실리콘(PDMS 또는 PMMA)의 경도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다. 상기 오븐의 온도가 70℃ 미만이면 열처리시간이 더 소요되며 상기 오븐의 온도가 90℃를 초과하더라도 열처리효과는 70-90℃ 오븐에서 열처리하는 것과 동일하다.
제 3 단계: 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널의 용액주입구 형성
상기 제 2 단계의 열처리를 통하여 경화된 실리콘 칩과 상기 실리콘 웨이퍼를 분리한 후 상기 실리콘 칩의 용액주입구를 형성한다. 상기 주입구의 형성은 4π 펀치기 및 주사기 바늘을 이용하여 각각 마이크로 유체 주채널의 용액주입구 및 마이크로 유체 부채널의 용액주입구를 형성할 수 있으며 레이저 커터기를 이용하여 형성할 수도 있다. 바람직하게는 상기 실리콘 칩이 PDMS를 주성분으로서 이루어져 있다면 4π 펀치기 및 주사기 바늘을 이용하는 방법이 적당하며 상기 실리콘 칩이 PMMA를 주성분으로 이루어져 있다면 레이져 커터기를 이용하는 방법이 적당하다.
제 4 단계: 전기방사를 통한 나노다공성 투과막의 제조
생체적합성 고분자 물질을 이용하여 전기방사용액을 제조하고 상기 전기방사용액을 이용하여 전기방사 방법으로 나노섬유를 적층하여 나노다공성 투과막을 제조한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자 물질은 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아세탈(polyacetal), 폴리아미드(polyamide), 폴리아미드 엘라스토머(polyamide elastomer), 폴리에스터(polyester), 폴리에스터 엘라스토머(polyester elastomer), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methymethacrylate)), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리설폰(polysulfone), 폴리비닐클로라이드(poly(vinyl chloride)), 실리콘(silicon), 및 폴리에틸렌(polyethylene)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물이다. 바람직하게는 상기 생체적합성 고분자 물질은 폴리우레탄(polyurethane)이다.
상기 전기방사용액은 분말형태의 생체적합성 고분자를 디메틸포름아미드(Di-methyl formamide, DMF)에 10-20중량%로 첨가하고 이를 교반기로 22-26시간 동안 교반하여 제조한다. 바람직하게는 상기 전기방사용액은 분말형태의 생체적합성 고분자를 디메틸포름아미드(Di-methyl formamide, DMF)에 15중량%로 첨가하고 이를 교반기로 24시간 동안 교반하여 제조한다. 상기 전기방사용액에 존재하는 생체적합성 고분자의 농도는 전기방사에 있어서 매우 중요한 요소이다. 상기 농도가 높으면 나노섬유의 직경이 증가하고 이로 인한 나노섬유간의 간극이 줄어들어 다공의 수 및 크기가 감소하게 된다. 따라서 상기 전기방사용액의 농도를 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 전기방사는 상기 생체적합성 고분자 물질을 포함한 전기방사용액 8-12㎖을 20-30G 바늘이 장착된 주사기에 주입하고 팁(tip)에 고정 시킨 후 상기 팁과 콜렉터(collector)의 거리를 25-45cm로 고정하고 10-20kV의 고전압을 인가하여 0.05-0.2㎖/h의 방사속도로 60-80시간 동안 수행한다. 