CN117603779A - 纳米试管药物筛选板及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳米试管药物筛选板及其制造方法。解决了现有药物筛选方法无法在一个容器内进行不同种药物的不同浓度的细胞杀伤测试的技术问题。本发明纳米试管药物筛选板包括透明基体，其上表面设置有隔离结构，隔离结构将透明基体上表面划分成多个互相分离的试管区域；试管区域内设置有多个纳米试管阵列；纳米试管阵列包括多个纳米试管单元，纳米试管单元由多个盲孔组成，每个盲孔形成一个纳米试管；纳米试管的最大开口宽度为20nm～单个目标细胞的最大铺展宽度；纳米试管的深度大于等于纳米试管的最大开口宽度，且小于等于200μm；相邻纳米试管之间的间距大于纳米试管的最大开口宽度且小于单个目标细胞的最大铺展宽度。

Description

纳米试管药物筛选板及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种用于药物筛选的容器，具体涉及一种纳米试管药物筛选板及其制造方法。

背景技术

现有的药物筛选方法通常是利用96孔板、培养小皿等容器，通过向培养好细胞的容器里加入大量具有一定浓度的目标药物，在一定时间后观察每个容器内细胞的存活状态，来判断加入的药物浓度对细胞是否具有良好的致死率，从而达到筛选出能杀伤细胞的最佳药物及其浓度的目的。但此类方法一个容器只能测试一种药物的一个浓度对细胞的作用效果，无法在一个容器内进行不同种药物、不同浓度的细胞杀伤测试。

发明内容

本发明的目的是解决现有药物筛选方法无法在一个容器内进行不同种药物、不同浓度的细胞杀伤测试的技术问题，而提供一种纳米试管药物筛选板及其制造方法。

本发明的技术解决方案是：

一种纳米试管药物筛选板，其特殊之处在于：

包括透明基体；所述透明基体的上表面设置有隔离结构，隔离结构将透明基体上表面划分成多个互相分离的试管区域；

所述试管区域内设置有纳米试管阵列，纳米试管阵列内设置多个纳米试管单元；

所述纳米试管单元由多个沿高度方向开设在透明基体上且开口朝上的盲孔组成，每个盲孔形成一个纳米试管，所述纳米试管用于注入所需的药物；纳米试管单元内纳米试管的密度根据药物浓度进行设置；

所述纳米试管的最大开口宽度为20nm～单个目标细胞的最大铺展宽度；纳米试管的深度大于等于纳米试管的最大开口宽度，且小于等于200μm；

相邻纳米试管之间的间距大于纳米试管的最大开口宽度且小于单个目标细胞的最大铺展宽度。

进一步地，所述隔离结构为矮墙，矮墙沿周向设置在每个试管区域外围，矮墙的上表面高于试管区域的上表面，且矮墙的高度大于100μm。

进一步地，所述隔离结构为沟壑结构，沟壑结构沿周向设置在每个试管区域外围；所述沟壑结构的宽度大于等于50μm，深度大于80μm。

进一步地，所述纳米试管的开口形状与目标细胞的铺展形状相适应。

进一步地，所述纳米试管阵列内多个纳米试管的排布形状为指定的线性阵列形状或图案化形状。

进一步地，所述透明基体为一个，至少一个纳米试管阵列集成在一个透明基体上；或者，所述透明基体为多个，多个纳米试管阵列分布在多个透明基体上。

进一步地，所述透明基体为熔融石英微片；所述纳米试管的最大开口宽度为500nm。

同时，本发明还提供了一种上述纳米试管药物筛选板的制造方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

步骤1)通过调整微纳加工系统中的位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在透明基体表面加工出试管区域，并在试管区域之间形成隔离结构；

步骤2)通过调整位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在试管区域内进行纳米试管阵列的单脉冲加工，直至完成所有纳米试管阵列的加工；

