KR20170099033A

KR20170099033A - 기계적 안정성이 증대된 세포시트

Info

Publication number: KR20170099033A
Application number: KR1020160020774A
Authority: KR
Inventors: 홍진기; 양미소; 이종민; 김현이; 정한성
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2017-08-31

Abstract

본 발명은 세포시트의 기계적 안정성을 증대 및 보호를 위하여, 다층박막을 도입한 세포시트에 관한 것으로, 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 세포시트, 또는 상기 세포 각각의 표면이 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 것인 세포시트를 포함한다.

Description

기계적 안정성이 증대된 세포시트{CELL SHEET WITH ENHANCED MECHANICAL STABILITY}

본 발명은 세포시트의 기계적 안정성의 증대 및 보호를 위한, 다층박막으로 코팅된 세포시트에 관한 것이다.

최근 인간의 평균 수명 증가로 인한 고령화, 다양한 질환, 그리고 사고나 외상에 의한 조직 손상을 포함하여 난치성 질병을 극복하기 위한 조직공학 및 재생의학의 역할은 더욱 중요해지고 있다. 손상된 조직이나 장기를 재생하는데 있어 적합한 세포의 적용이 필요하며, 특정 조직의 형태를 유지하기 위한 지지체 역시 세포가 안정적으로 조직이나 장기의 재생을 도울 수 있게 한다. 그러나, 기존의 지지체에 세포를 접종하는 방법의 경우, 세포가 균일하게 분포되지 않으며 세포의 밀도가 낮아 생리적 작용에 중요한 세포끼리의 상호작용이 어렵다는 문제가 존재하였다.

이러한 문제점을 해결하고자 세포만으로 세포시트를 제조하는 기술이 주목 받고 있는데, 특히 세포시트를 이용한 망막 재생에 관한 연구가 보고되면서 세포시트를 조직공학 및 재생의학에 활용하고자 수많은 연구들이 진행되고 있다. 또한, 세포시트는 세포를 높은 밀도로 밀집될 수 있게 하는데, 이를 활용한 심장질환 치료에 관한 연구가 보고되기도 하였다.

그러나, 세포만으로 이루어진 세포시트는 낮은 기계적 강도로 인하여 다루기 까다로워, 세포시트를 인체 내로 이식할 때의 문제점으로 작용하기도 한다. 때문에 세포시트의 기계적 강도를 증가시키기 위한 다양한 시도들이 보고되고 있다. 그 예로, 온도 감응형 고분자로 널리 사용되는 PNIPAAm(폴리(N-아이소프로필아크릴아미드))과 세포외기질 단백질을 함께 넣어 세포시트를 제조할 기판을 제작함으로써 세포시트의 기계적 강도를 증가시키는 방법 등이 보고된 바 있다.

향후 재생의학 및 조직공학 분야에서 세포시트의 상용화를 위한 기술은 특정 세포에 국한되지 않고 다양한 세포에 적용 가능해야 하며, 현재 세포시트가 가지는 취약점을 보완하고 세포시트를 최적화할 수 있어야 한다.

H. Fujita et al., Biotechnol. Bioeng., 2009, 103, 370-377

본 발명의 일 실시예는 세포시트의 기계적 안정성의 증대 및 보호를 위하여, 층과층 적층법(Layer-by-Layer assembly)을 이용하여 제조한 다층박막이 형성된 세포시트를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포시트는 (i) 세포시트가 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 세포시트, 또는 (ii) 상기 세포 각각의 표면이 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 것인 세포시트를 포함한다.

본 발명의 일 양상은 복수 개의 세포가 판상 배열되어 있는 세포시트로서, 상기 세포시트는 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 것인 세포시트를 제공한다.