바람직하게는 상기 전기방사는 상기 생체적합성 고분자 물질을 포함한 전기방사용액 10㎖을 25G 바늘이 장착된 주사기에 주입하고 팁(tip)에 고정 시킨 후 상기 팁과 콜렉터(collector)의 거리를 35cm로 고정하고 15kV의 고전압을 인가하여 0.1㎖/h의 방사속도로 70시간 동안 수행한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 나노다공성 투과막은 적층된 직경 5-30㎛의 나노섬유의 간극으로 인한 직경이 5-60㎛인 다수의 공극(pore)을 포함하며 두께가 30-200㎛인 막(membrane)이다. 상기 공극은 방사시간을 조절하는 방법으로 기공의 크기를 조절할 수 있다. 바람직하게는 상기의 전기방사조건으로 제조된 나노다공성 투과막은 적층된 직경 10-20㎛의 나노섬유의 간극으로 인한 직경이 20-40㎛인 다수의 공극을 포함하며 두께가 30~100㎛인 막(membrane)이다. 상기 공극의 직경이 5㎛미만이면 상기 나노다공성 투과막에 보관된 물질의 확산이 어렵고 세포가 성장할 수 있는 공간이 부족할 수 있으며 상기 공극의 직경이 60㎛을 초과하면 주입된 물질의 확산이 너무 빨라 상기 투과막의 물질에 대한 보관성이 저하된다. 또한 상기 나노다공성 투과막의 두께가 30㎛ 미만이면 공극의 개수가 너무 적어 세포를 배양할 공간 또는 주입된 약물, 세포분비물질, 또는 생리활성물질의 보관성이 저하되며 두께가 200㎛을 초과하면 투과막의 두께가 너무 두꺼워 상기 투과막과 실리콘 칩의 부착을 위한 실리콘 경화용액의 양을 많이 사용하게 되므로 부착과정에서 상기 실리콘 경화용액이 상기 투과막에 침투하여 상기 공극을 제거할 수 있는 위험이 있다.
제 5 단계: 나노다공성 투과막 부착
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노다공성 투과막과 상기 실리콘 칩(폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체로 제조된 칩)의 부착은 4℃에 보관하여 점도를 향상시킨 상기 실리콘 경화용액(폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액)을 상기 실리콘 칩의 표면에 골고루 펴 바른 후 상기 나노다공성 투과막을 부착시키는 1차 부착 단계 및 상기 1 차 부착단계로 부착된 상기 나노다공성 투과막의 마이크로 유체 주채널 용액주입구 부분과 마이크로 유체 중앙채널 부분을 제외한 나머지 부분에 상기 4℃에 보관하여 점도를 향상시킨 실리콘 경화용액을 골고루 펴 바른 후 70-90℃ 오븐에서 5-15분간 열처리하는 2차 부착단계로 구성된다. 상기 1차 부착단계는 상기 나노다공성 투과막과 상기 실리콘 칩을 직접적으로 부착시키는 단계이며 상기 2차 부착단계는 상기 나노다공성 투과막과 실리콘 칩의 추가적인 부착 및 상기 마이크로 유체 주채널의 용액주입구 및 마이크로 유체 중앙채널의 나노다공성 투과막을 제외한 투과막부분의 다공성을 제거하는 단계이다.
추가적으로 상기 나노다공성 투과막이 부착된 실리콘 칩에는 목적에 따라 상기 실리콘 칩의 높이를 조절하여 배양접시의 바닥으로부터 분리하거나 배양액의 흐를 수 있도록 하기 위하여 일종의 다리를 각 네 개의 모서리에 같은 높이로 설치할 수 있다. 상기 다리는 상기 PDMS 칩을 배양접시의 바닥으로부터 1-5cm 띄울 수 있어 상기 PDMS 칩과 배양접시 바닥 사이에 배지의 유입이 가능한 정도이면 적당하다.
실시예
실시예 1: 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조
본 발명의 3차원 세포배양용 마이크로 칩(도 1 참조)은 폴리우레탄 나노다공성 투과막을 마이크로 채널이 내재된 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 마이크로 칩에 수평으로 고정하여 제조한다. 상기 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조과정은 도 4에 개시되어 있다.