单脉冲加工过程中，位移台的速度应大于单个纳米试管之间的间隔与飞秒激光输出频率的乘积；

步骤3)将透明基体放置于刻蚀溶液中进行浸泡，至透明基体上的脱落部分完全剥离结束刻蚀，将透明基体清洗晾干，完成制造。

进一步地，步骤1)中，所述微纳加工系统是先利用锥透镜将飞秒激光输出的高斯飞秒脉冲整形成为类贝塞尔飞秒脉冲，再通过透镜组组成的4F系统将类贝塞尔飞秒脉冲引入100倍显微镜组成；所述飞秒激光源的单脉冲能量范围为0.1μJ～20μJ；飞秒激光的输出频率为10Hz～200kHz；位移台的移动速度为20μm/s～20000μm/s；

步骤2)中，所述单脉冲持续时间范围为250fs～20ps；

步骤3)中，所述刻蚀溶液为KOH刻蚀溶液，摩尔浓度为10mol/L，刻蚀温度为60℃。

本发明的有益效果：

1、本发明中的纳米试管药物筛选板具有阵列化可控，区域化可控的特点，可以在一片透明基体上制备互相分离的阵列，每个阵列都可以独立的载入不同种类，不同浓度的目标药物，从而可以在一次细胞培养过程中同时观察相同细胞在不同药物种类，不同药物浓度的存活状态，由此实现在一个透明基体上实现高通量的药物筛选工作，可以极大程度地节省药物筛选过程中人力、物力以及时间的耗费。

2、本发明纳米试管药物筛选板中的隔离结构，可以设置为矮墙或沟壑结构，具有很好的阻隔效果，可防止不同区域间药物串溶的影响。

3、本发明纳米试管药物筛选板中的纳米试管开口形状、开口大小以及深度均可根据要求进行设置，同时纳米试管阵列数量可控、图案可控以及密度可控，可满足不同细胞的药物筛选要求。

4、本发明纳米试管药物筛选板中的纳米试管阵列排布可根据要求进行多元化设计，满足不同商业化需求。

5、本发明纳米试管药物筛选板中的纳米试管可集成在一个透明基体上，也可分布在多个透明基体上，可满足大规模药物筛选同时进行的要求。

6、本发明纳米试管药物筛选板中的纳米试管阵列内多个纳米试管的排布形状可为指定的线性阵列形状或图案化形状，可用于区分不同的药物或不同的微生物。

7、本发明纳米试管药物筛选板的制造方法利用飞秒激光超快加工与湿法刻蚀的手段可快速高效的制备出本发明用于药物筛选的纳米试管微片，制造过程简便、易行、高效，所得产品相比传统的药物筛选工具可以极大的缩短时间周期，降低人力、物力成本。

附图说明

图1为本发明纳米试管药物筛选板实施例中透明基体加工有纳米试管阵列的结构示意图；

图2为本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管阵列的结构示意图；

图3为本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管阵列的侧面剖视图；

图4为本发明纳米试管药物筛选板实施例中透明基体设置矮墙的结构示意图；

图5为本发明纳米试管药物筛选板实施例中透明基体设置沟壑结构的结构示意图；

图6为本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管阵列上表面的形貌图；

图7为本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管阵列的排布示意图，其中，A为规则有序的线性化阵列排布，B为图案化排布；

图8为本发明纳米试管药物筛选板实施例中多个纳米试管阵列的不同组合方式示意图，其中，C为多个纳米试管阵列集成在一个透明基体上，D为多个纳米试管阵列分布在多个透明基体上；

图9为本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管的开口大小可调的示意图，其中，E为500nm的小开口示意图，F为3000nm的大开口示意图；

图10为本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管之间间距大小可调的展示图，其中，G的间距为2μm，H的间距为9μm；

图11为本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管的开口形状可调示意图；其中，O为圆形开口，P为三角形开口，Q为方形开口；

