KR101815370B1 - 세포 표면 고분자층 적층 기술 개발 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 층과층 적층법을 이용하여 다양한 물질로 이루어진 고분자층을 세포 표면에 적층할 수 있다.
상기 방법은 매우 간단하고, 적용할 수 있는 세포의 종류에 제한이 없으며, 고분자층의 두께를 수 나노미터로 조절할 수 있다. 또한 고분자층의 구조 및 밀도 등을 원하는 목적에 맞게 조절할 수 있다.
상기 방법은 매우 간단하고, 적용할 수 있는 세포의 종류에 제한이 없으며, 고분자층의 두께를 수 나노미터로 조절할 수 있다. 또한 고분자층의 구조 및 밀도 등을 원하는 목적에 맞게 조절할 수 있다.
Description
본 발명은 층과층 적층법(layer-by-layer self-assembly method)을 이용하여 줄기세포 표면에 나노 두께의 고분자층을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 세포외기질 단백질인 양전하 고분자를 기반으로 다양한 조합의 고분자층을 제조하여, 성장인자나 약물의 도움 없이 줄기세포의 증식과 분화를 유도하는 기술을 제공할 수 있다.
줄기세포는 조골세포, 연골세포, 지방세포 또는 근육세포 등으로 분화할 수 있는 다분화능 세포로서, 체외에서도 형질의 변화 없이 무한으로 증식할 수 있기 때문에 재생 의학 분야와 조직 공학 분야에서 꾸준히 연구되고 있다.
특히, 수많은 연구진들은 줄기세포를 원하는 조직의 세포로 분화하도록 유도하기 위해 화학적 또는 물리적인 방향으로 다양한 접근을 시도해 오고 있다. 물리적인 방향으로의 접근은 비교적 연구가 활발하지 못했으나, 줄기세포가 자라는 기판의 탄성에 의해 분화가 조절된다는 논문(비특허문헌 1)을 기점으로, 단백질, 리간드(ligand) 결박 (tethering)정도에 의한 세포외기질의 기계적 피드백에 의해 세포 분화 조절(비특허문헌 2), 세포외기질 소섬유의 장력의 크기에 따른 생화학적 신호에 의한 분화 조절(비특허문헌 3) 등의 다양한 의견들이 제시되고 있다. 그러나, 여전히 줄기세포 분화에 가장 큰 영향을 주는 요소를 찾기 위한 활발한 연구가 진행되고 있다.
뿐만 아니라, 줄기세포의 분화를 조절하는 메커니즘을 밝히기 위해 세포 내의 물질과 신호 전달 체계를 분석하는 수준 높은 연구들이 진행되고 있다. 이와 관련하여, 세포 내의 특정 단백질인 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)가 지방세포의 형성을 억제하고 조골세포의 형성을 촉진하는 transcriptional modulator임이 밝혀졌으며(비특허문헌 4), 외부의 기계적 자극에 의해 줄기세포의 분화를 조절한다는 보고(비특허문헌 5)가 있다. 외부의 기계적 자극에 의한 줄기 세포 내의 신호 전달 체계를 해석하기 위한 후속 연구들이 진행되고 있지만, 아직까지 정확하게 밝혀지지 않았다.
한편, 줄기세포를 목적에 따라 특정 세포로의 분화를 유도하기 위해 다양한 성장인자들이 사용되기도 하는데, 한 예로 조골세포로의 분화를 유도하기 위해 줄기세포를 bFGF(Basic fibroblast growth factor)와 BMP-2 (Bone morphogenetic protein 2)로 처리한다(비특허문헌 6). 그러나 상기 성장인자들은 관리가 까다롭고 가격이 비쌀 뿐만 아니라, BMPs 경우 염증반응, 종양형성 및 골용해와 같은 부작용의 문제가 있다. 또한 세포의 기능을 조절하기 위해 세포 표면에 다층박막을 제조하기도 하는데, 이 경우 물질에 대한 세포 독성 실험으로 양전하 물질 용액에 세포를 처리하면 음전하를 띄는 세포막이 손상을 입어 세포 생존력이 매우 떨어졌다(비특허문헌 7). 따라서, 생리학적 조건인 pH 7.4에서 음전하를 띄는 세포외기질 단백질인 피브로넥틴(fibronectin)과 젤라틴(gelatin)을 생물학적 인식(biological recognition)을 이용하여 세포 표면에 다층으로 적층하기도 하였다(비특허문헌 8). 그러나, 피브로넥틴 및 젤라틴은 모두 음전하를 띄므로, 같은 전하를 갖는 물질끼리 인력보다는 반발력이 크게 작용하여, 다층박막이 실제로 형성되는지에 대한 의문이 제기되기도 하였다.
따라서, 줄기세포의 상용화를 위해서는 더욱 간단하고 단순한 방법으로 줄기세포의 증식과 분화를 조절하기 위한 노력이 필요하다.
1. A. J. Engler et al., Cell, 2006, 126, 677-689
2. B. Trappmann et al., Nat. Mater., 2012, 11, 642-649)
3. B. Li et al., Sci. Rep., 2013, 3, 2425
4. J. Hong et al., Science, 2005, 309, 1074-1078
5. S. Dupont et al., Nature, 2011, 474, 179-183
6. K. Hanada et al., J. Bone Miner. Res., 1997, 12, 1606-1614
7. K. Kadowaki et al., Langmuir, 2010, 26, 8, 5670-5678
8. M. Matsussaki et al., Adv. Mater., 2012, 24, 454-474
본 발명은 층과층 적층법을 이용하여 세포 표면에 고분자층을 적층하는 기술에 관한 것이다. 세포외기질 단백질을 기반으로 한 고분자층은 세포에게 인공적 세포외기질을 제공해주고, 상기 세포를 안정하게 하여 세포 증식을 촉진시킬 수 있다. 또한, 성장인자나 약물의 도움 없이 특정 방향으로 줄기세포의 분화가 가능하다.