1) 폴리우레탄(polyurethane) 나노다공성 투과막의 제조
본 발명의 폴리우레탄 나노다공성 투과막(nano-porous membrane)은 전기방사(electrospining)방법을 이용하여 제조하였다. 상기 전기방사법을 수행하기 위하여 폴리우레탄(polyurethane, PU) 전기방사용액을 제조하였다. 디메틸포름아미드(dimethyl formamide, DMF) 100중량%에 대하여 폴리우레탄 분말 15중량%(w/w)을 첨가하고 교반기를 이용하여 24시간 동안 혼합하여 상기 PU 전기방사용액을 제조하였다. 상기 제조한 PU 전기방사용액을 25G 바늘이 장착된 10㎖ 주사기에 주입한 후 도 2에 기재된 전기방사장비의 팁(tip)부분에 고정시켰다. 상기 팁의 반대편에 위치한 타원형 형태의 콜렉터(collector)에 A4 용지를 부착시키고 상기 팁과 상기 콜렉터의 거리를 35cm로 일정하게 고정시킨 후 10rpm의 회전속도로 부여하고 15kV의 고전압을 인가하여 전기방사를 수행하였다. 상기 전기방사는 0.1㎖/h의 속도로 유지하였으며 70시간 동안 방사하였다. 상기 전기방사를 이용하여 제조된 폴리우레탄 나노투과막은 80℃ 실험용 오븐에서 24시간 동안 건조하였다.
2) 마이크로 칩의 제조
본 발명의 마이크로 칩(micro chip)은 마이크로 유체 채널(micro-fluidic channel)이 내재되어 있으며 생체적합성 고분자인 PDMS를 이용하여 제조된 칩이다. 상기 마이크로 칩의 마이크로 유체 채널을 형성하기 위하여 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)에 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하여 나노단위의 구조체(나노구조체)를 형성하였다(도 3 참조). 상기 형성된 나노구조체는 실리콘 웨이퍼상에 이산화규소(SiO2), 질화규소(Si3N4)와 같은 세라믹, 금속 또는 포토레지스트(photoresist)를 이용하여 높이 0.24mm 이며 폭 0.3-5mm인 양각의 형태로 형성되었다(도 3 참조). 상기 나노구조체는 폭 1mm; 높이 0.24mm; 길이 2.5cm의 직사각형 나노구조체와 상기 나노구조체의 양단에 직경 3mm의 원형 나노구조체가 포함되어 있는 주채널(main channel)용 나노구조체 2개와 높이 0.24mm; 폭 0.3mm; 길이 2.5mm의 직사각형 나노구조체와 상기 나노구조체의 양단에 직경 1mm의 원형 나노구조체가 포함되어 있는 부채널(side channel)용 나노구조체 1개로 구성된다. 상기 2개의 주채널용 나노구조체 사이에 상기 부채널용 나노구조체가 위치하며 상기 나노구조체들이 만나는 중앙 위치는 상기 나노구조체 사이의 경계(음각부분)를 상당 부분 양각으로 처리하여 상기 나노구조체에 의해 형성된 채널들을 통해 주입된 용액들이 서로 혼합될 수 있는 중앙채널(central channel)이 형성되도록 하였다. 상기 마이크로 채널용 나노구조체가 형성된 실리콘 웨이퍼를 사각 접시에 위치시킨 후 PDMS 용액을 도포하고 기포를 제거하였다. 상기 PDMS 용액은 PDMS와 경화제를 10:1(PDMS:경화제)의 중량비로 혼합하여 제조하였으며 데시게이터를 이용하여 기포를 제거하였다. 상기 PDMS 용액이 도포된 실리콘 웨이퍼는 80℃ 실험용 오븐에서 30분가량 열처리를 수행하였으며 경화된 PDMS 칩을 실리콘 웨이퍼로부터 분리하고 알맞은 크기로 상기 PDMS 칩을 잘라내었다. 주채널의 양단에 위치한 원형 음각홈을 4π 펀치기를 이용하여 구멍을 뚫어 세포, 배양액, 약물용액 등이 주입될 수 있는 주채널 주입구(4π 주입구)를 형성하였다. 부채널의 양단에 위치한 원형 음각홈을 주사기 바늘을 이용하여 구멍을 뚫어 약물요액이 주입될 수 있는 부채널 주입구를 형성하였다. 상기의 방법에 따라 형성된 마이크로 칩을 설명하면 상기 마이크로 칩의 두께는 1cm이며; 모든 마이크로 유체 채널의 깊이는 0.24mm이며; 마이크로 유체 주채널의 폭은 1mm이며; 마이크로 유체 부채널의 폭은 0.3mm이며; 4개의 마이크로 유체 주채널 및 4개의 용액주입구와 2개의 마이크로 유체 부채널 및 2개의 용액주입구를 포함하고 있으며; 폭 3.5mm인 마이크로 유체 중앙채널 1개를 포함하고 있고 상기 중앙채널을 가로로 3등분하는 다수의 투과막 지지기둥(membrane supporting column)이 형성되어 있다(도 1의 패널 A 참조).