본 발명의 다른 양상은 복수 개의 세포가 판상 배열되어 있는 세포시트로서, 상기 세포는 각각의 표면이 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 것인 세포시트를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포시트"는 당업계에 공지된 세포 배양 방법, 예컨대 단층배양법에 의하여 형성된, 하나 이상의 세포가 단일의 층으로 판상 배열되어 있는 것을 지칭하며, 배양관 등에 형성된 세포시트는 물리적 또는 화학적 방법으로 배양관 등으로부터 분리시키는 것이 가능하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다층 세포시트"는 상기 단층인 판상의 세포시트가 수직방향으로 하나 이상 적층됨으로써 형성되는 3차원적 세포시트의 집합을 지칭한다. 이하, 본 명세서에 기재되는 "세포시트"는 단일의 층을 갖는 세포시트뿐만 아니라, 다층 세포시트를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "적층" 또는 "형성"은 박막층이 생성 순서대로 층층이 쌓인 것을 의미한다. 이러한 적층된 구조는 당업계에 공지된 비한정된 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 예컨대 층과층 적층법(layer-by-layer self-assembly method; LbL)을 이용하여 여러 종류의 용액에 교대로 침지시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다층박막이 층과층 적층법에 의하여 형성되는 경우, 다층박막이 도입되는 유도력으로는 정전기적 인력, 세포 표면의 특정 수용체에 기인한 생물적 인식(biological recognition) 등을 포함한다. 이러한 층과층 적층법을 이용한 다층박막 제조는 방식이 매우 간단하고, 다층박막의 두께를 수 나노미터 단위로 조절 가능하며, 구조, 밀도 등을 목적에 맞게 조절할 수 있고, 적용가능한 세포의 종류 및 다층박막을 구성하는 물질의 선택 범위가 넓다는 장점이 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다층박막"은 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상으로 구성되는 박막을 지칭한다. 예컨대, 상기 다층박막은 소섬유 구조의 단백질-고분자 다층박막일 수 있다. 상기 다층박막의 2층 이상의 박막층은 각각 동일하거나 상이한 물질, 바람직하게는 생체적합성 물질을 포함할 수 있고, 상이한 2종 이상의 박막층이 일정 순서로 반복되거나 순서없이 적층되어 있을 수 있으며, 2종의 박막층이 교대로 적층되어 다층박막을 형성할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생체적합성"은 임상적 위험/이익 평가를 기초로, 치료 또는 조치의 종료 이전에 상기 세포시트의 제거를 필요로 하는 국소적 부위에서 임상적으로 관련된 조직 자극 또는 괴사를 야기시키지 않음을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생체적합성 물질은 다당류(예컨대, 알긴산, 키토산, 헤파란황산 등), 폴리아미노산(예컨대, 폴리-L-글루탐산 등), 단백질, 당단백질(예컨대, 콜라겐, 라미닌, 엘라스틴 등 세포외기질 단백질), 폴리페놀(예컨대, 탄닌산 등) 및 합성중합체(폴리 황산스티렌 등)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 박막층은 세포막의 특정 수용체와 결합하는 세포외기질 단백질(예컨대, 엘라스틴, 라미닌 등)로부터 선택되는 하나 이상의 물질로 구성될 수 있다. 상기 물질들은 생체적합성이 우수한 것들로서, 세포시트가 체내 기관 등에 부착되어 일체화되는데 영향을 미치지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포시트에서 상기 다층박막은 세포 성장 배지 조건에서 약한 양전하를 가지는 세포외기질 단백질 중 하나인 콜라겐, 및 음전하 물질인 알긴산의 정전기적 인력을 이용하여 형성될 수 있다. 또한, 콜라겐 및 알긴산이 사용되는 경우, 세포 성장 배지의 구성물질 중 하나인 칼슘이온과 생광물화(bio-mineralization)가 일어나 세포시트의 기계적 강도가 보다 더 증가한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다층박막은 기능성 물질로 구성된 층을 추가로 포함할 수 있다. 상기 기능성 물질은 목적에 따라 줄기세포의 분화를 유도하는 물질, 세포 증식을 촉진하는 물질 등으로 성장인자(예컨대, 뼈 형성 단백질, 섬유 아세포 성장 촉진 인자, 혈관 내피 생성 인자 등), 약물(예컨대, 덱사메타손 등) 기타 물질일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 다층박막은 줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 물질로 구성된 층을 포함할 수 있다. 상기 세포시트를 구성하는 세포로서 줄기세포를 사용하는 경우, 줄기세포로 이루어진 세포시트 표면에 줄기세포의 조골세포로 분화를 유도하는 다층박막을 적층한 후 조직에 삽입하면, 세포시트의 석회화(calcification)를 보다 신속하고 균일하게 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포는 세포시트 형태로 제조되어 인체 조직에 일체화되어 성장 및 증식할 뿐만 아니라 방향성을 갖도록 재배열될 수 있는 세포를 지칭한다. 상기 세포는 본 발명에서 제공하는 세포시트가 이식될 상처부위의 손상된 조직을 대체할 수 있는 세포가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 손상된 조직의 세포와 동일하거나 또는 유사한 특성을 갖는 세포 또는 상기 세포로 분화될 수 있는 줄기세포가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 신경세포, 혈관세포, 민무늬근세포, 심근 세포, 골격근세포, 골세포, 연골세포, 섬유세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 골수줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 세포는 인간 중간엽 줄기 세포(human Mesenchymal stem cell) 또는 근아세포일 수 있다.