본 발명에서는 줄기세포의 표면에 양전하 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액을 반복적으로 적층하여 상기 줄기세포의 표면을 둘 이상의 고분자층으로 적층하는 단계를 포함하고,
상기 양전하 고분자는 콜라젠, 엘라스틴 또는 데코린이며,
상기 음전하 고분자는 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 줄기세포 표면에 양전하 고분자층 및 음전하 고분자층이 교대로 적층되어 있으며,
상기 양전하 고분자층은 콜라젠, 엘라스틴 또는 데코린으로 구성되고,
상기 음전하 고분자층은 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상으로 구성되며,
상기 고분자층은 2 이상의 층인 줄기세포를 제공한다.
본 발명에서는 줄기세포 표면에 고분자층을 다층으로 형성하여 매우 간단한 방법으로 줄기세포의 증식과 조골세포 등으로 분화를 유도할 수 있다.
상기 고분자층은 세포의 성장 배지와 동일한 조건에서 제조될 뿐만 아니라, 세포막에 손상을 주지 않는 세포외기질 단백질을 기반으로 하므로, 기존의 세포 표면 다층박막과는 달리 세포 손상을 줄여 세포의 생존에 매우 유리하다.
이로써 성장인자나 약물의 사용 없이 저렴한 비용으로 세포 표면에 고분자층을 제조하여 다양한 분야에 적용할 수 있다.
도 1은 실리콘 기판에 적층된 고분자층의 두께를 측정한 그래프(A) 및 금 전극에 적층된 고분자층을 QCM(Quartz Crystal Microbalance)으로 분석한 그래프(B)이다.
도 2는 고분자층의 기계적 물성인 경도(hardness)(A), 영률(Young's modulus)(B)를 분석한 그래프 및 모폴러지(morphology) 이미지(C)이다.
도 3은 생리학적 조건(세포등장액 조건, 37 ℃)에서 고분자층의 감쇄곡선(degradation curve) 그래프이다.
도 4(A)는 중간엽 줄기세포 표면에 고분자층을 코팅하여 줄기세포의 증식과 조골세포로의 분화를 촉진하는 과정을 나타내는 모식도이고, (B)는 본 발명에서 사용된 양전하 및 음전하 고분자의 이름과 고분자층의 조합을 나타내는 표이다.
도 5(A)는 고분자층이 적층된 세포의 생존 정도를 나타내는 그래프이고, (B)는 세포를 씨딩(seeding)하고 이틀 후, qRT-PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 TAZ protein target gene을 정량적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이며, (C)는 부착 조건(Adherent condition)과 현탁 조건(Suspended condition)에서 6일 동안 이틀 간격으로 줄기세포의 증식을 확인한 그래프이다.
도 6은 분화 개시 6일 후, qRT-PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 조골세포 분화 표지인자를 정량 분석한 그래프이다.
도 7은 MAPK(Mitogen Activated Protein Kinases) pathway 관련 western blot의 결과(A) 및 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 세포핵을 염색하고 TAZ protein의 형광색소와 결합한 항체를 달아서 TAZ의 localization을 확인하기 위해 공초점 현미경을 이용해서 촬영한 immunofluorescence(B)를 나타내는 이미지이다.
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도 3은 생리학적 조건(세포등장액 조건, 37 ℃)에서 고분자층의 감쇄곡선(degradation curve) 그래프이다.
도 4(A)는 중간엽 줄기세포 표면에 고분자층을 코팅하여 줄기세포의 증식과 조골세포로의 분화를 촉진하는 과정을 나타내는 모식도이고, (B)는 본 발명에서 사용된 양전하 및 음전하 고분자의 이름과 고분자층의 조합을 나타내는 표이다.
도 5(A)는 고분자층이 적층된 세포의 생존 정도를 나타내는 그래프이고, (B)는 세포를 씨딩(seeding)하고 이틀 후, qRT-PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 TAZ protein target gene을 정량적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이며, (C)는 부착 조건(Adherent condition)과 현탁 조건(Suspended condition)에서 6일 동안 이틀 간격으로 줄기세포의 증식을 확인한 그래프이다.
도 6은 분화 개시 6일 후, qRT-PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 조골세포 분화 표지인자를 정량 분석한 그래프이다.
도 7은 MAPK(Mitogen Activated Protein Kinases) pathway 관련 western blot의 결과(A) 및 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 세포핵을 염색하고 TAZ protein의 형광색소와 결합한 항체를 달아서 TAZ의 localization을 확인하기 위해 공초점 현미경을 이용해서 촬영한 immunofluorescence(B)를 나타내는 이미지이다.