3) 마이크로 칩과 PU 나노다공성 투과막의 부착
상기 제조한 PU 나노다공성 투과막을 마이크로 칩 상에 수평으로 부착하였다. 상기 부착을 위하여 상기 제조한 PDMS 용액을 4℃에서 보관하여 점도를 유지하고 상기 점도가 유지된 PDMS 용액을 마이크로칩의 상부 표면에 고무 scrapper를 이용하여 소량 도포하였다. 상기 도포과정에서 상기 형성된 채널 안으로 PDMS 용액이 삽입되지 않도록 주의를 기울였다. 상기 제조된 PU 나노다공성 투과막의 먼지를 제거하여 PU 나노다공성 투과막의 공극이 막히지 않게 하였으며 상기 준비된 PU 나노다공성 투과막을 PDMS 용액이 도포된 마이크로 칩 위에 약간의 압력을 주어 부착시켰다. 상기 부착된 PU 나노다공성 투과막의 중앙채널 및 주채널 주입구를 제외한 모든 부분에 소량의 상기 4℃에서 보관하여 점도를 유지한 PDMS 용액을 도포한 후 고무 scrapper를 이용하여 얇게 펴 발라주었다. 상기 PU 나노다공성 투과막이 부착된 마이크로 칩을 80℃ 오븐에서 10분간 열처리하여 펴 바른 PDMS 용액이 경화되도록 하여 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 제조하였다(도 1의 패널 B 참조).
4) 마이크로 칩의 구조 및 물질이동
상기 제조된 3차원 세포배양용 마이크로 칩은 주채널 주입구, 및 중앙채널을 제외한 모든 부분에 도포된 PDMS 용액이 경화되면서 PU 나노다공성 투과막의 공극(pore)이 모두 제거된 상태이다. 따라서 상기 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 주채널 및 부채널 부분은 물질이 통과할 수 없는 상태로 씰링되었다. 상기 주채널의 주입구는 하부의 구멍 및 상부의 PU 나노다공성 투과막의 공극을 통해서만 물질의 이동이 가능하며 상기 부채널의 주입구는 하부의 구멍을 통해서만 물질의 이동이 가능하다. 또한 상기 중앙채널은 상부의 PU 나노다공성 투과막의 공극을 통해서만 물질의 이동이 가능하다.
실험예 1: PU 나노다공성 투과막의 공극
상기 제조한 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 PU 나노다공성 투과막의 공극을 확인하기 위하여 상기 PU 나노다공성 투과막을 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 표면 이미지를 촬영하고 이를 분석하였다(도 5 참조). 분석결과 상기 PU 나노다공성 투과막은 직경 5-10㎛의 나노섬유가 적층되어 형성되었으며 상기 나노섬유의 간극에 의해 직경 5-60㎛의 공극(pore)이 다수 존재하는 것이 확인되었다.