본 발명의 세포시트에 다층박막을 형성시키기 위해서는, 예컨대, 먼저 세포시트를 양전하 물질 용액에 담지한 후 세척하여 세포시트와 약하게 결합되어 있는 양전하 물질을 제거하고, 　다시 세포시트를 음전하 물질 용액에 담지한 후 세척하여 세포시트와 약하게 결합되어 있는 음전하 물질을 제거하며, 다층박막의 층 수만큼 양전하 또는 음전하 물질에 담지하고 세척하는 단계를 반복할 수 있다. 상기 물질 용액의 성질, 종류 및 순서는 사용되는 물질 용액의 특성에 따라 통상의 기술자가 용이하게 변경하여 수행할 수 있다.

또한, 세포시트를 구성하는 세포 각각의 표면에 다층박막을 형성시키기 위해서는, 예컨대, 먼저 양전하 물질 용액에 단일세포를 부유시키고 상기 세포 부유액을 원심 분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득한 후 세척하여 단일세포와 약하게 결합되어 있는 양전하 물질을 제거하고, 음전하 물질 용액에 상기 단일 세포를 부유시키고 상기 세포 부유액을 원심 분리하여 세포 펠렛을 수득한 후 세척하여 단일세포와 약하게 결합되어 있는 음전하 물질을 제거하며, 다층박막의 층 수만큼 양전하 또는 음전하 물질에 부유시키고 세척하는 단계를 반복할 수 있다. 상기 물질 용액의 성질, 종류 및 순서는 사용되는 물질 용액의 특성에 따라 통상의 기술자가 용이하게 변경하여 수행할 수 있다. 상기 방법을 통한 다층박막의 제조를 세포의 성장 배지와 동일한 조건에서 수행함으로써 세포가 느끼는 스트레스를 감소시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "물질 용액"은 침지함으로써 세포시트 또는 단일세포 상에 다층박막을 형성하는 용액을 지칭하는 것으로서, 용매, 예컨대 PBS, 트리스-버퍼(Tris-buffer), 세포 성장 배지 등에 다층박막을 제조할 물질, 예컨대 고분자, 단백질, 성장인자 등을 혼합하여 제조한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "세척"은 세포시트 또는 단일세포를 각종 용액에 침지한 후, 각 세포시트 또는 단일세포와 약한 결합으로 적층된 물질을 제거하기 위한 단계를 지칭하며, 사용된 용액의 용매를 이용하여 수행된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "포함"은 언급한 구성요소, 단계, 숫자 등의 존재를 의미하는 것이지, 다른 구성요소, 단계, 숫자 등의 존재 또는 부가를 배제하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양상은 상기 세포시트를 환부에 접촉시키는 단계를 포함하는 환부 조직을 재생 또는 회복시키는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "환부"는 창상, 자상 등의 물리적인 요인에 의하여 또는 선천적으로 손상 또는 멸실된 피부 세포, 근육 세포, 신경 세포, 혈관 세포 등의 부위를 지칭한다. 본 발명의 세포시트는 상처부위의 결손된 조직을 대체할 수 있으므로, 상처부위에 직접 도입하는 형태로 이식함이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예는 상기 세포시트를 포함하는 조직 재생 또는 회복용 제제를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "제제"는 하나 이상의 물질을 목적에 맞게 배합하고 가공하여 제조한 제품을 지칭하며, 그 형태로서 조성물, 드레싱 제제 및 패드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 세포시트, 또는 이를 포함하는 조직 재생 또는 회복용 제제는 조직의 재생 또는 회복을 요하는 조직 상에 또는 그 내부로 이식될 수 있다.