본 발명은 줄기세포의 표면에 양전하 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액을 반복적으로 적층하여 상기 줄기세포의 표면을 둘 이상의 고분자층으로 적층하는 단계를 포함하고,
상기 양전하 고분자는 콜라젠, 엘라스틴 또는 데코린이며,
상기 음전하 고분자는 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 '줄기세포'는 스스로 세포 분열을 할 수 있고, 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 이러한 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 일 구체예에서, 상기 줄기세포로 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 지방, 골수, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 상기 줄기세포의 조직 유래에 따라 분화 양상이 달라질 수 있다. 또한, 상기 골수 또는 조직 등의 채취 대상 동물은 포유동물일 수 있으며, 구체적으로 인간일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 중간엽 줄기세포는 증식 또는 분화할 수 있다. 일 구체예에서 상기 중간엽 줄기세포는 조골세포로 분화할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법은 줄기세포의 표면에 양전하 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액을 반복적으로 적층하여 상기 줄기세포의 표면을 둘 이상의 고분자층으로 코팅하는 단계를 포함한다.
상기 코팅은 자기조립방법에 의해 수행될 수 있다. 자기조립방법이란, 기판에 상대 전하를 띠는 고분자 용액을 순차적으로 분사하는 과정을 원하는 만큼 반복함으로써 고분자 용액의 박막을 적층시키는 것을 의미한다. 순차적으로 고분자 박막을 제조할 수 있기 때문에 'layer by layer(층대층, LBL)이라 부르기도 한다. 용액을 서로 혼합하는 것이 아니라 기질을 사용하는 방법이기 때문에 상분리가 일어나지 않는 박막(고분자층)을 제작할 수 있다.
본 발명에서는 줄기세포의 표면에의 양전하 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액의 박막(층)을 순차적으로 적층시켜 둘 이상의 고분자층을 제조할 수 있다.
본 발명에서 양전하 고분자 및 음전하 고분자는 고분자가 용매에 용해되었을 때 각각 양전하 및 음전하를 띌 수 있는 고분자를 의미한다.
상기 양전하 고분자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 세포외기질 단백질을 사용할 수 있다. 상기 세포외기질 단백질은 세포 표면의 리셉터(receptor)들과 결합하여 줄기세포가 느끼는 안정성을 증대시켜 세포 증식을 촉진시킬 수 있다. 또한, 성장인자나 약물 등의 활성성분의 도움 없이 줄기세포의 분화를 유도할 수 있다. 상기 성장인자는 염증반응, 종양형성, 골용해와 같은 부작용의 문제가 있고, 성장인자의 유래에 따라 재조합의 위험성을 가진다. 이러한, 세포외기질 단백질로는 콜라젠, 엘라스틴 또는 데코린을 사용할 수 있다.
또한, 음전하 고분자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기 다층박막을 구성하는 고분자의 종류에 따라 줄기세포의 분화를 조절할 수 있다.
양전하 고분자 용액은 상기 양전하 고분자를 포함하는 용액을 의미하며, 음전하 고분자 용액은 상기 음전하 고분자를 포함하는 용액을 의미한다. 상기, 양전하 고분자 및 음전하 고분자는 정전기적 인력 및/또는 생물학적 인식(biological recognition)을 통해 결합을 형성할 수 있다. 상기 정전기적 인력은 반대 전하를 띤 입자들 간의 인력을 의미하며, 음전하를 띄는 세포막은 정전기적 인력에 의해 양전하 고분자와 결합을 형성하고, 상기 양전하 고분자는 정전기적 인력에 의해 음전하 고분자와 결합을 형성한다. 또한, 상기 생물학적 인식은 세포와 세포 부착 단백질 또는 세포외 기질 단백질이 세포 특정 리셉터(receptor)에 의해 결합되거나, 세포 부착 단백질 또는 세포외 기질 단백질 각각 또는 서로 간의 특정 도메인(domain)에 의해 인력이 작용하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 상기 정전기적 인력 및 생물학적 인식이 함께 작용하여 결합을 형성할 수 있으며, 이에 의해, 세포 상에 고분자층을 다층으로 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 고분자 용액의 적층은 (a) 양전하 고분자 용액에 줄기세포를 부유시키는 단계;
(b) (a)에서 제조된 줄기세포 부유액을 원심분리하여 세포 펠렛을 얻는 단계;
(c) 음전하 고분자 용액에 (b)에서 얻은 세포 펠렛을 부유시키는 단계; 및
(d) (c)에서 제조된 부유액을 원심분리하여 세포 펠렛을 얻는 단계를 통해 수행될 수 있다.
일 구체예에서 단계 (a)를 수행하기 전에 세포를 수확하기 위해 상기 세포를 전처리하는 과정을 추가로 수행할 수 있다. 상기 세포 전처리는 트립신 처리일 수 있다. 상기 트립신 처리는 세포를 배양하던 플레이트에서 세포를 떼어내어 수확할 때 수행되는데, 상기 처리에 의해 부착 단백질을 제거하여 세포를 단일 세포 상태로 수확하게 할 수 있다.
일 구체예에서 양전하 또는 음전하 고분자 용액에서 양전하 또는 음전하 고분자는 전술한 고분자를 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 고분자 용액의 용매로는 PBS, Tris-buffer 또는 성장 배지(growth media)를 사용할 수 있다.
일 구체예에서 단계 (a) 및/또는 (c)에서 양전하 또는 음전하 고분자 용액의 함량은 0.3 내지 3 ml 또는 0.5 내지 1 ml일 수 있다. 또한, 상기 고분자 용액에서의 줄기세포 또는 세포 펠렛의 부유는 5 내지 50 회 동안 피펫팅(pipetting)하여 이루어질 수 있다.
일 구체예에서 단계 (b) 및/또는 (d)에서 원심분리는 1000 내지 1300 rpm에서 1 내지 10분 동안 수행할 수 있다. 상기 범위에서 세포 펠렛을 용이하게 얻을 수 있다.