실험예 2: 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 이용한 세포배양
상기 제조한 3차원 세포배양용 마이크로 칩을 멸균 처리한 후 커버글라스(cover glass)상에서 세포배양을 수행하였다. 상기 세포배양은 MDA-MB-23세포를 이용하였으며 주채널 주입구를 통해 세포 및 세포배양액을 주입하고 5일간 37℃, 5% CO2 분위기하에서 배양을 수행하였다. 상기 세포배양은 중앙채널의 PU 나노다공성 투과막이 커버글라스와 접하도록 위치시킨 3차원 세포배양용 마이크로 칩과 중앙채널의 PU 나노다공성 투과막이 커버글라스 방향에 위치하되 칩의 네 모퉁이에 동일한 길이의 다리를 부착하여 상기 중앙채널의 PU 나노다공성 투과막이 상기 커버글라스에 접하지 않도록 한 3차원 세포배양용 마이크로 칩에서 각각 수행하였다. 상기 세포배양에 대하여 Live/Dead 용액(The LIVE/DEAD® Cell Imaging Kit, Thermo Fisher Scientific)을 처리하여 세포의 생존율을 확인하였다. 도 6은 상기 네 모퉁이에 동일한 길이의 다리를 부착하여 상기 중앙채널의 PU 나노다공성 투과막이 상기 커버글라스에 접하지 않도록 한 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 세포배양 결과를 보여준다. 상기 Live/Dead 용액을 이용하면 세포막을 유지하고 있는 살아있는 세포와 세포막을 유지하지 못하는 죽은 세포를 구분할 수 있다. 상기 Live/Dead 용액을 배양된 세포에 첨가한 후 FITC 및 Texas RED 필터가 장착된 형광현미경을 이용하여 관찰하면 살아있는 세포는 전체적인 녹색형광(FITC, ex/em=488nm/515nm)으로 염색되어 나타나며 죽은 세포는 핵의 해체로 인해 노출된 DNA에 의해 붉은 형광(Texas RED, ex/em=570nm/602nm)이 염색되어 나타난다. 실험결과, 커버글라스와 접하여 위치한 3차원 세포배양용 마이크로 칩과 커버글라스와 접하지 않은 3차원 세포배양용 마이크로 칩 모두에서 세포들이 성공적으로 생존한 것이 확인되었으며 중앙채널의 모든 부위에서 세포들이 성공적으로 생존한 것이 확인되었다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims (15)

  1. a) 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체로 제조된 칩;
    b) 4개의 채널 및 4개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 주채널(micro-fluidic main channel);
    c) 2개의 채널과 2개의 용액주입구로 구성된 마이크로 유체 부채널(micro fluidic side channel); 및
    d) 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널과 연결되며 상기 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널의 주입구 통해 주입된 용액(fluid)이 흘러들어 공존하는 중앙공간, 나노다공성 투과막 및 상기 나노다공성 투과막(nano-porous membrane)을 지지하는 다수의 투과막 지지기둥(membrane supporting column)을 포함하는 마이크로 유체 중앙채널(micro-fluidic central channel);
    을 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩에 있어서,
    상기 나노다공성 투과막은 폴리아세탈(polyacetal), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리설폰(polysulfone), 폴리비닐클로라이드(poly(vinyl chloride)), 및 폴리에틸렌(polyethylene)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 포함하는 생체적합성 고분자 물질을 전기방사(electrospining)하여 제조한 직경 5-30㎛의 생체적합성 고분자 나노섬유를 포함하되, 상기 생체적합성 고분자 나노섬유가 적층되어 형성된 간극으로 인해 직경 5-60㎛인 다수의 공극(pore)이 포함된 두께 30-200㎛의 나노다공성 투과막인 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 유체 주채널, 마이크로 유체 부채널, 중앙공간 및 마이크로 유체 중앙채널은 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하여 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)상에 양각으로 형성한 나노구조체에 의해 음각으로 복제되어 형성되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 유체 주채널의 채널은 폭 0.5-1.5mm; 깊이 0.1-0.5mm; 및 길이 2-3cm이며 상기 마이크로 유체 주채널의 용액주입구는 상기 채널의 끝에 위치하며 직경 2.5-3.5mm의 원형으로 상기 칩을 관통하되 상기 칩의 하부방향에 