본 발명에 따른 다층박막이 형성된 세포시트는 매우 간단한 방법으로 세포시트를 보호하고 기계적 안정성을 증대시켜, 세포시트를 실제 활용하는데 있어 최적화할 수 있다. 또한, 세포시트의 표면에 다층박막을 형성하는 경우, 세포시트 내의 세포 유실을 줄이고 보호하여 생존정도를 높였으며, 단일세포 표면에 다층박막을 형성하는 경우에는 세포 증식을 촉진하는 다층박막을 적층하여 세포시트 제조시간을 단축시킬 수 있다.

도 1은 (i) 세포시트 표면에 소섬유 구조의 단백질-고분자 다층박막을 형성하거나, (ii) 단일세포 표면에 인공적 세포외기질 역할을 하는 다층박막을 형성한 후 세포시트를 제조하여, 세포시트를 최적화하는 과정을 모식화한 것을 나타낸다.
도 2의 (A)는 세포 등장액 조건 하에서, 실리콘 기판에 형성된 다층박막의 층수에 따른 두께, 및 금 전극에 형성된 다층박막에서 층수에 따른 다층박막의 질량을 나타낸다. 또한, 도 2의 (B)는 대조군 세포, 및 콜라겐-알긴산 다층박막을 형성한 세포의 증식 정도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 3의 (A)는 세포시트 3층을 겹친 후 다층박막을 도입한 이미지를 나타내며, 도 3의 (B)는 세포에 Qtracker 565를 처리하여 형광 염색한 후 세포시트를 제조하여, 단층의 세포시트와 3층의 세포시트에 대하여 각각의 대조군 및 세포시트 표면에 다층박막 제조군의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 또한, 도 3의 (C)는 세포시트의 생존 정도를 공초점 현미경을 통하여 측정한 그래프를, 도 3의 (D)는 세포시트 3층을 겹친 후, 조직감 측정기(texture analyzer)를 이용하여 세포시트의 기계적 강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4의 (A)는 수정 후 13.5일이 지난 쥐의 배아에서 입천장의 구개판을 수득하여, 생체외에서 세포시트를 삽입하는 모식도를 나타내며, 도 4의 (B)는 단층의 세포시트 및 3층의 세포시트 각각에 대한 대조군 및 세포시트 표면에 다층박막을 제조한 군에 대하여, 각각을 쥐 배아의 구개판에 삽입 후, 다광자 현미경을 통하여 z축을 따라 이동하며 촬영한 연속의 단층 형광 이미지를 삼차원 형상으로 재구성한 것을 나타낸다.