또한, 일 구체예에서 단계 (b) 및/또는 (d)를 수행한 후, 얻어진 세포 펠렛을 세척하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
예를 들어, 전 단계에서 사용된 고분자 용액의 용매(이하 세척 용액이라 함)를 사용하여 약한 결합으로 적층된 고분자를 제거할 수 있다. 상기 세척은 세척 용액에 세포 펠렛을 넣고 피펫팅 및 원심분리하여 수행될 수 있다. 상기 세척은 2회 이상 수행될 수 있다.
본 발명에서 단계 (a) 및 (c)는 원하는 고분자층의 수에 맞춰 반복적으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 조골세포로의 분화 양상은 예를 들어, 다층박막을 구성하는 물질의 종류, 고분자층의 두께와 구조 등에 따라 달라질 수 있다.
즉, 본 발명에서는 전술한 양전하 및 음전하 고분자를 사용하고, 고분자층의 두께 및 구조를 최적으로 한정하여, 성장인자 등의 사용 없이 세포를 조골세포로 분화시킬 수 있다.
일 구체예에서 둘 이상의 층으로 형성되는 고분자층의 총 두께는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 50 내지 80 nm 또는 60 내지 70 nm 일 수 있다. 상기 범위에서 줄기세포가 조골세포로 분화할 수 있다.
또한, 일 구체예에서 고분자층의 수는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 2 내지 9개 또는 2 내지 5개의 층으로 형성될 수 있다.
또한, 고분자층의 구조는 편평한 구조, 다공성 구조, 그물 구조, 계층 구조 또는 섬유질 구조일 수 있다. 또한, 줄기세포의 표면에 형성되는 고분자층의 거칠기(roughness)는 30 nm 내지 100 nm 일 수 있다.
전술한 바와 같이, 다층박막을 구성하는 물질의 종류, 고분자층의 두께와 구조 등의 조절을 통해 줄기세포를 조골세포로 용이하게 분화시킬 수 있다.
본 발명에서 줄기세포는 고분자층 내부에서 위치하며, 조골세포로 분화할 수 있다.
상기 줄기세포의 분화과정에서, 고분자층은 상기 고분자층을 구성하는 성분에 따라 완전히 분해되거나, 또는 일부 떨어져 나올 수 있다.
또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 표면에 콜라젠 용액 및 알긴산(alginic acid) 용액을 반복적으로 적층하여 상기 줄기세포의 표면을 둘 이상의 고분자층으로 적층하는 단계를 포함하는 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 양전하 고분자로 콜라겐을 사용하고, 음전하 고분자로 알긴산을 사용하여, 상기 줄기세포의 조골세포로의 분화 효율을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포 표면에 양전하 고분자층 및 음전하 고분자층이 교대로 적층되어 있으며,
상기 양전하 고분자는 콜라젠, 엘라스틴 또는 데코린이고,
상기 음전하 고분자는 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명에서 양전하 고분자층은 양전하 고분자로 형성되며, 음전하 고분자층은 음전하 고분자로 형성된다.
상기 줄기세포는 고분자층은 2 이상의 층으로 구성되는데, 상기 양전하 고분자층은 이웃하는 음전하 고분자층과 정전기적 인력을 통해 결합될 수 있다.
상기 줄기세포는 전술한 바와 같이, 줄기세포의 표면에 양전하 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액을 반복적으로 적층하여 상기 줄기세포의 표면을 둘 이상의 고분자층으로 적층하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
본 발명에서는 다층박막을 구성하는 물질의 종류, 고분자층의 두께 및 구조를 통해 줄기세포의 분화 정도를 조절하여, 질환의 종류에 따라 상기 줄기세포를 생체 내에 투입하는 시기를 결정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예
실시예 1. 다양한 기판 상에 고분자층 제조
양전하 고분자로는 collagen-type 1-from rat tail을, 음전하 고분자로는 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)을 사용하였다.
상기 고분자들은 PBS(phosphate buffer saline)를 용매로 pH 7.4 조건에서 1 mg/mL 의 농도로 용액으로 제조하였다. 상기 용액은 0.15M salt를 포함하며, 용매는 세포 등장액과 같은 조건을 가진다.
(1) 실리콘 기판 상에 고분자층 제조
실리콘 기판에 고분자층을 적층하기 전에, 실리콘 기판을 O2 plasma 처리하여 음전하로 개질하고, 양전하 고분자 용액인 콜라젠 용액에 10분간 담지시켰다. 약한 결합으로 적층된 콜라젠을 제거하기 위해 2분, 1분, 1분 동안 세척 용액에 담지하였다. 그 후, 음전하 고분자를 적층하기 위해 음전하 용액을 사용하여 상기 과정을 반복하였다.
(2) 금 전극 상에 고분자층 제조
금 전극(Gold electrode)의 세척을 위해 피라나 용액(piranha solution, 황산: 과산화수소=3:2)에서 5분 동안 처리하고 증류수에서 세척한 뒤에 O2 plasma 처리를 통해 음전하로 개질하였다. 그 뒤, 양전하 고분자 용액인 콜라젠 용액에 10분간 담지시키고, 약한 결합으로 적층된 콜라젠을 제거하기 위해 2분, 1분, 1분 동안 세척 용액에 담지하였다. 그 후, 음전하 고분자를 적층하기 위해 음전하 용액을 사용하여 상기 과정을 반복하였다.