图12为使用本发明纳米试管药物筛选板实施例载入紫杉醇药物(PTX)对乳腺癌细胞(MCF-7)的杀伤效果，A为活细胞观测通道，B为死细胞观测通道，C为显微镜白场观测通道，D为活细胞、死细胞和白场复合观测通道；

图13为通过改变本发明纳米试管药物筛选板实施例中纳米试管阵列的纳米试管密度，实现对细胞给药浓度的变化，进而造成不同杀伤效果的示意图，其中，A为从上到下分布的三个不同纳米试管密度的纳米试管阵列示意图，B为细胞铺展在每个纳米试管阵列上的示意图，C为细胞因纳米试管密度差异而导致杀伤效果不同的示意图，细胞形态裂开为死细胞，完整为活细胞。

附图标记：

1-透明基体，2-隔离结构，3-纳米试管阵列，4-纳米试管。

具体实施方式

本发明纳米试管药物筛选板可以制备于石英玻璃等生物工程应用材料的表面，可以通过浸泡或者点滴的方式往纳米试管4中注入所需要的药物，制备成亚细胞级的微量给药单元，实现高通量药物筛选的目的。下面通过实施例和附图对本发明进行详细的说明。

如图1所示，本发明纳米试管药物筛选板，包括透明基体1，透明基体1的上表面设置有隔离结构2，隔离结构2将透明基体1上表面划分成多个互相分离的试管区域，防止试管区域之间的药物互相串流，确保药物测试结果的准确可靠性。透明基体1可以是玻璃或熔融石英，本实施例采用熔融石英微片，熔融石英微片的长和宽随实际需要而改变，为了保持样品的可靠性，其厚度一般不小于200μm，其边长D1一般不小于1mm。试管区域内设置有纳米试管阵列3，纳米试管阵列3内设置多个纳米试管单元。如图2、图3和图6所示，纳米试管单元由多个沿高度方向开设在熔融石英微片上且开口朝上的盲孔组成，每个盲孔形成一个纳米试管4，纳米试管4用于注入所需的药物，纳米试管单元内纳米试管4的密度根据药物浓度进行设置，具体如图2所示，单个纳米试管阵列3从上至下设置有三个纳米试管单元，三个纳米试管单元中纳米试管4的密度根据药物浓度所需逐渐减小，即通过控制单元面积内相邻纳米试管4的间隔和纳米试管4的数量进行密度控制。纳米试管4的最大开口宽度为20nm～单个目标细胞的最大铺展宽度，如图9所示为本发明纳米试管4开口大小可调的示意图。本实施例中纳米试管4的最大开口宽度为500nm，远小于细胞直径(5-200μm)。纳米试管4的开口宽度D5是根据湿法刻蚀的时间来控制的，刻蚀的时间越长纳米试管4的开口宽度越大。纳米试管4的深度D6大于等于纳米试管4的最大开口宽度，且小于等于200μm，其深度是通过激光加工的位移台高度来控制的，位移台位置越高加工的纳米试管4的深度越深。如图10所示，相邻纳米试管4之间的间距D4可调，一般取决于单个纳米试管4的最大开口宽度，大于纳米试管4的最大开口宽度且小于单个目标细胞的最大铺展宽度。纳米试管阵列3内纳米试管4的密度(即数量)根据所需药物的浓度梯度进行设置，一般而言一块1mm*1mm的正方形区域即可测试一种药物在100倍浓度之间变化的杀伤效果。本发明可通过调节纳米试管4的长径比来实现载药量的变化，通过调节纳米试管阵列区域内纳米试管4的密度(数量多少)来实现纳米试管阵列区域内药物浓度的梯度变化。