이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 기판 상에의 다층박막의 제조

다층박막을 제조할 양전하 물질로 래트(rat) 꼬리로부터 유래된 콜라겐 유형 1을, 음전하 물질로 알긴산을 사용하였다. 세포 등장액과 같은 조건인 PBS(phosphate buffer saline)와 0.15M 염, pH 7.4 증류수에서 제조하였고, 농도는 1mg/mL이었다. 실리콘 기판에 다층박막을 적층하기 전, 실리콘 기판을 O₂ 플라즈마 처리하여 음전하로 개질시키고, 양전하를 띠는 콜라겐 용액에 10분 동안 담지하였다. 약한 결합으로 적층된 콜라겐을 제거하기 위하여 각 2분, 1분 및 1분 동안 세척 용액에 담지하였다. 그 후, 차례로 음전하 물질인 알긴산을 적층시키기 위하여 상기 과정을 반복하였다. 금 전극 세척을 위하여, 피라나 용액(piranha solution, 황산:과산화수소=3:2)에서 5분 동안 처리하고 증류수에서 세척한 후, O₂ 플라즈마 처리를 통하여 음전하로 개질시켰다. 그 후, 양전하 용액에 10분 동안 담지하고, 약한 결합으로 적층된 물질을 제거하기 위한 세척 과정 후, 음전하 용액에 담지하는 과정을 반복적으로 수행하여 다층박막을 제조하였다. 다층박막이 적층된 금 전극의 진동수 변화를 QCM(Quartz Crystal Microbalance)을 통하여 측정하고, 사우어브레이 방정식(sauerbrey equation)을 통하여 질량 변화를 계산하였다.

실시예 2. 단일세포 및 세포시트에의 다층박막 제조에 사용할 용액의 제조

다층박막을 제조할 양전하 물질로 래트 꼬리로부터 유래된 콜라겐 유형 1을, 음전하 물질로 알긴산을 사용하였다. 본 실험에서 사용한 모든 용액을 세포 성장 배지(DMEM에 소태아혈청 10%가 첨가된 배지)에서 제조하였고, 농도는 1mg/mL이었다. 박테리아 제거 등 소독을 위하여, 0.2μm 필터를 이용하여 주사기 필터링을 수행하였으며, 본 실시예의 모든 과정은 멸균 조건(소독된 벤치)에서 진행하였다.

실시예 3. 세포 표면에의 다층박막 제조 후 세포 시트의 제조

배양된 인간 중간엽 줄기 세포를 트립신으로 처리하여 수득한 단일세포 부유액을 1000 내지 1300rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득하였다. 상청액을 제거하고 양전하 용액 0.5mL을 넣은 후, 피펫팅 30회를 하여 세포를 재부유시켰다. 이어서, 1000 내지 1300rpm에서 3분 동안 원심분리하여 다시 세포 펠렛을 수득하였다. 상청액을 제거하고 세척 용액인 성장 배지 1mL 넣은 후, 피펫팅 10회를 하여 세포를 재부유시켰다. 다시, 1000 내지 1300rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하고, 세척 과정을 한 번 더 수행하였다. 상기 양전하 물질을 적층시키는 과정과 동일한 과정으로 음전하 물질을 적층시키는 과정을 수행하였으며, 다층박막의 층 수만큼 상기 과정을 반복하였다. 부착 조건에서 다층박막이 제조된 세포의 세포 증식 정도를 측정하기 위하여, 6-웰 배양접시에 세포를 1×10⁴cells/cm² 농도로 접종(seeding)하고, 37℃ 및 이산화탄소 5% 조건에서 배양하였다. 세포를 이틀 간격으로 6일 동안 트립신 처리하여 단일세포 상태로 만들어준 후, 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 세포의 개수를 측정한 후, 다시 6-웰 배양접시에 접종하였다.

상기 접종된 세포가 배양접시의 바닥을 빈틈없이 채워 세포시트를 형성할 때까지, 37℃ 및 이산화탄소 5% 조건에서 다층박막을 적층한 세포를 배양하고, 20℃ 배양기 또는 세포 스크래퍼(cell scraper)를 이용하여 6-웰 배양접시로부터 세포시트를 분리하였다.

실시예 4. 세포시트에의 다층박막 도입

35mm UpCell 배양접시 또는 35mm 세포 배양접시에 인간 중간엽 줄기 세포를 접종하고, 37℃ 및 이산화탄소 5% 조건에서 배양하였다. 세포가 배양접시 바닥을 빈틈없이 채워 세포시트를 형성할 때까지 배양한 후, 20℃ 배양기 또는 세포 스크래퍼(cell scraper)로 세포시트를 수득하였다. 단층의 세포시트를 수득한 후, 세포시트끼리 연접할 수 있도록 처리하여 다층 세포시트를 수득하였다.