시험예 1. 고분자층의 정량적 분석
본 발명에서 도 1은 실리콘 기판에 적층된 고분자층의 총 두께를 측정한 그래프(A) 및 금 전극에 적층된 고분자층을 QCM(Quartz Crystal Microbalance)으로 분석한 그래프(B)이다.
상기 실시예 1에서 제조된 고분자층을 쉽게 구분하기 위해 각각 사용된 음전하 고분자로 고분자층을 명명하였다. 즉, 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid)을 사용한 경우 PGA, 리그닌-알칼리(lignin-alkali)를 사용한 경우 Lignin, 탄닌산(tannic acid)을 사용한 경우 TA, 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate)을 사용한 경우 CS 및 알긴산(alginic acid)을 사용한 경우 AA로 명명하였다.
도 1(A)에 나타난 바와 같이, 고분자층의 층수의 증가에 따라 실리콘 기판에 흡착된 고분자층의 두께도 증가한 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 모든 종류의 고분자층이 성공적으로 제조되었음을 확인할 수 있다. 다만, 음전하 고분자의 종류에 따라 고분자층의 두께가 상이한 것으로 나타났는데, 이는 세포 등장액 조건에서 음전하의 전하 세기와 구조가 각각 다르기 때문에 적층되는 고분자층의 양상이 다르기 때문이다. 이는 (B)의 QCM 결과에서도 확인할 수 있다.
모든 종류의 고분자층이 층의 증가에 따라 두께가 전반적으로 증가하는 양상을 보이지만, TA과 PGA의 경우 짝수층에서 두께가 감소하는 양상을 보인다. 이는 홀수층에서 기판 상에 콜라젠이 많이 적층되었으나, 상기 기판이 음전하 고분자 용액에 담지될 때 기판 표면의 콜라젠층 일부가 떨어져 나가면서 음전하 고분자가 적층되기 때문이다. 즉, 음전하 고분자가 적층되는 짝수층의 값이 감소하지만 그 다음 양전하 고분자가 적층되는 홀수층의 값이 증가하고 이에 따라 전체적으로 값이 증가하는 양상을 갖는 것으로 보아, 음전하 고분자가 충분히 적층되어 다음 층이 적층될 수 있음을 보여준다.
또한 sauerbrey equation을 통해 QCM의 진동수 변화를 질량 변화로 계산할 수 있는데, 고분자층의 두께와 질량을 통해 고분자층의 밀도를 계산할 수 있다. 그 결과, PGA의 밀도는 다른 고분자층에 비해 매우 큰 것으로 나타났다.
실험예 2. 고분자층의 물리적 특성 분석
본 발명에서 도 2는 고분자층의 기계적 물성 및 모폴러지(morphology)를 분석한 그래프 및 사진으로, 경도(hardness)(A), 영률(Young's modulus)(B) 및 고분자층 모폴러지(morphology) 이미지(C)를 나타낸다.
상기 물리적 특성은 실시예 1의 실리콘 기판 상에 적층된 고분자층을 사용하여 측정하였으며, 이때, 고분자층의 두께는 400 nm였다. 또한, 경도 및 영률은 nano-indentation을 통해 측정하였으며, 모폴러지 이미지는 AFM (Atomic Force Microscope)를 이용하여 측정하였다.
경도(A) 및 영률(B)은 실제값이 아닌 모델링을 통한 비교값을 나타낸다. 상기 경도 및 영률은 고분자층의 종류마다 큰 차이를 보이지 않는데, 이는 모든 고분자층에서 콜라젠이 많은 양을 차지하며, 단백질과 고분자로만 이루어진 나노두께의 고분자층이기 때문에 비슷한 기계적 물성을 보이는 것이다.
이는 모폴러지(morphology) AFM 이미지(C)를 통해서도 확인할 수 있는데, 모든 종류의 고분자층에서 콜라젠 섬유의 모습이 주로 보이며 또한 비슷한 모폴러지를 가진다.
또한, 본 발명에서 도 3은 생리학적 조건(세포등장액 조건, 37 ℃)에서 고분자층의 감쇄곡선(degradation curve) 그래프이다.
구체적으로, 실시예 1의 실리콘 기판 상에 적층된 고분자층(두께 100 nm)을 사용하여, 줄기세포 분화에 필요한 6일 동안 고분자층의 두께 변화를 확인하였다. 100 nm 두께의 고분자층의 두께 변화 값을 초기값으로 나눠주어 정규화시켜 그래프로 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 음전하 고분자의 종류에 따라 유지되는 두께는 다르지만, 대부분 1 h 이내에 고분자층의 두께가 감소하였고 그 이후로는 그 두께가 일정하게 유지되었다. 고분자층을 제조하는 조건과 감쇄(degradation)를 확인한 조건이 같기 때문에 고분자층의 두께가 조금 감소하지만 일정하게 유지되므로, 이를 통해 세포 표면의 고분자층이 세포가 분화되는 동안 유지될 수 있을 것으로 예측할 수 있다.
실시예 2. 줄기세포 위 고분자층 제조
양전하 고분자로는 collagen-type 1-from rat tail을, 음전하 고분자로는 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)을 사용하였다.
또한, 세포로는 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow derived mesenchymal stem cell, hMSC)를 사용하였다.
모든 과정은 멸균 조건(소독된 벤치)에서 진행하였다.
전술한 양전하 및 음전하 고분자들은 hMSC의 growth media(DMEM에 Fetal bovine serum 10% 첨가되어 있는 media)를 용매로 pH 7.4 조건에서 1 mg/mL 의 농도로 용액으로 제조하였다. 박테리아 제거 등의 소독을 위해 0.2 μm 필터를 이용하여 주사기 필터링하였다.