纳米试管药物筛选板的不同区域一般是由隔离结构2(沟壑结构或者隆起结构)来实现区分的，通常会使用激光加工直写实现沟壑结构或热压印实现隆起结构。沟壑结构或者隆起结构的主要作用是为了避免不同种药物之间的液相互溶。如图4所示，隔离结构2可设计为矮墙，矮墙沿周向设置在每个试管区域外围，矮墙的上表面高于试管区域的上表面，防止不同药物或不同浓度的药物的串流。矮墙的宽度D2一般大于100μm，高度大于100μm，宽度越长，高度越高，则阻隔液相互溶的效果越好。如图5所示，隔离结构2还可以设计成沟壑结构，沟壑结构沿周向设置在每个试管区域外围。沟壑结构的宽度D2一般大于等于50μm，深度大于80μm，宽度越长，深度越深，则阻隔液相互溶的效果越好。其中，图4和图5中不同颜色代表浓度不同的药物。

纳米试管4在熔融石英微片的空间位置可以随意变换，可以与熔融石英微片有一定角度的倾斜，可以在熔融石英微片上成线性阵列排布，也可以成一定图案化规则排列，也可以在熔融石英微片上成一定图案化规则倾斜排列，如图7所示，多元化排布方式有利于不同药物的区分以及不同微生物的区分，同时也可以满足不同用户的审美需求。纳米试管4的开口形状具有可调性，纳米试管4的开口形状根据目标细胞的铺展形状确定，例如圆形、三角形或方形，如图11所示。纳米试管阵列3内多个纳米试管4的排布形状为指定的任意形状，包括线性阵列和图案化形状。多个纳米试管阵列3集成在一个熔融石英微片上或分布在多个熔融石英微片上，如图8所示。

使用过程中，熔融石英微片上不同纳米试管阵列3内的药物其种类可以相同也可以不同，浓度可以相同也可以不相同。将所需浓度的药物预先加载在纳米试管4里，细胞生长在熔融石英微片表面后与细胞作用，不同的药物及浓度使细胞的存活状态发生差异，从而达到研究药物对细胞杀伤效果的目的，如图12和13所示。在临床上，一次穿刺获取的细胞组织就足够在一块熔融石英微片上实现多种药物的药效测试，这既给患者减少了多次穿刺的痛苦和心理负担，又降低了药物筛选过程中人力物力财力的损耗。最关键的是它可以在一个很小的结构上实现高通量的药物筛选，为患者争取了宝贵的治疗时间。

同时，本发明还提供了上述纳米试管药物筛选板的制造方法，包括以下步骤：

步骤1)通过调整微纳加工系统中的位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在熔融石英微片1表面直写出连通的沟壑结构，沟壑结构所围成的区域即为试管区域。位移台的移动速度为20μm/s～20000μm/s；飞秒激光的输出频率为10Hz～200kHz。飞秒激光光源的单脉冲能量范围为0.1μJ～20μJ，一般选择1μJ。

微纳加工系统是先利用锥透镜将飞秒激光输出的高斯飞秒脉冲整形成为类贝塞尔飞秒脉冲(长焦深、小焦点的针状光场)，再通过透镜组组成的4F系统将类贝塞尔飞秒脉冲引入100倍显微镜组成，利用位移台来实现样品较类贝塞尔飞秒脉冲的移动。

步骤2)通过调整位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在熔融石英微片表面进行纳米试管4的单脉冲加工，直至完成纳米试管4的加工。单脉冲加工过程中，所选用的速度和频率应遵循“位移台的速度大于单个纳米试管4之间的间隔与飞秒激光脉冲输出频率的乘积”这一标准。单脉冲加工出来的纳米试管阵列即为待刻蚀的纳米试管阵列。单脉冲持续时间范围为250fs～20ps，一般选择250fs。

步骤3)刻蚀溶液选择摩尔浓度为10mol/L的KOH刻蚀溶液，在60℃下，将熔融石英微片放置于KOH溶液中进行浸泡，至熔融石英微片上的脱落部分完全剥离结束刻蚀，将熔融石英微片清洗晾干，完成制造。其他实施例中，刻蚀溶液也可以采用其他的酸性或碱性刻蚀溶液。