배양접시로부터 분리된 세포시트가 담긴 배양접시로부터 세포 배양 배지를 모두 제거하고, 상기 실시예 2에서 제조한 양전하 용액 1mL을 넣은 후 10분 동안 배양시켰다. 배양 후, 상기 용액을 모두 제거하고 세포 성장배지를 이용하여 세척한 후, 상기 실시예 2에서 제조한 음전하 용액 1mL을 넣은 후 10분 동안 배양시켰다. 이를 세포 성장배지를 이용하여 세척하였다. 상기 과정을 다층박막의 층 수만큼 반복함으로써, 다층박막을 형성한 세포시트를 수득하였다.

실시예 5. 세포시트의 형광 이미지 분석

세포를 배양 중인 UpCell 배양접시에 Qtracker 565를 처리하여, 세포를 형광 염색하였다. 20℃ 및 이산화탄소 5% 조건의 배양기에서 단층의 세포시트를 수득한 후, 세포 연접을 통하여 다층의 세포시트를 제조하였다. 단층 세포시트 대조군, 단층 세포시트 표면에 다층박막 제조군, 3층의 세포시트 대조군, 및 3층의 세포시트 표면에 다층박막 제조군을 형광 현미경을 통하여 확인하였다.

실시예 6. 세포시트의 생존 정도의 비교 측정

제조된 세포시트의 생존 정도를 비교하기 위하여 생사 분석(live/dead assay)을 진행하였다. JC-1 형광 염료를 사용 전 세포 성장 배지에서 5μg/mL의 농도로 제조한 후, 응집되지 않도록 충분히 볼텍싱 해주었다.

세포시트를 JC-1 염색 용액에 담지하여 37℃ 및 이산화탄소 5% 조건에서 15분 동안 배양한 후, PBS로 세척하였다. 공초점 현미경을 이용하여, 대조군, 세포시트 표면에의 다층박막 제조군, 및 단일세포에 다층박막 적층 후 세포시트 제조군에서의 적색 형광 및 녹색 형광의 강도를 1024×1024 픽셀로 각각 5회씩 측정하였다. 상기 적색 형광 및 녹색 형광의 평균 강도 비율을 통하여 세포시트의 생존 정도를 비교하였다.

실시예 7. 세포시트의 강도 측정

단층의 세포시트를 수득한 후, 세포시트끼리 연접시켜 3층의 세포시트를 제조하였다. 대조군과 세포시트 표면에 다층박막 제조군, 및 단일세포 표면에 다층박막 적층 후 세포시트 제조군의 강도를 조직감 측정기를 이용하여 비교분석하였다. 세포시트를 세포 배양 배지에 담지한 상태로, 세포시트의 가운데 부분에 일정 무게의 추로 하중을 가하였다. 세포시트의 기계적 강도를 높이당 하중으로 무게를 힘으로 계산하였으며, 초기에 500gf를 가해주고, 0.5gf일 때부터 세포시트 전체를 압축할 때까지의 힘을 측정하였다. 또한, 세포시트의 전체 높이를 측정하여 이를 100으로 두고 정규화시켜 각 세포시트의 같은 위치까지 압축하기 위하여 필요한 힘을 비교하였다.

실시예 8. 생체 외에서 조직내 세포시트 삽입

단층의 세포시트, 단층의 세포시트 표면에 다층박막 제조군, 3층의 세포시트, 및 3층의 세포시트 표면에 다층박막 제조군 등 총 네 군의 세포시트를 준비하였다. 수정 후 13.5일이 지난 ICR 쥐의 배아로부터 입천장을 분리한 후, 입천장 양 끝에서 융기하기 시작한 구개판을 분리하였다. 분리한 구개판에 텅스텐 니들을 이용하여 홈을 만들고, 홈의 안쪽으로 각각의 세포시트를 삽입하였다. 해당 구개판을 거름종이 위에 올리고 이를 철망 위에 안치하여, Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12) 배양액에서 37℃ 및 이산화탄소 5% 조건 하에 8일간 생체외 배양하였다. 배양액은 하루마다 교체하였다.