트립신 처리로 얻은 단일 세포 부유액을 1000 내지 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 얻었다. 상층액을 제거한 세포 펠렛에 양전하 용액인 콜라젠 용액 0.5 mL를 넣고 30회 pipetting하여 세포를 재부유 시켰다. 그 후, 1000 내지 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 다시 세포 펠렛을 얻었다. 상층액을 제거하고 세척 용액인 growth media 1 mL를 넣고 10회 pipetting하여 세포를 재부유시켰다. 다시 1000 내지 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻고 세척 과정을 한 번 더 진행하였다. 그 후, 음전하 고분자를 적층하기 위해 음전하 용액을 사용하여 상기 과정을 반복하였다.
고분자층의 층 수만큼 전술한 과정을 반복하였다.
또한, 대조군으로는 고분자층을 적층하지 않은 세포를 사용하였다.
본 발명에서 도 4(A)는 중간엽 줄기세포 표면에 고분자층을 적층하여 줄기세포의 증식과 조골세포로의 분화를 촉진하는 과정을 나타내는 모식도이고, (B)는 본 발명에서 사용된 양전하 및 음전하 고분자들의 이름과 고분자층의 조합들을 나타내는 표이다.
실험예 3. 세포 생존 실험
96 well culture plate에 실시예 2에서 제조된 고분자층이 적층된 세포(중간엽 줄기세포)와 대조군을 각각 1×104/cm2 농도로 씨딩(seeding)하고 37℃, CO2 5% 조건에서 인큐베이팅(incubating)하였다. 24시간 뒤에 EZ-Cytox 10 μL를 첨가하고 30분간 인큐베이팅(incubating)하였다. Well의 모든 곳에서 균일한 결과를 얻기 위해 조심스럽게 흔들어주고, plate reader로 bio-rad인 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 대조군의 흡광도와 실시예 2에서 제조된 고분자층이 적층된 세포의 흡광도를 각각 얻을 수 있었다.
또한, 본 발명에서 도 5(A)는 고분자층이 적층된 세포의 생존 정도를 나타내는 그래프이다.
상기 세포로는 실시예 2의 제조 방법에 따라, 60 nm의 두께의 고분자층이 적층된 중간엽 줄기세포를 사용하였으며, 대조군으로는 고분자층을 적층하지 않은 중간엽 줄기세포를 사용하였다.
상기 도 5(A)에 나타난 바와 같이, 코팅하지 않은 세포인 대조군(control)의 생존 정도를 100%로 두었을 때, 고분자층을 코팅한 세포의 생존 정도는 모든 종류의 고분자층에서 90% 이상을 보인다. 이는 세포 표면에 고분자층을 적층한 후에도 세포의 생존이 큰 영향을 받지 않음을 보여준다.
본 발명에서는 세포 독성이 없고 pH 7.4에서 약한 양전하 값을 갖는 세포외기질 단백질인 콜라젠을 기반으로 하는 고분자층을 적층하여, 높은 세포 생존률을 가질 수 있다.
실시예 4. 세포 성장 조건에서 세포 증식 정도 측정
부착 조건(Adherent condition)에서 세포 증식 정도를 측정하였다. 측정은 6 well culture plate에 세포를 1×104/cm2 농도로 씨딩(seeding)하고 37℃, CO2 5% 조건에서 인큐베이팅(incubating)하였다. 6일 동안 이틀 간격으로 세포를 트립신(trypsin) 처리하여 단일 세포 상태로 만들어준 뒤 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 세포의 개수를 세고, 다시 6 well culture plate에 씨딩(seeding)하였다.
현탁 조건(Suspended condition)의 경우에는 6 well culture plate에 세포가 붙을 수 없도록 poly-HEMA(poly 2 hydroxyethyl methacrylate) 코팅하고 세포를 씨딩(seeding)하였다. 마찬가지로 6일 동안 이틀 간격으로 세포의 개수를 세는데, 현탁(suspended) 세포를 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠렛으로 얻은 뒤, 다시 단일 세포 상태로 만들어주기 위해 growth media에 재부유시켰다. 혈구계수기(Hemacytometer)를 이용하여 세포의 개수를 세고, 다시 poly-HEMA coating된 6 well culture plate에 씨딩(seeding)하였다.
본 발명에서 도 5(B)는 세포를 씨딩(seeding)하고 이틀 후, qRT-PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 TAZ protein target gene을 정량적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 2의 고분자층이 적층된 중간엽 줄기세포(고분자층 두께 60 nm)에 대해 TAZ protein target gene을 정량적으로 분석하였다.
상기 도 5(B)의 결과는 세포 성장 조건에서 모든 종류의 고분자층이 코팅하지 않은 세포인 대조군(control)보다 TAZ protein을 더 많이 유도하며, 세포 증식을 촉진하는 TAZ에 의해 세포 증식이 더 잘 일어날 수 있는 가능성을 보여준다.
또한, 본 발명에서 도 5(C)는 부착 조건(Adherent condition)과 현탁 조건(Suspended condition)에서 6일 동안 이틀 간격으로 줄기세포의 증식을 확인한 그래프이다.
실시예 2의 60 nm 두께의 고분자층이 고분자층이 적층된 중간엽 줄기세포에 대하여 증식 변화를 확인하였다.