상기 나노다공성 투과막이 위치하여 주입된 세포 및 용액을 보관하거나 마이크로 유체 중앙채널로 확산될 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 유체 부채널의 채널은 폭 0.15-0.45mm; 깊이 0.1-0.5mm; 및 길이 2-3cm이며 상기 마이크로 유체 부채널의 용액주입구는 상기 채널의 끝에 위치하며 직경 0.5-1.5mm의 원형으로 상기 PDMS 칩을 관통하되 상기 PDMS 칩의 하부방향에 다공성이 제거된 상기 나노다공성 투과막이 위치하여 마이크로 유체 중앙채널에 용액을 주입하거나 배출하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 유체 중앙채널은 폭 4-5mm; 깊이 0.1-0.5mm; 및 길이 0.5-1.5cm이며 상기 나노다공성 투과막을 이용한 세포배양이 가능한 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서 상기 나노다공성 투과막은 전압 10-20kV, 방사속도 0.05-0.2㎖/h, 주사바늘의 직경 20-30G, 방사거리 25-45㎝의 조건으로 상기 생체적합성 고분자물질을 포함하는 전기방사용액 8-12㎖를 60-80시간동안 전기 방사하여 제조하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩.
  9. 삭제
  10. a) 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하여 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)에 마이크로 유체 채널용 나노구조체를 형성하는 제 1 단계;
    b) 상기 마이크로 유체 채널용 나노구조체가 형성된 실리콘 웨이퍼에 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액을 붓고 경화시켜 마이크로 유체 주채널 및 마이크로 유체 부채널을 포함하는 칩을 제조하는 제 2 단계;
    c) 상기 칩에 마이크로 유체 주채널의 용액주입구 및 마이크로 유체 부채널의 용액주입구를 형성하는 제 3 단계;
    d) 폴리아세탈(polyacetal), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리올레핀(polyolefin), 폴리설폰(polysulfone), 폴리비닐클로라이드(poly(vinyl chloride)), 및 폴리에틸렌(polyethylene)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 포함하는 생체적합성 고분자 물질이 포함된 전기방사용액 8-12㎖를 20-30G 바늘이 장착된 주사기에 주입하고, 상기 주사기의 바늘을 팁(tip)에 고정시키며, 상기 팁과 콜렉터(collector)의 거리를 25-45cm로 고정 한 후 상기 팁과 상기 콜렉터에 10-20kV의 고전압을 인가하여 0.05-0.2㎖/h의 방사속도로 60-80시간 동안 전기방사를 수행하는 방법으로 나노다공성 투과막을 제조하는 제 4 단계; 및
    e) 상기 나노다공성 투과막과 상기 칩을 상기 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액을 이용하여 부착시키는 제 5 단계;
    를 포함하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 마이크로 유체 채널용 나노구조체는 높이 0.1-0.5mm이며 폭 0.15-0.5mm인 양각의 형태인 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 칩은 상기 나노구조체가 형성된 실리콘 웨이퍼에 상기 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액을 붓고 70-90℃ 오븐에서 20-40분간 열처리를 수행하여 제조하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 나노다공성 투과막과 상기 PDMS 칩의 부착은 4℃에 보관하여 점도를 향상시킨 상기 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액을 상기 칩의 표면에 골고루 펴 바른 후 상기 나노다공성 투과막을 부탁시키는 1차 부착 단계; 및
    상기 1차 부착단계로 부착된 상기 나노다공성 투과막의 마이크로 유체 주채널 용액주입구 부분과 마이크로 유체 중앙채널 부분을 제외한 나머지 부분에 상기 4℃에 보관하여 점도를 향상시킨 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 및 폴리메타크릴산메틸(polymethylmethacrylate, PMMA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나, 또는 둘의 블록공중합체 또는 공중합체 경화용액을 골고루 펴 바른 후 70-90℃ 오븐에서 5-15분간 열처리하는 2차 부착단계;
    로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 마이크로 칩의 제조방법.
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