생체외 배양된 구개판 속 세포시트의 상태를 관찰하기 위하여, 다광자 현미경을 통하여 세포시트로부터 나오는 형광을 삼차원 형태로 촬영하였다. 단층 형광 이미지를 z축을 따라 이동하며 촬영하고, 연속 촬영된 이미지를 삼차원 형상으로 재구성하였다.

실험예 1. 다층박막의 정량적 분석

도 2의 (A)는 세포 등장액 조건에서 제조한 다층박막의 두께 및 질량 그래프이다. 층수의 증가에 따라 실리콘 기판에 형성된 다층박막의 두께 및 질량이 증가하였고, 이를 통하여 다층박막이 성공적으로 제조되었음을 확인하였다. 콜라겐-알긴산 다층박막은 층수의 증가에 따라 선형으로 두께가 증가하며, 거칠기가 작았다. 이는 소섬유 구조의 콜라겐이 적층되고, 그 사이를 알긴산이 메우듯 다층박막을 형성함에 기인하며, 이는 상기 질량 그래프에서도 확인할 수 있었다. 질량 그래프에서는 금 전극 표면에 첫번째 콜라겐 층이 다량으로 적층되어 질량 변화가 크지만 이후 여러층이 반복되어 적층되면서 두께 그래프와 마찬가지로 선형으로 증가하였다.

실험예 2. 단일세포 표면 다층박막 적층 후 세포 분석

도 2의 (B)는 부착 조건에서 대조군 세포와 콜라겐-알긴산 다층박막을 적층한 세포의 증식 정도를 비교분석한 결과로, 다층박막이 세포 증식을 촉진함을 확인할 수 있었다. 이는 세포 표면에 제조된 다층박막이 인공적 세포외기질의 역할을 해주어 세포가 더 안정감을 느낄 수 있고, 다층박막이 외부적 신호로 작용하여 세포 내로 증식을 촉진하도록 영향을 주는 것에 기인한다. 또한, 상기 결과는 세포시트에 콜라겐-알긴산 다층박막을 도입하였을 경우, 세포 증식을 촉진하여 세포시트를 수득하는데 소요되는 시간을 단축할 수 있음을 보여주었다.

실험예 3. 세포시트에 다층박막 도입 후 세포시트 분석

도 3의 (A)는 다층의 세포시트에 다층박막을 도입한 이미지로, 각각 0) 3층의 세포시트 대조군, 1) 3층의 세포시트 표면에 (콜라겐-알긴산) 5층의 다층박막 제조군, 및 2) 단일세포 표면에 (콜라겐-알긴산) 5층의 다층박막 적층 후 3층의 세포시트 제조군에 해당한다. 상기 세 군 간의 육안상 큰 차이점은 없었으나, 다층박막을 도입한 세포시트가 접히는 현상이 적어 다루기 더 용이하였다.

도 3의 (B)는 세포를 형광 염색한 후 세포시트를 제조하여, 단층의 세포시트와 다층의 세포시트 표면에 각각 다층박막을 제조한 군과 제조하지 않은 군을 형광 현미경을 통하여 촬영한 이미지이다. 모든 세포시트에서 형광이 잘 관찰되는 것을 통하여, 세포시트가 성공적으로 제조되었음을 확인하였으며, 다층박막을 도입한 세포시트의 형광의 세기가 더 큰 것을 통하여 다층박막이 세포시트를 보호하여 세포 유실을 감소시키고 세포시트가 더 잘 보존될 수 있도록 작용함을 확인할 수 있었다.