부착 조건에서 고분자층을 코팅하지 않은 세포인 대조군(control)과 고분자층을 코팅한 실시예의 세포의 세포 증식 정도를 비교하면, 고분자층을 이루는 물질의 종류에 따라 차이가 있지만, 모든 종류의 고분자층이 세포 증식을 촉진하는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과는 세포 성장 조건, 부착 조건에서 진행된 (B)의 결과와 부합하는데, 이는 세포 표면에 적층된 고분자층이 인공적 세포외기질 역할을 해주어 세포가 더 안정감을 느끼기 때문이다.
현탁 조건에서는 부착 세포인 줄기세포에 대해 인공적 세포외기질 역할을 수행하는 고분자층이 기판의 영향이 없을 때, 세포가 어느 정도의 안정감을 가지는지 확인할 수 있다. 대부분의 고분자층은 대조군보다 더 높은 증식 정도를 보이지만 PGA의 경우 오히려 대조군에 비해 증식 정도가 낮은 것을 확인할 수 있다. 이는, 세포 표면에 같은 두께의 고분자층을 적층해 주었을 때, 시간이 지나면서 가장 많은 양의 고분자층이 떨어져나가 세포에게 충분한 안정감을 주지 못하기 때문이다.
특히 AA 경우 두 조건에서 모두 높은 세포 증식 효과를 보이는데, 이는 AA가 줄기세포의 증식을 촉진시켜 빠른 시간 내에 충분한 양의 줄기세포를 확보하는데 이용될 수 있음을 보여준다.
실시예 5. 세포 분화 조건에서 조골세포로 분화 정도 측정
6 well culture plate에 세포를 1×104/cm2 농도로 씨딩(seeding)하고 37℃, CO2 5% 조건에서 인큐베이팅(incubating)하였다. 이틀 후, growth media에서 osteogenic differentiation media(DMEM에 Fetal bovine serum 10%, 50 μg/mL ascorbic acid, 0.1 μM dexamethasone 및 10 mM β-glucerophosphate가 첨가된 media)로 교체하고, 이틀에 한번씩 media를 새로 교체해주었다. 분화 개시 6일 후, Trizol 시약을 이용하여 세포에서 전체 RNA를 분리해내고 M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase를 이용하여 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 조골세포 분화 표지인자인 DLX5, MSX2, Osteocalcin 및 RUNX2를 qRT-PCR(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 이용해서 정량적으로 분석하였다.
본 발명에서 도 6은 분화 개시 6일 후, qRT-PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 조골세포 분화 표지인자를 정량 분석한 그래프이다.
상기 도 6에서는 조골세포 분화 표지인자들을 qRT-PCR을 이용하여 정량 분석함으로써, 상기 줄기세포의 조골세포 분화 정도를 확인할 수 있다. 상기 도 6에서는 고분자층을 코팅하지 않은 대조군(control)의 결과를 1로 두고 모든 결과를 정규화시켜 표현하였다. AA의 경우 대조군에 비해 2배가 넘는 조골세포로의 분화를 유도하는데, 이는 세포 표면에 고분자층을 제조해주는 것만으로도 줄기세포의 분화를 조절할 수 있음을 보여준다.
특히 조골세포로의 분화 촉진 효과는 임상적으로도 세포치료와 같은 분야에 응용될 수 있다.
실시예 6. TAZ 단백질 관련 분석
TAZ 단백질의 upstream molecule을 확인하여 조절되는 세포 시그널링(signaling)을 확인하기 위해 웨스턴 블랏(western blot)을 진행하였다. 6 well culture plate에 세포를 1×104/cm2 농도로 씨딩(seeding)하고 37℃, CO2 5% 조건에서 인큐베이팅(incubating)하였다. 24시간 뒤, TNE lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% NP-40, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM NaF, 1mM Na3VO4]에 단백질 분해 효소 억제제를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 Bradford protein assay와 95℃에서 5분간 끓여 단백질을 변성(denaturation)시킨 후 SDS sample buffer를 이용하여 정량화하였다. 8% 아크릴아미드 겔(acrylamide gel) 위에 샘플(sample)을 놓고, 전기영동으로 분리하고 PVDF 막에 블러팅(blotting)한 후, TBST의 5 % non-fat dry milk로 차단한 후에 1차 항체를 5% BSA를 포함한 TBST에서 희석시켜서 첨가하였다. 그리고 4 ℃에서 회전시키면서 하룻밤동안 인큐베이팅(incubation)하였다. 5분 동안 TBST로 3번 세척해주고, 2차 항체를 5% non-fat dry milk를 포함한 TBST에서 희석시켜서 첨가하고 상온에서 1시간 동안 교반시키면서 인큐베이팅(incubation)하였다. 5분 동안 TBST로 3번 세척해주고, ECL system을 이용하여 target 단백질의 특정 띠를 검출하였다.
TAZ의 localization을 확인하기 위해 immunocytochemistry를 진행하였다. 24 well culture plate 내의 poly-L-lysine을 코팅한 cover-slip 위에 세포를 1×104/cm2 농도로 씨딩(seeding)하고 37℃, CO2 5% 조건에서 인큐베이팅(incubating)하였다. 24시간 뒤, 3.7% formaldehyde와 투과성 3% triton X-100 시약으로 세포를 고정하였다. 그리고 5% normal goat serum을 한시간 동안 처리하여 세포를 blocking하고, 1차 항체를 1% BSA가 포함된 PBS에서 희석하여 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤동안 인큐베이팅(incubation) 한 후 세포를 5분 동안 PBS로 3번 세척해주었다. 형광색소와 결합된 2차 항체를 1% BSA가 포함된 PBS에서 희석시켜 세포에 첨가하고 상온에서 2시간동안 인큐베이팅(incubation)하였다. 5분 동안 PBS로 3번 세척해주고 세포핵을 염색하기 위해 DAPI가 포함된 mounting media에 세포를 처리한다. 그리고 공초점 현미경을 이용하여 염색된 시료를 확인하였다.