Claims (9)

1.一种纳米试管药物筛选板，其特征在于：

包括透明基体(1)；所述透明基体(1)的上表面设置有隔离结构(2)，隔离结构(2)将透明基体(1)上表面划分成多个互相分离的试管区域；

所述试管区域内设置有纳米试管阵列(3)，纳米试管阵列(3)内设置多个纳米试管单元；

所述纳米试管单元由多个沿高度方向开设在透明基体(1)上且开口朝上的盲孔组成，每个盲孔形成一个纳米试管(4)，所述纳米试管(4)用于注入所需的药物；纳米试管单元内纳米试管(4)的密度根据药物浓度进行设置；

所述纳米试管(4)的最大开口宽度为20nm～单个目标细胞的最大铺展宽度；纳米试管(4)的深度大于等于纳米试管(4)的最大开口宽度，且小于等于200μm；

相邻纳米试管(4)之间的间距大于纳米试管(4)的最大开口宽度且小于单个目标细胞的最大铺展宽度。

2.根据权利要求1所述的纳米试管药物筛选板，其特征在于：

所述隔离结构(2)为矮墙，矮墙沿周向设置在每个试管区域外围，矮墙的上表面高于试管区域的上表面，且矮墙的高度大于100μm。

3.根据权利要求1所述的纳米试管药物筛选板，其特征在于：

所述隔离结构(2)为沟壑结构，沟壑结构沿周向设置在每个试管区域外围；

所述沟壑结构的宽度大于等于50μm，深度大于80μm。

4.根据权利要求1或2或3所述的纳米试管药物筛选板，其特征在于：

所述纳米试管(4)的开口形状与目标细胞的铺展形状相适应。

5.根据权利要求4所述的纳米试管药物筛选板，其特征在于：

所述纳米试管阵列(3)内多个纳米试管(4)的排布形状为指定的线性阵列形状或图案化形状。

6.根据权利要求5所述的纳米试管药物筛选板，其特征在于：

所述透明基体(1)为一个，至少一个纳米试管阵列(3)集成在一个透明基体(1)上；或者，所述透明基体(1)为多个，多个纳米试管阵列(3)分布在多个透明基体(1)上。

7.根据权利要求6所述的纳米试管药物筛选板，其特征在于：

所述透明基体(1)为熔融石英微片；

所述纳米试管(4)的最大开口宽度为500nm。

8.一种权利要求1-7任一所述的纳米试管药物筛选板的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)通过调整微纳加工系统中的位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在透明基体(1)表面加工出试管区域，并在试管区域之间形成隔离结构(2)；

步骤2)通过调整位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在试管区域内进行纳米试管(4)的单脉冲加工，直至完成所有纳米试管(4)的加工；

单脉冲加工过程中，位移台的速度应大于单个纳米试管(4)之间的间隔与飞秒激光输出频率的乘积；

步骤3)将透明基体(1)放置于刻蚀溶液中进行浸泡，至透明基体(1)上的脱落部分完全剥离结束刻蚀，将透明基体(1)清洗晾干，完成制造。

9.根据权利要求8所述的纳米试管药物筛选板的制造方法，其特征在于：

步骤1)中，所述微纳加工系统是先利用锥透镜将飞秒激光输出的高斯飞秒脉冲整形成为类贝塞尔飞秒脉冲，再通过透镜组组成的4F系统将类贝塞尔飞秒脉冲引入100倍显微镜组成；所述飞秒激光源的单脉冲能量范围为0.1μJ～20μJ；飞秒激光的输出频率为10Hz～200kHz；

位移台的移动速度为20μm/s～20000μm/s；

步骤2)中，所述单脉冲持续时间范围为250fs～20ps；

步骤3)中，所述刻蚀溶液为KOH刻蚀溶液，摩尔浓度为10mol/L，刻蚀温度为60℃。