도 3의 (C)는 세포시트의 생존 정도에 관한 것으로, 적색 형광(살아있는 세포)과 녹색 형광(죽은 세포)의 강도비의 평균값을 나타내었다(녹색 형광 강도를 1로 정규화함). 세포시트 표면에 다층박막을 제조한 경우 대조군보다 더 높은 생존 정도를 보이는데, 이는 상기 도 3의 (B)에서 확인한 바와 같이, 박막이 세포시트를 보호하여 세포 유실을 감소시킴에 기인한다. 이는 세포시트 표면의 다층박막이 세포 생존 정도에 영향을 미치지 않은 정도를 넘어 생존에 더 유리한 조건을 갖추도록 할 수 있음을 시사한다. 또한, 단일세포에 다층박막 적층 후 세포시트를 제조한 군 역시, 대조군과 비슷한 세포 생존 정도를 보여주며 다층박막이 세포 생존 정도에 큰 영향을 주지 않음을 보여주었다. 이는 세포 독성이 없고 pH 7.4에서 약한 양전하 값을 갖는 세포외기질 단백질인 콜라겐을 기반으로 하는 다층박막이기 때문에 세포막에 선택적으로 흡착이 되고 세포막에 손상을 주지 않음에 기인한다.

도 3의 (D)는 세포시트의 기계적 강도에 관한 것으로, 다층박막 도입만으로 세포시트의 강도가 증가됨을 확인하였다. 추를 이용하여 각 세포시트를 동일 높이로 압축시키기 위하여는, 세포시트 표면에 다층박막 제조군, 단일세포 표면에 다층박막 적층 후 세포시트 제조군, 및 대조군의 순서로 더 큰 힘이 필요하였다. 다층박막을 이루는 콜라겐이 세포 성장 배지 내의 칼슘이온과 생광물화를 일으키며, 알긴산 역시 카복실 기를 다량 포함하고 있어, 광물화가 진행되는데 유리하며, 세포시트의 기계적 강도를 증가시킨다.

상기 결과들은 세포시트에 다층박막을 도입하는 것이 세포시트의 생존에 영향을 주지 않거나 생존에 더 유리한 조건을 갖출 수 있도록 하는 동시에, 세포시트의 기계적 강도를 증가시킬 수 있음을 보여주었다.

실험예 4. 생체외에서 조직내 세포시트 삽입 후 분석

도 4의 (B)는 단층의 세포시트, 단층의 세포시트 표면에 다층박막 제조군, 3층의 세포시트, 및 3층의 세포시트 표면에 다층박막 제조군 등 총 네 군의 세포시트를 각각 구개판에 삽입한 후, 구개판 조직 내에서 세포시트의 모습을 관찰하기 위하여 다광자 현미경으로 촬영한 이미지이다. 도 3의 (B)의 형광 이미지에서 확인한 바와 같이, 다층박막을 도입한 세포시트의 경우, 다층박막이 세포시트를 보호해주기 때문에 세포 유실이 적고, 조직 내에 삽입된 후에도 세포시트 내의 세포 밀도가 높은 상태로 구조를 더욱 잘 유지하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

복수 개의 세포가 판상 배열되어 있는 세포시트(cell sheet)에 있어서,
상기 세포시트는 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 것인 세포시트.
복수 개의 세포가 판상 배열되어 있는 세포시트에 있어서,
상기 세포는 각각의 표면이 하나 이상의 생체적합성 물질로 이루어진 2층 이상의 박막층을 포함하는 다층박막으로 코팅되어 있는 것인 세포시트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 생체적합성 물질은 다당류, 폴리아미노산, 단백질, 당단백질, 폴리페놀 및 합성중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포시트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 다층박막은 줄기세포의 분화 유도 물질 또는 세포 증식 촉진 물질을 더 포함하는 것인 세포시트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 세포는 신경세포, 혈관세포, 민무늬근세포, 심근 세포, 골격근세포, 골세포, 연골세포, 섬유세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 골수줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포시트.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 세포시트를 환부에 접촉시키는 단계를 포함하는 환부 조직의 재생 또는 회복 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 세포시트를 포함하는 조직 재생 또는 회복용 제제.