본 발명에서 도 7은 MAPK(Mitogen Activated Protein Kinases) pathway 관련 western blot의 결과(A) 및 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 세포핵을 염색하고 TAZ protein의 형광색소와 결합한 항체를 달아서 TAZ의 localization을 확인하기 위해 공초점 현미경을 이용해서 촬영한 immunofluorescence 이미지(B)를 나타낸다.
도 7(A)의 western blot의 결과, ERK의 인산화가 모든 종류의 고분자층에서 증가되었으며 JNK의 인산화의 경우 AA에서만 증가하였다. 이는 세포 표면의 고분자층에 의한 세포 증식 및 조골세포로의 분화 촉진이 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) pathway에 의해 매개될 수 있음을 보여준다. (B)는 공초점 현미경으로 촬영한 immunofluorescence 이미지로 TAZ의 형광색소와 결합한 항체를 이용하여 TAZ localization을 확인하였다. 모든 종류의 고분자층에서 TAZ가 activation되어 DAPI로 염색된 세포핵에 존재하며, 이는 세포 표면의 고분자층에 의한 세포 증식 및 조골세포로의 분화 촉진이 TAZ signaling과 관계 있음을 보여준다.
Claims (9)
- 줄기세포의 표면에 양전하 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액을 반복적으로 적층하여 상기 줄기세포의 표면을 둘 이상의 고분자층으로 코팅하는 단계를 포함하고,
상기 양전하 고분자는 콜라젠, 엘라스틴 또는 데코린이며,
상기 음전하 고분자는 폴리-L-글루탐산(poly-L-glutamic acid), 리그닌-알칼리(lignin-alkali), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate) 및 알긴산(alginic acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이고,
고분자층의 총 두께는 50 내지 80 nm인 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
줄기세포는 중간엽 줄기세포인 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
고분자층은 2 내지 9의 다층으로 형성되는 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
고분자 용액의 적층은 (a) 양전하 고분자 용액에 줄기세포를 부유시키는 단계;
(b) (a)에서 제조된 줄기세포 부유액을 원심분리하여 세포 펠렛을 얻는 단계;
(c) 음전하 고분자 용액에 (b)에서 얻은 세포 펠렛을 부유시키는 단계; 및
(d) (c)에서 제조된 부유액을 원심분리하여 세포 펠렛을 얻는 단계를 통해 수행되는 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,
단계 (b) 및 (d)를 수행한 후, 얻은 세포 펠렛을 세척하는 단계를 추가로 수행하는 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법.
- 제 5 항에 있어서,
단계 (a) 및 (c)를 반복적으로 수행하는 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법.
- 중간엽 줄기세포의 표면에 콜라젠 용액 및 알긴산(alginic acid) 용액을 반복적으로 적층하여 상기 줄기세포의 표면을 둘 이상의 고분자층으로 코팅하는 단계를 포함하며,
고분자층의 총 두께는 50 내지 80 nm인 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법.
- 삭제
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160022391A KR101815370B1 (ko) | 2016-02-25 | 2016-02-25 | 세포 표면 고분자층 적층 기술 개발 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101815370B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200007746A (ko) | 2018-07-12 | 2020-01-22 | 순천향대학교 산학협력단 | 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법 |
| KR20200007747A (ko) | 2018-07-12 | 2020-01-22 | 순천향대학교 산학협력단 | 골치료를 위한 fk506을 포함하는 키토산/템포 산화 셀룰로오스 나노 섬유 하이드로겔 및 이의 제조방법 |
| KR20200113769A (ko) | 2019-03-26 | 2020-10-07 | 연세대학교 산학협력단 | 연골세포 분화 유도용 조성물 및 이의 용도 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102066258B1 (ko) * | 2018-07-31 | 2020-01-14 | 연세대학교 산학협력단 | 줄기세포 표면의 코팅방법 |
| WO2022019688A1 (ko) * | 2020-07-22 | 2022-01-27 | 연세대학교 산학협력단 | 세포시트의 코팅기술을 기반으로 한 배양육 제조방법 및 이로부터 제조된 배양육 |
| KR102532138B1 (ko) | 2021-09-29 | 2023-05-11 | 인하대학교 산학협력단 | 티올화된 리그닌설폰산염 복합체와 이의 제조방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010028087A2 (en) * | 2008-09-02 | 2010-03-11 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Nanoparticle-stem cell conjugates for post-infarction treatment |
| JP2013233113A (ja) * | 2012-05-09 | 2013-11-21 | Osaka Univ | 物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法 |
-
2016
- 2016-02-25 KR KR1020160022391A patent/KR101815370B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010028087A2 (en) * | 2008-09-02 | 2010-03-11 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Nanoparticle-stem cell conjugates for post-infarction treatment |
| JP2013233113A (ja) * | 2012-05-09 | 2013-11-21 | Osaka Univ | 物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200007746A (ko) | 2018-07-12 | 2020-01-22 | 순천향대학교 산학협력단 | 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170100693A (ko) | 2017-09-05 |
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